SK279910B6

SK279910B6 - Process for producing non-infectious blood plasma

Info

Publication number: SK279910B6
Application number: SK3869-91A
Authority: SK
Inventors: Horst Schwinn; Dieter Wolter
Original assignee: Octapharma Ag
Priority date: 1991-12-18
Filing date: 1991-12-18
Publication date: 1999-05-07
Also published as: CZ282181B6; SK386991A3; CZ386991A3

Abstract

A process for the preparation of non-infectious blood plasma comprises treating the plasma with non-ionic tensides tri-N- -butylphosphate and/or 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol ethoxylate; adding biologically compatible lipids selected from vegetable oils, especially soya-bean oil and/or castor oil, prior to separation of the lipid phase; separating the lipid phase and removing the non-ionic surfactant by solid phase extraction on hydrophobic materials, with the proviso than said hydrophobic materials are octadecyl residuals which are connected with silica gel, polystyrene or polyglycidylmethacrylate thereby forming a matrix.

Description

Predmetom predloženého vynálezu je spôsob výroby krvnej plazmy bez infekčných zárodkov.It is an object of the present invention to provide a method for producing blood plasma without infectious germs.

Doterajší stav technikuState of the art technique

Krvná plazma sa v lekárstve používa na veľké množstvo indikácií. V súhlase s tým má veľký klinický význam. Krvná plazma sa získava oddelením krvných buniek z plnej krvi, ktorá bola odoberaná darcom. Aby sa zabránilo infikovaniu pacientov patogénnymi zložkami, ako vírusmi hepatitídy a H1V z plazmy darcu, musí byť táto zbavená intaktných vírusov. Preto bolo až dosiaľ možné používať iba plazmu jednotlivých darcov, ktorí mohli byť po dlhšom čase pozorovania považovaní za zdravých v zmysle toho, že nemajú vírusy. Zmiešanie (Poolen) plaziem viacerých darcov bolo vylúčené.Blood plasma is used in medicine for many indications. Accordingly, it is of great clinical importance. Blood plasma is obtained by separating blood cells from whole blood that has been drawn by the donor. In order to prevent the infection of patients with pathogenic components such as hepatitis viruses and H1V from donor plasma, they must be free of intact viruses. Therefore, until now, it has only been possible to use the plasma of individual donors who could be considered healthy after a long period of observation in the sense that they do not have viruses. Pooling of multiple donor reptiles was excluded.

Nedostatkom tohto spôsobu je enormný náklad, ktorý je nutné vynaložiť v dôsledku jednotlivých príprav. Kontinuálny spôsob práce nie je pomocou dnes existujúcich pracovných technických postupov možný. V dôsledku toho sa objavuje ďalší nedostatok. Štandardizované plazmatické preparáty sa dajú pripraviť len neúmerne vysokým, ťažko obhájiteľným nákladom. Vzhľadom na jednotlivú prípravu kolíše napríklad obsah proteínu v darcovskej frakcii. Preto sa musí pri použití plazmy vyrobenej jednotlivou prípravou brať do úvahy vždy aktuálny obsah proteínu dotyčnej šarže.The disadvantage of this method is the enormous cost that has to be incurred as a result of the individual preparations. Continuous working methods are not possible with the existing technical working methods. As a result, there is another shortcoming. Standardized plasma preparations can only be prepared with disproportionately high, difficult to maintain costs. With regard to the individual preparation, for example, the protein content in the donor fraction varies. Therefore, the actual protein content of the batch in question must always be taken into account when using the plasma produced by the individual preparation.

V princípe je možné inaktivovať vírusy prísadou chemických látok. Veľký problém predstavuje odstránenie prostriedku použitého na inaktiváciu infekčných zložiek. Podľa pracovného postupu vyvinutého New-York-Blood-Center sa na inaktiváciu vírusu používajú detergenty. Veľký problém spočíva v tom, že je nutné tieto detergenty po vykonanej inaktivácii vírusu z plazmy opäť odstrániť. Borowitz navrhuje zbaviť prípravky spracované detergentmi týchto detergentov pomocou hydrofóbnej chromatografie pomocou materiálov obrátených fáz.In principle, it is possible to inactivate viruses by adding chemicals. Removal of the composition used to inactivate the infectious components presents a major problem. Detergents are used to inactivate the virus according to the procedure developed by the New-York-Blood-Center. The big problem is that these detergents need to be removed from the plasma again after the virus has been inactivated. Borowitz proposes to discard detergent-treated detergents by hydrophobic chromatography using inverted phase materials.

