SU1296913A1 - Ферментный электрод дл определени концентрации тиохолиновых эфиров - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к аналитической химии и может быть использв- вано дл  определени  субстратов холинэстераз. С целью повышени  чувствительности и селективности определени  токосъемник выполн ют из амальгамированного серебра. Мембрана выполнена из нитрата целлюлозы, в которую введена холинэстераза и - глутаровый альдегид в количестве 10,6-12,6 и 17,5-18,0 мас. соответственно . Это позвол ет определ ть субстрат в количестве I 10 м/л в присутствии тиохолиновых зфиров. 1 ил.,2 табл. а (Л :о о со

Description

+

Изобретение относитс  к электрохимическим устройствам, используемым в аналитической химии дл  определени  соответствующих субстратов, ингибиторов, активаторов холинэс- тераз, а также может быть использовно в энзимологии дл  определени  скростей ферментативных реакций.

Цель изобретени  - увеличение чувствительности и селективности определений .

Отклик ферментного электрода на концентрацию субстратов холинэсте- раз наблюдаетс  практически мгновенно .

Определение субстратов и ингибиторов ХЭ основано на электрохимической активности одного из продуктов гидролиза субстрата, специфичного к ХЭ - бутирилтиохолин иодида (БТХИ

CjH COSCH - NiCH,), J + N(CH,),j.J.,

Продукт гидролиза БТХИ - тиол спсобен образовывать меркаптид ртути, который восстанавливаетс  на ртутно капельном и амальгамированном серебр ном электродах.

На вольтамперограммах БТХИ на стационарном амальгамированном сере р ном электроде наблюдаетс  небольшой , пик при потенциале -0,55 В относительно насыщенного каломельного электрода, который быстро растет в присутствии ХЭ. Высота пика зависит от концентрации как субстрата и ингибиторов ХЭ, так и ее активности и концентрации. Ферментный электрод и электрод сравнени  погружают в анализируемый раствор, содержащий буферный боратный раствор с рН 8,2- 8,4. Раствор термостатируют при 25 или 37°С, продувают током водорода или аргона и снимают вольтамперо- граммы в интервале потенциалов (-0,1)-(-0,8) В. Минимальный объем анализируемого раствора 4-5 мл.

На чертеже изображен предлагаемый электрод.

Электрод состоит из стекл нного или фторопластового корпуса амальгамированного серебр ного электрода

1, в который вставлена серебр на  проволока 2, спа нна  с медной 3,, гофрированной пленки 4 из нитрата целлюлозы с включенной в нее ХЭ и прижимных колец 5.

Серебр ную проволоку диаметром 0,5 мм закрепл ют в стекл нной труб

«i

0

5

0

ке или фторопластовом стержне с помощью эпоксидной смолы ЭПД или механически . Затем поверхность электрода шлифуют до зеркального блеска и опускают в металлическую ртуть на 2 мин и излишки ртути стр хивают. Дл  получени  иммобилизованной ХЭ 0,1 г нитрата целлюлозы раствор ют в смеси органических растворителей толуола и бутилацетата (1:1,6), добавл ют 0,2 мп водного раствора ХЭ (навеска 0,0180 г) и после перемешивани  - гексан в качестве коагул нта . Дл  более прочного св зывани  фермента с матрицей перед добавлением гексана приливают 0,1 мл 25%-ного раствору глутарового альдегида. Из этой смеси на стекл нной поверхности получают пленку, из которой вырезают кусочки размером 25-65 мм. Пленку закрепл ют на поверхности корпуса электрода с помощью прижимных колец или других зажимов, дл  увеличени  рабочей поверхности пленку используют в гофрированном виде.

Определени  с предлагаемым ферментным электродом осуществл ют следующим образом.

Пример 1, Построение граду - ровочного графика дл  определе 1и  БТХИ.

