SU1477742A1

SU1477742A1 - Method of extracting endonuclease from serratia marcescens culture fluid

Info

Publication number: SU1477742A1
Application number: SU874306951A
Authority: SU
Inventors: Мария Николаевна Филимонова; Инна Борисовна Лещинская; Римма Борисовна Пономарева; Владимир Иванович Гребеньков; Валентина Николаевна Жбанова; Татьяна Дмитриевна Муравьева; Клавдия Павловна Папукова
Original assignee: Казанский государственный университет им.В.И.Ульянова-Ленина; Вышневолоцкий завод ферментных препаратов; Институт Высокомолекулярных Соединений Ан Ссср
Priority date: 1987-06-26
Filing date: 1987-06-26
Publication date: 1989-05-07

Abstract

Эндонуклеаза, выдел ема из культуральной жидкости SERRATIA MARCESCENS, гидролизующа нуклеиновые кислоты до ди-, три-, тетра-, и олигонуклеотидов, примен етс дл лечени и профилактики вирусного паралича пчел, дл изучени структуры хроматина, может служить моделью дл исследовани вли ни одновременного наличи сульфгидрильных и дисульфидных групп на конформационные переходы молекул. Цель изобретени - упрощение и ускорение процесса. Способ выделени эндонуклеазы из культуральной жидкости S.MARCESCENS включает катионообменную хроматографию на бикарбе с сорбцией фермента при рН 5,0-5,5 и десорбцией при рН 8,0-8,5 в присутствии 0,35-0,40 М хлористого натри . Способ позвол ет за 40-45 ч из 100 л культуральной жидкости выделить 70-110 г препарата, содержащего 7-14 г белка без уменьшени степени чистоты препарата с сокращением времени выделени фермента в 8-10 раз и упрощением процесса по сравнению с известным. 1 з.п. ф-лы.Endonuclease secreted from SERRATIA MARCESCENS culture fluid, hydrolyzing nucleic acids to di-, tri-, tetra-, and oligonucleotides, is used to treat and prevent viral paralysis of bees to study the structure of chromatin, can be used as a model for studying the effect of simultaneous sulfhydryl and disulfide groups on conformational transitions of molecules. The purpose of the invention is to simplify and speed up the process. The method for isolating the endonuclease from the S.MARCESCENS culture liquid includes cation-exchange bicarb chromatography with sorption of the enzyme at pH 5.0-5.5 and desorption at pH 8.0-8.5 in the presence of 0.35-0.40 M sodium chloride. The method allows for 40-45 hours from 100 l of culture liquid to extract 70-110 g of the preparation containing 7-14 g of protein without reducing the purity of the preparation with reducing the enzyme release time by 8-10 times and simplifying the process as compared to the known. 1 hp f-ly.

Description

30 л/ч) при соотношении белок:сорбент не более 700 ед. Agjp : 1 см3 био- карба. По завершении сорбции колонку промывают 25,5 л (15-кратный объем) - 0,05 М трис-HCl буфера, рН 8,5. За- . тем элюируют фермент 8,5 л (5-кратный объем) 0,10 М трис-HCt буфера рН 8,5, содержащего 0,40 И хлористого натри . Полученный элюат высушивают при дробном режиме. При этом выход фермента составл ет 65-70%, активность не менее 30000 ед.акт./мг белка. Из 100 л культуральной жидкости удаетс выделить более 100 г препарата, содержащего более.10% белка.30 l / h) with a protein: sorbent ratio of not more than 700 units. Agjp: 1 cm3 bio-carba. Upon completion of the sorption, the column is washed with 25.5 l (15-fold volume) - 0.05 M Tris-HCl buffer, pH 8.5. Behind- . The enzyme 8.5 eluted (5-fold volume), 0.10 M Tris-HCt buffer pH 8.5, containing 0.40 AND sodium chloride. The resulting eluate is dried in fractional mode. The yield of the enzyme is 65-70%, the activity is not less than 30,000 units of act. / Mg of protein. More than 100 g of a preparation containing more than 10% protein can be isolated from 100 liters of culture liquid.

