SK7592002A3

SK7592002A3 - Method and compositions for treating pulmonary diseases

Info

Publication number: SK7592002A3
Application number: SK759-2002A
Authority: SK
Inventors: Peter N Goodfellow; Richard Nieman; Theodore J Torphy
Original assignee: Smithkline Beecham Corp
Priority date: 1999-11-02
Filing date: 2000-11-01
Publication date: 2002-11-06
Also published as: EP1225866A4; CN1387404A; AR029189A1; WO2001032127A3; TWI242431B; PL355261A1; OA12076A; JP2003513028A; IL149367A0; HK1049107A1; PE20011005A1; NO20022057D0; ECSP003747A; CO5261512A1; AU1357501A; CZ20021512A3; CA2388333A1; KR20020057988A; WO2001032127A2; NO20022057L

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka použitia inhibítorov fosfodiesterázy 4 (PDE4) na výrobu lieku na prevenciu alebo zníženie nástupu symptómov pľúcnych ochorení alebo na liečbu alebo zníženie závažnosti pľúcnych ochorení. Týka sa najmä použitia inhibítorov fosfodiesterázy 4 (PDE4) spolu s protizápalovým kortikosteroidom.

Doterajší stav techniky

Identifikovať nové terapeutické látky na liečbu pľúcnych ochorení je obtiažne kvôli skutočnosti, že za rozvinutie ochorenia je zodpovedných množstvo mediátorov. Preto sa javí nepravdepodobným, že by eliminácia účinkov jedného mediátora mohla mať podstatný vplyv na všetky tri zložky chronickej astmy. Alternatívou tohto „mediátorového prístupu“ je regulácia aktivity buniek zodpovedných za patofyziológiu ochorenia.

Jedným z prístupov je zvýšenie hladín cAMP (cyklický adenozín 3',5'- monofosfát). Cyklický AMP sa ukázal byť druhým informačným sprostredkovateľom biologickej odpovede na širokú škálu hormónov, neurotransmiterov a liečiv; (Krebs Endocrinology Proceedings zo 4. medzinárodného kongresu Excerpta Medica, 17 29, 1973). Ak sa vhodný agonista naviaže na špecifické povrchové receptory, aktivuje sa adenylát cykláza, ktorá konvertuje Mg²⁺ do cAMP zvýšenou rýchlosťou. Cyklický AMP upravuje aktivitu väčšiny, ak nie všetkých buniek, ktoré sa podieľajú na patofyziológii astmy spôsobenej vonkajšími vplyvmi (alergickej). Zvýšenie cAMP, ako také, by mohlo mať užitočné účinky, vrátane: 1) relaxácie hladkého svalstva dýchacích ciest, 2) inhibície uvoľňovania mediátora mastocytov, 3) supresie degranulácie neutrofilov, 4) inhibície degranulácie bazofilov a 5) inhibície aktivácie monocytov a makrofágov. Z toho dôvodu by mohli byť zlúčeniny, ktoré aktivujú adenylát cyklázu alebo inhibujú fosfodiesterázu, účinné pri supresii neprimeranej aktivácie hladkého svalstva dýchacích ciest a širokej škály zápalových buniek.

-2Základným bunkovým mechanizmom inaktivácie cAMP je hydrolýza 3-fosfodiesterovej väzby jedným alebo viacerými zástupcami zo skupiny izoenzýmov, ktoré patria medzi cyklické nukleotidové fosfodiesterázy (PDEs).

Ukázalo sa, že odlišný izoenzým cyklickej nukleotidovej fosfodiesterázy, PDE4, je zodpovedný za rozpad cAMP v svalstve dýchacích ciest a v zápalových bunkách. (Torphy, „Izozýmy fosfodiesterázy: Možné ciele pre nové antiastmatiká“, New Drugs for Asthma, Barnes, ed. IBC Technical Services Ltd., 1989). Výskum naznačuje, že inhibícia tohto enzýmu nielenže spôsobuje relaxáciu hladkého svalstva dýchacích ciest, ale potláča degranuláciu mastocytov, bazofilov a neutrofilov spolu s inhibiciou aktivácie monocytov a neutrofilov. Okrem toho, prospešné účinky PDE4 inhibítorov sú významne potenciované, ak sa adenylát cyklázová aktivita cieľových buniek zvýši vhodnými hormónmi alebo autokoidmi, čo by bol prípad in vivo. Preto by PDE4 inhibítory mohli byť účinné v pľúcach, kde sú zvýšené hladiny prostaglandínu E₂ a prostacyklínu (aktivátory adenylát cyklázy). Takéto zlúčeniny by poskytli jedinečný prístup do farmakoterapie bronchiálnej astmy a poskytli by významné terapeutické výhody v porovnaní s látkami, ktoré sú v súčasnosti na trhu.

