SU1079246A1

SU1079246A1 - Method of producing water-soluble antigens

Info

Publication number: SU1079246A1
Application number: SU813381974A
Authority: SU
Inventors: Ирина Борисовна Каргина; Светлана Николаевна Москвина; Виталий Яковлевич Арион
Original assignee: 2-Й Московский Ордена Ленина Государственный Медицинский Институт Им.Н.И.Пирогова
Priority date: 1981-10-30
Filing date: 1981-10-30
Publication date: 1984-03-15

Abstract

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ АНТИГЕНОВ из ткани животных и человека путем ее гомогенизации , обработки хлористым калием с . последующим центрифугированием и выделением целевого продукта, отличающийс тем, что, с целью повышени выхода целевого продукта , гомогенат перед добавлением хлористого кали подкисл ют до значени рН от 5.0 до k,0.METHOD FOR OBTAINING WATER-SOLUBLE ANTIGENS from animal and human tissue by homogenization and treatment with potassium chloride c. subsequent centrifugation and isolation of the desired product, characterized in that, in order to increase the yield of the target product, the homogenate is acidified before adding potassium chloride to a pH value from 5.0 to k, 0.

Description

// (ppQHt Uif 1 Изобретение относитс к медицине, а Точнее к иммунохимии и касаетс выделени растворимых антигенов, и может найти применение в медицине, например в онкологии, дл дифференциальной диагностики пролиферативных заболеваний и оценки состо ни клеточного иммунитета, в трансплатологии дл определени уровн специфических антител при кризах отторжени , а также в биохимии и биологии дл изучени физико-химических свойств и биологической активности антигенов клеточных мембран. Известен способ получени водорастворимых антигенов из ткани живот ных и человека путем ее гомогенизации , обработки ЗМ раствором хлористого кали с последующим центрифугированием и выделением целевого продукта С П. Однако известный способ не обеспе чивает высокого выхода целевого продукта (10-13%) поскольку после добав лени к клеткам ЗМ КС образуетс в зкий гомогенат, который подвергают диализу, что приводит к потере антигенного материала. Цель изобретени - -повышение коли чественного выхода целевого продукта Указанна цель достигаетс тем, что при осуществлении способа получе ни водорастворимых антигенов из тка ни животных и человека путем ее гомо генизации, обработки хлористым калием с последующим центрифугированием и выделением целевого продукта, гомо генат перед добавлением хлористого кали подкисл ют до значени рН от 5,0 до i},0. При мер 1. г свежей ткани , полученной в .результате биопсии или хирургической резекции, или вз той от трупа не позднее 2- ч после . смерти, гомогенизируют на лед ной бане в стекл нном гомогенизаторе Пот . тера в Q, растворе NaCI - . О,О М трис-HCI буфере рН 7.3. температура которого (вес: объем 1:9). В полученный гомогенат добавЛ ют 0,1 М НС1 до достижени рН ,5. В подкисленный гомогенат при.посто нном перемешивании внос т по мере растворени сухой КС1 до конечной кон центрации ЗМ и оставл ют при посто нном перемешивании на 16 ч при 4 С (в холодильнике). Гомогенат центрифугируют при 48 000 об/мин (центрифуга +6 Beckman povop 60 Ti) 90 мин, при k С, супернатант обессоливают на колонке с сефадексом G-10 (2,5-10 см/, концентрируют на мембранных фильтрах ИМ-2 (при . t с) и разбавл ют на сефадексе G-200 (2,5-100 см). Элюцию осуществл ют 0,о4 М трис-НС1 буфером рН 7,, содержащим 0,8 NaCI, Материал , содержащий водорастворимые трансплантационные антигены, выходит во внешнем объеме колонки (пробирки 13-16 на фиг. 1 сплошна лини ) Количество полученных частично очищенных трансплантационных антигенов составл ет 59,5% от исходной активности гомогената. П р и м е р 2. Все процедуры выполн ют как в примере 1 за исключением того, что материал, вз тый в качестве источника водорастворимых антигенов хранитс от нескольких дней до нескольких мес цев при 20°С . Выход антигенного материала срставл ет 59%. П р и м е р 3. Все процедуры выполн ют как в примере 1 за исключением того,что рН гомогената довод т до значени ,7. Выход антигенного материала составл ет 59,2%. П р И М е р А, Все про:,здуры выполн лись как в примере 1 за исключением того, что рН гомогената довод т до значени ,9. Выход антигенного материала составл ет 58,9%. П р и м е р 5.. Все процедуры выполн ют как в примере Г за исключением того, что рН гомогената довод т до значени 5,0. В этом случае дезокси- и рибонуклеопротеиды выход т в раствор, гомогенат становитс в зким и выделение ведетс по прототипу . Выход антигенного материала составл ет 13,3% П.