SU1130598A1

SU1130598A1 - Method for preparing immobilized oxydoreductases

Info

Publication number: SU1130598A1
Application number: SU823512069A
Authority: SU
Inventors: Валерий Давидович Соколовский; Галина Артемьевна Коваленко
Original assignee: Ордена Трудового Красного Знамени Институт Катализа Со Ан Ссср
Priority date: 1982-11-17
Filing date: 1982-11-17
Publication date: 1984-12-23

Abstract

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ОКСИДОРЕДУКТАЗ путем добавлени буферного раствора ферментов к пористому неорганическоиу носителю - окиси алюмини , отличающийс тем, что, с целью увеличени стабильности целевого продукта и ускорени способа, буферный раствор ферментов предварительно смешивают с золем кремниевой кислоты, имеющим рН 7-8 и застывающим в порах носител за 1-2 мин, а затем пропитывают полученной смесью сухую окись алюмини ипи сухой силикагель.A method for producing an immobilized oxide product by adding a buffer solution of enzymes to a porous inorganic alumina carrier, characterized in that, in order to increase the stability of the target product and accelerate the process, the buffer solution of enzymes is preliminarily mixed with silica sol having a pH of 7-8 and congealing the pores of the carrier for 1-2 minutes, and then impregnate the resulting mixture with dry alumina or dry silica gel.

Description

Изобретение относитс к .способам иммобилизации ферментов класса окси доредуктаз на неорганических носител х и получению на их основе эффективных гетерогенных биокаталиэаторрв дл практического применени . Известен способ двойной иммобилизации ферментов в полцакрилами ном геле, армированном неорганическим скелетом: кремнезернистым или металлическим материалом с диаметром пор свьше 700 А 1J . Недостатком способа вл етс возможность значительной дезактивации ферментов в процессе свободно радикальной полимеризации гел , кроме того получаемый способом конечный продукт имеет низкие физико-мехапические характеристики: мал механическую прочность, большое гидродинамическое сопротивление. Наиболее близким к предлагаемому способу по технической сущности и достигаемому положительному эффекту вл етс способ получени иммобилизованных оксидоредуктаз путем добавлени буферного раствора ферментов к пористому неорганическому носителю - окиси алюмини ( . 100 ,.радиус пор 175 А, 2 0,6 ), причем в качестве фермента используют глюкозооксидаЗУ 2. , Недостатками способа вл ютс длител;ьность процесса получени иммобилизованного фермента (адсорбци протекает в течение 17-18 ч) и .низка стабильность положенного препарата (адсорбированный фермент дезактивируетс за 7 сут). Целью изобретени вл етс увели чение стабильности целевого продукта и ускорение процесса иммобилизации . Поставленна цель достигаетс тем, что согласно способу получени иммобилизованных оксидоредуктаз пут добавлени буферного раствора ферме тов к пористому неорганическому Носителю окиси алюмини , буферный р створ ферментов предварительно смешивают с золем кремниевой кислоты, имеющим рН 7-8 и застывающим в пора носител за 1-2 мин, а затем пропи тывают полученной смесью сухую окись алюмини или сзгхой силикагель Сущность способа заключаетс в том, что свежеприготовленным золем кремниевой ки(;лоты с растворенным в нем ферментом (рН 7-8) пропитывают сухой носитель, в порах которого за 1-2 мин происходит желатинизаци зол , и образуетс гидрогель с включенным в него ферментом. Таким образом, фермент оказываетс заключенным одновременно и в гель, и в пористую структуру неорганического носител г- Вс процедура иммобилизации занимает 5-10 мин и отличаетс простотой и .