SU1367866A3 - Способ определени активности химотрипсина или трипсина в кале - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биохимии, точнее к медицинской энзимологии, предназначено дл  определени  активности трипсина иди химотрипсина в кале при диагностике хронического nanjc- реатита. Цель изобретени  - упрощение способа путем сокращени  числа стадий. Дп  этого измер ют скорость расщеплени  пригодного субстрата суспензии кала в водной или водно-органической среде, кал суспендируют в присутствии поверхностно-активного вещества (ПАВ) в концентра1щи 0,1- 3 мас,% и водорастворимых солей с ионной силой 20-1000 ммоль/л, рН 7,0- 11,0. В качестве ПАВ используют, например, анионные или амфолитичес- кие (производные глицерина с бетаино- вой структурой, сульфобетаины, лецитины ) ПАВ (алкенсульфонаты, олефино- вые сульфонаты, алкилнафталинсуль- фонаты, алкнлсульфаты, сульфаты: простых эфиров, жирных кислот, соли жирных и холевых кислот). Дл  фотометрического определени  активности трипсина и химотрипсина целесообразно суспензию пробы центрифугировать перед измерением вплоть до осветлени . 6 табл. СО

Description

00

сн

Изобретение относитс  к биохимии., а именно к медицинской энзимологии, и может быть использовано дл  определени  активности трипсина или хи- мотрипсина в кале, проводимого при диагностике хронического панкреатита Цель изобретени  - упрощение способа за счет сокращени  числа стадий .

Способ осуществл етс  следующим образом.

Определ ют активность химот рип- сина или трипсина в кале путем измерени  скорости расщеплени  пригодного субстрата суспензией кала в водной или водно-органической среде, при этом кал суспендируют в присутствии поверхностно-активного вещества в концентрации 0,1-3 мас.% и водорастворимых солей с ионной силой 20-1000 ммоль /л при рН 7,,0о

Измерение скорости расщеплени  субстрата можно осуществл ть любым известным способом, например путем титровани  вьщелившейс  аминокислоты с помощью раствора щелочи на рН стате

В присутствии поверхностно-активного вещества солюбилизируетс  более 90 % ферментной активности, скорость реакции расщеплени  субстрата значительно повьшаетс , а кажущеес  значение К дл  субстрата снижаетс  (фактор активации равен 2-10)о Благодар  этому .можно также фотометрическим путем быстро, просто, точно и с незначительным расходом субстрата измер ть его скорость расщеплени  В качестве поверхностно-активного средства можно использовать любое пригодное поверхностно-активное вещество , например анионные или амфо- литические поверхностно-активные вещества , предпочтительно неионогенные и особенно катионные поверхностно- активные вещества.

Анионные поверхностно-активные вещества представл ют собой например , алкансульфонаты, олефиновые сульфонаты, в том числе куменсуль- фонат, сульфонаты сложных эфиров, ал киларилсульфонаты, алкилбензолсуль- фонаты типа додецилбензолсульфона- та и апкилнафталинсульфонаты; апкшт- сульфаты, в том числе лаурилсульфат натри , сульфаты простых эфиров ипи сульфаты жирных спиртов, соли жирных кислот и холевых кислот. Амфо- литические поверхностно-активные вешества представл ют собой таковые с . анионоактивными и катионоактивными гидрофильными группами, например произ водные глицерина с бетаиновой структурой , сульфобетаины и лецитины,Неионогенные поверхностно-активные вещества представл ют собой, например, простые полиэфирыJ алкипфенолполи- гликолевые простые эфиры и другие продукты этоксилировани  жирных кислот , амидов жирных кислот, жирных аминов и жирных спиртов, в том числе этоксилированньш лауриловьй спирт,

полимеры из пропилена с этипенокси- дом, полиоксиэтиленалкиловые простые эфиры или полиоксиэтиленнонштфенило- вые простые эфиры, полиоксиэтилен- сорбитан-моно-олеат или лаурат, про- дукты присоединени  пропиленоксида с этилендиамином и этиленоксидом, окиси аминов и сложные эфиры жирных кислот многоатомных спиртов,полиглико- левые простые эфиры спирта, получаемого из сала.Катионные поверхностно- активные вещества представл ют собой, например, линейные и циклические аммониевые соединени , в том числе чис-. К-цетил-К-этил-морфолинметосульфат,

бензальконийхлориды и другие четвер- тичные аммониевые соли, соли аминов, соли пиридини  или четвертичные (жир- ньй амин) - полигликолевые простые эфиры,

Выбор оптимального пригодного поверхностно-активного вещества зависит также от прочих реакционных условий , в особенности от рода фермента и субстрата, от рода и концентрации солей, а также от рН среды.

