SU1295336A1

SU1295336A1 - Способ количественного определени регул торов роста растений на основе четвертичных аммониевых солей

Info

Publication number: SU1295336A1
Application number: SU853856005A
Authority: SU
Inventors: Игорь Константинович Блиновский; Виктор Петрович Тучков; Галина Львовна Соркина; Юрий Андраникович Бунятян
Original assignee: Московская сельскохозяйственная академия им.К.А.Тимирязева
Priority date: 1985-02-15
Filing date: 1985-02-15
Publication date: 1987-03-07

Abstract

Изобретение касаетс аналитической химии, в частности количественного определени регул торов роста растений на основе четвертичных аммониевых солей, и может быть использовано дл определени в биологических объектах хлорхолинхлорида, хлорида морфола или морфонола. Повьпление селективности определени с помощью экстракции растворителем и пропускани экстракта через адсорбент достигаетс использованием другого растворител дл элю- ировани - 0,9-1,1%-ного раствора НС1 в воде и адсорбента - силикагел , который перед элюированием обрабатывают 45-55%-ным водным раствором ацетона со скоростью 30-40 мл/мин. Далее элюат хроматографируют в тонком слое. Способ позвол ет определ ть пике,хлор холинхлорид.и морфол в концентрации 0,5 мкг, а морфонол - 1 мкг. 5 табл. (Л С ;о ел СА: CAD о:

Description

Изобретение относитс к аналитической химии, в частности к определению регул торов роста растений методом твердожидкостной хроматографии, и может использоватьс в химических и биохимических лаборатори х дл обнаружени и определени содержани в биологических объектах хлорхолинхло- рида, N-диметилморфолиний (хлорида морфола), Н,Н-дигидро(оксиэтил)-мор- фолиний хлорида (морфонола) и N,N-ди- метилпиперкдиний хлорида (пикса).

Цель изобретени - повышение селективности способа.

Способ осуществл ют следующим образом (концентрации растворов ацетона

и этанола даны в объемных % в воде, концентраци всех других растворов дана в массовых % в воде). Навеску 50 г измельченного образца экстрагируют 80%-ным раствором этанола в воде при малом содержании углеводов и высоком липидов, например сем н масfO

ческую плотность OKpniiieiifrhix п тен солей аммони на спектрофотометре в проход щем свете при 720-740 им. Количество определ емых регул торов роста растений, вл ющихс четвертичными сол ми аммони , определ ют по градуировочному графику, который стро т в период проведени подготовительных операций, осуществл емых следующим образом.

На аналитических весах взвешивают по 1,00 г химически чистых регул торов роста с точностью до 0,01 г. Навески перенос т в мерную колбу на 5 300 мл и раствор ют в 0,2 н. сол ной кислоте, довод т объем до метки. С помощью бюретки перенос т в 4 мерные колбы на 500 мл сьответственно 5, 15, 25 и 35 мл полученного стандартного маточного раствора и разбавл ют до 500 мл дистиллированной водой.

На катионитовые пластины размерами

20

30

70x100 мм параллельно одной из мень- личных культур, или 80%-ным раствором у ших ctopOH пластинок и на рассто нии ацетона в воде при высоком содержании 13 мм от кра м гким карандашом провод т стартовую линию, на которую нанос т с помощью микропипеток разбавленные стандартные растворы по 0,05мл в пор дке увеличени их концентрации, что соответствует количеству определ емых; регул торов роста по зонам соответственно ,0:3,0; 5,0:7,0 мкг. Этот процесс выполн ют в трехкрат- ной повторности (3 пластинки). 35 В хроматографическую камеру наливают 2,0-25%-ньш раствор серной кислоты и устанавливают в него катионитовые пластинки на ребро, вдоль которого нанесены определ емые регул торы роста. После подн ти фронта раствора кислоты на высоту 80 мм от стартовой линии пластинки вынимают из камеры.