технологичностью. Полученные предлагаемым способом препараты сочетают в себе преимущества иммобилизации в геле (высока стабильность и активность) с преимуществами иммобилизации на. неорганических носител х (устойчивость в водных средах, высока механическа прочность, хорошие гидродинамические показатели и вл ютс перспективными дл практического применени в высокопроизводительных реакторах колоночного типа. Кроме того, предложенный способ в силу м гкости условий иммобилизации: комнатна температура, нейтральные значени рН, отсутствие инициирующих радикальные реакции добавок, вл етс более предпочтительным дл иммобилизации таких лабильных, сложных по строению, как правило, субъединичных ферментов, как оксидоредуктазы. Конкретно способ осуществл етс следующим образом. Навеску сухого носител пропитывают по влагоемкости свежеприготовленным золем кремниевой кислоты с растворенным в нем ферментом. Золь кремниевой кислоты образуетс при смешении в тщательно подобранных пропорци х растворов метасиликата натри (228 г/л), сол ной кислоты (6%) и буферного раствора фермента с таким расчетом, чтобы значение рН этой гелеобразующёй смеси было нейтральным (во избежании дезактивации фермента под действием рН), и ее отверждение происходило после пропитки в порах неорганического носител , т.е. через 2-3 мин после приготовлени . Соотношение объемов жидкого стекла, сол ной кислоты и раствора фермента - 1:5:1. После застывани смеси в порах измер ютThe invention relates to methods for immobilizing the enzymes of the hydroxy preductance class on inorganic carriers and to obtain on their basis effective heterogeneous biocatalysts for practical use. A known method of double immobilization of enzymes in a half-acrylate gel, reinforced with an inorganic skeleton: silica-grained or metallic material with a pore diameter above 700 A 1J. The disadvantage of this method is the possibility of significant deactivation of enzymes in the process of free radical gel polymerization, and the final product obtained by this method has low physical and mechanical characteristics: low mechanical strength, high hydrodynamic resistance. The closest to the proposed method to the technical essence and the achieved positive effect is the method of obtaining immobilized oxidoreductases by adding a buffer solution of enzymes to a porous inorganic carrier - alumina (. 100,. Pore 175 A, 2 0,6), moreover, as an enzyme The glucose oxide solution 2 is used. The disadvantages of the method are the duration; the process of obtaining the immobilized enzyme (adsorption takes about 17-18 hours) and the stability of the positioned drug (adsorbed the enzyme is deactivated in 7 days). The aim of the invention is to increase the stability of the target product and accelerate the immobilization process. This goal is achieved by the fact that, according to the method of obtaining immobilized oxidoreductases by adding a buffer solution of farms to a porous inorganic alumina carrier, the buffer enzyme buffer is pre-mixed with a silicic acid solution having a pH of 7-8 and solidifying in a carrier for 1-2 minutes and then the resulting mixture is dried with dry alumina or scsi silica gel. The essence of the method lies in the fact that a freshly prepared silica sol (; lots with the enzyme dissolved in it (pH 7-8) dry carrier, in the pores of which gelization takes place within 1-2 minutes, and a hydrogel is formed with the enzyme included in it. Thus, the enzyme is enclosed simultaneously in the gel and in the porous structure of the inorganic carrier G- 10 minutes is simple and technological. The preparations obtained by the proposed method combine the advantages of immobilization in a gel (high stability and activity) with the advantages of immobilization on. inorganic carriers (stability in aqueous media, high mechanical strength, good hydrodynamic performance and are promising for practical application in high-performance column type reactors. In addition, the proposed method due to the soft immobilization conditions: room temperature, neutral pH values, no radical reactions of additives, it is more preferable to immobilize such labile, complex in structure, as a rule, subunit enzymes, as oxidoreductases. Specifically, the method is carried out as follows: A dry carrier is impregnated by moisture with freshly prepared silicic acid sol and enzyme dissolved in it. (6%) and a buffer solution of the enzyme so that the pH value of this gel-forming mixture was neutral (in order to avoid deactivation of the enzyme under the action of pH), and its curing took place After impregnation in the pores of the inorganic carrier, i.e. 2-3 minutes after preparation. The ratio of the volumes of liquid glass, hydrochloric acid and enzyme solution is 1: 5: 1. After the mixture hardens, the pores are measured.

