SU577229A1

SU577229A1 - Method of preparing hexokinase

Info

Publication number: SU577229A1
Application number: SU7602381622A
Authority: SU
Inventors: Зайга Арвидовна Виестуре; Рита Яновна Эзис; Майя Андреевна Озолиня; Айна Фрицевна Лидере
Original assignee: Предприятие П/Я М-5043
Priority date: 1976-07-05
Filing date: 1976-07-05
Publication date: 1977-10-25

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕКСОКИНАЗЫ (54) METHOD FOR OBTAINING HEXOKINASE

1one

Изобрете5ше отнсюитс к микробиологической промышленности, а именно к способам получени фермента гексокиназы, примен емого в мопекуп рной биологии и медицине.The invention relates to the microbiological industry, in particular to methods for producing the enzyme hexokinase used in motor biology and medicine.

Известен способ получени ксркииазы § из хлебопекарных дрожжей, предусматривающий плазм олиз дрожжей толуолом и осаждение фермента сульфатом аммони TlJПри этом исходна активность гексоки назы а первоначальном экстракте исходной ю биомассы составл ет 4 ед/мг белка. Активность гексокиназы после осаждени супьфатом аммони равна 6 ед/мг белка.A known method for the production of krkiazyase from baking yeast, which provides for plasma olysis of yeast with toluene and precipitating the enzyme with ammonium sulfate TlJ. At the same time, the initial activity of hexoxide in the initial extract of the original biomass is 4 u / mg protein. The hexokinase activity after precipitation with ammonium phosphate is 6 U / mg protein.

Однако активность гексокиназы зависит от активности гексокиназы в биомассе дрож-и жей..However, the activity of hexokinase depends on the activity of hexokinase in the biomass of yeast ..

Цель изобретени - интенсификаци rjpoаесса биосинтеза гексокиназы и увеличение активности фермента.The purpose of the invention is to intensify the rjpoaess of the hexokinase biosynthesis and to increase the activity of the enzyme.

Дл достижени поставленной цели перед плазмолизом дрожжи культивируют при аэрдции на питательной среде, содержащей фосфат кали и сернокислый магний в течение 1-3 ч, затем в питательную среду добавл ют индук-тор гексокиназы- глюкозу в количестве 10-,25In order to achieve this goal, before the plasmolysis, the yeast is cultivated by aerials on a nutrient medium containing potassium phosphate and magnesium sulphate for 1–3 hours, then an inducer of hexokinase, glucose, in an amount of 10–25, is added to the nutrient medium.

15% и продолжают процесс в течение 0,5-1 15% and continue the process for 0.5-1

При этом фосфат кали ввод т враствор в количестве 2,7%, а сульфат магни -0,5 %At the same time, potassium phosphate is introduced into the solution in the amount of 2.7%, and magnesium sulfate is 0.5%.

Дрожжи культивируют при. 30°С и рН 5-7 Пр предлагаем ому способу перед акстракций толуолом осуществл ют культивирование ис- ходной биомассы дрожжей в растворе фосфата кали с добавлением солей магни при 30®С, рР 5-7 и режиме аэрации 0,5-1 (воэдух , культуральна жидкость) в течение 1-3 ч, затем добавл ют индуктор гексокиназы-глюкозу в концентрации 10-15% и пр цесс продолжают в течение 0,5-1 ч.Yeast is cultivated at. 30 ° С and pH 5-7. The proposed method before cultivation with toluene is the cultivation of the initial biomass of yeast in a solution of potassium phosphate with the addition of magnesium salts at 30 ° C, pR 5-7 and aeration mode of 0.5-1 , culture fluid) for 1–3 h, then hexokinase glucose inducer is added at a concentration of 10–15% and the process continues for 0.5–1 h.

При проведении .культивировани биомассы дрожжей с активностью 0,75 ед/мг белка получают биомассу дрожжей с активностью 6,2 белка.When cultivating yeast biomass with an activity of 0.75 U / mg protein, yeast biomass with an activity of 6.2 protein is obtained.

