SU1102270A1 - Штамм Е. @ @ 1651,содержащий плазмиду @ @ 307-продуцент термолабильного токсина - Google Patents

Abstract

ГОтамм E.coli KS1651, содержащий плазмиду pLT307, № 10 коллекци  Наз но-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им.И.Ф.Гамалеи - продуцент термолабильного токсина.

Description

Изобретение относитс  к ветеринарии и медицине, а именно к получению непатогенного штамма E.coli, характе ризующегос  повышенной продукцией термолабштьного токсина. . Препарат термолабильного токсина E.coli  вл етс  веществом, необходим мым дл  получени  вакцин и сывороток против диарейных .заболеваний человека и животных, вызьшаемых патогенным E.coli. Известные штаммы E.coli, продуцирующие термолабильный токсин,  вл лись природными патогенными штаммами , вьщелёиными от .больных .животных и людей. Эти штаммы характеризуютс  относительно низкой продукцией токсина (0,4-0,5 мг на 1 л культуральной жидкости). Цель изобретени  - создание генно инженерным способом высокопродуктивного штамма термолабильного знтеротоксина , непатогенного дл  животных и человека. Предлагаемый штамм E.coli KS 1651 синтезирует в 10 раз больше термолабильного токсина, чем исходный природный штамм Н74-I14, вьщеленный от больного человека..Штамм KS 1651  вл етс  непатогенным, так как создан на основе штамма E.coli К12, который не может колонизировать тонкий кишечник животных и человека место действи  термолабильного знтеротоксина . ШтаМм KS 1651 содержит гибридную плазмиду pLT307,созданную на основе векторной плазмиды pBR322 и природной плазмиды,вьщелениой из штамма Н74-114 и детерминирун цей синтез, термолабильного токсина. Конструирование плазмиды pLT307 осуществл ли с помощью рестриктационной эндонуклеазы Р st 1. Полученна  гибридна  плазмнда содержит ; вставку размером в 6 тыс.нуклеотвд- ных пар. Количество копий плазмиды р Т308 на одну клетку штамма KS1651 составл ет около 20. Штамм E.coli KS1651 хранитс  в коллекции Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиоло гии им.Н.Ф.Гамалеи АМН СССР под регистрационным номером 10. Характеристика штамма. Морфологические признаки. Клетки пр мые палочковидной формы, i,I-1,5х X 2,0-6,0 мк, подвижные с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные , неспорообразующие, не кислотоустойчивые , оксидазоотрицательные. Культуральные признаки. Хемрорганотрофы . Метаболизм дыхательный и бродильньй, каталазо-положительные . Среда Эндо. Колонии бледно-розового цвета, блест щие с ровными кра ми, через 24 ч достигают 1,01 ,2 мм в диаметре. М со-пептонный агар. Колонии беловатого оттенка, в зкой консистенции , гладкие, круглые, прижатые с ровными кра ми. Кров ной агар. Колонии бледно-серого цвета, круглые с ровными кра ми . Гемолиз не вы влен. Среда Эванса. Азробные услови  выращивани . Через 5 ч образуют муть. Через 15 ч на дне пробирки по вл етс  микробна  взвесь сероватого цвета . М со-пептонный бульон. Аэробные услови  выращивани . Через 6 ч образуют ровную интенсивную муть. Через 24 ч на дне пробирки по вл етс  микробна  взвесь серовато-белого цвета. I. Физиолого-биохимические признаки. Бактерии штамма E.coli KS1651 растут в пределах от 5 до 43°С при оптимуме 37С и рН 6,8. В качестве источника углерода используют многие углеводы , спирты, органические кислоты. Глюкоза, мальтоза, арабиноза, рамноза и другие углеводы сбраживаютс  с образованием пирувата. Бактерии в качестве источника азота используют как минимальные соли в аммонийной и нитратной форме, так и в органической форме в виде пептона, аминокислот. Желатину не разжижают. Уреазной активностью не обладают. Индолане.образуют. Устойчивы к тетрациклину (20 мкг/мл). Непатогеиные дл  лабораторных животных . Дл  количественного определени  термолабильного энтеротоксина использовали метод двойной диффузии в агарозном геле. Дл  этой цели были использованы препараты антитоксической противохолерной сьшоротки. Как известно, аминокислотные последовательности соответствующих субъединиц термолабнльного токсина E.coli и Vibrio cholera во многом гомологичны, а сами субъединицы им31

мунологически родственны. Поэтому дл  термолабильного токсина E.coli примен ютс  антихолерна  сьшоротка.

Использование штамма KS1651 дл  получени  термолабильного токсина иллюстрируетс  следующим примером

П р им ер. Бактериальные клетки объемом 50 мл выращивают в течение ночи в 0,5 л колбах в среде Эванса, содержащей 2%-ные казаминовые кислоты , 0,6%-ный дрожжевой экстракт, 0,25%-ный NaCl, 0,87%-ный и 0,25%-ный раствор глюкозы. Клетки осаждают центрифугированием и ресуспендируют в 0,01 М трис НС1 рН 8,6. Клеточную суспензию подвергают озвучиванию в ультразвуковом дезинтеграторе.

При двухкратном титровании клеточных лизатов щтамма KS1651 положительна  реакци  в гель диффузии с антитоксической противохолерной сывороткой наблюдаетс  в разведении 1:128. В то же врем , лизаты клеток

22704

штамма Н74-114, полученные в тех же услови х, в гель-диффузии про вл ют активность в разведении 1:16. Учитыва  тот факт, что чувствительность 5 этой реакции дл  энтеротоксина составл ет 2 мкг/мл, можно считать, что концентраци  термолабильного энтеротоксина в клеточных лизатах штаммов KS 1651 и H74-I14 составл ет не ме0 нее 10 и 1 мг/л культуры соответст- . . венно.

Непатогенность и вьюока  продуктивность полученного штамма делают

5 егоперспективным дл  налаживани  производства энтеротоксина E.coli в промьшшенном масштабе.Энтеротоксин может быть использован дл  получени  химических вакцин, антисыворо0 ток и других диагностических препаратов против диарейных заболеваний животных и человека, вызываемых патогенными штаммами E.coli и WLbrio cholera.

Claims (1)

1. Штамм Ε.οοίί К31651, содержащий плазмиду рЪТ307, № 10 коллекция Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Η. Ф.Гамалеи - продуцент термолабильного токсина.

   1 1102270 2