SK6331Y1 - Bioreactor for functional tissue engineering - Google Patents

Abstract

Bioreactor for the production of tissue substitutes, particularly cartilage consists from hermetically separated chamber in which is arranged the device for mechanical loads. Equipment consists from the cultivation vessel with a pad (8) arranged in its top part (6) and from at least one rotating pressure indenter (13) connected to a carrier (2). Carrier (2) associated with the linear motor (1) and is in view of the cultivation vessel (5) movably stored.

Description

SK 6331 Υ1

Oblasť techniky

Technické riešenie sa týka bioreaktora pre funkčné tkanivové inžinierstvo pozostávajúceho z hermeticky oddelenej komory, v ktorej je umiestené zariadenie na mechanické zaťažovanie, predovšetkým tkanivových náhrad chrupavky.

Doterajší stav techniky

Pre úspešné vytváranie tkanivových náhrad chrupavky je nutné jednotlivé tkanivové preparáty po osadení bunkami mechanicky zaťažovať. Zároveň je nutné zabezpečiť prostredie, v ktorom sa dané bunky môžu ďalej rozvíjať. Pri splnení týchto požiadaviek dochádza k vytvoreniu funkčného tkanivového implantátu, ktorý je pripravený na implantáciu do prostredia biologickej záťaže. Na simuláciu zaťažujúcich cyklov v procese zrenia chrupavky sa využívajú tkanivové bioreaktory.

Zmyslom súčasných zariadení určených na kultiváciu tkanív je napodobenie podmienok prostredia in vivo a to najmä z chemického a biologického hľadiska. Toto prostredie je tvorené v súčasných typoch bioreaktorov v závislosti od typu požadovaného tkaniva. Všeobecne je možné konštatovať, že ide o zariadenie, kde je zabezpečená chemická a biologická stálosť vyživovacieho média, kde je regulovaná a monitorovaná inkubačná teplota kultivačného priestoru a kde je zabezpečený požadovaný tlak a koncentrácie zmesí prevádzkových a kultivačných médií. Ale na to, aby mohlo rásť životaschopné tkanivo, musí zariadenie spĺňať požiadavky kladené na ľahkú sterilizáciu, jednoduchý prístup vyživovacieho média ku kultivovaným bunkám a jeho obmenu.

Jedným z najzákladnejších vyhotovení je tzv. Flask (banka) systém, ktorý obsahuje kultivačné médium a môže obsahovať i niekoľko podporných scaffoldov v závislosti od veľkosti. Banka (y) sú prevádzkované buď staticky, alebo miešané.

Špeciálnym prípadom môžu byť bioreaktory na rast kardiálnych tkanív, ktoré sú uspôsobené pulzačnému jedno aj obojsmernému toku rastového média cez konštrukciu podporných scaffoldov. Sú teda uspôsobené tak, aby simulovali srdcovo-cievne prostredie. Predstaviteľmi týchto bioreaktorov sú systémy HARV (High Aspect Ratio Vessels) a STLV (Slow Tuming Lateral Vessels). STLV je konfigurovaný ako prstencový priestor medzi dvomi sústrednými valcami, z ktorých vnútorný je membránou na výmenu plynov, zatiaľ čo HARV je valcová nádoba s membránou na výmenu plynov vo svojom dne. Obe nádoby sú v prevádzke v horizontálnej rovine a navzájom sa otáčajú.

Ďalším používaným je systém RWPV (Rotating Wall Perfúsed Vessels), ktorý bol vyvinutý NASA a okrem iného bol používaný na kultiváciu chrupavky v priestore mikrogravitácie aj v bežných podmienkach. Médium priebežne obieha v perfúndovaných stĺpcoch. Perfúndované komory sú navrhnuté tak, aby médium priebežne prechádzalo medzi komorou a vonkajšou membránou.

Dosiaľ nebola dostatočne vyriešená konštrukcia bioreaktora na rast náhrad chrupavky a to predovšetkým v oblasti simulácie realistických záťažových podmienok. Doterajšie reaktory chrupavky zaťažujú jednotlivé implantáty jednoduchým zaťažením typu tlak alebo šmyk. Pri chrupavke in vivo dochádza vždy ku kombinácii týchto zaťažení v dôsledku špecifickej geometrie, kinematiky a vlastností kontaktných plôch.

Nevýhodou doterajších riešení je nepriama mechanická stimulácia tkaniva, ktorá sa javí ako zásadná pre vhodný rast pestovaného tkaniva.