ферментативную активность и стабильность полученного препарата иммобилизованного фермента.enzymatic activity and stability of the obtained preparation of immobilized enzyme.

Активность иммобилизованных ферментов намер етс в циркул ционной s установке с дифференциальным безградиентным реактором, термостатируемым при 25 С. Стабильность определ етс при хранении в буфере и комнатной температуре. Потер л/98% 10 активности считаетс полной дезактивацией фермента.The activity of immobilized enzymes is intended in a circulating s installation with a differential gradient-free reactor thermostatically controlled at 25 ° C. Stability is determined when stored in a buffer and at room temperature. A loss of l / 98% 10 activity is considered complete deactivation of the enzyme.

П р и м е р 1. Иммобилизаци глюкозооксидазы в порах окиси алюмини . . ,15Example 1: Immobilization of glucose oxidase in pores of alumina. . ,15

Навеску (25 мг) сухой 0 -окисиSample (25 mg) dry 0-oxide

алюмини (5цд 84 , 120 А, SOO A,V 0,4 ) пропитывают 20 мкл свежеприготовленного зол кремниевой кислоты с растворен- -Q ной в нем глюкозооксидазой (ГО), который застывает чере 1 мин в порах носител , рН смеси - 7,0.aluminum (5 84 d, 120 A, SOO A, V 0.4) is impregnated with 20 μl of a freshly prepared silica sol with dissolved glucose oxidase (GO), which solidifies for 1 minute in the pores of the carrier, the pH of the mixture is 7, 0

Ферментативную активность полученного препарата измер ют пол ро- 25 графически по убьши кислорода в реакционном растворе. Стабильность определ ют при хранении в буфере (рН 6,0) и комнатной температуре (20-22°С). ... ,„ Иммобилизованна предлагаемым спо-The enzymatic activity of the obtained preparation is measured sex-25 graphically by the destruction of oxygen in the reaction solution. Stability is determined by storage in a buffer (pH 6.0) and room temperature (20-22 ° C). ..., “Immobilized to the proposed method

собом ГО |2,9 ---4 сохран етSo it is GO | 2,9 --- 4 saves

; М п Гс ftfl I; M n GF ftfl I

32% активности нативного фермента.32% of the activity of the native enzyme.

При иммобилизации стабильность глюкозооксидазы увеличиваетс : иммо- 35 билизованный фермент сохран ет 100% первоначальной активности по истечение 1,5 мес цев хранени , тогда как нативна ГО полностью дезактивируетс за 30 сут. 40Upon immobilization, the stability of glucose oxidase increases: the immunobilized enzyme retains 100% of the initial activity after 1.5 months of storage, while the native GO completely deactivates in 30 days. 40

П р и м е р 2. иммобилизаци глюкозооксидазы в порах окиси алюмини .Example 2: Immobilization of glucose oxidase in pores of alumina.

Иммобилизацию ГО провод т способоьг описанным в примере 1 только подбирают услови таким образом, чтобы золь застьюал в порах носител через 2 мин после пропитки (рН смеси - 8,0). Свойства полученного препарата иммобилизованной глюкозооксидазы аналогичны примеру 1.JQThe immobilization of GO is carried out by the method described in Example 1, only the conditions are selected so that the sol will catch in the pores of the carrier 2 minutes after impregnation (pH of the mixture is 8.0). Properties of the obtained preparation of immobilized glucose oxidase are similar to example 1.JQ

П р и м е р 3. Иммобилизаци дрожжевой алкогольдегидрогеназы в порах окиси алюмини .PRI me R 3. Immobilization of yeast alcohol dehydrogenase in the pores of alumina.

Иммобилизацию аЛког.ольдегидрогеназы (АДГ) в порах S -окиси алюми -. .-j ни провод т по методике примера f.Immobilization alcogol aldehydrogenase (ADH) in the pores of S-alumina -. .-j is not carried out according to the procedure of example f.

Активность АДГ измер ют спектрефотометрически по скорости пойв-.The activity of ADH is measured spectrophotometrically by the flow rate.

лени в ферментативной реакции окислени этанола в ацетальдегиД кофермента NAO-H, который поглощают при 340 им. Стабильность определ ют в буфере (рН 8,0) и при комнатной температуре (20-22®С).In the enzymatic reaction of the oxidation of ethanol in acetaldehyde coenzyme NAO-H, which is absorbed at 340 them. Stability is determined in buffer (pH 8.0) and at room temperature (20-22 ° C).

При иммобилизации АДГ сохран етс от 6 до 100% активности нативного фермента в зависимости от ее концентрации в геле кремниевой кислоты.When ADH is immobilized, from 6 to 100% of the activity of the native enzyme is retained, depending on its concentration in the silica gel.

Стабильность иммобилизованной АД увеличиваетс в сравнении с нативным ферментом в 1,5-4 раза; алкоголдегидрогеназа в растворе полностью дезактивируетс за 10 сут, иммобилизованный фермент - за 2-3 недели.The stability of immobilized blood pressure is increased by 1.5–4 times in comparison with the native enzyme; the alcohol dehydrogenase in the solution is completely deactivated in 10 days, the immobilized enzyme in 2-3 weeks.

П р и м е р 4. Иммобилизаци дрожжевой алкогольдегидрогеназы в прах силикагел .PRI me R 4. Immobilization of yeast alcohol dehydrogenase into silica gel ashes.

Иммобилизацию АДГ в порах сили;кагел (5. 110 ,г„др 240 А, V О,б см/г) провод т в услови х, описанных в примере 1.The immobilization of ADH in the pores of silica, the kagel (5. 110, g, etc., 240 A, V O, cm / g) was carried out under the conditions described in Example 1.

При иммобилизации алкогольдегидрогеназа сохран ет от 3 до 82% активности нативного фермента в зависимости от ее концентрации в геле кремниевой кислоты.When immobilized, alcohol dehydrogenase retains from 3 to 82% of the activity of the native enzyme, depending on its concentration in the silica gel.