Из пригодных дп  предлагаемого способа катионных детергентов сильным активирзтощим эффектом обладают аммониевые соединени , предпочтительно формулы R,R,H (.,,, где R,- предпочтительно алкильный остаток с 9-14 С-атомами, главным образом лаурил и цетил; R.. - предпочтительно низший алкильньй остаток с 1-5 С-атомами или аралкильньй остаток, или оксиалкильньй остаток, особенно метил или бензил, а также алкшшириди- ниевые соли, предпочтительно с 12- 18 атомами углерода в алкипьном остатке , например лаурилпиридинийхлорид, лаурилпиридинийсульфат, особенно гек- садецилпиридинийхлорид. Особенно хорошо пригодным дл  предлагаемого способа поверхностно-активгазтм веществом  вл етс  лаурил-триметил-аммо- нийхлорид.

Концентраци  пробы кала в суспензии составл ет 0,2-2 %.

Используемый дл  суспензии кала раствор дл  гомогенизировани  нар ду с поверхностно-активным средством содержит еще одну или несколько водорастворимых солей, например хлориды или сульфаты щелочных и/или ще- лочно-земельных металлов. Особенно целесообразно содержание NaCl 00- 1000 ммоль/л или CaClj 20 - 500 ммоль/л, или комбинаци  обеих солей в пределах указанных концентраций . Пригодны также органические соли, например ацетаты или цитраты, а также соли других катионов. Соли должны быть в концентрации, котора  соответствует ионной силе 20 - 1000 ммоль/л. При этом установлено, что благодар  содержащему поверхностно-активное вещество и соли раствору дл  гомогенизировани  происходит 25 испытуемой суспензии к 2 мл раство- сверхаддитивное увеличение активно- ра реактива) и титрометрически или

сти фермента (повышение скорости реакции ), Т ое. увеличение, большее суммы величин, полученных в присутствии поверхностно-активного вещества или солей. Затем лишь с помощью комбинации соли С детергентом можно пе- ревести значительную часть св занного с частицами фермента трипсина или химотрипсина в раствор.

В качестве субстрата можно использовать любой известный субстрат дл  определени  активности химотрипсина или трипсина в кале известными методами .

Дл  определени  химотрипсина фотометрически особенно пригодным прежде всего в отношении водорастворимо- сти, стабильности, значени  К (Vi и константы скорости оказалс  Аланил- аланил-фенилаланил-п-нитроанилид, особенно сук1щнил-аланш1-аланил-про- лил-фенилаланил-нитроанилид и МеО- сукцинил-аргинил-пролил-тирозил-п- нитроанилид. Хорошо: пригодным субстратом дл  определени  активности трипсина  вл етс  хромоцим TRY (карбобензокси-валил-глицил-аргинил- п-нитроанилид-ацетат).

Дл  приготовлени  раствора реактива субстрат раствор ют в воде или в смеси воды с органическим растворителем . Органический растворитель при этом служит в качестве агента

фотометрически определ ют скорость расщеплени . При выборе количества и пытуемой суспензии (разбавление проб

30 кала) руководствуютс  достижением хо рошо измеримых значений, например, экстинкции/мин прежде всего в зависи мости от ожидаемой активности фермен та. На осн овании увеличени  чувстви .jj- тельности за счет использовани  дете гента количество пробы может выбират с  настолько малым, что собственное поглощение суспендированного твердого вещества незначительно и таким

40 образом становитс  возможным фотомет рическое измерение в присутствии сус пензии. Рекомендуетс  добавление к растворам буферной смеси дл  установлени  значени  рН 3-10, например,

45 трис-буфера, глицинового буфера или глиЦилглицинового буфера. Концентраци  буфера составл ет в общем 10- 1000 ммоль/л, оптимально 50 - 200 ммоль/л,

50

Измерение можно осуществл ть вруч ную или с помощью автоматического анализатора. Дл  фотометрического определени  активности и в особенно- gg сти дл  автоматического фотометричес кого измерени  (определени  экстинк- ции) целесообразно суспензию пробы центрифугировать перед измерением вплоть до осветлени .

