ел ate
СПSP
со сл Изобретение относитс к способам иммобипизации ферментов, к частности к попучениюгетерогенных катализаторов на неорганических аоситеп к. Известен способ получени иммобипизованной апкогопьцегицрогеназы (АДГ) путем ее ацсорбции на широкопористом сипикагепе, моцифицированном апьбуми ном i . Оцнако данный способ не обеспечивает высокой стабильности иммобипизованной апкогопьцегицрогенаэы. Наиболее близок к предлагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту способ получени иммобилизованной дрожжевой алкогольцегидрогеназы путем ее адсорбции на pt, - окиси-алюмини при рН 8,О-9,О ; последующей обработкой конденсирующим реагентом напримерглутаровымальдегицом 12 . Иммобилизацию фермента провод т на oL -окиси алюмини типа 5АЕН5За из водных растворов при 25®С. Параметры сорбента - удельна поверх- кость 4 .средний диаметр пор л- 10ОО Размер пор носител не соответ ствует размеру молекулы фермента. Следовательно, в порах этого носител не происходит многоточечного) св зывацтл фермента вспецствие отсутстви так называемого станочного эффекта. Поверх ность Л -окиси алюмини характеризуетс наличием слабых кислотно-основных центров, которые св зывают фермент, и низкой ик концентрацией. Поэтому иммобилизованна на таком носителе апкогопьдегидрогеназа имеет низкую стабиль ность. Обработка гпутаровым альдегидом не приводит к значительному увепичению стабильности препарата. Активность препарата 3-5 ЕА/г, врем полной дезакти вации от 5 до 7 дн. Недостатком известного способа в- п етс низка -стабильность препарата иммобипизованного фермента. ; Цель изобрёгени - увепиченне стабильности ферментного препарата. Указанна цепь достигаетс тем, что согласно способу получени иммобилизованной дрожжевой алкогольдегидроген&аы путем ее адсорбции на окиси апаоминн при рН 8,О-9,О с последующей обработкой конценснруюш м реагентом аасор ню провод т на 0 -или у ок с 1и апюмвни . Обычно в качестве конценсирующего реагента используют глутарбвый альцегид в концентрации 0,1% или карбодиимид в концентрации 2,5%. Низкотемпературные формы окиси алюмини 0 , у обладают, во-первых оптимальной пористой структурой, во-вторых, достаточной концентрацией и силой кислотно-основных центров на поверхности. Дополнительное увеличение стабильности достигаетс обработкой адсорбированного фермента конденсирующими агентами (глутаровым альдегидом, карбодиимидом). Использованный в способе носитель окись агдамини , вл етс крупнотоннажным промышленным продуктом, дешевым и доступным . Этот носитель имеет легко регулиру&мую пористую структуру, что вл етс чрезвычайно важным дл иммобилизации ферментов. Предлагаемый способ заключаетс в следующем. Навеску носител (25 мг) дезаэрируют , заливают 2 мл буферного раствора фермента и провод т адсорбцию фермента при комнатной температуре до достижени адсорбционного равновеси (2 сут). По разности количеств АДГ в исходном и равновесном растворе рассчитывают количество адсорбированного фермента. Затем аасорбированную алкогольдегидрогеназу обрабатывают 0,1% глутаровым альдегидом (0,1%) или карбодиимицом в концентрации 2,5 % в течение 30 мин. при комнатной температуре. Активность иммобилизованного фермента измерзпот в циркул ционной установке с дифференциальным безградиентным реактором , термостатируемым при . Скорость ферментативной реакции определ ют спектрофотометрически по по влению НАС Н, имеющего полосу поглощени при 340 нм. Стабильность иммобилизованной алкогольдегицрогеназы определ ют при хранении в буферном растворе при комнатной температуре, периодически испытыва по лученный образец на активность. Потер л 95% первоначальной активности считаетс полной дезактивацией иммобилизованной АДГ. Пример, Иммобилизаци дрожж&вой алкогольдегидрогеназы на Q -окии алюмини & AE50q( аезаэрируют и заливают 