SK501252018U1 - Spôsob purifikácie kryštálov alfa-anomérov z kryštalických zmesí alfa/beta-aromatických glykozidov - Google Patents

Abstract

Kryštály alfa-anoméru aromatického glykozidu sa zo zmesi kryštálov alfa-anoméru a beta-anoméru aromatického glykozidu získajú selektívnou enzymatickou hydrolýzou beta-anoméru pomocou fungálnych beta-N-acetyl-hexózaminidáz. Týmto spôsobom možno purifikovať napríklad kryštály alfa-anoméru 4-nitrofenyl-2- acetamido-2-deoxy-D-galaktopyranozidu a 4-metylumbeliferyl-2- acetamido-2-deoxy-D-galaktopyranozidu.

Description

Otáasť techniky

Technici® riešenie sa týka spôsobu eliminácie β-auonérov aromatických glykozidov z ktyštalickej aoomerickei zmesi a- a β-formy týchto látok. Počas procesu dochádza selektívne k hydrolýze výlučne β-anoméru vybraného glykozidu čo zabezpečuje špecifická mikrobiálnych β-Ν-acetyihejíózammídáz. Po skončení reakcie sa kryštály α-fbnry aromatického glykozidu jednoducho odfiltrujú, čím odpadá izolácia produktu extrakčnými postupmi.

Doterajší stav techniky

Aromatické glykozidy sú zlúčeniny obsahujúce dve zložky: sacharidovú (glykón) a nesachartdovú (agiykún), ktorá je tvorená aromatickým jadrom s rôznym biogenetickým pôvodom Čoraz častejšie sa aromatické glykozidy uplatňujú ako substráty v medicíne pri včasnej diagnostike závažných ochorení. Aglykónomje v tomto prípade chromogénna (farbu tvoriaca ) alebo fluorescenčná (fluorescenciu tvoriaca) látka, ktorá sa reakciou s enzýmom uvoľni do reakčnej zmesi a následne sa farebný, resp. fluorescenčný signál pomerne ľahko deleguje (najčastejšie UV/'VIS spektroibtometria). Vzhľadom na štruktúru glykónu glykozid sa vyskytuje v dvoch anoraémych formách označovaných a- a β-fortry v závislosti od väzby v molekule glykozidu. Aromatické glykozidy ako syntetické substráty sa dajú jednoducho a týchto využívať na identifikáciu, kvantifikáciu a bližšiu charakterizáciu enzýmov, ktoré sú zodpovedné za rôzne druhy ochorení. Možno ich použiť na štúdium enzýmových kinetík, lokalizáciu enzýmov v jednotlivých tkanivách či identifikáciu mikroorganizmov v oblasti medicínskej diagnostiky. Vysoká stereo- a regiošpecíficita enzýmov zabezpečuje rýchlu a presnú reakciu s vybraným syntetickým glykozidorn už pri veľmi nízkych koncentráciách (nikto·, resp. nanoroolárnych koncentráciách) o unxtžňuje diagnostikovať ochorenie už v jeho počiatočných štádiách.

Doterajší stav v príprave α-anomérov aromatických glykozidov je taký, že sa pripravujú takmer výlučne chemickými postupmi. Najpoužívanejšia je Kotrig-Ktrorrova metóda, resp. jej modifikácie (Batresi, E a Hindsgaul. O.: fíelv. Chiin. Acta 7, 1995, s. 281 - 330). Počas chemických procesov sa v extrémnych reakčných podmienkach vytvárajú glykozyiové halidy a nežiaduce aktivované intermediáty, ktoré sú tepelne nestabilné a ťažko sa izolujú. V týchto postupoch sa využívajú drahé, korozívne a toxické reagencie, ktoré je nutné po syntéze eliminovať z produktu nakoľko glykozidy môžu byť následne aplikované v potravinárskom alebo farmaceutickom priemysle. Okrem toho vytvárajú záťaž pre životné prostredie.