растворени  дл  субстрата и представл ет собой, например, ацетонитрил, диметилсульфоксид, ацетон или метанол . Раствор реактива содержит предпочтительно также еще те же соли , что используютс  дл  раствора при гомогенизации. Концентраци  этих солей в растворе реактива в общем ниже концентрации в растворе дл  гомогенизировани . Обща  концентраци  солей составл ет предпочтительно примерно 10 - 500 ммоль/л, например 250 ммоль/л хлорида натри  и

20 ммоль/л хлорида кальци .

Дл  проведени  измерени  определенное количество суспензии пробы кала в растворе дл  гомогенизировани  или определенное количество полученного путем центрифугировани  вплоть до осветлени  верхнего сло  жидкости после центрифугировани  добавл ют к определенному количеству раствора реактива (например, 0,1 мл

фотометрически определ ют скорость расщеплени . При выборе количества испытуемой суспензии (разбавление пробы

кала) руководствуютс  достижением хорошо измеримых значений, например, экстинкции/мин прежде всего в зависимости от ожидаемой активности фермента . На осн овании увеличени  чувствительности за счет использовани  детергента количество пробы может выбиратьс  настолько малым, что собственное поглощение суспендированного твердого вещества незначительно и таким

образом становитс  возможным фотометическое измерение в присутствии суспензии . Рекомендуетс  добавление к растворам буферной смеси дл  устаовлени  значени  рН 3-10, например,

трис-буфера, глицинового буфера или глиЦилглицинового буфера. Концентраи  буфера составл ет в общем 10- 1000 ммоль/л, оптимально 50 - 00 ммоль/л,

Измерение можно осуществл ть вручную или с помощью автоматического анализатора. Дл  фотометрического определени  активности и в особенно- сти дл  автоматического фотометрического измерени  (определени  экстинк- ции) целесообразно суспензию пробы центрифугировать перед измерением вплоть до осветлени .

Пример 1. Определение активности химотрипсина.

Раствор дл  гомогенизировани :

NaCl 2,9 г (500 ммоль/л)

CaClj 1,1 г (100 ммоль/л)

Лаурилтрнметиаммонийхпорид

(33%-ный) 2,0 г (0,7 %)

Дистиллиро

ванна 

вода До 100 мл

Раствор реактива:

Сукцинил-аланилаланил-пролилфенилаланил-пнитроанилид 2 9,5 мг

(0,5 ммоль/л)

NaCl1,46 г

(250 ммоль/л)

CaClj222 мг

(20 ммоль/л)

Буфер трис-HCl,

рН 9,060 ммоль/л до

общего объема 100 мл

Гомогенизирование пробы.

Примерно 100 мг пробы кала смешивают со 100-кратным весовым количеством раствора дл  гомогенизировани  и в пригодном сосуде гомогенизируют до высокодисперсной суспензии.

Осуществление измерени .

В спектрофотометрическую кювету с длиной оптического пути 1 см пипеткой внос т 2 мл раствора реактива , термостатитруют при 25°С и смешивают с 0,1 мл гомогената пробы. После кратковременного перемешивани  определ ют прирост зкстинкции в минуту при 405 нм. Дл  расчета активности фермента на 1 т кала прирост зкс- тшщик/мин при 405 нм нужно умножить на фактор 212.

I

Пример 2. Приготовление раствора дл  гомогенизировани  и раствора реактива, а также гомогенизи- - рование пробы осуществл ют по примеру 1. Затем суспензию центрифугируют до осветлени  раствора.Из верхней части жидкости после центрифугировани  отбирают аликвотную часть и определ ют активность фермента либо вручную (по примеру 1), либо при использовании автоматического анализатора .

678666

ПримерЗ. а Приготовление раствора дл  гомогенизировани .

Готов т водный раствор из следу- g ющих составных частей: трис-НС1-буфер,

рН 9,060 ммоль/л

NaCl250 ммоль/л

CaClj20 ммоль/л

10 Лаурил-триметиламмонийхлорид 0,6 % Приготовление раствора реактива, гомогенизирование пробы и осуществление измерени  осуществл ют соглас- 15 но примеру 1.

