SK9672002A3

SK9672002A3 - Synergistic insect control

Info

Publication number: SK9672002A3
Application number: SK967-2002A
Authority: SK
Inventors: Michael Frank Treacy
Original assignee: Basf Ag
Priority date: 2000-01-07
Filing date: 2000-12-21
Publication date: 2003-01-09
Also published as: IL150379A0; AR026806A1; JP2003519638A; WO2001050865A2; WO2001050865A3; CZ20022301A3; KR20020065923A; BR0016924A; PL357639A1; CA2396562A1; CN1420725A; AU3727001A; EG22209A; EP1244360A2; HUP0203815A2

Description

Synergické ničenie hmyzu

Oblasť techniky

Predložený vynález opisuje synergické ničenie hmyzu s použitím transgénnej plodiny, ktorá produkuje toxín hmyzu, a synergicky účinného množstva rekombinantného vírusu hmyzu, obsahujúceho vektor, ktorý je vysoko virulentný voči uvedenému hmyzu.

Doterajší stav techniky

Metóda ničenia škodlivého hmyzu chemickými prostriedkami sa už dlho úspešne používa na ochranu plodín pred ich poškodením zapríčineným napadnutím hmyzom a infestáciou. Okrem toho sa nedávno zaviedli spôsoby ničenia hmyzu poškodzujúceho úrodu, ktoré sú špecifické pre cieľový hmyz a vyhýbajú sa environmentálnym a ekologickým kompromisom, ktoré si vyžaduje tradičné použitie pesticídov. Jeden z týchto spôsobov využíva geneticky modifikovanú plodinu, ktorá produkuje toxíny špecifické pre hmyz, napr. Cry toxín z Bacillus thuringiensis. Avšak plodina exprimujúca Bacillus thuríngiensis-Cry-toxin môže vykazovať premenlivé stupne ochrany pred mnohými motýľovitými druhmi škodlivého hmyzu. Napríklad odrody bavlníka exprimujúce CrylA(c) sú vysoko rezistentné voči siskavcu, Heliothis virescens, ale len mierne rezistentné voči Helicoverpa zea (cotton bollworm) (J. H. Benedict a kol., 1966, Journal of Economic Entomology, 89 (1), str. 230).

Ďalším takýmto spôsobom boja proti hmyzu je aplikácia biologických agensov, ako napríklad vírusu nukleopolyedrózy (nucleopolyhedrosis vírus, NPV) (americký patent US 4,668,511) alebo rekombinantného vírusu nukleopolyedrózy (recombinant nucleo£olyhedrosis vírus, rNPV) (americké patenty US 5,662,897 a US 5,858,353). Ale NPV a rNPV sa môžu líšiť úrovňou virulencie/účinnosti voči rôznym druhom hmyzu, a to v závislosti na hostiteľskom rozsahu vírusového vektorizujúceho agensa a účinnosti toxínu kódovaného vloženým génom. Napríklad druh hmyzu Helicoverpa zea je veľmi vnímavý na NPV označený HzNPV a rNPV označený HzAalT, ale len stredne vnímavý na Autographa californica NPV (AcNPV) alebo jeho rNVP AcAalT (Treacy a kol., 1999, Proceedings Beltwide

Cotton Conf., str. 1076 - 1083). I keď je opísaná kombinácia použitia rekombinantného vírusu nukleopolyedrózy, obsahujúceho vektor, ktorý je stredne virulentný voči cieľovým druhom hmyzu, na transgénnu líniu plodiny (All and Treacy, 1977, Proceedings Beltwide Cotton Conf. str. 1294), ani samotná transgénna plodina ani samotný rNPV agens alebo ich kombinácia, neposkytujú takú úroveň ničenia hmyzu, ktorá je potrebná na to, aby sa zabránilo stratám na úrode na komerčnej úrovni.

Podstata vynálezu

Predložený vynález sa preto týka spôsobu synergického boja proti hmyzu, ktorý je schopný zabrániť poškodeniu úrody a z toho vyplývajúcej ekonomickej strate.

Vynález sa ďalej týka spôsobu zvýšenej ochrany transgénnej plodiny pred devastáciou a poškodením spôsobeným napadnutím hmyzom a infestáciou.

Charakteristickým znakom predloženého vynálezu je to, že synergické ničenie hmyzu a spôsoby ochrany plodín sú špecifické pre cieľové druhy hmyzu, a demonštrujú zvýšenú environmentálnu a ekologickú kompatibilitu, pričom poskytuje komerčne prijateľné úrovne boja proti hmyzu a ochrany plodín.

