SU1479513A1

SU1479513A1 - Method of producing formate dehydrogenase

Info

Publication number: SU1479513A1
Application number: SU874305717A
Authority: SU
Inventors: Илья Васильевич Березин; Владимир Васильевич Карзанов; Владимир Иванович Тишков; Татьяна Васильевна Авилова; Алексей Михайлович Егоров; Римантас Каролевич Вайткявичюс; Раймонда Йоновна Петкявичене; Антанас-Скайстутис Антанович Глемжа
Original assignee: МГУ им.М.В.Ломоносова; Институт биохимии им.А.Н.Баха; Научно-производственное объединение "Фермент"
Priority date: 1987-07-15
Filing date: 1987-07-15
Publication date: 1989-05-15

Abstract

Изобретение относитс к микробиологической промышленности и может быть использовано дл промышленного получени формиатдегидрогеназы. Целью изобретени вл етс повышение выхода фермента за счет сн ти репрессии его биосинтеза, вызываемого металлами, вход щими в материал ферментера. Культивирование метилотрофных бактерий PSEUDOMONAS SP. 101 ВКМ В-1545Д, продуцирующих формиатдегидрогеназу, осуществл ют на синтетической питательной среде, содержащей источники азота, фосфора, минеральные соли и метанол в качестве единственного источника углерода и энергии, в присутствии 10^-6 - 10^-3 М вольфрамат -иона. Удельна активность достигает 1700 нмоль/мин на 1 мг белка. 2 табл.The invention relates to the microbiological industry and can be used for the industrial production of formate dehydrogenase. The aim of the invention is to increase the yield of the enzyme due to the reduction of the repression of its biosynthesis caused by metals entering the material of the fermenter. Cultivation of methylotrophic bacteria PSEUDOMONAS SP. 101 VKM B-1545D producing formate dehydrogenase are carried out on synthetic nutrient medium containing sources of nitrogen, phosphorus, mineral salts and methanol as the sole source of carbon and energy, in the presence of 10 ^- 6 - 10 ^- 3 M tungstate-ion. The specific activity reaches 1700 nmol / min per 1 mg of protein. 2 tab.

Description

1one

Изобретение относитс к микробиологической промышленности, а именно к способу получени НАД-зависимой формиатдегидрогеназы, и может быть использовано в процессе получени различных физиологически активных соединений (аминокислоты, стероиды, спирты и т. д.) с системой регенерации НАДН на основе формиатдегидрогеназы , дл количественного определени муравьиной кислоты (формиат-ио- на) в сложных биологических смес х (сыворотка крови, культуральные среды , пищевые продукты), дл создани биохимического топливного элемента,The invention relates to the microbiological industry, in particular to a method for producing NAD-dependent formate dehydrogenase, and can be used in the process of obtaining various physiologically active compounds (amino acids, steroids, alcohols, etc.) with a NADH formate dehydrogenase regeneration system, for quantitative determination formic acid (formate-ion) in complex biological mixtures (blood serum, culture media, food products), to create a biochemical fuel cell,

-х|| x |

использующего в качестве топлива метанол или формиат, а также в научных цел х.using methanol or formate as a fuel, as well as for scientific purposes.

Цель изобретени - повышение выхода формиатдегидрогеназы за счет сн ти репрессии биосинтеза фермента под действием легирующих добавок покрыти ферментеров.The purpose of the invention is to increase the yield of formate dehydrogenase by reducing the repression of enzyme biosynthesis under the action of alloying additives of fermentors.

Способ осуществл етс следующим образом.The method is carried out as follows.

Бактерии Pseudomonas sp. (101) ВКМ В-1545Д культивируют на синтетической питательной среде следующего состава, г/л: 2,0, сульфат аммони 2,0; хлорид натри 0,5; сульСОBacteria Pseudomonas sp. (101) VKM B-1545D is cultivated on a synthetic nutrient medium of the following composition, g / l: 2.0, ammonium sulfate 2.0; sodium chloride 0.5; sulSO

