RU2054481C1

RU2054481C1 - Method of immobilized enzyme preparing

Info

Publication number: RU2054481C1
Application number: RU9393008907A
Authority: RU
Inventors: Л.Е. Горленко; Г.И. Емельянова; М.П. Зверев; В.В. Лунин
Original assignee: Химический факультет МГУ им.М.В.Ломоносова
Priority date: 1993-02-16
Filing date: 1993-02-16
Publication date: 1996-02-20

Abstract

FIELD: biochemistry, enzymology. SUBSTANCE: organic carrier - hemosorption fiber made on the basis of copolymer of acrylonitrile with 2,5-vinylpyridine is treated with aqueous solutions of different enzymes - alkaline phosphatase, peroxidase, papain, α-chymotrypsin. Enzyme quantity is 1.2-17 mg/g adsorbed on the fibers is 1.2-17 mg/g and depends on the enzyme nature, its concentration in solution and time adsorption. Activity of immobilized enzymes is 45-75% of native value and depends on the nature of applied enzyme and used substrate. Time of half-inactivation is 14 days and above. EFFECT: high activity and stability of immobilized enzymes, decreased cost of carrier, simplified procedure.

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения иммобилизованных ферментов, и может быть использовано в пищевой, химической, микробиологической промышленности, а также в медицинской и лабораторной практике. The invention relates to biotechnology, in particular to a method for producing immobilized enzymes, and can be used in the food, chemical, microbiological industry, as well as in medical and laboratory practice.

Известен способ получения иммобилизованного фермента холинэстеразы, состоящий в том, что полимерный носитель типа Акрилекс С, полученный в результате частичного гидролиза шарикового сополимера акриламида и N,N'-метилен-бисакриламида типа Акрилекс Р кислотой или основанием и содержащий 5,4-6,8 мэкв/г функциональных СООН-групп, суспендируют в растворе с рН 7,0 и в суспензию при 0^оС добавляют карбодиимид хлоргидрата, необходимый для связывания фермента с карбоксигруппами, после чего в реакционную смесь добавляют холинэстеразу, растворенную в буферном растворе при 4^оС. Смесь выдерживают при 0-4^оС в течение 48 ч. Гель выделяют фильтрацией, промывают, высушивают замораживанием [1]
Недостатками этого способа являются необходимость предварительного активирования носителя, проведение процесса при низких температурах (0-4^оС), длительность процесса.A known method of obtaining an immobilized cholinesterase enzyme, consisting in the fact that the polymer carrier type Acrilex C obtained by partial hydrolysis of a ball copolymer of acrylamide and N, N'-methylene-bisacrylamide type Acrilex R with acid or base and containing 5.4-6.8 meq / g of -COOH functional groups, is suspended in a solution of pH 7.0, and the slurry at ⁰ ° C was added carbodiimide hydrochloride required for binding of the enzyme with carboxy, after which the reaction mixture was added cholinesterase, dissolved in buffer solution at 4 ° ^C. The mixture was maintained at 0-4 ^{° C} for 48 hours. The gel was isolated by filtration, washed and freeze-dried [1]
The disadvantages of this method are the need for preliminary activation of the carrier, the process at low temperatures (0-4 ^about C), the duration of the process.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому является способ получения иммобилизованной монофенол-монооксигеназы, состоящий в том, что аминосодержащее полиакрилнитрильное волокно с обменной емкостью 2-3 ммоль/г обрабатывают культуральным фильтратом базидиального гриба Coriolus hirsutus c активностью 1,48 ед/мг белка в течение 30 мин при 18^оС, продукт отмывают дистиллированной водой. Получают препарат с активностью 4,17 ед/г волокна (90% от исходной). Спад активности за 7 циклов на 30% [2]
Известным способом проведена иммобилизация только одного фермента- монофенол- монооксигеназы. Нет указаний на происхождение волокна, имеет ли оно промышленную марку. Приведенная в прототипе величина активности (80-90%) иммобилизованной монофенол-монооксигеназы противоречит приведенной там же устойчивости и стабильности, высокая активность иммобилизованных ферментов свидетельствуют о малой прочности связи. В прототипе не указано, какие именно аминные группы волокна принимают участие в процессе.The closest in technical essence and the achieved result to the proposed is a method for producing immobilized monophenol-monooxygenase, which consists in the fact that the amine-containing polyacrylonitrile fiber with an exchange capacity of 2-3 mmol / g is treated with a culture filtrate of the basidiomycete fungus Coriolus hirsutus with activity of 1.48 u / mg protein for 30 min at 18 ^about C, the product is washed with distilled water. Get the drug with an activity of 4.17 u / g fiber (90% of the original). The decline in activity for 7 cycles by 30% [2]
In a known manner, only one enzyme, monophenol monooxygenase, was immobilized. There is no indication of the origin of the fiber, whether it has an industrial brand. The activity value (80-90%) of the immobilized monophenol-monooxygenase shown in the prototype contradicts the stability and stability given therein, the high activity of the immobilized enzymes indicates a low bond strength. The prototype does not indicate which particular amine groups of the fiber are involved in the process.