EP-A-0 239 859 opisuje spôsob čistenia krvnej plazmy extrakciou prírodnými rastlinnými olejmi, ako napríklad olejom zo sójových bôbov.EP-A-0 239 859 discloses a method for purifying blood plasma by extraction with natural vegetable oils such as soybean oil.

Technický problém, ktorý tvorí základ vynálezu, je teda daný tým, že je potrebné dať k dispozícii kontinuálny spôsob výroby krvnej plazmy zbavenej zárodkov. Z toho vyplývajúce problémy sa okrem iného týkajú bezpečného a spoľahlivého spôsobu odstránenia detergentov inaktivujúcich vírus. Okrem toho je žiaduce získať už pri výrobe plazmatického preparátu preparáty so štandardizovaným obsahom proteínu.Thus, the technical problem underlying the invention is due to the need to provide a continuous process for the production of de-seeded blood plasma. The resulting problems relate, inter alia, to a safe and reliable method of removing virus inactivating detergents. In addition, it is desirable to obtain standardized protein preparations already in the preparation of the plasma preparation.

Z vopred nepublikovaného EP-A-0 366 946 je známy spôsob odstránenia detergentov z krvnej plazmy pomocou hydrofóbnej chromatografie s obrátenými fázami, so silikagélovou matricou potiahnutou oktadecylom.It is known from the unpublished EP-A-0 366 946 to remove detergents from blood plasma by reversed phase hydrophobic chromatography, with octadecyl coated silica gel matrix.

Ďalší technický problém vyplýva zo skutočnosti, že látky nosiča, skladajúce sa zo silikátu, používané pri chromatografii s obrátenými fázami, strácajú pri extrakcii v menšej miere svoj povlak. Takto vznikajúce nepotiahnuté silikátové častice aktivujú potom faktory vytvárajúce v krvnej plazme zrazeninu a vedú k jej nežiaducemu rozrušeniu.A further technical problem arises from the fact that the silicate carrier materials used in reverse phase chromatography lose their coating to a lesser extent. The resulting uncoated silicate particles then activate the clot-forming factors in the blood plasma and lead to undesirable disruption.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Technické problémy, ktoré tvoria základ vynálezu, boli vyriešené spôsobom produkcie krvnej plazmy zbavenej infekčných zárodkov, pri ktorom sa plazma spracuje neionogénnymi tenzidmi tri-N-butylfosfátom a/alebo etoxylátom 4-(1,1,3,3-tetrametylbutyl)fenolu, pred oddelením lipidovej vrstvy sa pridajú biologicky kompatibilné lipidy vybrané zo súboru rastlinných olejov, osobitne sójového oleja a/alebo ricínového oleja, lipidová fáza sa oddelí a neionogénny tenzid sa odstráni extrakciou s pevnou fázou na hydrofóbnych materiáloch nosiča, pričom hydrofóbne materiály sú zvyšky oktadecylu a zvyšky oktadecylu sa spoja so silikagélom, polystyrénom alebo polyglycidylmetakrylátom za vytvorenia matrice.The technical problems underlying the invention have been solved by a method for producing plasma free of infectious embryos, wherein the plasma is treated with non-ionic surfactants with tri-N-butylphosphate and / or 4- (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenol ethoxylate before by separating the lipid layer, biocompatible lipids selected from the group of vegetable oils, in particular soybean oil and / or castor oil, are added, the lipid phase is separated and the nonionic surfactant is removed by solid phase extraction on hydrophobic carrier materials, the hydrophobic materials being octadium residues is combined with silica gel, polystyrene or polyglycidyl methacrylate to form a matrix.

Krvná plazma môže pritom pochádzať tak z čerstvo vyrobených plazmatických preparátov, ako aj z hlboko zmrazených frakcií. Krvná plazma, zmrazená v tomto prípade na teplotu -18 °C až -30 °C, sa nechá pred spracovaním neionogénnymi tenzidmi roztopiť na vodnom kúpeli pri 20 až 30 °C a hodnota pH krvnej plazmy sa nastaví na 7,0 až 7,4.The blood plasma can be derived from both freshly prepared plasma preparations and from deep-frozen fractions. Blood plasma, frozen in this case at -18 ° C to -30 ° C, is thawed in a water bath at 20-30 ° C prior to treatment with non-ionic surfactants and the blood plasma pH is adjusted to 7.0-7.4. .