Дл про влени хроматограмм опускают пластинки на 3/4 их высоты в 10,0-12,0%-ный раствор фосфорномолиб- деновой кислоты в воде, выдерживают 2-3 с,и промывают в 6 порци х воды

40

углеводов и малом липидов, например плодов фруктовых и годных культур, в анализируемом материале. Этанол и ацетон предварительно подкисл ют сол ной кислотой до рН 2,0. Экстракт в полном объеме очищают от липидов гек- саном и пропускают через колонку с силикагелем со скоростью 2-3 мл/мин.

Силикагель промывают от коэкстрактив- I

ных веществ 150 мл 45-55%-ного ацетона в воде со скоростью 30-40 мл/мин.. Хлорхолинхлорид и другие органические катионы, осевшие в микропорах силика- гел , элюирутот из последнего 250 мл 0,9-1,1%-ного раствора сол ной кислоты со скоростью 2-3 мл/мин. Элюат упаривают досуха. Сухой остаток раствор ют в 0,5 мл дистиллированной воды и нанос т микропипеткой 0,1 мл на хроматографическую пластинку с тонким слоем катионита. Осуществл ют развитие хроматограммы восход щим потоком 21,0-25,0%-ным раствором серной кислоты или 3,0-3,0%-ным раствором сол - Q ной кислоты. Дп про влени разделенных четвертичных солей аммони хроматографическую пластину без просушки обрабатывают 10,,0%-ным раствором фосфорномолибденовой кислоты и 5 после промьгоки водой 0,8-1,2%-ным раствором двухлористого олова. После просушивани пластинки просветл ют вазелиновым маслом и измер ют опти45

(первые 5 - водопроводна , а последн - дистиллированна ), выдержива в них пластинки по 5 мин.

После промывки пластинки осушают фильтровальной бумагой, не каса сь катионита выше стартовой линии, и об- .рабатывают. 0,8-1,2%-ньм раствором двухлористого олова в воде aнaлoг iч- но первой процедуре, увеличива выдержку до полного развити окраски

На аналитических весах взвешивают по 1,00 г химически чистых регул торов роста с точностью до 0,01 г. Навески перенос т в мерную колбу на 300 мл и раствор ют в 0,2 н. сол ной кислоте, довод т объем до метки. С помощью бюретки перенос т в 4 мерные колбы на 500 мл сьответственно 5, 15, 25 и 35 мл полученного стандартного маточного раствора и разбавл ют до 500 мл дистиллированной водой.

На катионитовые пластины размерами

хроматограмм. На светло-голубом фоне образуютс темно-синие п тна восста- новлеиньрс солей фосфорномодибденовых определ емых регул торов роста.

Про вленные хроматограммы высуши- вают под феном и просветл ют вазелиновым маслом посредством мазков м гкой (беличьей) кисточкой не менее, чем за 1 ч до измерени их оптической плотности. Измер ют оптическую плотность про вленных п тен хромато- грамм относительно окружающего фона пластин в проход щем или отраженном свете при 720,,0 нм.

Стро т градуировочный график, откладыва по абсдиссе количества нанесенных на пластинку регул торов роста в мкг, а по ординате - соответствующие им величины оптических плотностей п теп хроматограмм, и вычисл ют коэффициенты пропорциональности.

Приготовление колонок с силикаге- лем. Из мелкопористого силикагел марки МСМ выдел ют фракцию 0,5-1,5 м просеиванием. Закрепл ют на штативе стекл нные хроматографические колонки высотой 300 и диаметром 11-13 мм. Заполн ют колонки на 1/2 высоты дистиллированной водой и затем через воронку засыпают силнкагель, постукива по колонке стекл нной палочкой. Высота уплотненной набивки силикагел должна быть 145-155 мм.

Устанавливают на колонки питающие сосуды и промывают силикагель 1 л 2,0 н. сол ной кислоты со скоростью 2-3 мл/мин, заполненные раствором кислоты колонки выдерживают 1 сут, а затем повтор ют промывку в том же режиме . После кислотной промывки провод т промывку колонок дистиллированно водой до нейтрального показател рН по индикаторной бумаге.

