SK289057B6 - Spôsob chromatografickej purifikácie rekombinantného ľudského erytropoetínu - Google Patents

Abstract

Vynález sa týka spôsobu chromatografickej purifikácie rekombinantného ľudského erytropoetínu produkovaného v ľudských embryonálnych obličkových bunkách HEK 293. Spôsob chromatografickej purifikácie tvorí séria troch chromatografických krokov, pričom základom spôsobu trojkrokovej purifikácie je priamo kultivačné médium zbavené buniek s upraveným pH a vodivosťou. Prvým separačným krokom je multimodálna chromatografia, v ktorej sa ako elučné činidlo využíva arginín. Ďalšími krokmi postupu sú hydrofóbna chromatografia a ionovýmenná chromatografia pomocou silného katexu. Týmto spôsobom sa získa výsledný produkt s podielom rhEPO na celkovom obsahu proteínov najmenej 90 % hmotn.

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka chromatografickej purifikácie rekombinantného ľudského erytropoetínu (ďalej rhEPO) produkovaného rekombinantnými ľudskými embryonálnymi obličkovými bunkami HEK 293.

Doterajší stav techniky

Erytropoetín (EPO) je dôležitý terapeutický hormón využívaný na liečbu anémie u pacientov s chronickým ochorením obličiek, AIDS alebo rakovinou. Prvýkrát bol EPO úspešne purifikovaný v roku 1977 z moču pacientov s aplastickou anémiou, kedy Miyake a kol. (J Biol Chem. 252, 1977, s. 5 558 - 64) uviedli zložitú sedemstupňovú purifikačnú metódu s celkovým výťažkom 21 %. Lepší výťažok bol dosiahnutý aplikáciou imunoafinitnej chromatografie, pričom Yanagawa a kol. (Blood, 913, 1984, s. 170-178) pripravili EPO v dvoch separačných krokoch s výťažkom 63 %. Počas purifikácie použili samostatne vyvinuté protilátky z myších hybridómov.

Purifikovaný rhEPO sa začal využívať na terapeutické účely pri liečbe anémie až po pochopení mechanizmu syntézy EPO v tele a po úspešnom naklonovaní génu kódujúceho jeho tvorbu. Gén je vysoko konzervovaný. Nachádza sa v jednej kópii vo veľkosti 5,4 kilobáz na chromozóme 7q11-q22 (Jacobs a kol.: Nature, 313, 1985, s. 806 - 10). Po translácii génu vzniká prohormón, ktorý sa skladá zo 193 aminokyselín. Zrelý hormón vznikne posttranslačnými modifikáciami, a to odštiepením 27 aminokyselín z N-terminálneho konca a arginylového zvyšku z C-terminálneho konca polypeptidu. Molekulová hmotnosť peptidového reťazca EPO je 18 kDa. Polypeptidový reťazec je značne glykolyzovaný. Glykozylové zvyšky tvoria asi 40 % z celkovej molekulovej hmotnosti EPO. Správne glykozylovaná molekula má molekulovú hmotnosť okolo 30,4 kDa (Lai a kol.: J Biol Chem, 261, 1986, 3 116 - 21). Komerčné rhEPO prípravky sa kvôli komplexnosti molekuly a potreby správnej glykozylácie na zachovanie biologickej aktivity vyrábajú pomocou živočíšnych bunkových línií.

Na prípravu čistého rhEPO sa vyvinuli metódy, ktoré používajú kombináciu rôznych chromatografických metód. Patentový dokument EP3153522 opisuje zložitý sedemstupňový proces, v ktorom sú zabudované tri separačné kroky pomocou anionovýmenných adsorbentov, jeden separačný krok multimodálnou a jeden kationovýmennou chromatografiou. Okrem týchto separačných metód sa tu využíva aj afinitná chromatografia a veľkostne vylučovacia chromatografia. V patentovom dokumente MX2008002448 je uvedená metóda, kde je rhEPO purifikovaný kombináciou anionovýmennej, veľkostne vylučovacej a afinitnej chromatografie. Pred každým separačným krokom, ako aj po ukončení purifikácie je produkt zakoncentrovaný pomocou ultrafiltrácie. Patentový dokument EP1127063B1 uvádza, že časť kontaminujúcich bielkovín je odstránená vysolením. RhEPO je následne purifikovaný pomocou hydrofóbnej a ionovýmennej chromatografie. Purifikačný proces sa ukončí gélovou filtráciou.