Inou dostupnou chemickou metódou je Fisherova glykozylácia. Táto metóda je jednoduchšia a menej nákladná ako Konig-Knotrova metóda, avšak nevýhodami sú: vysoké reakčné teploty, použitie nadbytku alkoholu a silných minerálnych kyselín, ktoré sťažujú purifikáciu produktov. Jednoduchou Fischerovou glykozyláciou vznikajú znesi atiomérov α/β-glykozidov, v ktorých pomer a rovnováha gíykozidickej znes i α/β-anomérov závisí od termodynamickej stability jednotlivých izomérov (Raťner, M. ¥., Mishra, S.: Sustain. CheiH. Process 1(7), 2013, s. 1 - 15). a- a β-anoméry glykozidov majú takmer rovnaké fyzikálne vlastnosti čo sťažuje ich separáciu. Z tohto dôvodu separácia klasickými postupmi ako je napríklad chromatografia alebo rekryštahzáeía z reakčnej zmesi sú pomerne náročné z hľadiska technického zariadenia aj ekonomiky procesu (Ruiz, J. M. J.: J. Mol'Caí. B, 11, 2001, s. 189 - 197).

V literatúre sú popísané chemici® postupy prípravy' zmesí aromatických atiomérov glykozidov napríklad z l,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-azido-2-deoxy-D-galaktopyranôzy (Lemieux, R. U. a Rateliff, R. M.: Can. J. Chem. 57, 1979, s. 1244 - 1251), 3,4,6-lri-O-acelyl-2-azicío-2-cíeoxy-D-galaktopyranozyl chloridu. (Carb. Res. 2009, 344, s. 43'2 - 4-38; Can. J. Ch e tri. 1989, 67, s. 1388 1391) alebo 3,4,6-tri-O-acetyl-2-azido-2-deoxj'-D-galaktopyranozyitrichloroacetimidátu (Carb. Res. 2011, 346, s. 1454 - 1466), ktoré môžu byť substituované na lO-atyl-2-aeetamado-2-deoxy-«/^-galak;opyraiiozidy (kde 1-O-aryl ^::: p-nitroíényl (Carb. Res. 2011, 346, s. 1454 - Í466), 4-metylumbeíifery!-2-acetamido-2-deoxy-a/'’fi-gataktopyranozidy (Carb. Res. 2009, 344, s. 432 - 438; Can. J. Chem. 1989, 67, s. 1388 - 1391). Následne je azido-skupína redukovaná na acetamido-skupinu podľa Staudingerovej reakcie (Beckmann, H. S. G. and Wittmann, V. Organic Azides: Synťheses and Applieauons, Witey, 2010, s. 469 - 490) pričom sa tvoria l-O-atyl-2-acetamido-2-<leoxy-a/p-D-galaktopyranozidy.

Vyššie uvádzané nevýhody môžu byť eliminované využitím enzýmov v príprave vybraných glykozidov. Chemická syntéza tak môže byť nahradená chemoenzymaticko'u pripadne čisto enzymatickou prípravou glykozidov. Z literatúry je napr. známe použitie ghikanotransferáz na enzýmovú syntézu chromogénnych alebo fluorogénnvch glykozidov inaitooligosacharidov (Halí, L. M.: US4225672, 1979).

Enzyniatická príprava α-auomérov aromatických glykozidov z vodných roztokov anoneetickej zmesí aa β-formy týchto látok je predmetom patentovej prihlášky PP50042-2018. Popisuje postupy, ktorými sa v prítomnosti vybraných mikrobiálnych glykozid á z rozkladá selektívne len β-anomérvo vodných roztokoch anomérov vybraného glykozidu. Nevýhodou tohto procesu je však nízka počiatočná koncentrácia anotnerickej zmesi v dôsledku veľmi nízkej rozpustnosti aromatických glykozidov. Výťažky α-anoméru príslušného gly

S K 50125-2018 Uí kozidu sú tak limitované rozpustnosťou anomeríckej zmesi týchto látok. Tento problém je možné odstrániť nami navrhovanými riešením, ktoré popisuje prácu v suspenziách kryštálov α/β-zmesí aromatických glykozídov.