Смену нромыБочнь1Х жидкостей, а таже последующие внесени анализируемы растворов осуществл ют при высоте прдыдущей жидкости над слоем сорбента

на О,5-1,О см. (

Устанавливают рабочие объемы аце-

тона (дл промывки колонок и сол но кислоты (дл вытеснени определ емых веществ), пропуска через колонки со скоростью 2-3 мл/мин АО мл водного .раствора, содержащего по 80-100 мкг определ емых регул торов роста. Проход собирают в плоскодонные колбы на 250 мл. В том же режиме собирают 4 порции элюата по 50 мл 45,0-55,0%-но

5

0

5

О

0

5

0

5

го раствора ацетона в воде. Вымывают адсорбированные силикагелем регул торы роста 0,9-1,1%-ным раствором сол ной кислоты, собирают в 250 мл, плоскодонные колбы со скоростью 2- 3 мл/мин 4 порции: перва 150 мл и три последующих по 50 мл.

Собранные порции элюатов выпаривают досуха в ротационном испарителе. Сухие остатки в колбе после охлаждени до комнатной тe mepaтypы раствор ют в 0,1-0,2 мл воды и в полном объеме нанос т на катионитовые пластинки . Размер пластинок, нанесение и получение хроматограмм такие же, как при построении градуировочного графика .

На основании полученных результатов определ ют рабочие объемы, например , дл хлорхолинхлорила: первый дл промьшки колонок, (от коэкстрактив- ных веществ при выполнении анализов), равный сумме объемов порций 45-55%- ного ацетона, в которых не обнаружены регул торы роста, и второй дл вытеснени адсорбированных регул торов роста, равный сумме объемов порций 0,9-151%-ного раствора сол ной кислоты , в которых обнаружены определ емые регул торы роста. Например, в 45-55%- ном ацетоне обнаружен препарат в четвертой порции, а в 0,9-1,1%-ном растворе кислоты - в 1,2 и 3 порци х. Следовательно, промьгоать колонки от коэкстрактивных веществ нужно объемом не более 150 мл 45,0-55,0%-ного ацетона, а вытесн ть адсорбированные препараты - объемом не менее 250 мл 0,9-1,1%-ной сол ной кислоты. Перва порци прохода воды при внесении раствора препарата в колонку нужна дл контрол полноты адсорбции силикагелем определ емых регул торов роста.

Колонки, промытые дистиллированной водой от сол ной кислоты, готовы к работе. Подготовленные и апробированные таким образом колонки с силикагелем могут использоватьс посто нно без замены набивки, но не реже 2 раз в год провер ют и уточн ют рабочие объемы дл промывки и вытеснени определ емых регул торов роста.

Пример 1.50г анализируемой средней пробы, измельченной на гомогенизаторе до размера частиц не более 1 мм, внос т в экстрактор, заливают 200 мл 80%-ного этанола или

80%-иого ацетона, подкисленных до рН 2 по индикаторной бумаге,и осуществл ют процесс экстрагировани в течение 6 ч. Экстракт фильтруют чере бумажный фильтр в делительную воронку на 500 мл и смешивают с 50 мл гек сана путем энергичного встр хивани в течение 5 мин. После расслоени нижнюю фазу сливают в другую делительную воронку и повтор ют процесс очистки новой порцией гексана. Операцию повтор ют до получени бесцветного гексанового сло .

Очищенный гексаном экстракт (нижн фаза) пропускают через колонку с силикагелем со скоростью 2-3 мл/ /мин. Промывают колонку со скоростью 30-40 мл/мин 50%-ным раствором ацетона в воде с объемом, который установлен при апробации колонки. Поглощенные силикагелем регул торы роста элюируют 1,0%-ным раствором сол ной кислоты со скоростью 2-3 мл/мин объемом , который также установлен при апробации колонки. Сол нокислый элю- ат собирают в плоскодонную колбу на 250 мл и выпаривают досуха (например на ротационном испарителе).

Сухой остаток раствор ют в 0,5 мл дистиллированной воды, и 0,1 мл полученного раствора с помощью микропипеток в двукратной повторности нанос т на катионитовую хроматографи- ческую пластинку. Нанесение и все дальнейшие операции вьтолн ют так, как при получении градуировочного графика.