Okrem toho by mohlo byť vhodné skombinovať liečbu v súlade so skutočnosťou, že na etiológii množstva pľúcnych ochorení sa podieľa mnoho mediátorov. V tomto vynáleze sa predkladá kombinácia inhibítora PDE4 a protizápalového kortikosteroidu, podávaného najmä inhalačné, na liečbu pľúcnych ochorení. Táto kombinácia je zvlášť vhodná na liečenie chronickej obštrukčnej choroby pľúc (COPD) a astmy.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je použitie inhibítora PDE4 a protizápalového kortikosteroidu na výrobu lieku na liečenie pľúcneho ochorenia na spoločné, oddelené alebo oddelené a následné podanie, pričom následné podávanie sa uskutočňuje tesne za sebou alebo po dlhšom čase.

-3V druhom aspekte sa vynález týka prostriedku na liečbu pľúcneho ochorenia, ktorý obsahuje účinné množstvo inhibítora PDE4, účinného množstva steroidného protizápalového liečiva a farmaceutický prijateľnej pomocnej látky.

Kombinovaná liečba súvisiaca s týmto vynálezom zahŕňa podávanie inhibítora PDE4 a steroidného protizápalového liečiva na prevenciu vzniku pľúcneho ochorenia alebo na liečbu jestvujúceho ochorenia. Tieto zlúčeniny možno podávať spolu v jednej dávkovej forme. Možno ich podávať aj vo dvoch liekových prípravkoch, ktoré môžu byť z hľadiska podávania rovnaké alebo rôzne. Na ilustráciu, obidve liečivá môžu byť poskytnuté oddelene ako perorálne lieky alebo jeden môže byť vo forme perorálneho lieku a druhý ako inhalačný liek alebo môžu byť obidve podávané v inhalačnej forme. Môžu sa podať v tom istom čase. Alebo sa podávanie môže uskutočňovať tesne za sebou alebo po dlhšom čase, takže napr. jedno liečivo sa podáva ráno a druhé sa podáva večer.

Kombináciu možno použiť profylaktický alebo po nástupe symptómov. V niektorých prípadoch možno kombináciu(ie) použiť na prevenciu progresu pľúcneho ochorenia alebo na zachovanie zníženej funkcie, napr. pľúcnej funkcie.

Špecifický inhibítor PDE-4 vhodný podľa tohto vynálezu môže predstavovať akákoľvek zlúčenina, ktorá je známa tým, že inhibuje PDE-4 enzým alebo u ktorej je opísaný účinok inhibujúci PDE4 a zlúčeniny, ktoré sú iba PDE4 inhibítormi, nie zlúčeniny, ktoré inhibujú iných zástupcov skupiny PDE rovnako aj PDE4. Vo všeobecnosti je výhodné použiť PDE4 antagonisty, ktoré majú IC₅₀ pomer približne 0,1 alebo väčší, čo sa týka podielu IC₅₀ pre PDE4 katalytickú formu, ktorá viaže rolipram s vysokou afinitou a IC50 pre formu, ktorá viaže rolipram s nízkou afinitou.

PDE inhibítory používané na liečbu zápalu a ako bronchodilatátory, liečivá ako teofylín a pentoxyfylín, inhibujú PDE izoenzýmy bez rozdielu vo všetkých tkanivách. Tieto zlúčeniny majú nežiaduce účinky, zjavne preto, lebo neselektívne inhibujú všetkých 5 tried PDE izoenzýmov vo všetkých tkanivách. Cieľový chorobný stav možno týmito zlúčeninami účinne liečiť, ale môžu sa objaviť nežiaduce sekundárne účinky, ktorým, ak by bolo možné zabrániť alebo ich bolo možné minimalizovať, by sa zvýšil celkový terapeutický účinok pri tomto prístupe k liečbe určitých chorobných stavov. Napr., klinické štúdie so selektívnym PDE4 inhibítorom rolipramom, ktorý bol vyvinutý ako antidepresívum, naznačujú, že má psychotropnú aktivitu a má

-4sprievodné účinky na gastrointestinálny trakt, ako je napr. pyróza, nauzea a vracanie.

Z dôvodov tohto vynálezu cAMP katalytické miesto, ktoré viaže R a S rolipram s nízkou afinitou, je označené ako väzbové miesto „s nízkou afinitou“ (LPDE4) a ďalší druh tohto katalytického miesta, ktorý viaže rolipram s vysokou afinitou je označený ako väzbové miesto „s vysokou afinitou“ (HPDE4). Tento výraz “HPDE4“ by sa nemal zamieňať s výrazom „hPDE4“, ktorý sa používa na označenie humánneho PDE4.

