SU1084299A1

SU1084299A1 - Method for preparing complex of extracellular enzymes

Info

Publication number: SU1084299A1
Application number: SU823520061A
Authority: SU
Inventors: Валерий Дмитриевич Семичаевский; Николай Ильич Даниляк; Ирина Анатольевна Трутнева
Original assignee: Институт Ботаники Им.Н.Г.Холодного
Priority date: 1982-12-08
Filing date: 1982-12-08
Publication date: 1984-04-07

Abstract

,VCnOCOB ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА ;ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ФЕРМЕНТОВ, предусматривающий культивирование продуцентовгрибов базидиомицетов на питательной среде, содержащей лигнинсодержащие отходы в качестве источника углерода , минеральные соли и воду с последуннцим отделением грибного мицелр от культуральной жидкости, содержащей внеклеточные ферменты, о т л ичающийс тем, что, с целью повьшени активности комплекса, а также упрощени и удешевлени способа , в качестве источника углерода используют агримус - отход производства фурфурола, содержащий целлолигнин и свободный фурфурол в соотношении 42:1, в количестве 0,55 ,0%. 2.Способ по п. 1, отлича ющ и и с тем, что, с целью получени преимущественно фермента пероксидазы , культивирование провод т путем образовани поверхностной пленки при использовании агримуса в концентрации 1,0-2,5%. 3.Способ по пп. 1 и 2, о т л ичающийс тем, что, с целью (Л получени преимущественно фермента t монофенол-монооксигеназы, культивирование провод т путем образовани поверхностной пленки при использовании агримуса в концентрации 4,05 ,0%., VCnOCOB PREPARATION OF COMPLEX; OUT-CELL ENZYMES, involving the cultivation of basidiomycetes fungi on a nutrient medium containing lignin-containing waste as a carbon source, mineral salts and water with the separation of the extracellular enzymes, and the production systems, which can be used by the production workers, will be idle, and I will be asleep, but I will be asleep, I will be as simple as you can, and I will be as simple as if you’re using an iodine cell. The aim of increasing the activity of the complex, as well as simplifying and cheapening the method, is used as a carbon source, Agrimus, a waste product of furfural production, containing tsellolignin free and furfural in a ratio of 42: 1, in an amount of 0.55 to 0%. 2. The method according to claim 1, characterized in that, in order to obtain predominantly the enzyme peroxidase, the cultivation is carried out by forming a surface film using Agrimus at a concentration of 1.0-2.5%. 3. Method according to paragraphs. 1 and 2, that is, in order to (L) produce predominantly the monophenol monooxygenase t enzyme, the cultivation is carried out by forming a surface film using agrimus at a concentration of 4.05, 0%.