Existujú aj separačné postupy využívajúce purifikáciu pomocou hydroxyapatitu. V patentových dokumentoch WO2005121173 a US2007293420A1 sú uvedené purifikačné metódy, ktoré okrem separácie v hydroxyapatitovej kolóne zahŕňajú dva purifikačné kroky pomocou ionovýmenných adsorbentov a separačné kroky využívajúce hydrofóbnu interakčnú a afinitnú kolónu. V patentovom dokumente WO2010034442 je uvedený postup na prípravu mono-PEGylovaného EPO. Na purifikáciu sa použije separácia pomocou afinitného a hydrofóbneho interakčného adsorbenta a purifikácia pomocou keramického hydroxyapatitu. V každom purifikačnom kroku je udržiavaná presná koncentrácia Ca²⁺ iónov. Hydroxyapatit je efektívny v kombinácii s anionovýmennou chromatografiou a kyslým premývaním produktu aj na prípravu EPO analógov s nižším izoelektrickým bodom (pI<4). Proces je uvedený v patentovom dokumente WO2013058485.

Na purifikáciu rhEPO je efektívna aj chromatografia na reverzných fázach. V patentových dokumentoch CN101153058 a WO02003045996 sa v separačnom postupe použije okrem chromatografie na reverznej fáze aj ionovýmenná a veľkostne vylučovacia chromatografia. V iných metódach do purifikačného postupu okrem uvedených separačných techník je zavedená aj afinitná chromatografia (patentové dokumenty WO2011035914 a KR20120117728A).

Podstata vynálezu

Predmetom predkladaného vynálezu je trojkroková separačná metóda na purifikáciu rhEPO, ktorý sa produkuje rekombinantnou bunkovou líniou HEK 293. Výhodou tejto metódy je využitie multimodálneho adsorbenta, ktorý kvôli soliodolnosti umožní priame využitie kultivačného média na separáciu bez úpravy suroviny diafiltráciou. Unikátne vlastnosti multimodálneho adsorbenta zabezpečia odstránenie značného množstva kontaminujúcich bielkovín v jednom separačnom kroku. Vhodné usporiadanie ďalších purifikačných krokov umožní priame použitie produktu z predchádzajúcej separácie v ďalšom separačnom kroku.

Podstatou separácie rhEPO podľa vynálezu je, že na purifikáciu rhEPO sa používajú chromatografické metódy, ktoré kvôli vhodnému usporiadaniu separačných krokov umožnia priame použitie produktovej frakcie z predchádzajúceho kroku bez úpravy diafiltráciou.

Zdrojom rhEPO je rekombinantná bunková línia HEK 293/pcDNA3.1-EPO. Z buniek HEK 293 bola izolovaná mRNA a prepísaná do cDNA, ktorá slúži ako matrica na amplifikáciu génu pre EPO pomocou PCR reakcie. EPO gén je následne klonovaný do prokaryotického vektora pGEM-T-Easy. Z plazmidu pGEM-T-Easy je EPO gén reklonovaný do eukaryotického expresného vektora pcDNA3.1(+) za IE CMV promótor. DNA expresného vektora pcDNA3.1-EPO bola použitá na transfekciu HEK293. Selekčným tlakom geneticínu bola pripravená stabilná bunková línia HEK 293/pcDNA3.1-EPO produkujúca rhEPO do kultivačného média. Po ukončení kultivácie sa z kultivačného média odseparujú bunky a ich zvyšky centrifugáciou.