Počiatočné experimenty sa uskutočnili na stanovenie a validáciu väzbového testu [3H]-rolipramu. Podrobnosti tejto práce sú uvedené nižšie v príklade 1.

Kvôli stanoveniu, či vysoká väzbová aktivita a nízka väzbová aktivita pochádzajú z rovnakého génového produktu, boli kvasinky transformované známymi spôsobmi a expresia rekombinantného PDE4 nasledovala po 6 h fermentácie. Analýza Western blot za použitia protilátky namierenej proti PDE4 naznačila, že exprimované množstvo PDE4 sa zvyšovalo s časom, s dosiahnutím maxima po 3 h rastu. Okrem toho, viac ako 90 % imunoreaktívneho produktu bolo v supernantante lyzátov kvasiniek pri veľkej rýchlosti (100000x g). [³H]-(-)-rolipramová väzba a PDE aktivita sa monitorovali spolu s expresiou proteínu. PDE4 aktivita bola ko-exprimovaná s väzbovou aktivitou rolipramu, čo naznačuje, že obidve funkcie jestvujú na rovnakom génovom produkte. Podobne ako výsledky s analýzou Western blot, v supernatantovej frakcii kvasiniek sa zistila viac ako 85%-ná rolipramom inhibovateľná PDE aktivita a [³H]-rolipramová väzbová aktivita.

Celkovo, väčšina rekombinantnej PDE4 exprimovanej v tomto systéme jestvuje v podobe LPDE4 a iba malá frakcia ako HPDE4. Následne inhibícia rekombinantnej PDE4 katalytickej aktivity primárne odráža účinky zlúčenín na LPDE4. Inhibíciu PDE4 katalytickej aktivity preto možno použiť ako ukazovateľ účinnosti zlúčenín na LPDE4.

Účinnosť zlúčenín na HPDE4 možno stanoviť hodnotením ich schopnosti kompetície s [³H]-R-rolipramom. Na vývin SARs pre rolipramové väzbové miesta s nízkou i vysokou aktivitou sa v dvoch testoch stanovili účinnosti vybraných zlúčenín. Výsledky z experimentov sa vložili do tabuľky. Ako sa očakávalo, určité zlúčeniny boli jasne účinnejšie v kompetícii s [³H]-(-)-rolipramom na mieste, kde

-5rolipram vykazoval vysokú väzbovú aktivitu v porovnaní s miestom, kde je rolipram viazaný nízkou afinitou. SAR korelácia medzi väzbou s vysokou aktivitou a väzbou s nízkou afinitou bola slabá a vyslovil sa záver, že SAR pre inhibíciu väzby [³H]-(-)rolipramu s vysokou afinitou bol vzdialený od SAR pre väzbové miesto rolipramu s nízkou afinitou.

Teraz je známe, že jestvujú najmenej dve väzbové formy na monocytovej rekombinantnej PDE4 (hPDE4) u ľudí, s ktorými sú inhibítory v interakcii. Jedným vysvetlením pre tieto zistenia je, že hPDE4 existuje v dvoch odlišných formách. Jedna sa viaže podobne ako rolipram a denbufylín s vysokou afinitou a druhá viaže tieto zlúčeniny s nízkou afinitou. Výhodnými PDE4 inhibítormi na použitie podľa tohto vynálezu budú tie zlúčeniny, ktoré majú dobrý terapeutický pomer, t.j. zlúčeniny ktoré prednostne inhibujú cAMP katalytickú aktivitu, kde enzým je vo forme, ktorá viaže rolipram s nízkou afinitou, čím sa znižujú nežiaduce účinky, ktoré sú viazané na inhibíciu formy, ktorá viaže rolipram s vysokou afinitou. Ďalším spôsobom na určenie tohto je, že výhodné zlúčeniny budú mať IC₅₀ pomer približne 0,1 alebo väčší, čo sa týka podielu IC50 pre PDE4 katalytickú formu, ktorá viaže rolipram s vysokou afinitou a IC50 pre formu, ktorá viaže rolipram s nízkou afinitou.

Ďalším zlepšením tohto štandardu je to, ak má PDE4 inhibitor IC₅o pomer približne 0,1 alebo väčší; tento pomer je pomerom IC50 hodnoty pre kompetíciu s naviazaním 1nM [³H]-R-rolipramu na vytvorenie PDE4, ktorá viaže rolipram s vysokou afinitou voči IC50 hodnote na inhibíciu PDE4 katalytickej aktivity formy, ktorá viaže rolipram s nízkou afinitou za použitia 1μΜ [³H]-cAMP ako substrátu. Ďalšie prehľadné vysvetlenie tohto testu možno nájsť v patentovej prihláške US 08/456274 podanej 31. mája 1995, text ktorej je tu nahradený citáciou, ktorá vyjadruje, že na uskutočnenie vynálezu je text potrebný.