Повышение активности .гекссжиназы npt исходит за счет культивировани исходной биомассы дрожжей. Культивирование исходной биомассы дрожжей провод т в две стадии . На первой стадии введением фосфата кали и солей магни происходит активаци ферментных систем клетки, в том числе ферментов цикла гликолиза. Это достигаетс The increase in activity of the heptinjase npt comes from the cultivation of the initial yeast biomass. The cultivation of the initial yeast biomass is carried out in two stages. In the first stage, the introduction of potassium phosphate and magnesium salts activates cell enzyme systems, including the enzymes of the glycolysis cycle. This is achieved

путем частичного и обратимого блокировани окислительных железоферментов дрожжей, в результате чего flbfxaiffle клетки частично тормозитс и поэтому активизируетс анаэробна фаза дыхани . На второй стадии бла годар добавлению глюкозы в качестве индуктора активности гаксокиназы в ферментационной среде осуществл етс следующа реакци :by partially and reversibly blocking the yeast oxidative iron enzymes, with the result that the flbfxaiffle cells are partially inhibited and therefore the anaerobic respiration phase is activated. In the second stage, thanks to the addition of glucose as an inducer of the activity of goxokinase in the fermentation medium, the following reaction is carried out:

Д-глюкоза + АТФ гексокинааа Д-глюкоао-бфсхфат + АДФ.D-glucose + ATP hexokinanaa D-glucoao-bfshfat + ADP.

Таким образом по предлагаемому способ провод т еторичное культивирование исходного дрожжевого сырь . Биомассу дрожжей (500 г йрессованных дрожжей на 1 л среды) суспендируют, в растворе фосфата кали (2,7% KHgPO) и солей магни (О,5 Мй50 -7НдО) и при непрерывном перемешивании и аерации культивируют 2-6 ч. Температура культивировани от 25 до 32 рН среды 5,0-7,0, режим аэрации 0,5:1 (воздух: культуральна жидксх;ть). Затем к ферментационной среде добавл ют глюкозу в концентраци х 10-15%, Процесс культивировани продолжают еще ЗО-бО мин. Активность гексокиназы в биомассе дрожжей составл ет 8,2 ед/мг белка. Дрожжи плаз- молизируют толуолом и экстракт фракционируют сульфатом аммони .Thus, according to the proposed method, the ethereal cultivation of the raw yeast raw material is carried out. Yeast biomass (500 g of pressed yeast per 1 l of medium) is suspended, in a solution of potassium phosphate (2.7% KHgPO) and magnesium salts (O, 5 My 50 -7 H 2 O) and with continuous stirring and aeration, cultured for 2-6 hours. from 25 to 32 pH of the medium 5.0-7.0, aeration mode 0.5: 1 (air: liquid culture; be). Then, glucose in concentrations of 10–15% is added to the fermentation medium. The culture process is continued for 30 min. The hexokinase activity in yeast biomass is 8.2 U / mg protein. The yeast is plasmolyzed with toluene and the extract is fractionated with ammonium sulfate.

Предлагаемый способ иллюстрируетс примерами его выполнени .The proposed method is illustrated by examples of its implementation.

Пример.В качестве исходного CfiipbH используют биомассу хлебопекарных дрожжей Sci ОС ha thorny се5 cereviaia Е, Прессованные дрожжи в количестве 1 500 г с активностью гексокиназы 0,69 ед/мг белка подвергают вторичному культивированию в реакторе емкостью 10,0 л. В первой стадии культивировани примен етс следую . пшй состав питательной среды в г: 81.0 , 15,OMg50j7H20 1.5 воды.Example. As the initial CfiipbH, the biomass of the Sci O bakery yeast ha thorny ce5 cereviaia E is used. Pressed yeast in an amount of 1,500 g with a hexokinase activity of 0.69 u / mg protein is subjected to secondary cultivation in a reactor with a capacity of 10.0 l. In the first stage of cultivation, the following is applied. The composition of the nutrient medium in g: 81.0, 15, OMg50j7H20 1.5 water.

Температура культивировани , В реакторе и распределитель подаютCultivation temperature, In the reactor and the distributor serves

стерильный воздух в количестве 1,5 л/мин, Культуральную жидкость перемешивают со скоростью мешалки 600 об/мин.sterile air in the amount of 1.5 l / min, the culture fluid is mixed with a stirrer speed of 600 rpm.

После 2 ч начинают вторую стадию культивировани биомассы дрожжей и в реактор добавл ют 300 г глюкозы. (После этого процесс культивировани дрожжей при данном режиме продолжают 30 мин.After 2 hours, the second stage of yeast biomass cultivation begins and 300 g of glucose are added to the reactor. (After this, the process of cultivating the yeast under this regime continues for 30 min.