Neionogénny tenzid je tri-N-butylfosfát a/alebo etoxylát 4-( 1,1,3,3 -tetrametylbuty ljfenolu.The non-ionic surfactant is 4- (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenol tri-N-butyl phosphate and / or ethoxylate.

Krvná plazma sa môže spracovávať aj vodnou zmesou tri-N-buty[fosfátu a etoxylátu 4-(l,l,3,3-tetrametylbutylfenolu. Pracuje sa pri teplote 20 až 40 °C, výhodne pri 30 °C. Ako neionogénny tenzid prichádza do úvahy najmä tri-N-butylfosfát (TEBP) a/alebo Triton-X-100 [etoxylát-4-(l,l,3,3-tetrametylbutyl)fenolov]. Pomer zmesi tri-N-butylfosfátu : etoxylátu 4-(1,1,3,3-tetrametylbutyl)fenolu : : vode = 0,5 až 2 : 0,5 až 2,2 až 4. Je výhodné, keď sa zmes spracováva určitý čas miernym miešaním pri zvýšenej teplote. Lipidová zmes sa oddelí odstredenim. Pred odstredenim sa lipidová frakcia obohatí biologicky znesiteľnými lipidmi, ako napríklad rastlinným olejom, najmä olejom zo sójových bôbov a/alebo ricínovým olejom. Potom sa lipidová frakcia odstráni odstredenim. Lipidová fáza sa môže tiež oddeliť filtráciou na hydrofóbnom filtračnom materiáli výhodne mikronizovanom filtračnom materiáli. Pri výhodnej forme realizácie sa pridáva asi 10 % rastlinného oleja. Po odstredení sa lipidová vrstva a plazmatická vrstva oddelí. Toto sa môže stať pomocou sifónu alebo kontinuálne pracujúcej odstredivky s automatickým delením fáz. Lipidová fáza zodpovedá množstvu 10 % (obj./obj.), vztiahnuté na celkový objem.The blood plasma may also be treated with an aqueous mixture of tri-N-butyl phosphate and 4- (1,1,3,3-tetramethylbutylphenol ethoxylate) at a temperature of 20 to 40 ° C, preferably at 30 ° C. in particular, tri-N-butyl phosphate (TEBP) and / or Triton-X-100 [ethoxylate-4- (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenols], ratio of tri-N-butyl phosphate: ethoxylate 4- ( 1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenol:: water = 0.5 to 2: 0.5 to 2.2 to 4. It is preferred that the mixture is treated for some time by gentle stirring at elevated temperature. Prior to centrifugation, the lipid fraction is enriched with biocompatible lipids, such as vegetable oil, in particular soybean oil and / or castor oil, after which the lipid fraction is removed by centrifugation by filtration on a hydrophobic material, preferably by filtration with a hydrophobic material. In a preferred embodiment, time is added After centrifugation, the lipid layer and the plasma layer are separated. This can be done by means of a siphon or continuously operating centrifuge with automatic phase separation. The lipid phase corresponds to an amount of 10% (v / v) based on the total volume.

Plazmatická vrstva sa zhromaždí, zatiaľ čo sa lipidová vrstva odloží. Potom sa pripadne pripojí filtračný krok a potom sa zvyšný, ešte prítomný neionogénny detergent z plazmy odstráni pomocou extrakcie s pevnou fázou. Táto extrakcia sa vykonáva s materiálmi na chromatografiu s obrátenými fázami. Na chromatografiu s obrátenými fázami sa používajú materiály modifikované oktadecylom. Extrakcia s pevnou fázou sa môže vykonávať rovnako pomocou alifatických zvyškov s 18 atómami uhlíka chromatografiou s obrátenými fázami. Ako materiál nosiča sa okrem iného používa silikagél, ktorý má ale tu nevýhodu, že v prípade, keď chýba potiahnutie, vyvoláva v krvnej plazme aktiváciu faktorov, ktoré vedú k jej rozrušeniu. Tomuto nežiaducemu účinku je možné čeliť výberom vhodných organických materiálov nosičov ako je Sephacryl, čo je gél tvoriaci materiál na gélovú filtráciu vo vode alebo organických rozpúšťadlách, vyrobiteľný trojrozmerným zosietením lineárnych reťazcov dextránu s N,N'-metylén-bis-(okralamidu), Superose, ktorá predstavuje rôzne typyThe plasma layer is collected while the lipid layer is discarded. Thereafter, a filtration step is optionally added and then the remaining non-ionic detergent still present is removed from the plasma by solid phase extraction. This extraction is carried out with reversed phase chromatography materials. Octadecyl modified materials are used for reverse phase chromatography. Solid phase extraction can also be carried out using 18-carbon aliphatic residues by reverse phase chromatography. Silica gel is used inter alia as a carrier material, but has the disadvantage that, in the absence of coating, it induces in the blood plasma the activation of factors which lead to its disruption. This adverse effect can be countered by the selection of suitable organic carrier materials such as Sephacryl, which is a gel forming material for gel filtration in water or organic solvents, obtainable by three-dimensional crosslinking of dextran linear chains with N, N'-methylene-bis- (okralamide), Superose which represents different types