Предлагаемый способ иммобилизации ферментов состоит в том, что водным раствором фермента обрабатывают органический носитель хемосорбционное волокно на основе сополимера акрилонитрила с 2,5-винилпиридином. The proposed method for immobilizing enzymes consists in treating an organic carrier with a chemisorption fiber based on a copolymer of acrylonitrile with 2,5-vinylpyridine with an aqueous solution of the enzyme.

Предлагаемый способ отличается тем, что в качестве носителя используют хемосорбционное волокно на основе сополимера акрилонитрила с 2,5-винилпиридином, содержащее координационно-активные пиридиновые группы в структуре полимера. The proposed method is characterized in that a chemisorption fiber based on a copolymer of acrylonitrile with 2,5-vinylpyridine containing coordination-active pyridine groups in the polymer structure is used as a carrier.

Установлено, что предлагаемое волокно с обменной емкостью 2,5-3,5 ммоль/г имеет поверхность 150-180 м²/г и способно иммобилизовывать ферменты, принадлежащие к различным классам щелочную фосфатазу, пероксидазу, папаин, α-химотрипсин.It was found that the proposed fiber with an exchange capacity of 2.5-3.5 mmol / g has a surface of 150-180 m ² / g and is able to immobilize enzymes belonging to different classes of alkaline phosphatase, peroxidase, papain, α-chymotrypsin.

Количество фермента, адсорбируемого предлагаемым волокном в зависимости от природы фермента, концентрации его в растворе и времени адсорбции, составляет 1,2-17 мг/г. Активность иммобилизованных ферментов составляет 45-75% от нативной величины в зависимости от природы наносимого фермента и используемого субстрата. Время полуинактивации 14 сут и более, что вдвое превышает время полуинактивации фермента в растворе. Значительно повышается термостабильность иммобили- зованного фермента по сравнению с ферментом в растворе. Не отмечено снижения активности при многократном проведении процесса на иммобилизованных ферментах. Предлагаемое волокно имеет промышленную марку ВИОН АН-1. Это позволяет упростить технологию процесса, волокно легко доступно, механически прочное, устойчиво в агрессивных средах, имеет хорошие гидравлические характеристики, процесс протекает с высокой скоростью и не требует дополнительной активации. Значительные количества адсорбированных ферментов позволяют считать способ адсорбции на волокне ВИОН АН-1 перспективным для извлечения ферментов в промышленном производстве. The amount of enzyme adsorbed by the proposed fiber, depending on the nature of the enzyme, its concentration in solution and the adsorption time, is 1.2-17 mg / g. The activity of immobilized enzymes is 45-75% of the native value, depending on the nature of the applied enzyme and the substrate used. The half-inactivation time is 14 days or more, which is twice as long as the half-inactivation time of the enzyme in solution. The thermal stability of the immobilized enzyme significantly increases as compared with the enzyme in solution. There was no decrease in activity during repeated carrying out the process on immobilized enzymes. The proposed fiber has the industrial brand VION AN-1. This allows us to simplify the process technology, the fiber is easily accessible, mechanically strong, stable in aggressive environments, has good hydraulic characteristics, the process proceeds at high speed and does not require additional activation. Significant amounts of adsorbed enzymes make it possible to consider the adsorption method on VION AN-1 fiber as promising for the extraction of enzymes in industrial production.