Príkladmi vhodných PDE4 inhibítorov sú: (R)-(+)-1-(4-brómbenzyl)-4-[(3-cyklopentyloxy)-4-metoxyfenyl]-2-pyrolidón; (/?)-(+)-1-(4-brómbenzyl)-4-[(3-cyklopentyloxy)-4-metoxyfenyl]-2-pyrolidón; 3-(cyklopentyloxy-4-metoxyfenyl)-1-(4-N'-[N2-kyano-S-metylizotioureido]benzyl)-2pyrolidón;

kyselina c/s-4-kyano-4-(3-cyklopentyloxy-4-metoxyfenyl)cyklohexán-1-karboxylová; c/s-[4-kyano-4-(3-cyklopropylmetoxy-4-difluórmetoxyfenyl)cyklohexán-1-ol];

-6(R) -(+)-etyl-[4-(3-cyklopentyloxy-4-metoxyfenyl)pyrolidón-2-ylidén]acetát;

(S) -(-)-etyl-[4-(3-cyklopentyloxy-4-metoxyfenyl)pyrolidón-2-ylidén]acetát.

Najvýhodnejšie sú tie PDE4 inhibítory, ktorých pomer IC₅o je väčší ako 0,5 a najmä tie, ktorých pomer je väčší ako 1,0. Výhodnými zlúčeninami sú kyselina c/s-4-kyano-4-(3-cyklopentyloxy-4-metoxyfenyl)cyklohexán-1-karboxylová, 2-karbometoxy-4-kyano-4-(3-cyklopropylmetoxy-4-difluórmetoxyfenyl)cyklohexán-1-ón a c/s-[4-kyano-4-(3-cyklopropylmetoxy-4-difluórmetoxyfenyl)cyklohexán-1 -ol]; toto sú príklady zlúčenín, ktoré sa viažu najmä na miesto s nízkou väzbovou aktivitou a ktoré majú pomer IC₅o 0,1 alebo väčší.

Zlúčeniny sú uvedené v US patente 5 552 438 vydanom 3. septembra 1996. Tento patent a zlúčeniny, ktoré opisuje, sú tu uvedené citáciou. Zlúčeninou, o ktorú je zvláštny záujem, ktorá je opísaná v US patente 5 552 438, je kyselina c/s-4kyano-4-[3-(cyklopentyloxy)-4-metoxyfenyl]cyklohexán-1-karboxylová a jej soli, estery, prekurzory alebo fyzikálne formy.

AWD-12-281 od Astra (Hofgen, N. A ďalší: 15. EFMC Int Symp Med Chem (Sept 6-10, Edinburg) 1998, Abst. str. 98 ); 9-benzyladenínový derivát nazvaný NCS-613 (INSERM); D-4418 od Chiroscience a Schering-Plough; benzodiazepínový PDE4 inhibítor označený ako CI-1018 (PD-168787; Parke-Davis/Warner-Lambert); benzodioxolový derivát Kyowa Hakko opísaný vo WO 9916766; V-11294A od Napp (Landells, L. J. a ďalší Eur Resp J [Annu Cong Eur Resp Soc (sept. 19-23, Ženeva) 1998], 12 (Suppl. 28); Abst P2393); roflumilast (CAS ref. č. 162401-32-3) a ftalazinón (WO 9947505) od Byk-Gulden; alebo zlúčenina označená ako T-440 (Tanabe Seiyaku; Fuji, K. a ďalší J Pharmacol Exp Ther, 1998, 284 (1):162). Ktorákoľvek alebo všetky z týchto zlúčenín by mohli mať prospech zo spôsobu tu opísaného.

Niekoľko špecifických zlúčenín spomenutých vyššie, ktoré nemajú generický alebo obchodný názov možno vyrobiť spôsobom opísaným v patentových prihláškach tiež v konaní a to v US patentovej prihláške USSN 862 083 podanej 30. októbra 1992; USSN 862 111 podanej 30. októbra 1992; USSN 862 030 podanej 30. októbra 1992 a USSN 862 114 30. októbra 1992 alebo v ich predchodcoch alebo v US patentoch nárokujúcich si prioritu jednej alebo viacerých týchto

-7prihlášok. Každá z týchto prihlášok alebo príbuzných patentov je tu spomenutá plnou citáciou, ako by bola uvedená v tomto spise.

Steroidné látky použiteľné v tohto vynáleze sú perorálnymi alebo inhalačnými kortikosteroidmi a ich prekurzormi, ktoré majú protizápalovú aktivitu. Príkladmi týchto steroidov sú metylprednizolón, prednizón, dexametazón, flutikazón, beklometazón, budezonid, flunizolid, mometazón furoát a triamcinolón acetonid. Metylprednizolón a prednizón sú vo forme perorálnych a injektabilných kortikosteroidov; sú dostupné od mnohých výrobcov originálnych i generických liekov. Beklometazón dipropionát je obchodovaný vo forme aerosólu na inhalačné používanie pod názvami Beconase®a Beconase AQ® od firmy Glaxo Wellcome.