Podstata technického riešenia

Uvedené nedostatky sú do značnej miery odstránené bioreaktorom pre funkčné tkanivové inžinierstvo pozostávajúcim z hermeticky oddelenej komory, v ktorej je umiestené zariadenie na mechanické zaťažovanie, predovšetkým tkanivových náhrad chrupavky, podľa tohto technického riešenia. Jeho podstatou je to, že zariadenie je tvorené kultivačnou nádobou s podložkou na uloženie kultivačných vzoriek a aspoň jedným prítlačným rotačným indentorom pripojeným k unášaču, pričom unášač je uložený posuvne proti kultivačnej nádobe.

Zariadenie je výhodne tvorené lineárnym motorom, ku ktorého statoru je pripojený spodný diel kultivačnej nádoby a horný diel kultivačnej nádoby a k pohyblivej časti lineárneho motora je pripojený unášač aspoň s jedným rotačným indentorom valivo uloženým na osi. Os je posuvne uložená vo vertikálnom smere vo vedení zvislých stojín na rovnomerné cyklické zaťažovanie kutivačných vzoriek indentorom.

Na os je výhodne pripojená aspoň jedna nadľahčovacia ťažná pružina a/alebo tlačná pružina, pričom medzi osou a pružinami je vložený snímač napätia.

Okolo rotačného indentora môže byť opásaná dvojica brzdných pásov, pripevnených ku spojovaciemu profilu. K brzdným pásom je pripojené vahadlo na zabezpečenie symetrie ťažnej sily v pásoch na nastavenie

SK 6331 Υ1 odvaľovania, preklzu alebo úplného kĺzania indentora po podložke.

Horný diel kultivačnej nádoby je vo výhodnom vyhotovení členený pozdĺžnymi priečkami a priečnou priečkou na menšie kultivačné priestory pre podložku s otvormi na kultivačné vzorky. Podložka je z materiálu obdobných mechanických vlastností, ako sú mechanické vlastnosti budúceho požadovaného tkaniva na zabezpečenie stability a rovnomerného rozloženia zaťaženia na vzorkách.

Podstata technického riešenia spočíva v umiestení stola s rotačným indentorom do rastovej komory bioreaktora. Komora je od okolitého laboratórneho prostredia hermeticky oddelená a vnútri je udržovaná ochranná atmosféra. Komora bioreaktora prakticky predstavuje laboratórny laminámy box, ktorý je uspôsobený veľkosti kultivačnej vane so vzorkami. Oproti používaným technickým riešeniam dochádza k priamemu mechanickému stimulu pestovaného tkaniva rotačným indentorom, ktorý simuluje reálne zaťaženie kĺbu.

Rotačný indentor tvorí valec s rotačným uložením, ktorý s rôznou veľkosťou nastaveného prítlaku prechádza cez kultivované tkanivové vzorky. Ďalším dôležitým prínosom je možnosť odvaľovania, čiastočného sklzu alebo úplného šmyku, čím je docielená nielen stimulácia od normálového zaťaženia, ale uplatňuje sa aj zložka v dotyčnicovom smere od šmykového zaťaženia. Týmto riešením sa výrazne približujeme in vivo podmienkam rastu tkaniva v organizme. Vzorky kultivovaného tkaniva sú uložené v dierach valcového tvaru. Zvyšok kultivačného priestoru je vyplnený podložkou z materiálu obdobných mechanických vlastností, ako sú mechanické vlastnosti budúceho požadovaného tkaniva. Rotačný indentor sa pohybuje po podložke so vzorkami rovnomerným pohybom a konštantným prítlakom, pričom je možné jednotlivé parametre pohybu a prítlaku v priebehu kultivácie meniť a zaznamenávať. Vzorky a podložka sú uložené v temperovanej vaničke. Konštrukčné riešenie odstraňuje niektoré nedostatky jestvujúcich štandardne používaných zariadení.

Technické riešenie sa týka novej koncepcie zariadenia stimulujúceho tkanivo počas rastu. Bioreaktor s rotačným indentorom pre funkčné tkanivové inžinierstvo náhrad chrupavky a s kontinuálnym doplňovaním živín predstavuje trojfázové zariadenie, v ktorom je riadená vnútorná atmosféra, ďalej je regulovaný prívod živín a v neposlednom rade dochádza k mechanickému stimulu kultivovaných buniek rotačným indentorom.

Navrhnuté technické riešenie zvyšuje svojím usporiadaním účinnosť mechanickej stimulácie tkaniva. To spočíva hlavne v možnom zaťažení v šmyku za súčasne aplikovaného normálového prítlaku. Využitím dvoch valcov s piatimi funkčnými plochami umožňuje súčasne vykonávať kultiváciu až 50 vzoriek súčasne, čo znamená ekonomický prínos a značnú úsporu času.