Následne sa pracuje s odobratým kultivačným médiom obsahujúcim proteíny, pričom podiel rhEPO je od 2 do 2,2 % hmotn. z celkového obsahu proteínov nachádzajúcich sa v kultivačnom médiu na vstupe do separačných krokov.

Pred vstupom do prvého separačného kroku sa pH kultivačného média upraví na hodnotu 5 až 7 a jeho vodivosť na 30 až 40 mS/cm.

Postup krokov procesu separácie rhEPO je nasledujúci.

Prvým krokom separácie je multimodálna chromatografia prebiehajúca v chromatografickej kolóne, ktorá je naplnená multimodálnym kationomeničom. Kultivačné médium obsahujúce rhEPO je po úprave pH a iónovej sily priamo nastreknuté do kolóny. Soliodolnosť multimodálnych adsorbentov umožní priame použitie vstupujúceho kultivačného média na separáciu rhEPO. Veľkou výhodou multimodálnych adsorbentov je prítomnosť iónových a hydrofóbnych funkčných skupín, ktoré zabezpečia vysokú selektivitu. V tomto separačnom kroku je odstránených najmenej 97 % podiel kontaminujúcich proteínov, pričom straty rhEPO počas adsorpčnej fázy sú minimálne. Na elúciu sa kvôli silným interakciám pôsobiacich na molekuly rhEPO používa 1 až 2 M roztok arginínu. Po elúcii sa dosiahne výťažok rhEPO 60 až 70 % a podiel rhEPO v celkovom obsahu proteínov narastie na 32 až 38 % hmotn.

Následne produktová frakcia s rhEPO je po úprave pH a iónovej sily separovaná pomocou hydrofóbnej interakčnej chromatografie na adsorbente s fenylovými funkčnými skupinami, pričom vodivosť produktovej frakcie získanej v predchádzajúcom separačnom kroku sa upravuje prídavkom soli na hodnotu 120 až 150 mS/cm. Arginín, prítomný vo vzorke po prvom separačnom kroku, neovplyvňuje tento proces. Kvôli silnému hydrofóbnemu charakteru adsorbenta sa dá dobrý výťažok dosiahnuť elúciou pomocou 25 až 30 % vodného roztoku izopropanolu pripraveného do 50 mM Tris-HCl pufra s pH 8 až 9. Po elúcii je výťažok rhEPO po druhom kroku separácie 58 až 66 %. Podiel rhEPO v celkovom obsahu proteínov narastie na 45 až 55 % hmotn.

Získaná produktová frakcia v predchádzajúcom separačnom kroku je následne purifikovaná ionovýmennou chromatografiou po úprave jej pH na silnom kationomeniči na hodnotu 5 až 6. Izopropanol sa odstráni počas adsorpčnej fázy. RhEPO je z kolóny uvoľnený zvýšením iónovej sily alebo kombináciou zmeny pH a zvýšenia iónovej sily. Elúcia sa uskutočňuje pomocou 0,8 až 1,2 M roztoku NaCl. Celkový výťažok rhEPO po troch separačných krokoch je 13 až 26 % a podiel rhEPO v celkovom obsahu proteínov narastie na 90 až 95 % hmotn. v závislosti od použitého pufra pri elúcii v tomto separačnom kroku.

Príklady uskutočnenia vynálezu

V príklade 1 je podrobne opísaná príprava rhEPO v kultivačnom médiu a jednotlivé kroky separácie a purifikácie rhEPO sú opísané v príkladoch 2 až 4.

Príklad 1

RNA z buniek HEK 293 sa prepisuje do cDNA pomocou RT-PCR. Gén kódujúci EPO je amplifikovaný PCR reakciou pomocou špecifických primérov:

EPO5-ATG -Hind III 5'-CGTTTAAGCTTGCCACC ATGGGG GTG CAC GAA TGT CC- 3',

EPO3-TCA-Xho1 5' -CCGCCCTCGAGTCA GTC CCC TGT CCT GCA GGC CTC-3'.