Полученные данные по активности химотрипсина в пробах кала представлены в табл.1.

Пример4. Приготовление раст- 20 вора дл  гомогенизировани  аналогично примеру 1.

Приготовление раствора реактива. Водный раствор готов т из следзто- щих составных частей, ммоль/л -25 Аланил-аланилфенилаланш1-п-нит- роанилид2

NaCl250

CaCl,

20

60

трис-НС1-буфер,

рН 9

Гомогенизаци  пробы.

200 мг пробы кала смешивают с 10 мл раствора дл  гомогенизировани  и обрабатывают в пригодном сосуде вплоть до образовани  высокодис- персной суспензии.

Осуществление измерени . В кювету с длиной оптического пути 1 см пипеткой внос т 1 мл раствора реактива, термостатируют при 25°С и смешивают с 0,02 мл гомогената пробы . После кратковременного перемеши- вани  определ ют прирост коэффициента экстинкции при 405 им Активность составл ет 45 мЕд/мин.

Пример5. Приготовление раствора дл  гомогенизировани  аналогич- но примеру 1.

Приготовление раствора реактива. Готов т водный раствор из следующих составных частей, ммоль/л:

3-Карбометоксипро- пионш1-1-аргинилЬ-пролил-Ь-тиро3ин- п-нитроанилид-гидро- хлорид 0,5

NaCl250

CaCIj20

трис-НС1-буфер,

рН 9,060

Гомогенизирование и измерение осу ществл ют согласно примеру 1

Активность составл ет 148 мЕд/мин

П р и м е р 6, Определение активности трипсина.

Раствор дл  гомогенизировани  го тов т аналогично примеру 1.

Приготовление раствора реактива

Готов т водный раствор из следующих составных частей, ммоль/л:

КарбобейзоксиЬ-валил-Ь-глицилL-аргинин-пнитроаннпид-ацетат 5

NaCl250

CaCl

г

20

50 г/л (5%) 500 ммоль/л 100 ммоль/л

трис-НС1-буфер,

рН 9,060

Гомогенизирование и измерение осуществл ют согласно примеру 1.

Активность трипсина составл ет 8 мЕд/мин.

Пример 7. Определение активности химотрипсина.

На фильтровальную бумагу нанос т пробу кала, затем обрабатывают ее 0,05 .мл водного солюбилйзирующего раствора , состо щего из:

Лаурилтриметиламмонийхлорид

NaCl

CaClj

Затем фильтровальную бумагу обрабатывают 0,05 мл раствора реактива следующего состава:

Сукцинил-апанил- аланил-пролил-

фенилаланил-пнитроанилид

Н-с -Нафтилэтилендиамин

Нитрит натри 

Буфер трис-НС1,

рН 9,0

Спуст  5 мин на бумагу нанос т 1 каплю трихлоруксусной кислоты (3,2 ммоль/л). В присутствии химо-. трипсина в пробе по вл етс  интенсивное (фиолетовое окрашивание, величина которого зависит от количества фермента.

2 ммоль/л

г/л г/л

100 ммоль/л

8668

ПримерВ. Определение активности химотрипсина с различными детергентами при разных их концентраци х,

В табл.2 и 3 представлены данные по измерению активности химотрипсина в суспензии кала и супернатанте по примеру 1 при варьировании детергентов и их концентрации.

го- Ю

ю

П р и м е р 9. Определение активности химотрипсина при граничных значени х ионной сипы.

В табл.4 и 5 представлены данные 15 по ак тивности химотрипсина (при определении по примеру 1) при разных- значени х ионной силы.

Пример 10, Определение активности химотрипсина при разных значе- 20 ки х рН,

В табл.6 представлены данные определени  активности по примеру 1 при разных значени х рН.

Claims (2)

1.Надосадочна  кость

Суспензи 

2.Надосадочна  кость

Суспензи 

Услови  определени : в числителе - концентраци , а в знаменателе - ионна  сида хлористого кальци , ммоль/л.

г

Таблица5

Услови  определени : в числителе - концентраци , а

в знаменателе - ионна  сила хлористого натри , ммоль/л.

(Таблица 6

Буфер

Значение рН

35 36

49 52

Активность химотрипсина, мЕд/мин

Ацетат натри 

3,0

Трис-НС

6,0 17,0,0