Ďalšie zámery a špecifiká vynálezu budú zrejmé odborníkom v danej oblasti techniky na základe nasledovného opisu a pripojených patentových nárokov.

Predložený vynález sa týka spôsobu synergického ničenia hmyzu, ktorý spočíva vtom, že sa na lokus transgénnej plodiny aplikuje synergicky účinné množstvo rekombinantného vírusu hmyzu obsahujúceho vektor, ktorý je vysoko virulentný voči uvedenému hmyzu.

Vynález sa ďalej týka spôsobu zvýšenej ochrany transgénnej plodiny pred poškodením spôsobeným napadnutím hmyzom a infestáciou.

I keď chemické metódy boja proti škodcom sú účinným prostriedkom na ničenie škodlivého hmyzu, významným z agronomického hľadiska, zaviedli sa cielenejšie špecifické spôsoby ničenia hmyzu. Medzi tieto špecifické spôsoby na ničenie hmyzu patrí použitie transgénnej plodiny, ktorá sa geneticky zmenila tak, aby produkovala toxín hmyzu, ako napríklad Bacillus thuringiensis (Bt) alebo použitie prirodzene sa vyskytujúceho vírusu, ako napríklad vírusu nukleopolyedrózy (NPV) alebo rekombinantného NPV (rNPV). Ale transgénna plodina, ktorá produkuje Bt toxín, môže vykazovať menej uspokojivý stupeň ochrany pred cieľovým hmyzom. Podobne, prirodzene sa vyskytujúce a rekombinantné vírusy hmyzu často vykazujú premenlivé stupne účinnosti, ak sa použili ako jediný spôsob na boj proti hmyzu.

Hoci použitie kombinácie rNPV, obsahujúceho vektor, ktorý je mierne virulentný voči cieľovým druhom hmyzu, a transgénnej plodiny bolo opísané, dosiahnuté výsledky neboli uspokojivé pre boj proti hmyzu na komerčnej úrovni, ak sa uvedený rNPV aplikoval samostatne alebo ak sa uvedený rNPV aplikoval v kombinácii s transgénnou plodinou geneticky zmenenou tak, aby produkovala toxín hmyzu.

Teraz sa zistilo, že aplikácia rekombinantného vírusu hmyzu, obsahujúceho vektor, ktorý je vysoko virulentný voči cieľovým druhom hmyzu, na transgénnu plodinu, výhodne transgénnu plodinu, ktorá sa geneticky zmenila tak, aby produkovala toxín hmyzu (insekticíd), vykazuje signifikantne synergický účinok (t.j. výsledné ničenie hmyzu je omnoho väčšie, než aké by sa mohlo predpokladať z ničenia hmyzu virulentným rekombinantným vírusom hmyzu, ak sa použil samotný alebo ak sa hmyz ničil pomocou transgénnej plodiny, ak sa táto použila samostatne). Tento synergický účinok umožňuje komerčne využiteľnú úroveň boja proti hmyzu prostredníctvom nechemických biologických prostriedkov. Okrem toho, spôsob synergického boja proti hmyzu podľa predloženého vynálezu umožňuje účinný management rezistencie, kompatibilných s udržateľnými poľnohospodárskymi postupmi, ktoré sú vhodné z environmentálneho a ekologického hľadiska.

V súlade so spôsobom podľa tohto vynálezu, použitie synergický účinného množstva rekombinantného vírusu hmyzu, výhodne rekombinantného vírusu nukleopolyedrózy (rNPV), obsahujúceho vektor, ktorý je vysoko virulentný voči cieľovým druhom hmyzu, na transgénnu odrodu plodiny, výhodne transgénnu plodinu, ktorá je geneticky zmenená tak, aby produkovala toxín hmyzu, poskytuje synergické ničenie škodlivého hmyzu. To znamená, že aplikácia virulentného rekombinantného vírusu hmyzu na transgénnu plodinu poskytuje kombináciu insekticídnych zložiek, ktoré majú väčší insekticídny účinok (synergický účinok) pri porovnaní s tým, ktorý by sa bol očakával pri individuálnom použití jednotlivých insekticídnych zložiek.

Rekombinantné vírusy hmyzu obsahujúce vysoko virulentný vektor, ktorý je vhodný na použitie pri spôsobe podľa vynálezu, zahrňujú rNPV, ako napríklad HzNPV, HzAalT, EGTdel alebo ich kombináciu.