Priméry obsahujú restrikčné miesta pre HindIII a Xho1 a Kozak sekvenciu. Produkt amplifikácie sa klonuje do prokaryotického vektora pGEM-T-Easy (Promega). Primárna štruktúra amplifikovanej a klonovanej cDNA EPO je verifikovaná sekvenovaním. Z plazmidu pGEM-T-Easy je EPO gén reklonovaný pomocou reštrikčných enzýmov do eukaryotického expresného vektora pcDNA3.1(+)(Invitrogen) za IE CMV promótor. DNA expresného vektora pcDNA3.1-EPO bola použitá na transfekciu HEK 293. Transfekcia buniek sa uskutočňuje pomocou lipozomálneho reagensu Turbofect (Thermofisher), ktorý spontánne reaguje s DNA a umožňuje jej prejsť cez bunkovú stenu do vnútra bunky. Nakoľko expresný plazmid nesie a exprimuje gén pre odolnosť proti antibiotiku G418 (Geneticín) je umožnená pozitívna selekcia transfekovaných buniek, ktoré sú nositeľmi expresného plazmidu s génom pre EPO.

Pozitívne transfekované bunky HEK 293 s pcDNA3.1-EPO sa kultivujú v 550 ml adherentných kultivačných fľašiach (Greiner Bio-One) do 100 % konfluencie v 10 % FCS VLE v DMEM (Biochrom, fetálne teľacie sérum v Dulbeccom modifikovanom Eagleho médiu) pri 37 °C 5 % CO2. Po dosiahnutí 100 % konfluencie sa bunky opatrne prepláchnu s fosfátom pufrovaným fyziologickým roztokom (PBS) a pokračuje sa v kultivácii v produkčnom médiu (EX-CELL® 293 bezsérové médium pre bunky HEK 293, SIGMA). Po 12 dňoch sa bunky scentrifugovali pri 3 000 g 20 min. a supernatant sa použil na separáciu rhEPO.

Správna veľkosť rhEPO bola verifikovaná Western blotom.

Na stanovenie koncentrácie rhEPO bola využitá nepriama ELISA metóda. Podrobný opis metódy je uvedený v článku Molnár a kol.: Chem. Pap., 73, 2019, 713 - 718. Stanovenie celkovej koncentrácie proteínov vo vzorkách sa uskutočnilo pomocou štandardnej BCA metódy na mikrotitračných platničkách.

Uvedeným spôsobom sa získalo kultivačné médium ako surovina obsahujúcu rhEPO na uskutočnenie separačných a purifikačných krokov opísaných v ďalších príkladoch.

Príklad 2

Kolóna Tricorn 5/100 (GE Healthcare) sa naplnila multimodálnym kationomeničom Capto MMC (GE Healthcare), objem živice v kolóne (CV) bol 1,2 ml.

Počas separácie boli použité nasledujúce pufre:

pufer A: 50 mM citrát-fosfátový pufer s pH 6 obsahujúci 300 mM NaCl, pufer B: 50 mM Tris-HCl s pH 7 obsahujúci 1 M arginínu.

Úprava suroviny

Ako surovina obsahujúca rhEPO sa použilo postkultivačné médium pripravené podľa postupu v príklade 1, ktoré sa upravilo na pH 6 prídavkom 50 mM kyseliny citrónovej a na vodivosť 33 mS/cm prídavkom NaCl. Takto upravená surovina bola filtrovaná cez PES membránu s veľkosťou pórov 0,22 pm. Koncentrácia proteínov v postkultivačnom médiu bola 1,9 g/L, z čoho rhEPO tvorilo 2 % hmotn.