Description

1 Изобретение относитс к микробиологической промышленности, в частности к способам получени ферментов , продуцируемых базидиомицетами . Известен способ культивировани базидиомицетов на питательной среде , содержащей источник углерода и минеральные соли, а также отходы производства jl . Однако данный способ не позвол е получить широкий спектр продуцируем ферментов. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к предлагаемому вл етс способ получени комплекса внеклеточных ферментов, предусматривающий культи вирование продуцентов-грибов бази- диомицетов на питательной среде, содержащей лигнинсодержащие отходы в качестве источника углерода, минеральные соли и воду с последующим отделением грибного мицели от куль туральной жидкости, содержащего вне клеточные ферменты . К недостаткам этого способа относ тс сложность технологии его. осуществлени и значительные затрат времени и средств. Кроме того, спос ограничиваетс использованием единственного штамма дереворазрушающего гриба. В нем использован недостаточ но широкий ассортимент лигнинсодержащих отходов и получаемых при этом продуктов биосинтеза микроорганизмо в частности внеклеточных ферментов, обладающих недостаточно высокой активностью. Цель изобретени - повышение активности комплекса ферментов, а также упрощение и удешевление- способа . I.. Поставленна цель достигаетс тем, что согласно способу получени комплекса внеклеточных ферментов, предусматривающему культивирование продуцентов-грибов базидиомицетов на питательной среде, содержащей лигнинсодержащие отходы в качестве источника углерода, минеральные сол и воду с последующим отделением гри ного мицели от культуральной жидкости , содержащей внеклеточные ферменты , в качестве источника углерода использзтот агримус-отход произ водства фурфурола, содержащий целлолигнин и свободный фурфурол в 99 соотношении 42:1, в количестве 0,55 ,0%. Кроме того, с целью получени преимущественно фермента пероксидазы культивирование провод т путем образовани поверхностной пленки при использовании агримуса в концентрации 1,0-2,5%. С целью получени преимущественно фермента монофенол-монооксигеназы, культивирование провод т путем образовани поверхностной пленки при ис.пользовании агримуса в концентрации 4,0-5,0%. Агримус представл ет собой многотоннажньй отход, полученный при производстве фурфурола из стержней початков кукурузы, который частично используют как лигноцеллюлозное удобрение в сельском хоз йстве. Пример 1. Готов т питательную среду следующего состава N 2,0 КН2Р040,6 К НР040,4 МрЗрф0,5 Агримус5,0 Водопроводна вода 1 л. Приготовленную таким образом среду автоклавируют, охлаждают и засевают чистыми культурами базидиомицетов Pfeurotus ostreatus (Fr.) Kumm. HMBF1300 .или CorioZus versicofor (Fr.) Que2.087. Культивирование провод т в глубинных услови х на качалке в колбах Эрленмейера в течение 7 сут. при 28°С. Дл сравнени в качестве контрол выращивание указанных базидиомицетов провод т также в аналогичных услови х на питательной среде, содержащей вместо агримуса целлюлозу (фильтровальную :бумагу) в количестве 15,0 г/л. В табл. 1 и 2 приведены результаты измерений активностей внеклегточных пероксидазы (КФ 1.11.1.7), монофенол-монооксигеназы (КФ 1.14. 18.1), Эндо-1,4-/3-глюканазы (КФ.3.2. 1.4), полигалактуроназы (КФ 3.1.1.15), экзополигалактуроназы (КФ 3.2.1.67) и пектинэстеразы (КФ 3.1111) в культуральных фильтратах указанных продуцентов, полученных после отделени мицели и остатков твердого субстрата. По сравнению с контролем среда с агримусом более эффективна дл получени большинства 3 ,; 10 исследуемых ферментов. Так, при выращивании PJeurotus ostreatus на среде с агримусом достигнуто увеличение активности пероксидазы .и монофенол-монооксигеназы , более чем в 12 раз по сравнению с контролем. П р и,м е р. 2. Готов т питательную среду по примеру 1, которую засевают чистыми культурами базидиомицетов Pieurotus ostreatus (Fr.) Kurara. HMBF-1300, Funalia trogii (Berk.) Bond et. Sing БИН-2 или Oxyporus obducens (Fr.) Donk.HBK-85. В отличие от примера 1 культивировав ние провод т в стационарных уелоВИЯХ методом поверхностной пленки в течение 10 сут при 28 С. Дл сравнени в качестве контрол выращивание указанных базидирмицетов провод т также в аналогичных услови х на питательных средах, содержащих вместо агримуса .целлюлозу (фильтровальную бумагу) в количестве 15,0 г/л или экстракт из свекловичного жома в количестве 100 мл/л. В табл. 3 приведены результаты измерений активностей внеклеточных пероксидазы и монофенол-моноксигеназы в культуральных фильтратах указанных продуцентов, полученных после отделени -мицели и остатков твердого субстрата. На среде с агримусом активность обоих ферментов згачитель но выше, чем в контрольном варианте. Так, дл культуры Pjeurotus ostreatus активность пероксидазы на среде с агримусом составл ет 18,6 ед/л. Активность внеклеточных HMBF-1300 при глубинном ферментов Fleurotus ostreatus (Fr.) Kunnn выращивании на агримусе и целлюлозе 9 тогда как в контроле с целлюлозой обнаружены следы активности этого фермента, на среде с экстрактом из свекловичного жома активность пероксидазы составл ет 14,2 ед/л. П р и м е .р 3. Готов т питательную среду по примеру 1, в которую в качестве единственного источника углерода ввод т агримус в количествах 5,0-50,0 г/л. Указанные среды засевают чистой культурой базидиомицета PJeurotus ostreatus (Fr.) Kumm. HMBF-1300. Культивирование провод т в стационарных услови х методом поверхностной пленки в течение 10 сут при 28°С. В табл. 4 приведены результаты измерений активностей внеклеточной пероксидазы и монофенолмонооксигеназы- в культуральных.фильтратах , полученных после отделени мицели и остатков твердого субстрата . Из табл, 4 видно, что наибольша активность пероксидазы культуры гриба Pleurotus ostreatus -56,2 ед/л при концентрации агримуса 1,0%, а наибольша активность монофенол-монооксигеназы - 56,0 ед/л при концентрации агримуса в среде 4,0%. Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным позвол ет повысить активность ферментов получаемого комплекса в 12 раз, а также упростить и удешевить способ за счет использовани отходов производства . Та б л л. ц а1 The invention relates to the microbiological industry, in particular to methods for producing enzymes produced by basidiomycetes. There is a method of cultivating basidiomycetes on a nutrient medium containing a carbon source and mineral salts, as well as waste products jl. However, this method does not allow to obtain a wide range of producing enzymes. The closest in technical essence and achievable effect to the proposed is a method of obtaining a complex of extracellular enzymes, which involves cultivating the producers of basidomycete fungi on a nutrient medium containing lignin containing waste as a carbon source, mineral salts and water, followed by separating the fungal mycelium from crops. Tural fluid containing out cellular enzymes. The disadvantages of this method include the complexity of its technology. implementation and significant time and cost. In addition, spos is limited to using a single strain of wood-destroying fungus. It uses an insufficiently wide range of lignin-containing wastes and microbial biosynthesis products obtained in this way, in particular extracellular enzymes with insufficiently high activity. The purpose of the invention is to increase the activity of the enzyme complex, as well as to simplify and reduce the cost of the method. I. The goal is achieved by the method of obtaining a complex of extracellular enzymes, involving the cultivation of basidiomycete mushroom producers on a nutrient medium containing lignin-containing waste as a carbon source, mineral salt and water, followed by separation of the green micelle from the culture fluid containing extracellular enzymes, as a carbon source, use furfurol agrimus waste, containing cello lignin and free furfurol in 99 ratio of 42: 1, The amount of 0.55, 0%. In addition, in order to obtain predominantly peroxidase enzyme, cultivation is carried out by forming a surface film using agrimus at a concentration of 1.0-2.5%. In order to obtain mainly the enzyme monophenol monooxygenase, the cultivation is carried out by forming a surface film using agrimus at a concentration of 4.0-5.0%. Agrimus is a tonnage waste produced in the production of furfural from corn cobs, which is partially used as agricultural lignocellulose fertilizer. Example 1. Preparing a nutrient medium of the following composition N 2.0 КН2Р040.6 К НР040.4 МрЗрф0.5 Agrimus5.0 Tap water 1 l. The medium thus prepared is autoclaved, cooled and seeded with pure cultures of Basidiomycetes Pfeurotus ostreatus (Fr.) Kumm. HMBF1300. Or CorioZus versicofor (Fr.) Que2.087. Cultivation was carried out in deep conditions on a rocking chair in Erlenmeyer flasks for 7 days. at 28 ° C. For comparison, as a control, the cultivation of these basidiomycetes was also carried out under similar conditions on a nutrient medium containing cellulose (filter: paper) in the amount of 15.0 g / l instead of agrimus. In tab. 1 and 2 shows the results of measurements of the activities of extracellular peroxidase (EC 1.11.1.7), monophenol monooxygenase (EC 1.14. 18.1), Endo-1,4- / 3-glucanase (EC 1.5.2), polygalacturonase (EC 3.1.1.15 ), exopolygalacturonase (EC 3.2.1.67) and pectinesterase (EC 3.1111) in the culture filtrates of these producers, obtained after separation of the mycelium and residues of the solid substrate. Compared to the control, the medium with Agrimus is more effective for obtaining a majority of 3; 10 studied enzymes. Thus, when growing PJeurotus ostreatus on a medium with agrimus, an increase in the activity of peroxidase and monophenol monooxygenase was achieved, more than 12 times as compared with the control. PRI and, mer. 2. Prepare the nutrient medium of Example 1, which is inoculated with pure cultures of basidiomycetes Pieurotus ostreatus (Fr.) Kurara. HMBF-1300, Funalia trogii (Berk.) Bond et. Sing BIN-2 or Oxyporus obducens (Fr.) Donk.HBK-85. In contrast to example 1, the cultivation was carried out in stationary fields by the surface film method for 10 days at 28 C. To compare as a control, the growth of these basidirtsetes was also carried out under analogous conditions on nutrient media containing, instead of agrimus, cellulose (filter paper ) in the amount of 15.0 g / l or extract from beet pulp in the amount of 100 ml / l. In tab. Figure 3 shows the results of measurements of the activities of extracellular peroxidase and monophenol monoxygenase in the culture filtrates of the said producers, obtained after separation of the micelle and residues of the solid substrate. On a medium with agrimus, the activity of both enzymes is zgachitel but higher than in the control variant. Thus, for the culture of Pjeurotus ostreatus, the peroxidase activity on the agrimus medium is 18.6 U / L. The activity of extracellular HMBF-1300 with the Fleurotus ostreatus (Fr.) Kunnn downhole enzymes grown on agrimus and cellulose 9, while in the control with cellulose traces of this enzyme activity were found, on a medium with an extract from beet pulp the peroxidase activity was 14.2 units / l . EXAMPLE 3 A nutrient medium is prepared as in Example 1, into which agrimus is added as the sole carbon source in amounts of 5.0-50.0 g / l. These media are seeded with pure basidiomycete culture of PJeurotus ostreatus (Fr.) Kumm. HMBF-1300. The cultivation was carried out under stationary conditions by the method of surface film for 10 days at 28 ° C. In tab. Figure 4 shows the results of measuring the activities of extracellular peroxidase and monophenol monooxygenase-in culture filtrates obtained after separation of the mycelium and residues of the solid substrate. From Table 4, it can be seen that the highest peroxidase activity of the culture of the fungus Pleurotus ostreatus is 56.2 u / l at an agrimus concentration of 1.0%, and the highest monophenol monooxygenase activity is 56.0 u / l at an agrimus concentration in the medium 4.0 % Thus, the proposed method, in comparison with the known, allows to increase the activity of the enzymes of the resulting complex 12 times, as well as to simplify and reduce the cost of the method by using production wastes. That b l l. c a