римерб, Все процедуры как примере 1 за исключением того, что рН гомогената довод т до значени 4,0. Выход антигенного материала составл ет 45%. Пример. Все процедуры выполн ют как в примере 1 за исключением того, что рН гомогената довод т до значени 3,5. Выход антигенного материала составл ет 11%. П р и м е р 8. Все процедуры выполн ют как в примере 1 за исключением того, что рН гомогената довод т до значени 2,0. Выход антигенного материала составл ет 2%.// (ppQHt Uif 1 The invention relates to medicine, more specifically to immunochemistry, and to the isolation of soluble antigens, and can be used in medicine, for example in oncology, for differential diagnosis of proliferative diseases and assessment of cellular immunity, in transplatology to determine the level of specific antibodies in crises of rejection, as well as in biochemistry and biology for the study of physicochemical properties and biological activity of cell membrane antigens. in from animal and human tissue by homogenizing it, treating the ZM with a solution of potassium chloride followed by centrifugation and isolating the desired product With P. However, the known method does not provide a high yield of the target product (10-13%) because after adding to the ZM KS cells a viscous homogenate is formed, which is subjected to dialysis, which leads to a loss of antigenic material. The purpose of the invention is to increase the quantitative yield of the target product. This goal is achieved by the fact that before homogenization, treatment with potassium chloride followed by centrifugation and isolation of the target product, the homogenization of soluble antigens from animal and human tissues is acidified to pH 5.0 to i}, 0 before adding potassium chloride. Example 1. A fresh tissue obtained as a result of a biopsy or surgical resection, or taken from a corpse no later than 2 hours after. death, homogenized in an ice bath in a glass homogenizer Pot. tera in Q, solution NaCI -. O, O M Tris-HCl buffer pH 7.3. whose temperature (weight: volume 1: 9). 0.1 M HCl is added to the resulting homogenate until a pH of 5 is reached. In the acidified homogenate, with constant stirring, the dry KC1 is dissolved to the final concentration of the ZM and left under continuous stirring for 16 hours at 4 ° C (in the refrigerator). The homogenate is centrifuged at 48,000 rpm (+6 Beckman povop 60 Ti centrifuge) for 90 minutes, at k C, the supernatant is desalted on a Sephadex G-10 column (2.5-10 cm /, concentrated on IM-2 membrane filters ( t) and diluted on Sephadex G-200 (2.5-100 cm). The elution is carried out with 0, 4 4 M Tris-HCl buffer pH 7 containing 0.8 NaCl, a material containing water-soluble transplantation antigens, out in the external volume of the column (tubes 13-16 in Fig. 1 is a solid line) The number of partially purified transplant antigens obtained is 59.5% of the initial activity and homogenate. EXAMPLE 2: All procedures are carried out as in Example 1, except that the material taken as a source of water-soluble antigens is stored for several days to several months at 20 ° C. The yield of antigenic material is It is 59%. EXAMPLE 3 All procedures are carried out as in Example 1, except that the pH of the homogenate is adjusted to a value of 7. The yield of antigenic material is 59.2%. PRI M A R A, All products:, the health systems were performed as in Example 1, except that the pH of the homogenate was adjusted to a value of 9. The yield of antigenic material is 58.9%. EXAMPLE 5 All procedures are carried out as in Example D, except that the pH of the homogenate is adjusted to a value of 5.0. In this case, the deoxy and ribonucleoproteins are released into solution, the homogenate becomes viscous and the selection is carried out according to the prototype. The yield of antigenic material is 13.3% P. Example. All procedures as Example 1, except that the pH of the homogenate is adjusted to 4.0. The yield of antigenic material is 45%. Example. All procedures are performed as in Example 1 with the exception that the pH of the homogenate is adjusted to 3.5. The yield of antigenic material is 11%. Example 8: All procedures are carried out as in Example 1, except that the pH of the homogenate is adjusted to a value of 2.0. The yield of antigenic material is 2%.