2 мл буферного раствора апкогопьдегицрогеназы (0,05 М триобуфер , рН 8,0) в концентрации 70080О мкг АДГ/МП. Адсорбцию провод т при комнатной температуре п течсггие 2 сут. Максимальна вепичина ацсорбции цостигает 45 мг/г. Активность полученного образца 30 ециниц активности на г препарата (за единицу активности (ЕА) фермента принимают такое его копичестг во, которое восстанавливает 1 ммопь при 25°С (р-Н 8,О) и насыщающих концентраци х этанопа). При хранении полученной иммобипи зованной апкогопьцегицрогеназы в буферных растворах (0605 М трио-буфер, рН 8,0) и комнатной температуре фермент полностью дезактивируетс за 5 нецель . П р и м а р 2, Иммобилизаци црожжевой апкогопьдегицрогеназы на -окиси алюмини . Ацсорбцию фермента нау4е,ОД5ад 80«/ провоц т в услови х примера 1. Величина ацсорбции цостигает 46 мг/г активность - 2О ЕА/г препарата. Алкогольцегицрогеназа , ацсорбированна на таком носителе, поцностью тер ет свою активность за 5 нацель хранени в триобуфере (рН 8,0) при комнатной темпера тура. Алкогопьдегицрогеназа, ацсорбирован- на на облацает большей ста- бильностью по сравнению с ферментом, иммобилизованным Ha.oL ABjO В порах этих носителей АДГ св зана нavIбoлee прочно и многоточечно вслецствие станоч ного эффекта. Ацсорбци алкогольаегиаро геназы на Q- к -окис х алюмини .увеличивает ее стабильность в сравнении с нативным ферментом: при хранении в . трис- буфере (рН 9) иммобилизованный фермент дезактивируетс за 5 нецель, нативный - за 4 ан. Наблюдаетс оптимум стабильности в зависимости от ст&пени заполнени поверхности АДГ. Наибо лее стабильны образцы, в которых поверхность носител покрыта полностью, когца мажбелковые взаимоцействи молекул цруг с другом стабилизируют фермен алкогольдегицрогеназы. Иммобилизованна (1 алкогольаегидрогеназа при хранении в пирофосфатном буфере(рН 9) и комнатной температуре полностью цезакт . вируетс на 4 цн. Следовательно, . адсо{Ь бированна на Q « у /.( дрожжева АДГ на пор док стабильнее. П р и м а р 3. Иммобилизаци алко .гопьцагидрогеназы на д -окиси ашоми ни с последующей обработкой глутаровым альдегидом. Полученную в услови х примера 1 адсорбированную Ha9-A2.;0-j алкогольцегидрогеназа обрабатывают глутаровым альдегидом по следующей методике: концентраци глутарового альдегида О,1%, врем сшивки 30 мин при комнатной температуре. Затем проводитс восстановление образовавшихс оснований шиффа 20 мМ боргидридом натри в течение 20 мин, при . При хранении в 0,05 М трио-буфере (рН 8,0) с добавлением 1 мМ ЭДТА и 1 мМ меркаптоэтанола в течение 1 мае. иммобилизованна алкогольдегидрогеназа (а 45 мг/г) сохран ет 9О -1ОО% первоначальной активности. Иммобилизованна алкогольдегидрогеназа , приготовленна таким способом, сохран ет 30-4О% первоначальной активности по истечении 9 мае. хранени при комнатной температуре и 80-100% - при хранении в холодильнике (). Обработка глутаровым альдегидом адсорбированной на - f(2,iO({sa 6 MVr) алкогольдегидроганазы приводит к незначительному увеличению стаг бильности иммобилизованного фермента: обработанна глутаровым альдегидом АДГ полностью дезактивируетс за 11-12 дн. тогда как без обработки этим реагентом - за 3-5 дн. П р и м е р 4; Адсорбци комплекса фермент: кофермент или фермент - суб- страт HaQ-аДб Оз с последующей обра. боткой глутаровым альдагицом. На носитель Q -окись алюмини (5uQ 73 Mvr) адсорбируют комплекс, фермента с субстратом (этанолом) или кофармантом (ЦА)) в услови х примера 1, При этом активный центр фермев та, в который вход т N Н -содержащие аминокислоты, защищаетс ет модифика- , ции глутаровым альдегидом, обладаю, щим сродством к активному центру . Последующую обработку комплекса глу- таровым альдегидом провод т по методике , описанной в примере 3. Попученна таким образом, иммобиггазованна алко гольдегидрогеназа (45 мг/г) попностью сохран ет свою активность по истечении 1 мае хранени при комнатной темперв туре (0,О5 М трио-буфер, рН 8,0; 1 мМ ЭДТА; 1 мМ меркаптрэтаноп). ПримерЗо Иммобилизаци црон жевой апкогопьдегицроганазы с поспецующей обработкой карбодиимидом, , Ацсорбированную на& A jU {6ue 7 ii/i) в успови х примера 1 алкогопьдегицро$10 геназу обрабатывают карбоциимицом fl - гакпогексип -д-(2-морфопиноэтип) , -карбоциимицмето-4-топуопсуцьфонатомТ по спецующей метоцике: 2, раствором карбоцивмица (рН 8,0) сшивают мопекулы фермента цруг с цругом Ъри комнатной температуре в течение ЗО мин Лп уцапени карбоциимиаа nociie реакции образец многократно промывают бицистиппированной воцой. Бпагоаар бопь шому размеру молекупы, карбоциимиа почти не затрагивает активный центр фермента. что позвол ет получать более активный, чем в примере 3, препарат иммобилизованной алкогольаегиарогеназы . Активность АДГ, обработанной глу таровым альцегицом (пример 3), составл ет 16 ЕА/г препарата, активность сшитта о карбоциимицом фермента 25 ЕА/ препарата, т. е. в 1,6 раз больше. Полученна такик образом алкогольцегицрогеназа { С| 25 мг/г) сохран ет 35 в течение 1 мес хранени в трис-буф&ре рН 8,О (с 1 мМ ЭДТА и 1 мМ меркаптоэтанолом ) при комнатной температуре 95-10О% первоначальной активноо ти. Преимуществом аанного способа вл етс высока стабильность препаратов иммобиливованной црожжевой алкогольцегиарогеназы , полученных путем аасор цин путем ацсорбции фермента на 9,- у формах окиси алюмини с последующей обработкой конценсирующими агентами (глутаровым альаегиаом, карбоциимиаом), по сравнению с препаратами фермента, ацсорбированными на ei -.окиси алюмини . Высока стабильность препарата & .л етс важнейшей технологической характеристикой и позвол ет использовать иммобилизованную алкогольцегицрогеназу в проточных реакторах с максимальной эффективностью.The invention relates to methods of immobilization of enzymes, in particular, to the propagation of heterogeneous catalysts on inorganic aositheppes. A method is known for preparing immobilized apocopicotserogenicase (ADH) by adsorbing it on a wide pipylum mocified by apbumine i. However, this method does not provide a high stability of the immobilized apkopopitsegitsrogenaei. Closest to the proposed by the technical essence and the achieved positive effect is the method of obtaining immobilized yeast alcohol hydration of hydrogenase by its adsorption on pt, - alumina at pH 8, O-9, O; subsequent treatment with a condensing reagent such as glutaric aldehyc 12. The enzyme is immobilized on oL-alumina type 5AEN5Sa from aqueous solutions at 25 ° C. The parameters of the sorbent - specific surface 4. The average pore diameter is 1010. The pore size of the carrier does not correspond to the size of the enzyme molecule. Consequently, in the pores of this carrier, there is no multipoint binding of the enzyme due to the absence of the so-called machine effect. The surface of L-alumina is characterized by the presence of weak acid-base centers that bind the enzyme and a low IR concentration. Therefore, immobilized on such a carrier, apkopogdegidrogenaza has low stability. Treatment with gputarova aldehyde does not lead to a significant increase in the stability of the drug. The activity of the preparation is 3-5 EA / g, the time of complete deactivation is from 5 to 7 days. The disadvantage of this method is the low stability of the preparation of immobilized enzyme. ; The purpose of the invention is to increase the stability of the enzyme preparation. This chain is achieved in that according to the method of obtaining immobilized yeast alcohol dehydrogenogenic by adsorbing it onto apaominne oxides at pH 8, O-9, O, followed by treatment with a concentrated aasoru nude