флт магни семнводный 0,0/5; растворима соль вольфрамовой кислоты (кали , натри , аммони и т. д.) как источник вольфрамата-иона 10 -10 3М} дистиллированна вода. Среду стерилизуют в течение 20 мин при 1 атм, рН среды после стерилизации 7,2. Отдельно готов т 10%-ный раствор дрожжевого автол зата, который стерилизует в течение 20 мин при 0,5 атм и внос т в среду из расчета 0,1-10 мл на 1 л среды. Метанол не стерилизуют и добавл ют к среде до концентрации 1%. Посевной материал внос т в количестве 2-5%. Культивирование провод т в 100 л ферментере при 28°С,расходе воздуха 0,5:1 в течение 45-52 ч. Удельна активность формиатдегидрогеназыв бесклеточных экстрактах составл ет 1600- 1700 нмоль/мин на 1 мг белка. Выход биомассы 250-300 г сырых клеток.flint magnesium semvodny 0,0 / 5; soluble tungstic acid salt (potassium, sodium, ammonium, etc.) as a source of tungstate-ion 10 -10 3M} distilled water. The medium is sterilized for 20 minutes at 1 atm, the pH of the medium after sterilization is 7.2. Separately, a 10% solution of yeast autocate is prepared, which is sterilized for 20 minutes at 0.5 atm and introduced into the medium at a rate of 0.1-10 ml per liter of medium. Methanol is not sterilized and added to the medium to a concentration of 1%. The seed is introduced in the amount of 2-5%. The cultivation is carried out in a 100 l fermenter at 28 ° C, an air consumption of 0.5: 1 for 45-52 hours. The specific activity of formate dehydrogenase in cell-free extracts is 1600-1700 nmol / min per 1 mg of protein. Biomass yield 250-300 g of raw cells.

Наиболее оптимальной вл етс концентраци вольфрамат-иона от до 10 3М. В указанном диапазоне концентраций удельна активность формиатдегидрогеназы практически одинакова и составл ет 1600- 1700 нмоль/мин на 1 мг белка. При повышении концентрации вольфрамат-иона до М происходит резкое снижение скорости роста самой биомассы. При концентрации вольфрамата менее 10 М увеличени выхода фермента не наблюдаетс .The most optimal concentration of tungstate ion is from up to 10 3M. In the specified concentration range, the specific activity of formate dehydrogenase is almost the same and amounts to 1600-1700 nmol / min per 1 mg of protein. With an increase in the concentration of tungstate ion to M, there is a sharp decrease in the growth rate of the biomass itself. When the tungstate concentration is less than 10 M, no increase in the yield of the enzyme is observed.

Исследование вли ни иондв металлов на биосинтез формиатдегидрогеназы (табл.1) показывает, что большинство из них, почти не вли на общий выход биомассы, вызывает резкое уменьшение активности формиатдегидрогеназы .The study of the influence of ionv metals on the biosynthesis of formate dehydrogenase (Table 1) shows that most of them, having almost no effect on the total biomass yield, cause a sharp decrease in the activity of formate dehydrogenase.

Как было показано с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, снижение активности формиатдегидрогеназы при культивировании в присутствии различных ионов металлов сопровождаетс уменьшением содержани самого фермента в клетках, т. е. эти ионы вызывают репрессию биосинтеза формиатдегидрогеназы. Единственным ионом, который не только не подавл ет биосинтез фермента, а наоборот индуцирует увеличение содержани и уровн активности формиатдегидрогеназы в клетках, вл етс вольфрамат- ион. Такое вли ние вольфрамат-иона на биосинтез формизтдегидрогеназы в метилотровных бактери х в литературAs was shown by polyacrylamide gel electrophoresis, a decrease in the activity of formate dehydrogenase during cultivation in the presence of various metal ions is accompanied by a decrease in the content of the enzyme itself in the cells, i.e., these ions cause repression of the formate dehydrogenase biosynthesis. The only ion that not only does not inhibit enzyme biosynthesis, but rather induces an increase in the content and activity level of formate dehydrogenase in the cells, is a tungstate ion. Such an effect of tungstate-ion on biosynthesis of formazdehydrogenases in methyltraining bacteria in the literature

0 0

ньтх данных не описано. Предполагают, что вольфрлмат-ион каким-то обратом вли ет на процесс утилизации формиа- та клетками.No data is described. It is assumed that a wolframmate ion somehow affects the process of utilization of the formate by cells.