Содержание остаточных количеств регул торов роста в анализируемой пробе вычисл ют по формуле

f - 4

GX 5 А М где Cj( - содержание в пробе хлорхо- линхлорида мг/кг или мг/л;

5 - коэффициент, .равный отношению объема раствора сухого остатка экстракта (0,5 мл) к объему этого раствора, нанесенного на хроматографи- ческую пластинку (0,1 мл);

А - количество хлорхолинхлорида обнаруженное на хроматограм ме, мкг по градуировочному графику,

М - масса или объем анализируемой пробы, г или мл.

Пример 2, Определение провод т аналогично примеру 1, но промывку колонок осутцествл ют 45%-ным раствором ацетона в воде и 0,9%-ным 5 раствором сол ной кислоты.

Пример 3, Анализ провод т, использу 55%-ный раствор ацетона и 1,1%-ный раствор сол ной кислоты.

)Q Результаты вли ни концентрации ацетона в промывочном растворе на уменьшение содержани загр зн ющих коэкстрактивных веществ (г) в элюа- те четвертичных солей аммони привеJ5 дены в табл. 1.

В табл. 2 приведены результаты вли ни концентрации хлористоводороной кислоты на активность вымывани с 250 мл элюата адсорбированных силкагелем четвертичных солей (%).

20

Результаты определени препаратов четвертичных солей аммони и коэффициенты их подвижности приведены в табл. 3 и 4.

Пример 4. Провод т анализ аналогично примерам 1-3, определ стабильность и воспроизводимость ре- .зультатов определений. Данные о стабильности сорбции мелкопористым силикагелем определ емых регул торов роста при многократном использовании (200 определений) приведены в табл.5.

Claims

Формула изобретени

Способ количественного определени регул торов роста растений на основе четвертичных аммониевых солей путем экстракции их органическим растворителем , пропусканием экстракта через колонку с адсорбентом, элюированием растворителем с последующим тонкослойным хроматографированием элюата, о т- личающийс . тем, что, с целью повышени точности и селективности определени , в качестве адсорбента используют силикагель, перед элюированием адсорбент обрабатывают 45-55 об.% раствором ацетона и в качестве растворител используют 0,9- 1,1 мас.% раствор сол ной кислоты в воде.

Картофель

Яблоки

Томаты

1,32 0,96 0,68 0,56 0,54 0,48 0,48 0,49 0,64 2,24 1,64 1,24 0,92 0,89 0,84 0,90 1,04 1,36 1,80 1,28 0,96 0,72 0,70 0,64 0,71 0,76 0,97

Таблица 1

Таблица 3

Вещество

N,Ы-Диметилпиперидиний

хлорид (пике)0,13-0,15

2-Хлорэтилтриметиламмоний хлорид (хлорхолинхлорид )0,21-0,25

N-Диметилморфолиний хлорид (морфол)0,29-0,31

Холин0,35-0,37

Триметиламин хлоргидрат 0,36-0,38

Примечание, Пределы обнаружени дл пикса, хлорхолинхлорида и морфола равны 0,5 мкг, а дл морфоно- ла 1,0 мкг.

2-Хпорэтилтриметиламмоний хлорид 100-200 8,}-9,7 150-250 24,9-29,1 41,8-3.8,4

и-Диметилморфолиний хлорид 200-300 7,-8,4 250-330 23,4-27,2 21 37,3-44,7

N,N-Дигидро-(оксиэтил)морфолиний хлорид 430-550 7,,0 450-550

22,1-24.5 . 40,8-48,4

Коэффициент подвижности

Таблица 5

Ы,Ы-Диметилпиперидиний хлорид

450-550

8,5-9,9

26,0-29,2

45,1-50,5

Составитель С. Хованска Редактор О. Бугир Техред А.Кравчук Корректор А. Зимокосов

Заказ 613/52 Тираж 777Подписное

ВНИШШ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушска наб., д. 4/5

. Производственно-полиграфическое предпри тие, г. Ужгород, ул. Проектна , 4

8,0-9,4

24,1-28,3

41,4-48,2

-5,4 -1,4 -7,3