Postup purifikácie rhEPO multimodánou chromatografiou bol uskutočnený v nasledujúcich krokoch:

1. Ekvilibrácia kolóny: 20 CV pufra A pri prietoku 1 ml/min.

2. Nástrek suroviny: 35 CV upravenej suroviny pri prietoku 0,3 ml/min.

3. Premývanie kolóny: 10 CV pufra A pri prietoku 0,3 ml/min.

4. Elúcia skokovým gradientom: 5 CV pufra B pri prietoku 0,3 ml/min.

5. Regenerácia kolóny: 5 CV 1 M NaOH pri prietoku 0,3 ml/min. s následným premytím 10 CV vody pri prietoku 1 ml/min.

Počas krokov 2 až 4 sa odoberali frakcie, v ktorých sa stanovila koncentrácia rhEPO a proteínov. Počas krokov 2 a 3 strata rhEPO je 3 %, pričom viac ako 50 % kontaminujúcich proteínov opúšťa kolónu. Kvôli silným interakciám medzi molekulami rhEPO a ligandmi adsorbenta je, na uvoľnenie rhEPO z kolóny, potrebné použiť arginín. Počas kroku 4 sa dosiahol výťažok rhEPO 65 % a čistota rhEPO, t. j. podiel rhEPO z celkového množstva proteínov v produkte, narástla na 35 % hmotn.

Príklad 3

Kolóna Tricorn 10/100 (GE Healthcare) bola naplnená hydrofóbnym chromatografickým adsorbentom Capto Phenyl (GE Heathcare), objem živice v kolóne bol 1,8 ml.

Počas separácie boli použité nasledujúce pufre:

pufer A: 50 mM citrát-fosfátový pufer s pH 6 obsahujúci 1,5 M NaCl, pufer B: 50 mM Tris-HCl s pH 9 obsahujúci 30 % izopropanolu.

Ako surovina bola použitá produktová frakcia pochádzajúca z prvého kroku separácie, uvedeného v príklade 2, ktorá sa upravila na pH 6 prídavkom 50 mM kyseliny citrónovej a na vodivosť 139 mS/cm prídavkom NaCl. Arginín, prítomný v surovine z predchádzajúceho separačného kroku, neovplyvňuje separáciu na hydrofóbnom adsorbente Capto Phenyl, preto nie je potrebná úprava suroviny diafiltráciou.

Postup purifikácie rhEPO hydrofóbnou chromatografiou bol uskutočnený v nasledujúcich krokoch:

1. Ekvilibrácia kolóny: 20 CV pufra A pri prietoku 1 ml/min.

2. Nástrek suroviny: upravená produktová frakcia z predchádzajúceho separačného kroku pri prietoku 0,3 ml/min.

3. Premývanie kolóny: 10 CV pufra A pri prietoku 0,3 ml/min.

4. Elúcia skokovým gradientom: 5 CV pufra B pri prietoku 0,3 ml/min.

5. Regenerácia kolóny: 5 CV 1 M NaOH pri prietoku 0,3 ml/min. s následným premytím 10 CV vody pri prietoku 1 ml/min.

Počas krokov 2 až 4 sa odoberali frakcie, v ktorých sa stanovila koncentrácia rhEPO a proteínov. Počas adsorpčnej fázy (krok 2 a 3) neboli zaznamenané žiadne straty rhEPO. Vďaka silnému hydrofóbnemu charakteru adsorbenta sú interakcie medzi rhEPO a stacionárnou fázou silné. Na dosiahnutie dobrého výťažku musí elučný pufer (pufer B) obsahovať izopropanol. Použitie izopropanolu umožnilo dosiahnuť výťažok 62 % rhEPO z pôvodného množstva na vstupe do separácie. Čistota rhEPO, t. j. podiel rhEPO z celkového množstva proteínov v produkte, po druhom separačnom kroku narástla na 50 % hmotn.

Príklad 4

Kolóna Pharmacia HR5/5 bola naplnená chromatografickým adsorbentom Fractogel EMD SE Hicap (Merck). Objem živice v kolóne bol 0,9 ml.

Počas purifikácie boli použité nasledujúce pufre:

pufer A: 50 mM Bis-Tris-HCl pufer s pH 5,5, pufer B: 50 mM Tris-HCl pufer s pH 7 obsahujúci 1 M NaCl, pufer C: 50 mM Bis-Tris-HCl pufer s pH 5,5 obsahujúci 1 M NaCl.