Flutikazón propionát je obchodovaný pod názvom Flonase® tiež firmou Glaxo Wellcome. Triamcinolón acetonid je obchodovaný Rhone-Poulenc Roher pod názvom Nasacort® ako nazálny sprej a aerosól. Flunizolid je obchodovaný ako nazálny roztok pod názvom Nasalide® a Nasarel™ od Roche Laboratoires. Dexametazón je obchodovaný ako nátriumfosfátová soľ od Medeva Pharmaceuticals, Inc. pod názvom Dexacort™ fosfát. Mometazón furoát je obchodovaný ako monohydrát vo forme nazálneho prípravku pod názvom Nasonex®. Budezonid je ďalším inhalačným kortikosteroidom používaným na liečbu pľúcnych ochorení. Je obchodovaný Astra Pharmaceuticals, L. P. ako prášok v turbohalerovom zariadení pod názvom Pulmicort Turbohaler®. Všetky tieto liečivá a nazálne prípravky alebo perorálne alebo injektabilné prípravky možno nájsť vo vydaní 1999 Physicians' Desk Reference® (PDR) publikovanom Medical Economics Corporation, Inc. New Je.rsey, USA a je dostupné na Internete na adrese http:www. tomescps.com/fraMain.asp?Mnu=0 a na ďalších stránkach. Ďalšie kortikosteroidy sú vo vývoji a tie, ktoré by sa mohli použiť v tomto vynáleze, sú uvedené v tabuľke I.

Tabuľka I

Inhalačné kortikosteroidy

Liečivo	Spoločnosť	Indikácia
mometazón furoát	Schering-Plough	astma, SAR

rofleponid	AstraYeneca	astma
ciklezonid	Byk-Gulden/recordati	astma
butixokort propionát	Warner-Lambert/3M	astma, nádcha
RPR-106541	Rhone-Poulenc Rorer	astma
ST-126	SSP/Torii	astma

Výhodnou kombinovanou liečbou je taká liečba, kde sa jeden alebo viac liečiv vybraných z dexometazónu, flutikazónu, beklometazónu, budezonidu, flunizolidu, mometazón furoátu a triamcinolón acetonidu podáva s kyselinou c/s-4-kyano(3-cyklopentyloxy-4-metoxyfenyl)cyklohexán-1 -karboxylovou (Ariflo®). Výhodnou liečbou je súčasné podávanie steroidu ako inhalovaného lieku a kyseliny v perorálnej dávkovej forme, kde sa každý liek podáva raz alebo dvakrát denne. Pokiaľ ide o kyselinu, je výhodné, ak je vo forme tablety s predĺženým uvoľňovaním.

Očakáva sa, že obidve účinné látky sa podávajú v rovnakom čase, alebo tesne za sebou. Alternatívne by sa jeden liek mohol podať ráno a druhý neskôr počas dňa. Podľa inej schémy by sa jeden liek mohol podávať dvakrát denne a druhý raz denne, či už súbežne pri jednom z dvoch podávaní alebo oddelene. Je výhodné, ak by sa obidva lieky podávali súbežne.

Tu spomenuté zlúčeniny a ich farmaceutický prijateľné soli, ktoré sú účinné pri perorálnom podávaní, možno upraviť do formy sirupov, tabliet, kapsúl, prípravkov s predĺženým uvoľňovaním alebo pastiliek. Sirupové prípravky tvorí vo všeobecnosti suspenzia alebo roztok zlúčeniny alebo soli v tekutom nosiči, ako je napr. etanol, olej z búrskych orieškov, olivový olej, glycerín alebo voda s ochucovacím činidlom a farbivom. Ak je prípravok vo forme tablety, možno použiť akékoľvek farmaceutické nosiče, ktoré sa bežne používajú pri výrobe tuhých prípravkov. Príkladmi takýchto nosičov sú stearan horečnatý, sadrovec, mastenec, želatína, akácia, kyselina steárová, škrob, laktóza a cukróza. Ak sú prípravky vo forme kapsuly, je vhodná akákoľvek bežná enkapsulácia, napr. za použitia už spomenutých nosičov v tvrdej želatínovej kapsule. Ak sú prípravky vo forme obalu mäkkej kapsuly, možno použiť akýkoľvek bežne používaný farmaceutický nosič na výrobu disperzií alebo suspenzií, napr. tekuté slizy, celulózy, silíkáty alebo oleje a tie sú vložené do mäkkého želatínového obalu.