Podstata íechniekého riešenia

Podstatou predkladaného technického riešenia je euzymatická hydroíýza β-anoméru vybraného glykozidu v kryštalickej suspenzii a β-foriem týchto látok:. Nie je potrebné, aby anomerická zmes boía úplne rozpustená vo vodnom roztoku, k rozkladu β-anoméru dochádza aj v kryštalickej zmesi α/β-glykozidov. V reakčných podmienkach sa rozpustí iba určitá časť oboch anomérov a zvyšok zostáva v reakčnej zmesi vo forme kryštálov. Ehzytratické štiepenie β-atíoméru vybraného glykozidu zacítia prídavkom ftiitgáineiio enzýmu β· -N-acetyihexózaminidázy do kryštalickej zmesi anomérov a reakcia prebieha za intenzívneho miešania, pri teplote 20 - 40 °C a pH reakčnej zmesi 4 - 6, s výhodou 4,4 - 4,6. Počas reakcie sa vybraný β-glykozid rozkladá na dve zložky - etikom á zložka (giykót·) a necukomá zložka (agiykót·). Zároveň dochádza k ďalšiemu postupnému rozpúšťaniu kryštálov β-anoméru v reakčnej zmesí Po skončení reakcie sa v zmesi nachádzajú kryštály α-anoméni derivátu glykozidu a rozpustené zvyšky po rozklade β-anoméru (príslušný aglykón a glykón). Kryštály produktu sa od zvyšnej kvapalnej zmesi oddelia jednoduchou filtráciou, centriHugádou alebo inými vhodnými postupmi, premyjú s a ľadovou vodou a vysušia.

Týmto spôsobom je možtíé rozdeliť chemickú zmes napríklad 4-nitrofet:yl-2-aeetamido-2-deGxy-«/^-D· -galaktopyranozidov (2-niirofenyl-2-acetamido-2-deoxy-«/p-D-galaktopyraiJozidov, 2-chloro-4-nilrofenyl-α/β-D-galakiopyranozidov či 4-metyiumbehíéryi-2-acetamido-2-deoxy-a/fi-D-galaktopyranozidov) v rôznom pomere anomérov, pričom β-artomér je enzýmom hydrolyzovaný a kryštály intaktného α-anotnéru je následne možné z reakčnej zmesi jednoducho odfiltrovať (podľa Schémy 1).

Schéma 1: Príklad hydrolýzy vodnej suspenzie kryštálov zmesi ch β-aromatických galaktopyranozidov pomocou β-Ν-acetylhexozammidaz.

Používané glykozidázy, β-Ν-acetyHiexózaminklázy, sú vysokošpecifické najmä k N-acetylovaným β-D-glykozidom Najčastejším zdrojom tohto enzýmu sú prirodzené kmene vláknitých húb (zrodov Penicillium, Aspergillus, resp. Talaromyces) príp. rekombinantné kmene (Pichlapastorís), popísané v literatúre (Weiguerová L. a kol: Carbohydr. Res. 338, 2003. s. 1003 - 1008, Slamová, K. a kol.: Prot. Expr. Purif. 82. 2012, s. 212 - 217). Submerzné kultivácie prirodzených kmeňov vláknitých húb prebiehajú 11 - 14 dní, pri teplote 25 - 30 °C, optimálne pri teplote 28 °C. Po ukončení kultivácie je médium obsahujúce enzým preíiltrované, centrifogované a supernatant je použitý na izoláciu hexôzaininidáz štandardnými postupmi (Skriňová, K. a kol.: Prot, Expr. Purif 82. 2012, s, 212 - 217). Získaný proteínový preparát β Nm.cetylhe:<ózatnKiidáz sa použije priamo na hydrolýzu β-anomém glykozidov kryštalickej α/β-zmesi aromatických glykozídov. Aktivita pripravených euzýmových preparátov (1 Unit) je definovaná ako množstvo enzýmu, ktorého pôsobením nad-ni'rofetiyl-Z-ace'ainido-z-deoxy-p-D-galaktopyratiozid. sa uvoľní i utrel 4-tritrofenolu za i minútu pri teplote 35 °C, hodnote pH 4,5 a miešaní 450 rpm. Uvoľnený 4-nitrofenol sfarbuje postupne reakčnú zmes, pinčom zmenu intenzity sfarbenia možno pozorovať spektrofotometricky pri vlnovej dĺžke 420 nm (Mega a kol.: J. Bioehem., 1970, 68, 109---117).