Oproti jednoduchším typom zariadení, ktoré predstavuje uvedený systém „Flask“, predstavuje navrhované riešenie ekonomicky a technicky náročnejšie zariadenie, ktoré je z pohľadu technickej náročnosti ovládania vo svojom dôsledku pre obsluhu pohodlnejšie. Celý systém je vybavený množstvom kontrolných a riadiacich prvkov, ktoré umožňujú lepšie sledovať deje vnútri zariadenia a presnejšie nastavenie prevádzkových parametrov. Oproti zložitejším a špeciálnym systémom je vzájomné porovnanie zložitejšie v tom, že zmieňované systémy „HARV, STLV a RWPV“ sú primáme určené na kultiváciu iných typov tkanív než nami navrhnutý bioreaktor. Ale je možné predpokladať, že vzhľadom na konštrukciu je výsledný mechanický efekt na mechanickú stimuláciu nižší než pri priamom kontakte valca a tkaniva.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Bioreaktor podľa tohto technického riešenia bude podrobnejšie opísaný na konkrétnom príklade uskutočnenia pomocou priložených výkresov, kde na obr. 1 je znázornený schematicky v axonometrickom pohľade systém mechanickej stimulácie, na obr. 2 je znázornené v detaile uloženie indentora a na obr. 3 je znázornené technické vyhotovenie pre čiastočný preklz a úplné kĺzanie.

Príklady uskutočnenia

Zariadenie, podľa obr. 1 a 2, pozostáva z lineárneho servomotora 1, ktorý je v hornej časti pripojený skrutkami k pozdĺžnym výstužiam 3 a na spodnej ploche je pripevnený ku komore bioreaktora. Na pohyblivú časť lineárneho servomotora 1 je pripevnený skrutkami unášač 2 rotačného indentora 13 a k nemu sú pripevnené pomocou skrutiek 4 štyri zvislé stojiny 11, ktoré sú vybavené pozdĺžnymi drážkami na klzné vedenie. Každý pár stojín Uje vzájomne z dôvodu tuhosti prepojený spojovacím profilom 10, v ktorom sú závity na nastavovacie skrutky 12 prítlaku. Pozdĺžne výstuhy 3 sú pripevnené ku spodnému dielu kultivačnej nádoby 5. Spodný diel 5 je vybavený drážkou esovitého tvaru na prechod výhrevného média a je spojený s horným dielom 6 tak, aby nedochádzalo k úniku vyhrievacieho média. Spodný diel 5 je ďalej po obvode vybavený drážkou na odvod prebytočnej výživy. Horný diel 6 kultivačnej nádoby 5 je členený pozdĺžnymi priečkami 7 a priečkou 14 na menšie kultivačné priestory. Vnútri kultivačných priestorov je podložka 8 z materiálu obdobných mechanických vlastností, ako sú budúce požadované tkanivá, ktorá je vybavená dierami na uloženie kultivačných vzoriek 9 valcového tvaru. Po podložke 8 sa úplne odvaľuje, s čiastočným preklzom alebo s

SK 6331 YI úplným šmykom, rotačný indentor 13, ktorý je rotačné uložený ložiskami 15 na osi 16.

Na obr. 2 je znázornený použitý systém prítlaku s odmeriavaním vyvodzovanej sily. S osou 16 je pevne spojený a zaistený maticou 17 snímač 18 napätia — ťah/tlak. Na opačnej strane snímača 18 je priskrutkovaná oporná miska 19 tlačnej pružiny 22, ktorej súčasťou je aj záves ťažnej pružiny 21. Na opačnej strane tlačnej pružiny 22 sa nachádza záves 20 ťažnej pružiny 21, ktorý zároveň slúži aj ako oporná podložka na tlačnú pružinu 22. Pohybovaním skrutkou 12 nastávajú celkom tri prevádzkové režimy. Východisková pozícia — — režim I znamená, že skrutka 12 je v pozícii, kedy je natiahnutá ťažná pružina 21 a indentor 13 nie je v kontakte so vzorkami 9. Režim II nastáva vtedy, keď skrutka 12 je v takej pozícii, kedy dochádza ku kontaktu indentora 13 s podložkou 8 a kultivačnými vzorkami 9. Veľkosť prítlaku je v tomto prípade 0 až hodnota prítlaku vyvodená vlastnou hmotnosťou indentora £3. Režim III nastáva vtedy, keď k prítlaku od indentora 13 sa pripojí zaťaženie od deformácie tlačnej pružiny 22 vyvodené skrutkou 12. Z dôvodu symetrie zaťažovania je nutné nastaviť zaťaženie od skrutiek 12 v párovej zhode a na to slúžia údaje zo snímača £8.