-9Bežné parenterálne prípravky tvorí roztok alebo suspenzia zlúčeniny alebo soli v sterilnom nosiči na báze vody alebo v nevodnom nosiči voliteľne obsahujúcom parenterálne prijateľný olej, napr. polyetylénglykol, polyvinylpyrolidón, lecitín, podzemnicový olej alebo sezamový olej.

Bežné prípravky na inhalačné použitie sú vo forme roztoku, suspenzie alebo emulzie, ktoré môžu byť podávané ako suchý prášok alebo vo forme aerodisperzie za použitia bežného hnacieho plynu, akým sú fluórované uhľovodíky, ako je napr. trichórfluórmetán.

Prostriedok s obsahom inhibítorov PDE4 je výhodne v jednodávkovej forme, ako je napr. tableta alebo kapsula. Pre steroidy s odmeranou dávkou sú výhodné inhalátory s odmeranou dávkou suchého prášku.

Účinnú látku možno podávať 1 až 6-krát denne, čo je postačujúce na to, aby sa prejavil požadovaný účinok. Výhodne sa účinná látka podáva 1 až 2-krát denne, výhodnejšie 2-krát denne.

Predkladané zlúčeniny sú vhodné na liečbu astmy vyvolanej námahou (EIA), astmy vyvolanej znečistením prostredia (PIA) a astmy vyvolanej chladom (CIA) v prípade chronického ochorenia ako aj prerušovanej liečby, ak sa očakáva vyvolávajúci podnet. Predkladané zlúčeniny sa výhodne používajú pri dlhodobej liečbe.

Pokiaľ ide o množstvo podávaného liečiva, uvažuje sa, že v prípade inhibítorov PDE4 sa bude podávať množstvo medzi 1 a 200 pg denne u dospelého človeka. Steroidy možno podávať v súlade so schváleným označením.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Väzbové testy fosfodiesterázy a rolipramu

Príklad 1A

Stanovilo sa, že izolovaná humánna monocytová PDE4 a hrPDE (humánna rekombinantná PDE4) jestvuje primárne vo forme s nízkou afinitou. Preto možno účinnosť zlúčenín proti PDE4 s nízkou afinitou stanoviť štandardnými testmi na

-10PDE4 katalytickú aktivitu za použitia 1 μΜ [³H]cAMP ako substrátu (Torphy a ďalší, J. Biol. Chem., zv. 267, č. 3, str. 1798-1804, 1992).

Vysoko odstredené supernantanty z mozgu potkana sa použili ako zdroj bielkovín a vyrobili sa obidva enantioméry [³H]-rolipramu na špecifickú aktivitu 25,6 Ci/mmol. Štandardné podmienky testu sa modifikovali podľa publikovaného postupu, aby boli identické v podmienkach PDE testov, s výnimkou pre posledný cAMP: 50 mM Tris HCI (pH 7,5), 5 mM MgCh, 50 μΜ 5’-AMP a 1 nM [³H]-rolipramu (Torphy a ďalší, J. Biol. Chem., zv. 267, č. 3, str. 1798-1804, 1992). Test sa nechal bežať 1 h pri 30 °C. Reakcia sa ukončila a naviazaný ligand sa odseparoval z voľného ligandu za použitia Brandelovho zberača buniek. Kompetícia na vysoko afinitné väzbové miesto sa stanovila za podmienok, ktoré boli rovnaké ako podmienky na meranie PDE aktivity s nízkou afinitou, s výnimkou toho, že [³HJcAMP nebol prítomný.

Príklad 1B

Meranie aktivity fosfodiesterázy

PDE aktivita sa stanovila za použitia [³H]cAMP SPA alebo [³H]cGMP SPA enzýmového testu, ako to uvádza dodávateľ (Amersham Life Sciences). Reakcie sa uskutočnili na 96-jamkových platniach pri izbovej teplote, v 0,1 ml reakčného pufra obsahujúceho (konečné koncentrácie): 50 mM Tris HCI, pH 7,5, 8,3 mM MgCh, 1,7 mM EGTA. [³H]cAMP alebo [³H]cGMP (približne 2000 dpm/pmol), enzým a rôzne koncentrácie inhibítorov. Reakcia sa nechala prebiehať 1 h a bola ukončená pridaním 50 ml SPA ytriumsilikátových kvapiek v prítomnosti síranu zinočnatého. Platne sa potriasli a nechali sa stáť pri izbovej teplote 20 min. Rádioznačený produkt sa stanovil scintilačnou spektrometriou.