S K 50125-2018 Uí

Príklady uskutočnenia

Príklad i

Vláknitá huba P. oxalicum CCF 1959 sa kultivuje v kultivačných bankách s objemom média 0,1 drn³ obsahujúceho: kvasničný extrakt (0,5 g/dm³), KIT2PO4 (3 g/dm³), NH4H2PO4 (5 g/dm³), (ΝΗ.φδίλι (2 g/dm³), NaCl (15 g/dm³), N-acetylglukozamín (5 g/dm³), destilovaná voda; pH ^::: 6,0. Po sterilizácii kultivačného média (autokláv, 120 °C, 120 kPa, 20 minút) bol pridaný sterilný roztok MgSOi 11a výslednú koncentráciu 0,5 g/dm³. fíaničky sa očkujú sterilné pripravenou sporovou suspenziou. Kultivácia prebieha 13 dní pri teplote 28 ^C'C na rotačnej trepačke s rýchlosťou otáčania 180 rpm. Následne sú zvyšky mycélta oddelené od kultivačného média filtráciou a z filtrátu je enzým β-Ν-acetylhexózaminidáza izolovaný pomocou FPLC. Získaný roztok enzým: je uskladňovaný v roztoku IM síranu amónneho v chladničke pri teplote 4 °C.

Chemicky pripravená zmes 4-mtrofenyí-2-acetartrldo-2-deoxy-a/p-D-gaiaktopyranoädov (4-NPGalNAc) v pomere anomérov α : β 3 : 2 sa použije na enzýmovú hydrolýzu pomocou izolovaných β-Ν-acetylhexózanÄndáz z vláknitej huby oxalicum CCF 1959. 1 g tejto chemickej zmesi anomérov sa rozmieša v 50 cm³ 5(1 mM fbsfôtovo-citráíového tlmivého roztoku (pH 4,5). Suspenzia kryštálov satempetuje 5 minút pri teplote 35 °C a pridá sa 0,4 cm³ roztoku enzýmu β-Ν-acetylhexózamnidázy s aktivitou 160 U/ml. V daných podmienkach je po 6-tich hodinách reakcie stupeň rozkladu β-anoméru vyšší ako 96 %. V reakčnej zmesi nakoniec zostáva mu 99 % z obsahu a-anorém 4-nitrofenyl-2-acetairddo-2-deow-D-gaiaktopyranozidu vneseného do reakcie a produkty hydrolýzy β-anoméru (4-nitrofenol a N-acetyl-D-galaktózamin).

Ktyštály α-aoomém sa izolujú z výslednej zmesi jednoduchou filtráciou, premyjú sa ľadovou destilovanou vodou a vysušia sa v sušiarni pri teplote 40 °C. Optická čistota kryštálov 4-oitrofenyl-2-acetamido-2-deoxy-a-D-galaktopyranozidu bola vyššia ako 96 % a identita látky bola potvrdená aj NMR analýzou t¹H NM R (CDCÍ3) alfa artomér 5,60 pprn (d, J ^::: 3,35 Hz); beta anornér 5,14 ppm (d, J ^::: 8,41 Hz)).

Príklad 2

Chemicky pripravená zmes 2-nitrofetjyl-2-acetairddo-2-<ieow-aý3-I)-galaktopyranozrdov v pomere anotrérov α : β 3 : 2 sa použije na enzýmovú hydrolýzu pomocou preparátu β-N-acetylhexózaminidázy z vláknitej huby P. oxalicum CCF 1959 pripraveného podľa postupu uvedenom v príklade 1. Pripraví sa 180 cm³ 150 mM suspenzie zmesi kryštálov anotnérov v destilovanej vode pričom hodnota pH sa upraví na 4,5. Po vytemperovaní zmesi na teplotu 35 °C sa pridá 20 cm³ roztoku enzýmu β-Ν-acetylhexózaminidázy s aktivitou 160 U/ml. V daných reakčných podmienkach (teplota 35 °C, pH 4,5) je po 7 hodinách reakcie stupeň hydrolýzy β-anornéru vyšší ako 99,8 % V reakčnej zmesi zostáva udnimálne 99,3 % obsahu a-anoirétu 2-nitrofenyl-2-acetarcido-2-deoxy-D-ga]aktopyranozidt) vneseného do reakcie a produkty hydrolýzy' β-anotnéru (2-nitrofenol a N-acetyl-D-galaktózamin). α-Anomér sa izoluje z reakčnej zmesi postupom opísaným v príklade í a optická čistota kryšt álov a-anoméru bola 92 - 98 %.