Пример 2. Биокарб Д-241 уравновешивают 0,10 М натрий-ацетат- ным буфером, рН 5,0 и помещают в колонку как в примере 1. Культураль- ную жидкость подкисл ют концентрированной уксусной кислотой до рН 5,0 и помещают на колонку как в примере 1. Сорбци эндонуклеазы составл ет 90-95%. Промывку колонки и элюцию фермента провод т как в примере 1. При этом выход фермента составл ет 60-65%, активность около 25000 ед.акт./ /мг белка.Example 2. Biocarb D-241 is equilibrated with 0.10 M sodium acetate buffer, pH 5.0 and placed in a column as in Example 1. The culture fluid is acidified with concentrated acetic acid to pH 5.0 and placed on a column. as in Example 1. The sorption of the endonuclease is 90-95%. Column washing and elution of the enzyme is carried out as in Example 1. The yield of the enzyme is 60-65%, the activity is about 25,000 units of act. / Mg of protein.

П р и м е р 3, Биокарб Д-24 уравновешивают 0,10 М натрий-ацетатным буфером, рН 5,5 и помещают в колонку как в примере 1. Культуральную жидкость подкисл ют концентрированной уксусной кислотой до рН 5,5 и помещают на колонку как в примере 1. Сорбци эндонуклеазы составл ет 40-87%. Промывку колонки и элюцию фермента провод т как в примере 1. При этом выход фермента составл ет 35-65%, активность около 30000 ед„акт./мгExample 3, Biocarb D-24 equilibrated with 0.10 M sodium acetate buffer, pH 5.5, and placed in a column as in Example 1. The culture fluid was acidified with concentrated acetic acid to pH 5.5 and placed on a column as in Example 1. The endonuclease sorption is 40-87%. The column was washed and the elution of the enzyme was carried out as in Example 1. The yield of the enzyme is 35-65%, the activity is about 30,000 units „act./mg.

t белка.t protein.

Пример 4. Биокарб Д-24 уравновешивают и помещают в колонку как в примере 1. Культуральную жидкость нанос т на колонку как в примере 1.Example 4. Biocarb D-24 is equilibrated and placed in a column as in Example 1. The culture fluid is applied to the column as in Example 1.

Промывку колонки провод т как в примере 1. Фермент элюируют 0,1 М трис-HCl буфером, рН 8,0, содержащим 0,35 М хлористого натри . При этом выход фермента составл ет 60-65%, активность.более 30000 ед.акт./мг белка.The column was washed as in Example 1. The enzyme was eluted with 0.1 M Tris-HCl buffer, pH 8.0, containing 0.35 M sodium chloride. At the same time, the yield of the enzyme is 60-65%, the activity. More than 30,000 units of act. / Mg of protein.

Пример 5. Биокарб Д-24Example 5. Biocarb D-24

уравновешивают и помещают а колонку как в примере 1. Культуральную жидкость нанос т на колонку как в примере 1. Промывку колонки провод т как в примере 1. Фермент элюируют 0,1 Мbalance and place the column as in Example 1. The culture fluid is applied to the column as in Example 1. The column is washed as in Example 1. The enzyme is eluted with 0.1 M

трис-HCl буфером рН 8,5, содержащим 0,35 М хлористого натри . При этом выход фермента составл ет 65-70%. активность более 30000 ед.акт./мг белка,Tris-HCl buffer pH 8.5, containing 0.35 M sodium chloride. The yield of the enzyme is 65-70%. activity of more than 30,000 units of act. / mg of protein,

При осуществлении способа в услови х , отличающихс от описанных, выход целевого продукта снижаетс .By implementing the method under conditions different from those described, the yield of the desired product is reduced.

Реализаци способа обеспечивает упрощение и ускорение процесса.The implementation of the method provides a simplified and accelerated process.

Claims

Invention Formula

one ,. A method for isolating endonuclease from the culture fluid of Serratia marcescens, including purification by ion-exchange chromatography, which is aimed at simplifying and shortening the process, ion-exchange chromatography is directly applied to the Culture fluid, and ion-exchange chromatography is performed on the Biocarb exchanger D -24 with sorption of the target product at pH 5.0-5.5 and desorption in buffer at pH 8.0-8.5 in the presence of 0.35-0.40 M sodium chloride.

2. The method according to claim. Characterized in that for desorption, 0, 1 1-1 is used as the buffer.

five

Tris-HCl.