Положительное вли ние вольфрамата на выход формиатдедрогеназы подтвержден на примере ферментеров различной конструкции. При проведении культивировани в 100-литровых фермен-- терах отечественного производства, фирм Электролюкс (Швеци ), Нордон, (Франци ) и в 15-литровом ферментере 5 фирмы Ныо Браунсвик (США) величина удельной активности формиатдегидрогеназы составила 1000, 80, 92 и 410 нмоль/мин на 1 мг белка соответственно . При проведении культивировани в присутствии 10 М вольф5The positive effect of tungstate on formate dehydrogenase yield was confirmed by the example of fermenters of various designs. When cultivating in 100-liter fermenters of domestic production, by Electrolux (Sweden), Nordon, (France) and 15-liter fermenter 5 of Nyo Braunsvik (USA), the specific activity of formate dehydrogenase was 1000, 80, 92 and 410 nmol / min per 1 mg of protein, respectively. When cultured in the presence of 10 M wolf5

0 0

5five

рамата величина удельной активности независимо от типа ферментера составила 1640-1700 нмоль/мин на 1 мг белка. Выход фермента увеличилс на на 70%, а в случае других ферментеров выход возрос в 4-21 раз.The value of specific activity, regardless of the type of fermenter, was 1640–1700 nmol / min per mg of protein. The yield of the enzyme increased by 70%, and in the case of other fermenters, the yield increased 4-21 times.

Изобретение имеет важное значение, поскольку позвол ет проводить крупномасштабное культивирование бакте- 0 рий Pseuclomonas sp. (10.1) ВКМВ-1545Д дл получени формиатдегидрогеназы независимо от марки и объема ферментера с более высоким выходом.The invention is important because it allows large-scale cultivation of the bacteria Pseuclomonas sp. (10.1) VKMB-1545D to obtain formate dehydrogenase, regardless of the brand and volume of the fermenter, with a higher yield.

Изобретение иллюстрируетс следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.

Пример 1. Метилотрофные бактерии Pseudomonas sp. (101) ВКМ В-1545Д культивируют согласно известному способу в 100-литровом ферментере отечественного производства на минеральной среде следующего состава, г/л: , 2,0; сульфат аммони 2,0; хлорид натри 0,5; сульфат магни семиводный 0,025; вода дистиллированна . рН среды после стерилизации 7,2. Во вр ем посева внос т 1% метанола и 0,2 мл 10%-го раствора дрожжевого автолизата на 1 л среды. Посевной материал внос т в количестве 2-3%. Режим ферментации: температура 28°С, расход воздуха 1:1, избыточное давление 0,5 атм, стерилизаци при 120°С в течение 2 ч, паракультуру выращивают 48 ч. Удельна активность формиатдегидрогеназы в бесклеточных экстрактах составл ет 1000 нмоль НАДН/мин на 1 мг белка.Example 1. Methylotrophic bacteria Pseudomonas sp. (101) VKM B-1545D is cultivated according to a known method in a 100-liter fermenter of domestic production in a mineral medium of the following composition, g / l: 2.0; ammonium sulfate 2.0; sodium chloride 0.5; magnesium sulphate, seven-water 0.025; distilled water. pH after sterilization of 7.2. During sowing, 1% methanol and 0.2 ml of a 10% yeast autolysate solution are added per liter of medium. The seed material is introduced in the amount of 2-3%. Fermentation mode: temperature 28 ° C, air flow 1: 1, overpressure 0.5 atm, sterilized at 120 ° C for 2 hours, paraculture grown 48 hours. Specific activity of formate dehydrogenase in cell-free extracts is 1000 nmol NADH / min per 1 mg of protein.

II р и м е р 2. Метилотрофные бактерии Pseudomonas sp. (101) ВКМII p and m e p 2. Methylotrophic bacteria Pseudomonas sp. (101) VKM

00

5five

00

5five

В-1545Д культивируют согласно примеру 1, но в ферментере фирмы Электролюкс (Швеци ). Удельна активность формиатдегидрогеназы в бесклеточных экстрактах составл ет 80 нмоль/мин на 1 мг белка.B-1545D is cultivated according to Example 1, but in an Electrolux (Sweden) fermenter. The specific activity of formate dehydrogenase in cell-free extracts is 80 nmol / min per mg protein.