Na obr. 3 je znázornené použitie s brzdením alebo úplnou blokáciou indentora £3. Brzdenie indentora £3 je realizované dvojicou pásov 23, ktoré sú opásané vo vybraniach mimo funkčnej plochy. Pásy 23 sú na jednej strane pevne spojené so spojovacím profilom 10 a na druhej strane sú pripevnené pomocou skrutiek 25, matíc 24, poistných podložiek 26 k obdĺžnikovému vahadlu 27. ktoré je skrutkovo spojené maticou 32 a skrutkou 33 k ťahadlu 30. Použitím vahadla 27 s otočným uložením okolo skrutiek 25 a 33 je zabezpečená rovnaká ťažná sila v pásoch 23. Veľkosť ťažnej sily v pásoch 23 je možné regulovať maticou 29 s podložkou 30. Na meranie ťažnej sily v pásoch 23 je možné vložiť snímač medzi podložku 30 a spojovací profil 10.

Rotačný indentor 13 vrátane jeho súčastí — horný diel 6, pozdĺžne priečky 7, ktoré prichádzajú do kontaktu s kultivovaným tkanivom, sú vyrobené z antikorózneho biokompatibilného materiálu. Ostatné komponenty sú vyrobené z antikoróznej ocele. Kultivačná časť má rozmery 200 x 650 mm. Jednotlivé kultivačné priestory majú veľkosť 30 x 300 mm. Do každého z nich sa vojde 5 kultivovaných vzoriek 9. Celkom ich je teda možné pestovať až 50 naraz. Uložené vzorky 9 sa skladajú z matrice osadenej kultivačnými bunkami tkaniva. Okolitý priestor vedľa vzoriek je vyplnený podložkou 8, ktorá je z materiálu obdobnému kolagénu so špecifickým chemickým zložením, ktoré zabezpečuje zodpovedajúce chemicko-mechanické vlastnosti.

Kultivácia prebieha tak, že za presne stanovených biologicko-fyzikálnych podmienok, ako je napr. teplota, koncentrácia živného roztoku a zloženie ochrannej atmosféry, dochádza k mechanickej stimulácii vzoriek 9 rotačným indentorom £3. Zariadenie umožňuje kontinuálne zaťažovanie alebo s užívateľsky definovanými pauzami medzi zaťažovaním. Samotné nastavenie prítlaku je volené a nastavované obsluhou. Každý z valcov indentora 13 je možné nastaviť na iné parametre zaťaženia a teda na rôzne podmienky kultivácie. Prítlak je možné nastaviť pomocou skrutiek 12 a odmeriavaním pomocou snímača £8. Hodnoty prítlaku je možné v priebehu kultivácie sledovať a zaznamenávať pomocou PC.

Priemyselná využiteľnosť

Bioreaktor pre funkčné tkanivové inžinierstvo podľa tohto technického riešenia nájde uplatnenie predovšetkým v tkanivovom inžinierstve a medicíne. Súčasné trendy ukazujú, že práve týmto smerom sa uberá výskum a vývoj.

NÁROKY NA OCHRANU

Claims (5)

1. Bioreaktor na tvorbu tkanivových náhrad, najmä chrupavky, pozostávajúci z hermeticky oddelenej komory, v ktorej je usporiadané zariadenie na mechanické zaťažovanie, predovšetkým tkanivových náhrad, vyznačujúci sa tým, že zariadenie na mechanické zaťažovanie je tvorené kultivačnou nádobou s podložkou (8) usporiadanou v jej hornom diele (6) a aspoň jedným prítlačným rotačným indentorom (13) pripojeným k unášaču (2), pričom unášač (2), spojený s lineárnym motorom (1), je proti kultivačnej nádobe (5) uložený posuvne.

2. Bioreaktor podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ku statoru lineárneho motora (1) je pripojený spodný diel (5) a horný diel (6) kultivačnej nádoby a k pohyblivej časti lineárneho motora (1) je pripojený unášač (2) aspoň s jedným rotačným indentorom (13) valivo uloženým na osi (16) posuvne uloženej vo vertikálnom smere vo vedení zvislých stojín (11).

3. Bioreaktor podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že na os (16) je pripojená aspoň jedna nadľahčovacia ťažná pružina (21) a/alebo tlačná pružina (22), pričom medzi osou (16) a pružinami (21,22) je vložený snímač (18) napätia.

4. Bioreaktor podľa nároku 1, 2 alebo 3, vyznačujúci sa tým, že okolo rotačného indentora (13) je opásaná dvojica brzdných pásov (23), pripevnených ku spojovaciemu profilu (10), pričom k brzdným pásom (23) je pripojené vahadlo (27) na zabezpečenie symetrie ťažnej sily v pásoch (23).

SK 6331 Υ1

5. Bioreaktor podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že horný diel (6) kultivačnej nádoby je členený pozdĺžnymi priečkami (7) a priečnou priečkou (14), pričom podložka (8) je vybavená otvormi na uloženie kultivačných vzoriek (9).