SK 279910 Β6 priečne zosietených agarózových periel s priemerom 10 až 30 pm na HPLC, alebo Fractogel^ TSK, čo sú stacionárne fázy na hydrofílnú gólovú chromatografiu. Pri výhodnej forme rozpracovania sa môže extrakcia s pevnými fázami vykonávať ako chromatografia. Pomer medzi objemom lôžka a objemom spracovávanej plazmy je výhodne 1 : 6 až 1 : 20, najvýhodnejšie 1:10.Cross-linked agarose beads with a diameter of 10 to 30 µm for HPLC, or Fractogel ® TSK, which are stationary phases for hydrophilic goal chromatography. In a preferred embodiment, the solid phase extraction can be carried out as chromatography. The ratio between bed volume and plasma volume treated is preferably 1: 6 to 1: 20, most preferably 1:10.

Po extrakcii s pevnými fázami sa vykoná sterilná filtrácia. Vo výhodnom rozpracovaní sa sterilná filtrácia urobí po extrakcii s pevnými fázami a po kontrole pH s nastavením hodnoty pH na 7,0 až 7,4.After solid phase extraction, sterile filtration is performed. In a preferred embodiment, sterile filtration is performed after solid phase extraction and pH control with a pH of 7.0 to 7.4.

Po sterilnej filtrácii sa krvná plazma suší vymrazovaním, výhodne v prítomnosti obvyklých pomocných prostriedkov na lyofilizáciu, ako napríklad lyzinu alebo glycínu. Hydrofóbny materiál je mikronizovaný.After sterile filtration, the blood plasma is freeze-dried, preferably in the presence of conventional freeze-drying aids such as lysine or glycine. The hydrophobic material is micronized.

Spôsob podľa vynálezu umožňuje ustúpiť od obvyklého jednotlivého spracovania plazmy. Spôsob je vhodný na realizáciu v priemyslovom meradle a najmä umožňuje kontinuálny spôsob práce. Ďalšia výhoda spôsobu podľa vynálezu spočíva v tom, že na základe kontinuálneho vykonávania spôsobu sa môžu podmienky voliť tak, že konečný produkt má vždy rovnakú alebo prinajmenšom veľmi podobnú koncentráciu proteínov. Tým sa stáva klinické ovládanie preparátov krvnej plazmy, osobitne pri viacnásobnej dávke, neproblematické, pretože sa odstránia premenné množstvá proteínu, ktoré vyplývajú z jednotlivých príprav.The method according to the invention makes it possible to withdraw from the usual individual plasma treatment. The method is suitable for industrial scale implementation and, in particular, allows a continuous process. A further advantage of the process according to the invention is that, based on the continuous operation of the process, the conditions can be chosen such that the end product always has the same or at least very similar protein concentration. This makes the clinical control of blood plasma preparations, especially at multiple doses, unproblematic, since the variable amounts of protein resulting from the individual preparations are removed.

Príklady uskutočnenia vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Spôsob podľa vynálezu je bližšie vysvetlený pomocou nasledujúcich príkladov uskutočnenia.The process according to the invention is explained in more detail by the following examples.