Эффект стабилизации алькогольдегидрогеиазы , иммобилизованной в порах силикагел , зависит от рН буферного раствора, используемого дц хранени полученного препарата. При нейтральных значени х рН (6,0, 7,0) стабильность включенной АДГ увеличиваетс в 1,5-3 раза по сравнению с нативным ферментом: иммобилизованна АДГ полностью тер ет активность по истечение 1,5 мес ца хранени , тогда как нативна - за 1520 сут. При щелочных значени х рН (8,0) стабилизаци АДГ незначительна в силу увеличени растворимости силикагел при рН 7,0 (100 мг/л). Следовательно, дл ферментов, рН-оптимум которых находитс в щелочной области (алькогольдегидрогенеза), рекомендуетс , использовать в качестве носител только окись алюмини , дл ферментов с кислым значением оптимального рН (глюкозооксидаза ) - силккагель и окись алюмини .The effect of stabilization of alcohol dehydrogenase immobilized in the pores of silica gel depends on the pH of the buffer solution used to store the resulting preparation. At neutral pH values (6.0, 7.0), the stability of the included ADH is increased 1.5-3 times as compared with the native enzyme: the immobilized ADH completely loses activity after 1.5 months of storage, while the native - for 1520 days At alkaline pH values (8.0), stabilization of ADH is negligible due to an increase in the solubility of silica gel at pH 7.0 (100 mg / l). Therefore, for enzymes whose pH-optimum is in the alkaline area (alcohol dehydrogenesis), it is recommended to use only alumina as a carrier, for enzymes with an acidic optimum pH value (glucose oxidase) - silkkagel and alumina.

Наиболее существенным вл етс то, что рН гелеобразующей смеси должно быть близким к нейтральному значению (7-8) ВО избежание инактиваIции фермента под действием щелочныхThe most significant is that the pH of the gel-forming mixture should be close to the neutral value (7-8). In order to avoid the inactivation of the enzyme under the action of alkaline

(раствор жидкого стекла, рНл-14) или кислых (сол на кислота, pHrvl) значений рН, При дальнейшей работе с препаратом иммобилизованного фермента (хранение определени активности ) рН в геле определ етс значением рН рабочего буфера.(solution of liquid glass, pH-14) or acidic (hydrochloric acid, pHrvl) pH values. During further work with the preparation of immobilized enzyme (storage, determination of activity), the pH in the gel is determined by the pH value of the working buffer.

Врем застудневани зол подбираетс таким образом, чтобы золь кремниевой кислоты успел пропитать пористый носитель и его желатинизаци проходила именно в порах.The ash time is selected in such a way that the silica sol can saturate the porous carrier and its gelatinization takes place exactly in the pores.

Главным достоинством предлагаемого способа вл етс ускорение всего процесса получени иммобилизованного фермента: процедура иммобилизации занимает 5-10 мин и складываетс из взвешивани носител (2-7 минХThe main advantage of the proposed method is the acceleration of the whole process of obtaining the immobilized enzyme: the immobilization procedure takes 5-10 minutes and is made up of weighing the carrier (2-7 min X

смешени реагентов (0,5-1 мин), пропитки (0,1-0,2 мин) и застудневани (1-2 мин).mixing reagents (0.5-1 min), impregnation (0.1-0.2 min) and chilling (1-2 min).

Таким образом, использование предлагаемого изобретени позвол ет значительно увеличить стабильность целевого продукта ферменты сохран ют активность в течении 1-1,5 мес цев (по известному способу дезактиваци происходит через 1 неделю ) . Врем иммобилизации также снижаетс с 17-18 ч до 5-10 мин.Thus, the use of the proposed invention significantly increases the stability of the target product. Enzymes retain activity for 1-1.5 months (according to a known method, deactivation occurs after 1 week). The immobilization time is also reduced from 17-18 h to 5-10 min.

Способ позвол ет получать высокоактивные и стабильные препараты иммобилизованных ферментов с хорошими техническим характеристиками: высокой механической прочностью и малым гидродинамическим сопротивлением .The method allows to obtain highly active and stable preparations of immobilized enzymes with good technical characteristics: high mechanical strength and low hydrodynamic resistance.

Claims

METHOD FOR PRODUCING IMMOBILIZED OXIDOREDUCTASES by adding an enzyme buffer solution to a porous inorganic carrier - alumina, characterized in that, in order to increase the stability of the target product and speed up the process, the enzyme buffer solution is pre-mixed with silicic acid sol having a pH of 7-8 and solidifying in the pores of the carrier “for 1-2 minutes, and then impregnated with a mixture of dry alumina or dry silica gel.

1 1130596