В мерную колбу на 5 мл ввод т 0,05-3,00 мл стандартного раствора БТХИ с концентрацией 0,005 г/кл 5 довод т до метки боратным буферным раствором с рН 8jA. Перенос т раствор в электролитическую  чейку с насыщенным каломельным электродом и ферментным электродом, удал ют кислород продуванием в течение 15 мин (врем  достижени  равновеси  реакции гидролиза должно быть посто нным во всех определени х) аргоном или электролитически генерированным водородом. Снимают вольтамперограм- мы в интервале потенциалов от -0,1 до 0,8 В при скорости наложени  потенциала 1 В/с при непрерывном режиме пол ризации с треугольной разверткой потенциала. Измер ют ту пика при потенциале -0,55 В. .. Стро т градуировочную пр мую, выражающую зависимость величины тока в пике от концентрации БТХИ.

O

5

0

Определение неизвестной концентрации субстрата.

В мерную колбу на 5 мл внос т н( известное количество БТХИ, довод т

31296913

до метки борат ым буфером с рН 8,4, перемешивают и перенос т  чейку. Все дальнейшие операции провод т как описано выше. По высоте пика при потенциале -0,55 В и градуировоч- s ному графику определ ют концентрацию субстрата,

В табл, 1 приведены результаты определени  БТХИ с помощью предлагаемого ферментного электрода ( 10

Р 0,95).

Таблица 1

П р и м е р 2. Определение концентрации ингибитора (хлорофоса). В медную колбу на 5 мл ввод т 1 мл стандартного раствора БТХИ концентрацией 0,005 г/мл, добавл ют от 0,05 до 0,20 мл стандартного расвора хлорофоса с концентрацией 0,005 г/мл, довод т боратным буферным раствором до метки, перемешиваю и перенос т в электролитическую  чейку с насыщенным каломельным и ферментным электродами. Удал ют кислород в течение 15 мин током аргона или водорода и снимают вольтам- перограммы в интервале потенциалов (-0,1)-(-0,8) Б (скорость наложени  потенциала 1 Б/с, непрерывный режим пол ризации, треугольна  развертка потенциала), Измер ют высоту катодного пика при потенциале -0,55 Б. Стро т градуировочную пр мую, выражающую зависимость высоты катодного пика dT концентрации ингибитора.

. Неизвестную концентрацию ингибитора наход т по градуировочному графику ,

В табл, 2 приведены некоторые результаты определени  хлорофоса с помощью предлагаемого ферментного электрода (п 4; Р 0,95).

Таблица 2

Предлагаемый ферментный электрод позвол ет снизить нижнюю границу определ емых содержаний субстрата по сравнению с известными способами определений до 110 моль/л, повысить селективность определений (дает отклик в присутствии лишь тиохолиновых зфиров), С помощью предлагаемого электрода можно определ ть не только субстраты, но и ингибиторы холинэстераз до концентрации (0,2-10 г/мл). Электрод прост в изготовлении, его конструк7 ци  позвол ет легко заменить фермент , потер вший активность на новый, путем замены пленки, содержащей иммобилизованную ХЭ.

Врем  жизни мембраны составл ет 1 неделю.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Ферментный электрод дл  определени  концентрации тиохолиновых эфиров, включающий , внутри которого расположен токосъемник, электролитически св занный с мембраной, отличающийс  тем,-что, с целью повышени  чувствительности и селективности определени , в качестве токосъемника использован серебр ный амальгамированный электрод, а мембрана выполнена из пленки на основе нитрата целлюлозы с введенными в нее холинэстеразой и глутаровым альдегидом в следующих количествах, мае, %:

   Холинэстераза Глутаровый альдегид Нитрат целлюлозы

   5

   Составитель И. Роггшь Редактор Н. Киштулинец Техред и,Попович Корректор Г. Решетник

   Заказ 769/45Тираж 777Подписное

   ВНИИПИ Государственного комитета СССР.

   по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушска  наб.,д. 4/5

   Производственно-полиграфическое предпри тие, г. Ужгород, ул. Проектна , 4