Medzi transgénne plodiny, ktoré produkujú toxín hmyzu vhodný na použitie pri spôsobe podľa vynálezu, patria línie kukurice exprimujúce Bta línie bavlníka (BTK línie), ako napríklad NuCotn 33B™, transgénna odroda bavlníka odvodená od Deltapine DP5415™ podľa Bollgard™ transformačného javu alebo napríklad tie transgénne odrody kukurice, ktoré exprimujú MON 810™ transformačný jav (YieldGard™, Monsanto Co.).

Súčasná prax je taká, že virulentný rekombinantný vírus hmyzu sa môže aplikovať vo forme upravenej kompozície, ako napríklad vo forme zmáčateľného prášku, na lokus, listy alebo steblá, výhodne listy, transgénnej plodiny, predovšetkým transgénnej plodiny, ktorá sa geneticky zmenila tak, aby produkovala toxín hmyzu. Výhodný prípravok je opísaný v americkej patentovej prihláške, č. konania 09/094,279 podanej 9. júna 1998, ktorá je súbežne v konaní, a ktorá je tu týmto začlenená formou odkazu.

Synergický účinné množstvo virulentného rekombinantného vírusu hmyzu sa môže meniť podľa rozhodujúcich podmienok, ako napríklad stupňa rezistencie transgénnej plodiny voči hmyzu, načasovania aplikácie, podmienok počasia,

I spôsobu aplikácie, hustoty populácie hmyzu, cieľových druhov plodín, cieľových druhov hmyzu a podobne. Vo všeobecnosti, synergické ničenie hmyzu sa môže dosiahnuť vtedy, ak sa virulentný rekombinantný vírus hmyzu aplikuje na transgénnu plodinu v pomere 1 x 10¹° okludovaných častíc (occlusion bodies, OB) na hektár (OB/ha) až 1 x 10¹³OB/ha, výhodne 5 x 10¹⁰OB/ha až 12 x 10¹¹ OB/ha.

Aby sa ozrejmilo pochopenie tohto vynálezu, sú uvedené nasledovné príklady, ktorých hlavným cieľom je špecifickejšie ilustrovať jeho detaily. Vynález nie je týmto limitovaný a jeho rozsah vyplýva z patentových nárokov.

V nasledujúcich príkladoch sa stanovil synergizmus dvojzložkových insekticídnych kombinácií pomocou Colbyho metódy (Colby, S. R., Weeds, 1967, (15), str. 20-22), t.j. očakávané (alebo predpokladané) výsledky (percento eliminovaného hmyzu) pre kombináciu sa vypočíta zo súčtu výsledkov pre každú insekticídnu zložku aplikovanú samostatne a odpočítaním súčinu týchto dvoch výsledkov delených 100. Matematicky je to vyjadrené' nižšie, kde dvojzložková kombinácia pozostáva zo zložky X plus zložky Y.

XY (X + Y) --------------- = očakávané výsledky

100

Ak sú skutočne získané výsledky väčšie ako očakávané výsledky vypočítané zo vzorca, hovoríme o synergii.

V predloženom vynáleze percento ničenia hmyzu (bez vonkajšej aplikácie insekticídu), ktoré vykazuje transgénna plodina podľa tohto vynálezu, týkajúce sa zodpovedajúcej kontrolnej plodiny by sa mohlo vyjadriť pomocou X a percento ničenia pomocou rekombinantného vírusu hmyzu podľa tohto vynálezu, ak sa použije kontrolná plodina, by sa mohlo vyjadriť pomocou Y. Už uvedený Colbyho vzorec sa môže použiť na výpočet očakávaného percenta pre kombináciu vírusu a transgénnej plodiny. Ak pozorované výsledky (skutočné percento ničenia) kombinácie transgénnej plodiny ošetrenej s vírusom sú väčšie ako vypočítané očakávané výsledky, potom kombinácia je synergická.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Vyhodnotenie synergického insekticídneho účinku virulentného rekombinantného vírusu hmyzu aplikovaného na transgénnu plodinu

Na toto vyhodnotenie sa použil testovací systém, ktorý aproximuje postrek na list a parametre rastlinnej štruktúry, ktoré sa charakteristicky vyskytujú pri pestovaní bavlny na poliach. Vyhodnotil a porovnal sa insekticídny účinok (a) aplikácie prípravku zmáčateľného prášku (wettable powder, WP) HzAalT v množstvách 5x10¹¹ OB/ha a12x10¹¹ OB/ha a (b) odrody bavlníka „NuCotn

33B“ exprimujúceho Bacillus thuringiensis CrylA(c), s kombináciami používanými na štandardnú odrodu bavlníka „Deltapine DP5451“.