reagent at 0 or at the next stage. Usually, glutarbium alcehyde at a concentration of 0.1% or carbodiimide at a concentration of 2.5% is used as a concentrating agent. Low-temperature forms of alumina 0, y have, firstly, an optimal porous structure, and secondly, a sufficient concentration and strength of acid-base centers on the surface. A further increase in stability is achieved by treating the adsorbed enzyme with condensing agents (glutaraldehyde, carbodiimide). The carrier material used in the method, agdamini oxide, is a large-tonnage industrial product, cheap and affordable. This carrier has an easily adjustable & porous structure, which is extremely important for immobilization of enzymes. The proposed method is as follows. A portion of the carrier (25 mg) is desaerated, 2 ml of the enzyme buffer solution is poured, and the enzyme is adsorbed at room temperature until the adsorption equilibrium is reached (2 days). Based on the difference in the amount of ADH in the initial and equilibrium solutions, the amount of the adsorbed enzyme is calculated. Then the asassed alcohol dehydrogenase is treated with 0.1% glutaraldehyde (0.1%) or carbodiimic at a concentration of 2.5% for 30 minutes. at room temperature. The activity of the immobilized enzyme measured in a circulation plant with a differential gradient-free reactor thermostatically controlled at. The rate of the enzymatic reaction is determined spectrophotometrically by the appearance of NAS H having an absorption band at 340 nm. The stability of the immobilized alcohol dehydrogenase is determined by storage in a buffer solution at room temperature, periodically testing the resulting sample for activity. A loss of 95% of the initial activity is considered complete deactivation of the immobilized ADH. For example, Immobilizing Yeast & Alcohol Dehydrogenase on Q-alumina & AE50q (2 ml of apocompleganhydrogenase buffer solution (0.05 M triobuffer, pH 8.0) at a concentration of 70080 O μg ADH / MP were aerated and poured at room temperature for 2 days. The maximum adsorption rate is 45 mg / g. The activity of the obtained sample is 30 decibits of activity per g of the preparation (per unit of activity (EA) of the enzyme is taken such as its copicest in which it recovers 1 mmop at 25 ° C (pH 8, O) and saturating concentrations of ethanop). called apkopopycegrogenase in buffer enzyme (pH 8.0) and room temperature, the enzyme is completely deactivated in 5 weeks. PRI m 2 p, Immobilization of the yeast apocotdegenerogenase on α-alumina. Absorption of the enzyme nauda, OD5ad 80 "/ provots conditions of Example 1. The magnitude of the adsorption is 46 mg / g of activity — 2O EA / g of drug.Alcoholcenecerogenase adsorbed on such a carrier will lose its activity during 5 storage in a tri-buffer (pH 8.0) at room temperature. Alcohol absorption, adsorbed on the table is more stable than the enzyme immobilized by Ha.oL ABjO In the pores of these carriers, ADH is associated more strongly and multi-pointly due to the machine effect. The adsorption of alcohol-degary genase on Q-to-oxides of aluminum. Increases its stability in comparison with the native enzyme: during storage in. the tris buffer (pH 9) immobilized enzyme is deactivated for 5 times, the native - for 4 an. Optimum stability is observed depending on the st & fi of the filling of the ADH surface. The most stable samples are those in which the surface of the carrier is completely covered, when coarse protein interactions of molecules with a friend stabilize the alcohol dehydrogenase enzyme. Immobilized (1 alcohol hydrogenase, when stored in pyrophosphate buffer (pH 9) and at room temperature, completely cesactates by 4 cent. Consequently, adsorbentine (Q / Y). (Yeast ADH is about 