При м е р 9- Все процедуры выпо н ют как в примере 1 за исключением того, что сначала к исходному гомогеиату добавл ют сухой 1(С1 до конечной концентрации ЗМ, а затем в полученный в зкий гомогенат добавл ют 0,1 М НС1 до исчезновени в зкости. Это достигаетс при значении рН 2,0 Выход антигенного материала составл ет 1,Example 9- All procedures are carried out as in Example 1, except that dry 1 is first added to the initial homogate (C1 to the final concentration of PW, and then 0.1 M HC1 is added to the resulting viscous homogenate disappearance of viscosity. This is achieved at a pH of 2.0. The yield of antigenic material is 1,

Предлагаемый способ получени водорастворимых антигенов пoзвoл et получать, в отличие от прототипа, довольно высокое количество растворимых антигенов (45-60) вне зависимости от того, использовались ли в качестве исходного материала живые клетки или ткани животных и человека, хранившиес при -20 С.The proposed method of obtaining water-soluble antigens from et al. To obtain, unlike the prototype, a rather high amount of soluble antigens (45-60), regardless of whether living cells or human and animal tissues stored at -20 ° C were used as the starting material.

Последнее очень важно, так как позвол ет накапливать материал и длительно сохран ть его при отсутствии возможности провести выделение антигенов непосредственноThe latter is very important because it allows you to accumulate material and maintain it for a long time if it is not possible to isolate the antigens directly.

после забора материала. Проведена сравнительна оценка распределени на сефадексе G-200 антигенного материала , полученного по предлагаемому способу и по прототипу. .after taking the material. A comparative assessment of the distribution of antigenic material obtained by the proposed method and the prototype on Sephadex G-200 was carried out. .

На чертеже представлены профили элюции препаратов растворимых трансплантационных антигенов на сефадёксе G-200.The drawing shows the elution profiles of soluble transplant antigen preparations on Sephadex G-200.

Сплошна лини - профиль элюции антигенного материала, полученного по предлагаемому способу, пунктирна лини - разделение препарата, полученного по прототипу. На колонку The solid line is the elution profile of the antigenic material obtained by the proposed method, the dotted line is the separation of the preparation obtained by the prototype. On column

с сефадексом G-200 12,5100 см) уравновешенную 0,0 М трис-НС1 буфером , содержащим 0,8 NaCI, нанесены равные объемы проб препаратов (.11 мл I, полученных двум разными методами, содержащие одинаковую концентрацию белка (10 мг/мл). Элюци провс5дитс тем же буферным раствором при скорости 20 мл/ч. Антигенный материал, определ емый по методу ингибировани цитотоксического действи специфической антисыворотки содержитс в 13-16 фракци х, т.е. в свободном объеме колонки. Из представленных на чертеже профилей элюции видно, что препарат, полученный по предлагаемому методу, присутствует в максимально недеградированной форме,- по сравнению с антигенным препаратом , полученным по прототипу. . Удельна активность препарата, полученного по предлагаемому способу в объединенных фракци х составл ет 21 АЕ/мг по сравнению с удельной активностью препарата, полученного по прототипу и равной 110 АЕ/мг (ЛЕ - антигенна единица).with Sephadex G-200 12.5100 cm) equilibrated with 0.0 M Tris-HC1 buffer containing 0.8 NaCI, equal volumes of sample preparations were applied (.11 ml I, obtained by two different methods, containing the same protein concentration (10 mg / ml). Elution is carried out with the same buffer solution at a rate of 20 ml / h. Antigenic material, determined by the method of inhibiting the cytotoxic effect of a specific antisera, is contained in 13-16 fractions, i.e., in the free volume of the column. elution shows that the drug obtained by the offer This method is present in the maximally non-degraded form, compared to the antigenic preparation obtained by the prototype. The specific activity of the preparation obtained by the proposed method in combined fractions is 21 AU / mg compared to the specific activity of the preparation obtained by the prototype and equal to 110 AU / mg (LU - antigenna unit).

Таким образом, способ получени водорастворимых антигенов позвол ет расширить сырьевую базу (возможность использовани нар ду с живыми клетками материал, хранившийс при -20 С увеличить количественный выход растворимого антигенного материала с 10-13 до 55-59, получить антигенный материал внедеградированной форме с большой удельной активностью уменьшить затрачиваемое по получению антигенов рабочее врем на 1520% за счет ликвидации этапа диализаThus, the method of obtaining water-soluble antigens allows you to expand the raw material base (the ability to use, along with living cells, the material stored at -20 C to increase the quantitative yield of soluble antigenic material from 10-13 to 55-59, to obtain an antigenic material of degraded form with a large specific activity to reduce the time spent on obtaining antigens working time by 1520% due to the elimination of the dialysis phase

Claims

METHOD FOR PRODUCING WATER-SOLUBLE ANTIGENS from animal and human tissue by homogenizing it, treating it with potassium chloride followed by centrifugation and isolating the target product, characterized in that, in order to increase the yield of the target product, the homogenate is acidified before adding potassium chloride to a pH from 5.0 to 4, 0.

9Н6 £ 0Г ^{, _} П§ ·

1 1079246