Полученную биомассу дрожжей отдел ют ог культуральной жидкости на вакуумном фильтре. Концентраци гексоциназы в биомассе составл ет 8,2 ед/мг белка. В сравнении с исходным сырьем активность гексо киназы повышаетс от 0,69 до 8,2 ед/мг белка.The obtained yeast biomass is separated by a culture liquid on a vacuum filter. The concentration of hexacinase in biomass is 8.2 U / mg protein. In comparison with the feedstock, the activity of hexo kinase is increased from 0.69 to 8.2 u / mg protein.

Дрожжи плазмолиаируют толуолом и экс-ртракт фракционируют сульфатом аммони . Получают ферментативную активность гексо киназы 14,2 ед/мг белка.The yeast is plasmolylated with toluene and the extract is fractionated with ammonium sulfate. An enzymatic activity of 14.2 units / mg of hexoin kinase is obtained.

Пример 2, В качестве исходногосырь используют биомассу спиртных арож «eEiSaccha omyces cei evisiaHj Пре 5сованные дрожжи в количеств 5ОО г с активностью гексокиназы 0,75 ед/ мг белка подвергают культивированию в реакторе емкостью 10 л. В первой стадии культивировани I примен етс следующий состав питательной среды -в г: 81,0 KHjPO , 15,0 , 1,5 л вода,Example 2 As a source of organic matter, aeroge “eEiSaccha omyces cei evisiaHj” biomass was used. Pre-dried yeast in quantities of 5OO g with a hexokinase activity of 0.75 units / mg of protein was cultured in a 10-liter reactor. In the first stage of cultivation I, the following nutrient composition is used — in g: 81.0 KHjPO, 15.0, 1.5 l water,

Температура культивировани 30 С. В растворе через распределитель подают стерильный воздух в количестве 1,5 л/мин. Культуральную жидкость перемешивают со скоростью мешалки 1 2ОО об/мин. После 3 ч начинают вторую стадию культивировани биомассы дрожжей и в реактор добавл ют 450 г глюкозы. После чего процесс культивировани дрожжей продолжают 1ч.The cultivation temperature is 30 C. In the solution, sterile air is fed in the amount of 1.5 l / min through the distributor. The culture fluid is stirred at a stirrer speed of 1 2 RPM. After 3 hours, the second stage of yeast biomass cultivation is started and 450 g of glucose is added to the reactor. After that, the yeast cultivation process is continued for 1 hour.

Полученную биомассу дрожжей отдел ют от культуральной жидкости на вакуумном фильтре. Концентраци гексокивазы в биомасс составл ет 7,9 ед/мг белка. Гексоки азу из биомассы дрожжей выдел ют как в примере 1.The obtained yeast biomass is separated from the culture fluid on a vacuum filter. The concentration of hexokivase in biomass is 7.9 U / mg protein. Hexases from yeast biomass are isolated as in Example 1.

Предложенный способ обеспечивает повышение активности гексокиназы в биомассе дрожжей до 7,9- В,2 ед/мг белка. В сравнении с исходным сырьем активность повышаетс от 0,69 ед/мг белка до 8,2 ед/м белка и от 0,75 ед/мг белка до 7,9 ед/мг белка.The proposed method provides an increase in the activity of hexokinase in yeast biomass to 7.9 V, 2 units / mg protein. Compared to the feedstock, the activity is increased from 0.69 U / mg protein to 8.2 U / m protein and from 0.75 U / mg protein to 7.9 U / mg protein.

Claims

Invention Formula

1, a method for producing hexokinase from yeast biomass, which involves plasmamotor of yeast by toluene and precipitating the enzyme with ammonium sulfate, characterized in that, in order to intensify the process of hexokinase biosynthesis and increase the activity of the enzyme, before plasmolysis, the yeast is cultured by aeration on a nutrient medium, and a virus, Kali

and magnesium sulphate for 1-3 h, then hexokinase inducer, a glucose in an amount of 10-15%, is added to the nutrient medium and the process continues for 0.5-1 h.

2. A method according to claim 1, characterized in that the potassium phosphate is introduced into a plant.

a thief in (quantity. 2.7%, and magnesium sulphate - Sources of information taken into consideration, 5%. During examination:

3. The method according to claim 1, of which is that the yeast is cultivated at 1. AHnaJs N.J. Acdda igu of Sieitces,

BO ° C and pH 5-7.5 1068, 151. 1, 307.