Rastliny sa pestovali zo semena v 3,8 litrových plastových črepníkoch naplnených komerčnou črepníkovou pôdou. Kvôli porovnaniu sa do výskumu zahrnul aj bežný bavlník Deltapine DP5415. S vírusovými aplikáciami na bavlník sa začalo asi po 1,5 mesiaci od dátumu vysadenia bavlníka. Črepníkové rastliny sa postrekovali v uzatvorenej komore so stropným rotačným hydraulickým ramenom. Na rameno sú namontované tri dýzy vytvárajúce postrekovači kužeľ (TX3, Spraying Systems, Wheaton, IL); jedna dýza je namontovaná na priamy postrek na rastliny a dve dýzy sú namontované na postrekovaciu trubicu v uhle sklonu asi 45 ° na bočný postrek rastlín. Rozprašovač je kalibrovaný na dodávanie 189 litrov/ha pri

3,5 kg/cm²; na pohon rozprašovania sa použil stlačený vzduch. Upravený rNPV insekticíd sa suspendoval vo vode zbavenej chlóru spolu s chuťovým stimulátorom Coax™ (CCT Corp., Carsbad, CA) a upravil sa na dávku 3,5 l/ha. Rastliny sa postrekovali trikrát v sedemdňových intervaloch. Bavlníkové rastliny v črepníkoch sa usporiadali úplne náhodným spôsobom v štyroch replikáciách na stolových doskách, ktoré sa zavodnili vodou do výšky asi 2 cm, aby sa zabránilo migrácii lariev medzi rastlinami. Dve rastliny vytvárali replikatívne dávky pri ošetrení s replikatívnymi subvzorkami, ktoré sa odobrali zo samostatných testov. Environmentálne parametre skleníka počas tohto výskumu sú naprogramované na najnižšiu dennú priemernú teplotu asi 27 °C a na najvyššiu dennú priemernú teplotu asi 32 °C.

Rastliny sa infestovali s neonatálnymi, laboratórne vypestovanými H. zea asi 1 hodinu po každej sérii rozprašovania. Pomocou malého štetca sa larvy umiestnili na listy a neotvorený kvetný púčik bavlníka cez hornú časť každej bavlníkovej rastliny. Celkove sa umiestnilo na každú rastlinu 30 čerstvo vyliahnutých lariev, a to v každej z troch nasledujúcich sérií rozprašovania. Umelé umiestnenie lariev na rastliny sa navrhlo, aby sa aproximovala prirodzená distribúcia vajíčok a malých lariev tohto druhu bavlníkového škodcu (Farrar and Bradley, 1985, Environ. Entomol.). Účinnosť takéhoto ošetrenia bavlníka sa stanovila o sedem dní po tretej sérii aplikácie pomocou zaznamenania počtu poškodených a nepoškodených neotvorených kvetných púčikov bavlníka pripadajúcich na rastlinu. Signifikantné rozdiely poškodenia bavlníka s H. zea medzi ošetreniami sa stanovili analýzou rozptylu (ANOVA, SAS Inštitúte, 1989). Spôsoby ošetrenia sa separovali pomocou Duncanovho viacrozsahového testu (DMRT; SAS Inštitúte, 1989).

Priemerné hodnoty sledované pomocou všeobecného symbolu nie sú signifikantne odlišné od tých, ktoré sa stanovili Duncanovým viacrozsahovým testom (P < 0,05; F [df5, 18] = 16,9); údaje percentilu sú arkussínusovo transformované na analýzu.

Počet poškodených a nepoškodených neotvorených kvetných púčikov bavlníka pripadajúcich na každú rastlinu sa stanovil po siedmich dňoch po konečnej aplikačnej/infestačnej sérii (7DA3T = sedem dní po tretej aplikácii ošetrenia).

Výsledky

Pri tomto skleníkovom výskume spôsobili týždenné infestácie lariev H. zea signifikantne väčšie poškodenie na neošetrenom (vnímavom) bavlníku DP5415 (53,0 % poškodených neotvorených kvetných púčikov bavlníka) v porovnaní s neošetreným (rezistentným) bavlníkom NuCotn 33B (20,8 % poškodených neotvorených kvetných púčikov bavlníka). Ak sa na listy aplikoval HzAalT v množstve 5x10¹¹ ÓB/ha a 12x10¹¹ OB/ha, poškodenie spôsobené hmyzom bolo signifikantne nižšie na obidvoch odrodách bavlníka. Ak sa ošetrila vnímavá rastlinná odroda DP5415 s HzAalT v množstve 5x10¹¹ OB/ha, poškodenie neotvorených kvetných púčikov bavlníka predstavovalo v priemere 27,6 % a pri množstve 12x10¹¹ OB/ha 23,9%. Ak sa ošetrila rezistentná rastlinná odroda NuCotn33B s HzAalT v množstve 5x10¹¹ OB/ha, poškodenie neotvorených kvetných púčikov bavlníka predstavovalo v priemere 8,8 % a pri množstve 12 x 10¹¹5,0 %. Tieto údaje sú uvedené v tabuľke I.