Väzbový test [³H]-rolipramu

Väzbový test [³H]-rolipramu sa uskutočnil modifikáciou spôsobu podľa Schneidera a spolupracovníkov. Pozri Nicholson a ďalší, Trends Pharmacol Sci., zv. 12, str. 19-27 (1991) a McHale a ďalší Mol. Pharmacol., zv. 39, 109-113 (1991). Rrolipram sa viaže na katalytické miesto PDE4, pozri Torphy a ďalší, Mol. Pharmacol., zv. 39, str. 376-384 (1991). Následne kompetícia pre [³H]-rolipramovú

-11 väzbu poskytuje nezávislé potvrdenie PDE4 inhibičných vlastností neznačených kompetítorov. Test sa uskutočňoval pri 30 °C 1 h v 0,5 ml pufra obsahujúceho (konečné koncentrácie): 50 mM Tris HCI, pH 7,5, 5 mM MgCh, 0,05% bovinný sérový albumín, 2 nM [³H]-rolipramu (5,7 x 104 dpm/pmol) a rôzne koncentrácie nerádioznačených inhibítorov. Reakcia sa zastavila pridaním 2,5 ml ľadom chladeného pufra (bez [³H]-rolipramu) a rýchlou vákuovou filtráciou (Brandelov zberač buniek) cez Whatman GF/B filtre, ktoré boli nasiaknuté 0,3% polyetylenimínom. Filtre sa premyli ďalšími 7,5 ml studeného pufra, vysušili sa a vyhodnotili kvapalinovou scintilačnou spektrometriou.

Príklad 2

Cilomalast/nízka dávka inhalovaného kortikosteroidu (ICS), štúdia s rozpätím dávok

Návrh štúdie • Bola to fáza IIB, randomizovaná, kontrolovaná placebom, štúdia s dávkovým rozpätím, s jednotýždňovým podávaním zaslepeného placeba, so 6-týždňovou dvojito zaslepenou fázou liečby a s jednotýždňovým sledovaním pacientov s miernou až strednou astmou.

• Populácia štúdie. Vybraní boli muži a ženy vo veku medzi 18 a 70 rokov, so slabou až miernou astmou, ktorí neboli dostatočne kontrolovaní nízkymi dávkami kortikosteroidov (nie viac ako 500 μg beklometazón dipropionátu/deň alebo ekvivalent). Požadovalo sa, aby mali skríningový FEVi 50 % a 80 % predpokladaný podľa výšky, veku, pohlavia rasy a 12% alebo väčšiu reverzibilitu po podávaní beta-2 agonistov. Pacienti mali mať celkové skóre symptómov 6 alebo viac počas 4 zo 7 dní, pred randomizáciou počas vstupnej návštevy. Vzorku tvorilo 300 hodnotiteľných pacientov.

• Cilomast sa dávkoval v dávkach 5 mg, 10 mg a 15 mg dvakrát denne počas 6 týždňov.

• Jedinci boli nastavení na strednú dávku 500 μg ekvivalentu beklometazónu, hoci stredná dávka ICS bola 652 μς.

• Primárny cieľový parameter: zmena od východiskového stavu po dosiahnutie klinického výdychového objemu za 1 s (FEVj), zmeny v klinickom FEVi každý týždeň a viac ako 4 hodinové obdobie nasledujúce po podaní prvej dávky dvojito slepej medikácie.

• Sekundárne cieľové parametre: použitie záchrannej liečby a symptómy cez noc.

• Terciárne cieľové parametre: klinicky vyvolaná vitálna kapacita (FVC), klinicky najvyššia výdychová rýchlosť (PEFR), vyvolaný výdychový tok pri 25 až 75 % (FEF25-75) 3 75 % (FEV75) PEFR variabilita doma, PEFR doma, celkové skóre symptómov.

Hodnotiace kritériá

Primárna miera účinnosti bola definovaná ako zmena z východiskového stavu na stav na konci štúdie vo vyvolanom výdychovom objeme za 1 s (FEV1) pred podaním ďalšej dávky. Zmeny v klinickom FEV-ι sa tiež analyzovali každý týždeň dvojito zaslepenej liečebnej fázy a po 4 h okamžite po podaní prvej dávky dvojito zaslepenej liečby. Sekundárnymi parametrami účinnosti bolo použitie inhalovaného/nebulizovaného beta 2-agonistu a symptómy počas noci. Terciárnymi parametrami účinnosti bola klinicky vyvolaná vitálna kapacita (FVC), klinicky najvyššia výdychová rýchlosť (PEFR), vyvolaný výdychový tok pri 25 až 75 % (FEF25-75) a 75 % (FEV75) PEFR variabilita doma, PEFR doma (ráno a večer) celkové skóre symptómov (celkové skóre nočnej, rannej astmy a astmy počas dňa), ranná astma, astma pretrvávajúca po celý deň, použitie inhalovaného kortikosteroidu, kašeľ, chrčanie, dýchavičnosť/zovretie na prsiach, stupeň exacerbácie astmy a celkové hodnotenia lekára a pacienta.

