SU1578597A1 - Способ определени изоэлектрической точки белка - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к молекул рной биофизике и предназначено дл  измерени  характеристик белков-протеинов. Цель изобретени  - повышение чувствительности и точности определени  изоэлектрической точки белков-протеинов. Дл  этого облучают среду, содержащую макромолекулы, пол ризованным оптическим излучением, регистрируют пол ризованную и депол ризованную компоненты рассе нного света при различных PH среды и различных концентраци х раствора белка, затем определ ют зависимость коэффициента депол ризации, экстраполированного к нулевой концентрации белка, от PH раствора, по положению экстремума этой зависимости наход т значени  PH, соответствующие изоэлектрической точке белка. 1 ил.

Description

Изобретение относитс  к молекул рной биофизике и предназначено дл  измерени  характеристик белков-протеинов , а именно их изоэлектрических точек.

Целью изобретени   вл етс  повышение чувствительности и точности определени  изоэлектрической точки белков.

Сущность способа заключаетс  в следующем.

Облучают среду, содержащую макромолекулы пол ризованным оптическим излучением, регистрируют пол ризованную (1) и депол ризованную (I.) компоненты рассе нного света при различных рН среды и различных концентраци х раствора белка (С), затем определ ют зависимость коэффициента депол ризации (и j), экстрапол ризованного к нулевой концентрации белка,

от рН раствора и по положению экстремума этой зависимости наход т значени  рН, соответствующие изоэлектрической точке белка.

На чертеже представлены графики зависимости коэффициентов депол ризации от рН раствора дл  водных растворов Х-глобулийа и сывороточного альбумина (HSA). Из приведенных экспериментальных зависимостей видно, что дл  альбумина (1) экстремум зависимости коэффициента депол ризации от рН соответствует ,7, а дл  Х-гло- булина (2) - рН 6,1.

Способ осуществл ют следующим образом .

Приготавливают серию образцов растворов исследуемых белков в стандартных стекл нных кюветах с уменьшающейс  концентрацией (исходные значени 

сл J

оо

СП

СО

концентраций не более нескольких %) и различными значени ми рН раствора. На установке, предназначенной дл  измерени  интенсивности пол ризованного и депол ризованного излучени , с лазерным источником света, фотоэлектрической регистрацией и пол ризационным устройством (призмы Воллас- тона и Глана-Томсона) производ т измерени  пол ризованной и депол ризованной компонент света, рассе нного от образцов белковых растворов под углом регистрации -90°, Стро т график зависимости отношени  интенсивностей депол ризованной (1) и пол ризованной (1л) компонент от концентрации белка (С) и рН раствора. Положение экстремума этой .зависимости (dj f(рН) при С - 0 определ ет значение pri, соответствующее изоэлектрической точке белка.

Падающа  на рассеивающую среду монохроматическа  светова  волна Е 0-е J индуцирует в молекуле переменный дипольный момент , где t/ - пол ризуемость молекулы. Дл  совершенно изотропных молекул /  вл етс  скал ром , и основной вклад в интенсивность рассе нного излучени  в растворах макромолекул дает рассе ние на флуктуаци х концентрации.

В общем случае, когда рассеивающий объем обладает оптической анизотропией , пол ризуемость определ ет соотношение величин и ориентации в пространстве двух векторов - напр женности электрического пол  Е и индуцированного дипольного момента р, к описываетс  тензором второго ранга, называемым тензором пол ризуемости.

Если падающий и рассе нный лучи лежат в горизонтальной плоскости и составл ют угол 90°, причем падающий луч пол ризован в вертикальной плоскости , флуктуации ориентации оптической анизотропии молекул приведут к по в-« лению в рассе нном излучении горизонтальной пол ризованной составл ющей. Отношение интенсивности депол ризо- ванной и пол ризованной составл ющих рассе нного излучени  называетс  коэффициентом депол ризации. /5 , где Т и I - горизонтально и вертикально пол ризованные компоненты рас- се нного излучени . Зар довые свойства поверхности макромолекул белков определ ют их электронную пол ризуемость , котора   вл етс  основным физическим параметром в  влении рэлеев- ского рассе ни . При перезар дке молекул с изменением рН среды резко возрастает интенсивность рассе нного света, св занного с флуктуаци ми концентрации растворов. При этом должны измен тьс  и пол ризованные характеристики среды, св занные с флуктуаци ми ориентации анизотропных молекул. Различный знак производной приведен ; ных на чертеже зависимостей дл  альбумина и т-глобулина может быть объ снен различием в распределении электронной плотности у поверхностных групп белковых макромолекул.

Q Таким образом, предлагаемый способ отличаетс  от прототипа повышенной чувствительностью, а также более высокой точностью определени  изоэлектрической точки белка.

5 При осуществлении данного способа могут быть использованы стандартные установки, примен ющиес  дл  измерени  интенсивности рассе нного света, требуетс  очень малое количество исходного вещества, не требуетс  использовани  охлаждающей системы, падающее на среду излучение не вносит возмущени  и не измен ет параметров белка.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ определени  изоэлектрической точки белка, основанный на измерении рН среды, содержащей белковые макромолекулы , отличающийс  ; тем, что, с целью повышени  чувствительности и точности определени , облучают среду, содержащую белковые макромолекулы, пол ризованным оптическим излучением, регистрируют пол ризованную и депол ризованную компоненты рассе нного света при различных рН среды и различных концентраци х раствора белка, затем определ ют зависимость коэффициента депол ризации, экстрапол ризованного к нулевой концентрации белка, от рН раствора,и по положению экстремума этой зависимости наход т значение рН, соответствующее 5 изоэлектрической точке белка.

   0

   0

   5

   0

   1

   11 рН