Príklad 3

Pripraví sa ettzým β-Ν-acetyihexózamimdáza postupom opísaným v príklade 1 pričom ako produkčný mikroorganizmus sa použije Talaromyces flavus CCF 2686. Kultivácia ndkroorgatiiara· prebiehala 11 dní.

Enzým je použitý na štiepenie chemicky pripravenej zmesi 4-iretylumbeliferyl-2-acetanrédo-2-deosy-a/p-D-galakíopyranoztdu (4-MU-«/p-GalNAc) s pomerom anomérov α : β 1 : 2. Reakčná zmes obsahuje 18 cm³ vodnej suspenzie kryštálov anomeriokej zmesi (20 mM) a 2 ml roztoku enzýmt (špecifická enzýmová aktivita 30 U/ml). Ehzýinová hydrolýza prebieha v termostate pri teplote 35 °C, pri pH 4,5 a za miešania (450 rpm). Po 60-tich minútach reakcie je stupeň rozkladu β-anoméru vyšší ako 98 %. V reakčnej zmesi ostáva min 99,6% z obsahu α-anoméru 4-MlJ-a-GaINAc vneseného do reakcie a produkty štiepenia β-anoméru (4-mstylumbeliféróii a N-acetyi-D-gaiaktózamín). α-Anomér sa izoluje z reakčnej zmesi postupom opísaným v príklade l a opt ická čistota kryšt álov a-anométu bola 95 - 98 %.

Priemyselná využiteľnosť

Predkladané technické nesenie je využiteľné pri príprave čistých α-anomérov aromatických glykozidov priamo zo suspenzií kryštálov chemicky pripravených «.''β-zmesí týchto látok. Tieto sa používajú ako chrotnogénne a fluorogénne substráty v medicíne na včasnú diagnostiku ochorení, detekciu mikroorganizmov, respektíve môžu byť využité ako substráty 11a prípravu nových bioaktivnych látok.

Claims (6)

1. NÁROKY NA OCHRANU

   ä. Spôsob purifikácie kryštálov a-anontérov zo zmesí kryštálov α/β-aromatických glykoadov, vyznačujúci sa tým, že sa zo zmesi kryštálov α/β-anomérov aromatických glykozidov selektívne enzymaticky hydrolyzuje β-anomér týchto glykozidov s použitím iúngálnych β-Ν-acetyi-hexózaininidáz, pričom kryštály α-anonérov sa z reakčnej zmesí odseparujú filtráciou, centri-ugáciou, resp. inými vhodnými postupmi.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa zo zmesi kryštálov α/β-anomérov aromatických glykozidov selektívne enzymaticky hydrolyzuje β-anomér týchto glykozidov s použitím β-Ν-acetyl-hexózaminidáz z vláknitých húb rodu PenicilHuma. Taiaroinyces.
3. 3. Spôsob podľa nárokov 1 a 2, vyznačujúci s a tým, že sa v kryštalickej zmesi ako α/β-atioméry aromatických glykozidov použijú deriváty nhrofenylgalaktozidov.
4. 4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že sa v kryštalickej zmesi ako α/β-anoméry aromatických glykozidov použijú deriváty 4-nitrofeny 1-2-acetamido -2-deoxy -D-galaktopyranožidov a2-ni!.rofeny 1-2-ace!.amtdo-2-deoxy-Il-galakiopyranoztdov.
5. 5. Spôsob podľa nárokov 1 a 2, vyznačujúci sa tým, že sa v kryštalickej zmesi ako α/β-anoméry aromatických glykozidov použijú deriváty fluorogénnychsubstrátov.
6. 6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci s a tým, že sa v kryštalickej zmesí ako α/β· -anoméry aromatických glykozidov použijú deriváty 4-metyrdni>eiifeiyl-2-acetamido-2-deoxy-D-gaiaktopy•au oxidov.