Výsledky štúdie:

• žiadne štatisticky významné zlepšenie vo FEVí pred podaním ďalšej dávky v ITT analýze 15 mg cilomastu BID verzus placebo (0,16 I; p=0,062) • odpoveď bola v závislosti od dávky pre FEV1 pred podaním ďalšej dávky v ITT analýze • významné zlepšenie vo FEV-ι pred podaním ďalšej dávky (0,21 I; p=0,033) po vylúčení pacientov na ICS dávkach > 500 μ9 beklometazónu počas podávania cilomastu 15 mg BID • Potvrdenie podpory pre cilomast 15 mg BID zahrnovalo 4 h FEV-ι, PFER, FEF25-75 doma a celkové hodnotenie lekára a pacienta.

Príklad 3

Cilomalast/vysoká dávka inhalovaného kortikosteroidu (ICS)

Návrh štúdie • R, DB, PC, DR u pacientov so slabou až miernou astmou na 800 pg beklometazónu • Dávky u Cilomast® boli 5,10 a 15 mg dvakrát denne počas 4 týždňov • 2-týždňová séria • primárny sledovaný parameter na konci liečby: klinický FENA pred podaním ďalšej dávky • sekundárne parametre na konci liečby: ranné PEFR, symptómy, PFER variabilita, večerné PFER, klinické PFER, FEF25-75, použitie záchrannej liečby

Výsledky štúdie:

• žiadna štatisticky významná zmena vo FEVi pred podaním ďalšej dávky v žiadnej dávkovej skupine v ITT analýze • žiadny vplyv dávok ma primárny sledovaný parameter na konci štúdie • FEVi pred podaním ďalšej dávky sa významne zlepšil pri podávaní 10 mg cilomastu BID po vylúčení pacientov dostávajúcich < 800 pg ICS (0,16 I; p= 0,009) • ICS (beklometazón) dávka sa pohybovala v rozmedzí od 100 do 4000 pg a priemerná dávka bola 1136 pg • potvrdenie podpory pre cilomast 10 mg BID ako účinnej dávky vyplynulo aj ₍ z mnohých lepších výsledkov v 4 h FEV-ι, klinickom FVC, PFER • nebolo možné stanoviť žiadnu závislosť odpoveď/dávka, koncentrácie pred podaním ďalšej dávky boli primerané dávke a podobné ako v predchádzajúcich štúdiách

Tabuľka 1

Porovnanie zlúčenín vo vybraných štúdiách

Štúdie pri vyvolaní alergénom

Porovnávacie údaje: Štúdie pri vyvolaní alergénom

	Ariflo 15 mg bid	Singulaire	Ultair	ICS 800 μg budezonidu	B2
% max zníženia LAR (účinok liečby)	1,3	12,3	10,7	22,9	+6,9
% ochrany max zníženie LAR	žiadne	36,4	30,8	32	žiadne zníženie
% AUCoELAR (účinok liečby)	3,5	63,5	42,4	nerobené
% ochrany AUC LAR	žiadne	56,9	42,6	nerobené

Legenda: Údaje o cilomaste sú vybrané z protokolovej analýzy u astmatikov na < 652 μ9 ICS. Údaje o montelukaste (MT), budezonide (BD) a o obidvoch sú vybrané zo štúdie týkajúcej sa Singulair SBA, ktorá hodnotila účinok lieku Singulair vo vzťahu k inhalovaným kortikosteroidom.

V obidvoch štúdiách nie sú žiadne rozdiely v správaní sa placebo (Pbo) skupín. Záver je taký, že cilomast prekonal Singulair, ak bol pridaný k nízkej dávke ICS, napriek tomu Pbo skupina sa v štúdii s cilomastom tiež zlepšila.

Predchádzajúce stanoviská a príklady slúžia na ilustráciu vynálezu, nie na to, aby ho limitovali. Nižšie sú uvedené nároky, ktoré uvádzajú, čo je vyhradené pre vynálezcov.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použitie inhibítora PDE4 a protizápalového kortikosteroidu na výrobu lieku na liečenie pľúcneho ochorenia na spoločné, oddelené alebo oddelené a následné podanie, pričom následné podávanie sa uskutočňuje tesne za sebou alebo po dlhšom čase.

2. Použitie podľa nároku 1, kde PDE4 inhibítorom je kyselina c/s-4-kyano-4(3-cyklopentyloxy-4-metoxyfenyl)cyklohexán-1-karboxylová a steroid je vybraný zo skupiny zahrnujúcej dexametazón, flutikazón, beklometazón, budezonid, flunizolid, mometazón furoát a triamcinolón acetonid.