П р и м е р 1. 100 мг волокна ВИОН АН-1 обрабатывают раствором щелочной фосфатазы из кишечника цыплят с удельной активностью 8-9 ф.ед./мг. Связывание с носителем осуществляют адсорбцией из 0,05 М раствора трис-HCl буфера рН 7,2. Количество иммобилизованного фермента определяют по уменьшению концентрации контактного раствора. Время контакта от 35 мин до 7 сут. После адсорбции носитель с иммобилизованным ферментом промывают буферным раствором до полного исчезновения фосфатазной активности в промывных водах. Процент адсорбции 40-65% емкость 9,0 мг фермента/г волокна при концентрации щелочной фосфатазы 2,5 мг/мл. Активность иммобилизованной щелочной фосфатазы в реакции гидролиза динатриевой соли п-нитрофенилфосфата 42,1 ед/г волокна или 58,5% от нативной величины. Время полуинактивации 14 сут. PRI me R 1. 100 mg of fiber VION AN-1 is treated with a solution of alkaline phosphatase from the intestines of chickens with a specific activity of 8-9 f.ed./ mg. Linking with the carrier is carried out by adsorption from a 0.05 M solution of Tris-HCl buffer pH 7.2. The amount of immobilized enzyme is determined by reducing the concentration of the contact solution. Contact time from 35 minutes to 7 days. After adsorption, the carrier with the immobilized enzyme is washed with a buffer solution until the phosphatase activity in the washings disappears completely. The adsorption percentage is 40-65%, the capacity is 9.0 mg of the enzyme / g of fiber at a concentration of alkaline phosphatase of 2.5 mg / ml. The activity of immobilized alkaline phosphatase in the hydrolysis of the disodium salt of p-nitrophenyl phosphate is 42.1 units / g of fiber or 58.5% of the native value. The half-inactivation time is 14 days.

П р и м е р 2. 100 мг волокна ВИОН АН-1 обрабатывают 10 мл раствора пероксидазы из хрена с концентрацией 0,02 мг/мл в 0,1 М ацетатном буфере рН 4,6 и выдерживают 35 мин при температуре 20^оС. После окончания адсорбции волокно промывают буферным раствором до исчезновения активности в промывных водах. Адсорбируется 1,26 мг пероксидазы на 1 г волокна или 63,4% от концентрации в растворе. Активность иммобилизованной пероксидазы определяют в реакции окисления иодид-ионов перекисью водорода. Активность иммобилизованного фермента составляет 72% от нативной величины.PRI me R 2. 100 mg fiber VION AN-1 is treated with 10 ml of horseradish peroxidase solution with a concentration of 0.02 mg / ml in 0.1 M acetate buffer pH 4.6 and incubated for 35 minutes at a temperature of 20 ^about After the adsorption is complete, the fiber is washed with a buffer solution until the activity in the wash water disappears. Adsorbed 1.26 mg peroxidase per 1 g of fiber or 63.4% of the concentration in solution. The activity of immobilized peroxidase is determined in the oxidation of iodide ions with hydrogen peroxide. The activity of the immobilized enzyme is 72% of the native value.

