SU1561042A1

SU1561042A1 - Способ проведени иммуноанализа

Info

Publication number: SU1561042A1
Application number: SU884363876A
Authority: SU
Inventors: Николай Сергеевич Осин; Наталья Викторовна Лепешкина; Дмитрий Борисович Папковский; Валентина Дмитриевна Румянцева; Захар Бомович Иткин; Гелий Васильевич Пономарев; Александр Павлович Савицкий; Валерий Георгиевич Петухов; Андрей Федорович Миронов; Илья Васильевич Березин
Original assignee: Институт биохимии им.А.Н.Баха АН СССР; Московский институт тонкой химической технологии им.М.В.Ломоносова; Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения
Priority date: 1988-01-14
Filing date: 1988-01-14
Publication date: 1990-04-30

Abstract

Изобретение относитс к биохимии, в частности к способам проведени иммуноанализа. Цель изобретени - увеличение чувствительности способа. Это достигаетс за счет того, что используютс металлопорфирины, способные при ковалентном мечении белков резко увеличивать уровень замедленной флуоресценции, спектрально совпадающей с обычной флуоресценцией. Это дает возможность, возбужда флуоресценцию металлопорфиринов в длинноволновой полосе поглощени и регистриру свечение в той же спектральной области, минимизировать фоновое вли ние фосфоресцирующих примесей, присутствующих в анализируемом образце и в материале кюветы. 1 табл.

Description

Изобретение относитс к биохимии, в частности к способам проведени иммуноанализа.

Целью изобретени вл етс повышение чувствительности способа.

Указанна цель достигаетс тем, что в качестве люминесцирующих металлопорфиринов используют металлопорфирины , обладающие свойством замедленной флуоресценции; при этом возбуждение светом провод т в длинноволновой полосе поглощени металлопорфиринов , а измерение уровн замедленной флуоресценции св завшегос метал- лопорфирина ведут в диапазоне длин волн максимума флуоресценции.

Пример 1. Исследуемую про- бу с диагностируемым объектом - клетками Alcaligenus faecalis в концентрации 1 млн микробных тел/мл обрабатывают гомологичными антителами к Alcaligenus faecalis, приготовленными из сыворотки крови кролика. Антитела , мечены А1(ОН)-копропорфирином- III в соотношении белок/порфирин 1/1 (М). Параллельно провод т обработку исследуемой пробы гетерологич- - ными антителами, меченными А1(ОН)- копропорфирином. Обработку провод т добавлением в пробирки с пробой по 1 мл гомологичных и гетерологичных антител в концентрации 1 мкг/мл. Опытную и

%

Јь ГО

контрольную пробирки затем освобождают от несв завшихс меченых антител центрифугированием при 5000 об/мин в течение 5 мин. Надосадок сливают, а осадок промывают изотоническим расвором , повтор операцию центрифугировани , и ресуспендируют в изотоническом растворе хлорида натри . Зате дополнительно в раствор ввод т кис- лородсв зывающий реагент - сульфит натри в концентрации 3 мг/мл.

1 Параллельно провод т аналогичный эксперимент, в котором используют гомологичные и гетерологичные анти- тела, меченные Pd (2+)-копропорфири- нЬм (прототип).

Регистрацию уровн сигнала опытной и контрольной проб осуществл ют н спектрофлуориметре LS-5 фирмы Pbrkin Elmer. Временна задержка между актом .возбуждени и приемом излучени - 1 мс.

а) Режим измерени замедленной флуоресценции А1(ОН) -копропорфирина длина волны возбуждени 570 нм (длинноволнова полоса поглощени ); ре- г страци при длине волны 578 нм. Превышение сигнала опытной пробы (380 отн.ед.) над контрольной (40 отн.ед.) в 9,5 раз свидетельствует о наличии определ емого микроорганизма в пробе.

б) Регистрацию фосфоресценции Pd (2+)-копропорфирина (прототип) при длине волны 670 нм осуществл ют при возбуждении светом с длиной волны 395 нм (полоса Сорэ). Сигнал опытной пробы 1300 отн.ед., контроль

0

5

0

5

0

ной - 350 отн.ед. Числовое соотношение опыт/контроль 1300/350 равно 3,7.

Пример 2. В лунки полисти- рольного микропланшета дл иммуно- ферментного анализа (Dynatech, США) адсорбируют антитела к определ емому антигену: заливают в каждую лунку по 0,2 мл антител (10 мкг/мл в 0,1 М карбонатном буфере, рН 9,1), инкубируют 1 ч при 37 С и ночь при k С. Затем раствор сливают и промывают лунки буфером ФСБТ (физраствор, рН 7,4, содержащий 0,1% тритона Х-100).

Заливают в 2 р да лунок (опыт и контроль) по 0,2 мл стандартных растворов антигена из Pseudornonas auro- ginosa (1; 0,5; 0,25; 0,12; 0,06; О мкг/мл) и инкубируют при 37°С в течение 1 ч. Затем сливают растворы, промывают лунки 3 раза ФСБТ, заливают во все лунки 1 р да антитела, ме- ченные А1 (ОН)-копропорфирином (20 мкг/мл в ФСБТ), а в лунки второго р да - антитела, меченные Pd-копро- порфирином (20 мкг/мл). После 1-часовой инкубации при 37°С растворы сливают, промывают лунки ФСБТ, заливают по 0,2 мл десорбирующего раствора (3 мМ ЦТАБ). Затем добавл ют в лунки кислородсв зывающий агент сульфит натри (5 мг/мл), перенос т растворы в измерительные кюветы на 0,5 мл и регистрируют замедленную флуоресценцию А1(ОН)-копропорфирина и фосфоресценцию Pd-копропорфирина в услови х, описанных fc примере 1. Результаты приведены в таблице. Чувствительность способа - 0,12 мкг/мл, выше, чем чувствительность способа- прототипа (0,25 кг/мл).

Концентраци антигена 1 0,5 0,25 0,12 I 0,06 О

Claims

формула изобретения Способ проведения иммуноанализа jq путем получения антител или антиге.нов, меченных люминесцирующими соединениями, проведения иммунохимической реакции и детекции специфического Связывания по люминесценции меченого Соединения, отличающийся Тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве люминесцируюших соединений используют металлопорфирины, обладающие свойством замедленной флуоресценции, возбуждение светом проводят в длинноволновой Об -полосе поглощения металлопорфирина, а измерение уровня замедленной флуоресценции ведут в диапазоне длин волн флуоресценции металлопорфирина, при этом задержка между возбуждением и измерением уровня замедленной флуоресценции эквивалентна ) времени ее затухания.