10 times more stable. p 3. An immobilization of alkoxy acid hydrogenase on d-oxide ashomi nor with subsequent treatment with glutaric aldehyde. The adsorbed Ha9-A2 prepared under the conditions of example 1; 0-j alcoholic hydrogenation is treated with glutaric aldehyde according to the following procedure: the glutaral concentration is treated with glutaraldehyde according to the following procedure: crosslink time 30 min at Room temperature of the Schiff base is then reduced with 20 mM sodium borohydride for 20 minutes while stored in a 0.05 M trio buffer (pH 8.0) with 1 mM EDTA and 1 mM mercaptoethanol added for 1 May. immobilized alcohol dehydrogenase (a 45 mg / g) retains 9O –1OO% of the initial activity. Immobilized alcohol dehydrogenase prepared in this way retains 30–4O% of the initial activity after 9 May. storage at room temperature and 80-100% - when stored in the refrigerator (). Treatment with glutaraldehyde adsorbed on - f (2, iO ({sa 6 MVr) alcohol dehydrogenase) leads to an insignificant increase in the stabilities of the immobilized enzyme: treated with glutaraldehyde ADH completely deactivates in 11-12 days, whereas without treatment with this reagent - in 3-5 days day Example 4; Adsorption of the complex enzyme: coenzyme or enzyme — substrate HaQ-aDb Oz followed by treatment with glutaric aldagic. On the carrier Q-alumina (5uQ 73 Mvr) adsorb the complex of the enzyme with the substrate (ethanol) or cofarmant (CA)) in the conditions of example 1; in this case, the active center of the farm, which includes NH-containing amino acids, is protected by modifications, glutaraldehyde, possessing affinity for the active center. Subsequent treatment of the complex with glutaraldehyde was carried out according to the procedure described in Example 3. Thus accumulated, the immobilizing alcoholic acid dehydrogenase (45 mg / g) retains its activity after 1 May storage at room temperature (0, O5 M trio -buffer, pH 8.0; 1 mM EDTA; 1 mM mercaptretanop). Example 3: Immobilization of crony apocotdegysroganase with pospecific treatment with carbodiimide, adsorbed on & A jU {6ue 7 ii / i) in the time of example 1 alcohol – 10 mg of genose is treated with carbocyclic fl –gacpohexip –d- (2-morphopinoiethip), –carbocionicmitmeto-4-topopopsuconatom T according to a special method: 2, solution of carbociticone; 4); ) Sews the enzyme cycle mopules with a circle at room temperature for 30 minutes Lp per sample of the carbocioimia – nociie reaction, the sample is repeatedly washed with a bi-hissystatic bobtail. Bpagoaar bopa molecular size, malekutya, karbotsimia almost does not affect the active center of the enzyme. which makes it possible to obtain a preparation of immobilized alcohol diharogenase, which is more active than in Example 3. The activity of ADH treated with glutamic alcegic (example 3) is 16 EA / g of the preparation, and the activity of the carbocyclic enzyme is 25 EA / preparation, i.e., 1.6 times greater. It is obtained in the same way as alcohol-and-egrogenase {С | 25 mg / g) retains 35 for 1 month of storage in Tris-buf & pH 8, O (with 1 mM EDTA and 1 mM mercaptoethanol) at room temperature 95-10 O% of the initial activity. The advantage aannogo method is the high stability of the formulations immobilivovannoy tsrozhzhevoy alkogoltsegiarogenazy obtained by aasor ching by atssorbtsii enzyme to 9, - the forms of alumina, followed by treatment kontsensiruyuschimi agents (glutaric alaegiaom, karbotsiimiaom), compared with preparations of enzyme atssorbirovannymi on ei -. alumina. High stability of the drug & It is one of the most important technological characteristics and allows the use of immobilized alcoholic and anhydrogenase in flow reactors with maximum efficiency.