П р и м е р 3. 72,2 мг волокна ВИОН АН-1 обрабатывают 1 мл раствора папаина с концентрацией 0,833 мг/мл, выдерживают 30 мин при 20^оС. Процент адсорбции 100% Количество адсорбированного папаина 11,54 мг/г волокна. Для определения активности к 1,8 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 6,85, содержащего 0,3 мМ ДТТ и 0,1 мМ ЭДТА добавляют 50 мкл раствора коммерческого субстрата Gly The Ala pNa с концентрацией 10 мг/мл, термостатируют 5 мин при 35^оС, после чего вносят иммобилизованный фермент. Активность иммобилизованного фермента папаина 45,7% от нативной величины. Время полуинактивации 16 сут.EXAMPLE EXAMPLE 3 72.2 mg of fiber VION AN-1 was treated with 1 mL of papain solution containing 0.833 mg / ml, incubated for 30 min at 20 ^C. Percentage of adsorption 100% Number of papain adsorbed 11.54 mg / g fiber. To determine the activity, to 1.8 ml of 0.1 M phosphate buffer pH 6.85 containing 0.3 mm DTT and 0.1 mm EDTA add 50 μl of a solution of commercial substrate Gly The Ala pNa with a concentration of 10 mg / ml, thermostat 5 min at 35 ^about C, after which the immobilized enzyme is introduced. The activity of the immobilized papain enzyme is 45.7% of the native value. The half-inactivation time is 16 days.

П р и м е р 4. Адсорбцию папаина на волокне ВИОН АН-1 проводят, как в примере 3. Концентрация папаина в растворе 2,5 мг/мл. Величина адсорбции 17 мг/г волокна. Десорбция иммобилизованного папаина в жестких условиях (раствор 2 М хлорида натрия с 20% изопропанола) не превышает 8-10% что указывает на высокую устойчивость иммобилизованного фермента. PRI me R 4. The adsorption of papain on the fiber VION AN-1 is carried out, as in example 3. The concentration of papain in a solution of 2.5 mg / ml The adsorption value of 17 mg / g fiber. The desorption of immobilized papain under severe conditions (a solution of 2 M sodium chloride with 20% isopropanol) does not exceed 8-10%, which indicates a high stability of the immobilized enzyme.

П р и м е р 5. К 0,1103 г волокна ВИОН АН-1 приливают раствор α-химотрипсина с концентрацией 1 мг/мл и трис-HCl буфер рН 8,0. Спустя 1 ч адсорбируется 3,35 мг/г волокна или 37% спустя 5 сут. 5,7 мг/г или 63% Активность иммобилизованного α-химотрипсина, измеренная по превращению коммерческого препарата Pyr, Phe, pNA, составляет 35-42% от нативной величины. Example 5. To 0.1103 g of VION AN-1 fiber, a solution of α-chymotrypsin with a concentration of 1 mg / ml and Tris-HCl buffer pH 8.0 were added. After 1 h, 3.35 mg / g of fiber is adsorbed, or 37% after 5 days. 5.7 mg / g or 63%. The activity of immobilized α-chymotrypsin, measured by the conversion of the commercial preparation Pyr, Phe, pNA, is 35-42% of the native value.

П р и м е р 6. Иммобилизацию α-химотрипсина проводят также, как в примере 5, предварительно выдерживая волокно в растворе трис-HCl буфера рН 8,0 7 сут. Адсорбция 81% или 7,32 мг/г волокна. При 55^оС константа скорости дезактивации на порядок ниже, чем для фермента в растворе.PRI me R 6. The immobilization of α-chymotrypsin is carried out as in example 5, previously maintaining the fiber in a solution of Tris-HCl buffer pH 8.0 7 days. Adsorption of 81% or 7.32 mg / g of fiber. At 55 ^° C, the deactivation rate constant is an order of magnitude lower than for the enzyme in solution.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет провести иммобилизацию различных классов ферментов на волокне, выпускаемом промышленностью, что делает его легко доступным, носитель не требует предварительной активации, а иммобилизованные ферменты сохраняют высокую активность и устойчивость. Thus, the proposed method allows the immobilization of various classes of enzymes on the fiber produced by the industry, which makes it easily accessible, the carrier does not require prior activation, and the immobilized enzymes retain high activity and stability.

Claims

METHOD FOR PRODUCING IMMOBILIZED ENZYMES by treating an organic carrier with an aqueous enzyme solution, characterized in that a chemisorption fiber based on a copolymer of acrylonitrile with 2,5-vinylpyridine is used as a carrier.