П р и м е р 3. Метилотрофные бактерии Pseudomonas sp. (1П1) ВКМ В-1545Д культивируют согласно примеру 2, но в минеральную среду перед стерилизацией внос т различные концентрации вольфрамата натри . Вли ние концентраций вольфрамат-иона на выход формиатдегидрогеназы представлен в табл. 2.PRI me R 3. Methylotrophic bacteria Pseudomonas sp. (1P1) VKM B-1545D is cultivated according to Example 2, but various concentrations of sodium tungstate are introduced into the mineral medium before sterilization. The effect of tungstate-ion concentrations on the formate dehydrogenase yield is presented in Table. 2

П р и м е р 4. Метилотрофные бактерии Pseudomonas sp. (101) ВКМ В-1545Д культивируют согласно примеру 1 , но в минеральную срецу перед стерилизацией добавл ют вольфрамат кали в концентрации . Удельна активность формиатдегидрогеназы составл ет 1700 нмоль/мин на мг белка.PRI me R 4. Methylotrophic bacteria Pseudomonas sp. (101) VKM B-1545D is cultivated according to example 1, but potassium tungstate is added to the mineral srets before sterilization. The specific activity of formate dehydrogenase is 1700 nmol / min per mg of protein.

П р и м е р 5. Метилотрофные бактерии Pseudomonas sp. (101) ВКМ В-1545Д культивируют согласно примеру 1 , нов ферментере фирмы Нордон (Франци ). Удельна активность формиатдегидрогеназы составл ет 92 92 нмоль/мин на 1 мг белка.PRI me R 5. Methylotrophic bacteria Pseudomonas sp. (101) VKM B-1545D cultivated according to example 1, a new fermenter company Nordon (France). The specific activity of formate dehydrogenase is 92 92 nmol / min per mg of protein.

П р и м е р 6. Метилотрофные бактерии Pseudomonas sp. (101) ВКМ В-1545Д культивируют согласно примеру 5, но в минеральную среду добав- iл ют вольфрамат аммони в концентрации . Удельна активность формиатдегидрогеназы составл ет 1670 нмоль/мин на 1 мг белка.PRI me R 6. Methylotrophic bacteria Pseudomonas sp. (101) VKM B-1545D is cultivated according to Example 5, but ammonium tungstate in concentration is added to the mineral medium. The specific activity of formate dehydrogenase is 1,670 nmol / min per mg of protein.

П р и м е р 7. Метилотрофные бактерии Pseudomonas sp. (101) ВКМPRI me R 7. Methylotrophic bacteria Pseudomonas sp. (101) VKM

В-1545Д культивируют согласно примеру 1, но в ферментере фирмы Ныо Браунсвик (США). Удельна активность формиатдегидрогеназы составл ет 410 нмоль/мин на 1.мг белка.B-1545D cultivated according to example 1, but in a fermenter company Nyo Braunsvik (USA). The specific activity of formate dehydrogenase is 410 nmol / min per 1.mg protein.

П р и м е р 8. Метилотрофные бактерии Pseudomonas sp. (101) ВКМ В-1545Д культивируют согласно приме-PRI me R 8. Methylotrophic bacteria Pseudomonas sp. (101) VKM B-1545D is cultivated according to application

0 РУ 7, но в минеральную среду добавл ют вольфрамат натри в концентрации . Удельна активность формиатдегидрогеназы составл ет 1640 нмоль/мин на 1 мг белка.0 RU 7, but sodium tungstate in concentration is added to the mineral medium. The specific activity of formate dehydrogenase is 1640 nmol / min per mg of protein.

5 Как следует из результатов экспериментов , приведенных в примерах 1-8, добавление в минеральную среду растворимой соли вольфрамовой кислоты позвол ет повысить выход формиатдео гидрогеназы и сн ть репрессию ее биосинтеза тз любом типе ферментера.5 As follows from the results of the experiments given in examples 1-8, the addition of soluble tungstic acid salt to the mineral medium makes it possible to increase the yield of formatedeo-hydrogenase and remove the repression of its biosynthesis for any type of fermenter.

Claims

Invention Formula

5 A method for producing formate dehydrogenase, predicting the cultivation of the bacteria producing it Pseudomonas sp. VKM B-1545D under aerobic conditions on synthetic nutrient medium containing sources of nitrogen, phosphorus, mineral salts and methyl alcohol as the only source of energy and carbon, characterized in that

5 in order to increase the yield of the target product due to the reduction of the repression of biosynthesis of formate dehydrogenase by doping additives of fermenters' material, a soluble tungstate salt in the concentration of tungstate-ion is added to the medium before it is sterilized.

Table 1.

3

four

Moov

IMO;

1.05 1.13

64 63

eight

Continuation of table 1

Table 2