Z údajov v tabuľke I. vidno, že pri aplikácii virulentného rekombinantného vírusu hmyzu (HzAalT) na listy transgénnej plodiny (NuCotn33) v množstve 12x10¹¹ OB/ha sa 4,2-násobne znižuje poškodenie spôsobené hmyzom v porovnaní s poškodením spôsobeným hmyzom na neošetrenej transgénnej plodine, zatiaľ čo pri aplikácii uvedeného virulentného rekombinantného vírusu hmyzu na vnímavú plodinu (DP5415) v množstve 12x10¹¹ OB/ha sa znižuje poškodenie spôsobené hmyzom len 2,2-násobne, v porovnaní s poškodením spôsobeným hmyzom na neošetrenej vnímavej plodine. Z tohto dôvodu, kombinácia použitia virulentného rekombinantného vírusu hmyzu na transgénnu plodinu poskytuje približne 2-násobne zníženie poškodenia spôsobeného hmyzom, v porovnaní s očakávaným poškodením spôsobeným hmyzom buď pri aplikácii samotného virulentného rekombinantného vírusu hmyzu alebo pri použití samotnej transgénnej plodiny.

Tabuľka I.

Použitie rekombinantného vírusu nukleopolyedrózy HzNPV (Egtdel)/DA26-ADKAalT (HzAalT) na list pre bežné atransgénne odrody bavlníka pri ničení Helicoverpa zea (cotton bollworm).

Odroda bavlníka & ošetrenie na list	Priemerné % poškodenia neotvorených kvetných púčikov bavlníka (±SD) 7D3T	% ničenia ²
		Pozorované	Očakávané
DP5415
HZAalT 5x10¹¹ OB/ha	27,6 b (±7,5)	47,9	Údaj nie je k dispozícii
HZAalT 12 x 10¹¹ OB/ha	23,9 b (± 6,8)	54,9	Údaj nie je k dispozícii
Neošetrené	53,0 a (± 9,4)	Údaj nie je k dispozícii	Údaj nie je k dispozícii

NuCotn 33 B
HZAalT 5 x 10¹¹ OB/ha	8,8 c (± 5,6)	83,4*	79,6
HZAalT 12 x 10¹¹ OB/ha	5,0 c (± 3,4)	90,6*	82,3
Nepostriekané	20,8 b (±10,4)	60,8	Údaj nie je k dispozícii

¹ Priemerné hodnoty sledované pomocou spoločných symbolov nie sú signifikantne odlišné od tých, ktoré sa stanovili Duncanovým viacrozsahového testu (P < 0,05; F (df5, 18) = 16,9) údaje percentilu sú arkussínusovo transformované na analýzu.

2	% pošk. (neošetrené)	% pošk. (ošetrené)	x 100
ničenie —	% pošk. (neošetrené)

Synergizmus = pozorované > očakávané

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob synergického ničenia hmyzu, vyznačujúci sa tým, že sa na lokus, list alebo steblo transgénnej plodiny, ktorá produkuje toxín hmyzu, aplikuje synergicky účinné množstvo rekombinantného vírusu hmyzu obsahujúceho vektor, ktorý je vysoko virulentný voči uvedenému hmyzu.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedeným rekombinantným vírusom je rekombinantný vírus nukleopolyedrózy.
3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že uvedeným rekombinantným vírusom je HzNPV, HzAalT, EGTdel alebo ich kombinácia.
4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedenou transgénnou plodinou je poľnohospodárska plodina, ktorá sa geneticky zmenila tak, aby exprimovala toxín Bacillus thuríngiensis.
5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že uvedenou transgénnou plodinou je kukurica.
6. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že uvedenou transgénnou plodinou je bavlník.
7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že uvedenou plodinou je NuCotn33B.
8. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že synergicky účinným množstvom uvedeného rekombinantného vírusu hmyzu je 1 x 1O¹⁰ OB/ha až 1 x 10¹³ OB/ha.
9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že hmyzom je Lepidoptera.
10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že hmyzom je Helicoverpa zea.