Ako surovina bola použitá produktová frakcia pochádzajúca zo separácie, uvedenej v príklade 3, ktorá sa upravila na pH 5,5 prídavkom 1 M HCl. Produktová frakcia po separácii na Capto Phenyl obsahovala izopropanol, ktorý bol odstránený v krokoch 2 a 3 počas separácie na Fractogel EMD SE Hicap.

Postup purifikácie rhEPO kationovýmennou chromatografiou bol uskutočnený v nasledujúcich krokoch:

1. Ekvilibrácia kolóny: 20 CV pufra A pri prietoku 1 ml/min.

2. Nástrek suroviny: upravená produktová frakcia z predchádzajúceho separačného kroku pri prietoku 0,3 ml/min.

3. Premývanie kolóny: 10 CV pufra A pri prietoku 0,3 ml/min.

4. Elúcia skokovým gradientom: 5 CV pufra B alebo pufra C pri prietoku 0,3 ml/min.

5. Regenerácia kolóny: 5 CV 1 M NaOH pri prietoku 0,3 ml/min. s následným premytím 10 CV vody pri prietoku 1 ml/min.

Počas krokov 2 až 4 boli odobraté frakcie, v ktorých je stanovená koncentrácia EPO a proteínov. Počas krokov 2 a 3 neboli zaznamenané žiadne straty produktu. Použitím pufra B sa získalo 40 % z nastreknutého rhEPO a čistota produktu, t. j. podiel rhEPO z celkového množstva proteínov v produkte, sa zvýšila na 90 % hmotn. Celkový výťažok rhEPO po troch separačných krokoch bol 26 %.

Použitím pufra C sa získalo 18 % z nastreknutého množstva rhEPO. Čistota výsledného produktu, t. j. podiel rhEPO z celkového množstva proteínov v produkte, dosiahla 95 % hmotn. Celkový výťažok po troch separačných krokoch bol 13 %.

Priemyselná využiteľnosť

Predložený vynález možno využívať pri priemyselnej výrobe významného terapeutického proteínu rekombinantného ľudského erytropoetínu.

Claims (2)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   Spôsob chromatografickej purifikácie rekombinantného ľudského erytropoetínu produkovaného ľudskými embryonálnymi obličkovými bunkami HEK 293, vyznačujúci sa tým, že sa purifikácia 5 rhEPO uskutočňuje pomocou nasledujúcich separačných chromatografických krokov: v prvom kroku separácie pomocou multimodálnej chromatografie s použitím multimodálneho kationomeniča, pričom kultivačné médium vstupuje do procesu s upraveným pH na 5 až 7 a vodivosťou na 30 až 40 mS/cm a obsahuje proteíny s podielom rhEPO od 2 do 2,2 % hmotn., sa pôsobením multimodálneho kationomeniča odstraňujú kontaminujúce proteíny a následná elúcia sa uskutočňuje pomocou 1 až
2. 2 M roztoku arginínu, následne 10 v produktovej frakcii po elúcii v prvom kroku separácie s podielom rhEPO 32 až 38 % hmotn. na celkovom obsahu proteínov sa rhEPO separuje pomocou hydrofóbnej interakčnej chromatografie na adsorbente s fenylovými funkčnými skupinami, pričom vodivosť produktovej frakcie získanej v predchádzajúcom separačnom kroku sa upraví pridaním soli na hodnotu 120 až 150 mS/cm, a následná elúcia sa uskutoční 25 až 35 % vodným roztokom izopropanolu s pH 8 až 9, v získanej produktovej frakcii v predchádzajúcom 15 separačnom kroku s podielom rhEPO 45 až 55 % hmotn. na celkovom obsahu proteínov sa rhEPO purifikuje ionovýmennou chromatografiou pomocou silného katexu, pH sa upraví na hodnotu 5 až 6, pričom zvýšením iónovej sily alebo kombináciou zmeny pH a zvýšenia iónovej sily sa uvoľní rhEPO, a po elúcii uskutočnenej pomocou 0,8 až 1,2 M roztoku NaCl je podiel rhEPO od 90 do 95 % hmotn. na celkovom obsahu proteínov.