ед/лu / l

Пероксидаза БензидинBenzidine Peroxidase

--

ВензидинBenzidine

% депоНатриева соль карболимеризации ксиметилцеллюлозы% depot Sodium salt of carboxymerization xymethylcellulose

12441244

0,90.9

11,211.2

12851285

0,70.7

9,09.0

203,5203.5

19,919.9

40,540.5

силированный ед/мл 0,05siliconized units / ml 0.05

Продолжение табл. 1Continued table. one

125,0125.0

0,04 Активность внеклеточных ферментов базидиомицетов при выращивании0,04 The activity of extracellular enzymes of basidiomycetes during cultivation

методом поверхностной пленки на агримусе, целлюлозе и экстракте из жома .using the surface film method on agrimus, cellulose and pulp extract.

Pteurotus ostreatus (Fr.) Kumra HMBF-1300 Перексидаза Бензидин ед/л 18,6 СледыPteurotus ostreatus (Fr.) Kumra HMBF-1300 Peroxidase Benzidine units / l 18.6 Traces

||||

Funalia trogli (Berk) Bond. et. Sing БИН-2 - 14,0 Следы МонофенолмонооксигеOxyporus Пероксидаза - МонофенолмонооксигеназаFunalia trogli (Berk) Bond. et. Sing BIN-2 - 14.0 Traces of Monophenol monooxige Oxyporus Peroxidase - Monophenol monooxygenase

Активность внеклеточных ферментов Pteurotus ostreatus (Fr) Kumm ИШР-1300 при выращивании методом поверхностной пленки в зависимости от содержани arpimyca в питательной средеThe activity of extracellular enzymes Pteurotus ostreatus (Fr) Kumm ISR-1300 when grown by the method of surface film, depending on the content of arpimyca in the medium

Таблица 3 Table 3

14,214.2

18,0 Следы 18.0 Footprints

13,013.0

гg

8,08.0

5,05.0

СледыTraces

Таблица 4 otducens (Fr.) Donk ИБК-85 14,6 Следы 10,0 Следы Table 4 otducens (Fr.) Donk IBK-85 14.6 Footprints 10.0 Footprints

Claims

D. METHOD FOR PRODUCING A COMPLEX OF EXTRACELLULAR ENZYMES, which involves the cultivation of producers of basidiomycetes fungi in a nutrient medium containing lignin-containing wastes as a carbon source, mineral salts and water, followed by separation of fungal mycelium from the culture fluid containing extracellular enzymes, which are isolated the fact that, in order to increase the activity of the complex, as well as simplify and reduce the cost of the method, agrimus is used as a carbon source - a waste from the production of furfural containing cellolignin and free furfural in a ratio of 42: 1, in an amount of 0.55.0%.

2. The method of pop. 1, the difference is that in order to obtain a predominantly peroxidase enzyme, cultivation is carried out by forming a surface film using agrimus in a concentration of 1.0-2.5%.

3. The method according to PP. 1 and 2, characterized in that, in order to obtain mainly the enzyme monophenol-monooxygenase, the cultivation is carried out by forming a surface film using agrimus at a concentration of 4.05.0%.

>