PríkladExample

1 krvnej plazmy (80 x 250 ml) sa nechá roztopiť vo vodnom kúpeli pri 25 °C počas 1,5 hodiny. Prípadne sa frakcia po roztopení sfiltruje cez gázový filter alebo cez filtračnú patrónu (napríklad firmy Pal, 100 pm). Potom sa plazma naplní pri 30 °C do kotla z nehrdzavejúcej ocele. Na operáciu miešania sa použije vrtuľové listové miešadlo. Hodnota pH roztopenej plazmy sa preskúša a nastaví sa pomocou 0,5 N kyseliny soľnej na hodnotu pH 7,0 až 7,4.1 blood plasma (80 x 250 ml) was thawed in a water bath at 25 ° C for 1.5 hours. Alternatively, the thawed fraction is filtered through a gauze filter or a filter cartridge (e.g., Pal, 100 µm). The plasma is then fed into a stainless steel boiler at 30 ° C. A propeller blade stirrer is used for the mixing operation. The pH of the molten plasma is checked and adjusted to pH 7.0-7.4 with 0.5 N hydrochloric acid.

Vyrobí sa zmes TNBP, Tritonu X-100 a destilovanej vody. Množstvo je výhodne v pomere TNBP : Triton X-100-destilovaná voda + 0,5 až 2 : 0,5 až 2 : 2 až 4. V predloženej veľkosti šarže bolo pri najvhodnejšom spôsobe použitých 200 ml TNBP, 200 ml Tritonu X-100 a 800 ml destilovanej vody. Zmes sa ohriala asi na 30 °C. Potom sa pridá zmes neionogénnych tenzidov k plazme. Zmes sa opatme mieša pri 30 °C. Po 4 hodinách nasleduje odstreďovanie plazmy.A mixture of TNBP, Triton X-100 and distilled water is made. The amount is preferably in the ratio of TNBP: Triton X-100-distilled water + 0.5 to 2: 0.5 to 2: 2 to 4. In the present batch size, 200 ml of TNBP, 200 ml of Triton X-100 were used in the most appropriate method. and 800 ml of distilled water. The mixture was heated to about 30 ° C. A mixture of non-ionic surfactants is then added to the plasma. The mixture was carefully stirred at 30 ° C. After 4 hours, the plasma is centrifuged.

Výhodne sa odstreďuje pri 4 000 otáčkach za minútu počas 1 hodiny pri 12 °C. Na zväčšenie lipidovej fázy sa pred odstreďovaním k reakčnej zmesi pridá asi 10 % (obj./obj.) oleja zo sójových bôbov alebo ricínového oleja. Po odstreďovaní sa lipidová vrstva oddelí od plazmatickej vrstvy. To sa môže urobiť pomocou sifónu alebo filtráciou na hydrofóbnom, prípadne mikronizovanom materiáli, napríklad Zetaplus DEL 1 Filter (predstavuje hydrofóbny, mikronizovaný filtračný materiál). Vrstvy plazmy sa zhromaždia a prefiltrujú cez filtračné membrány, inertné proti proteínu (napríklad firmy Pal, 3 až 5 pm). Získa sa 12 % plazmy.Preferably it is centrifuged at 4000 rpm for 1 hour at 12 ° C. To increase the lipid phase, about 10% (v / v) soybean oil or castor oil is added to the reaction mixture prior to centrifugation. After centrifugation, the lipid layer is separated from the plasma layer. This can be done by siphon or by filtration on a hydrophobic or micronized material, for example a Zetaplus DEL 1 Filter (representing a hydrophobic, micronized filter material). The plasma layers are collected and filtered through protein-inert filtration membranes (e.g., Pal, 3-5 µm). 12% of the plasma is obtained.

Toto množstvo sa spracuje Prep C-10 adsorpčným činidlom alebo Pro RPC HR 5/5 adsorpčným činidlom. Pri odpadajúcom množstve 10 1 sa výhodne rozmieša 1,2 kg v 2,4 1 vody. Chromatografia sa uskutočňuje na stĺpci s priemerom 15 cm. Pretečené množstvo je 300 ml/min. Eluát sa kontroluje pomocou UV-monitora. Vystupujúca frakcia plazmy sa zhromažďuje a prípadne sa nastaví na pH 7,0 až 7,4 0,5 N hydroxidom sodným.This amount is treated with Prep C-10 adsorbent or Pro RPC HR 5/5 adsorbent. For a 10 L drop-off, 1.2 kg is preferably stirred in 2.4 L water. Chromatography is performed on a 15 cm diameter column. The flow rate is 300 ml / min. The eluate is checked by means of a UV-monitor. The protruding plasma fraction is collected and optionally adjusted to a pH of 7.0 to 7.4 with 0.5 N sodium hydroxide.

Plazma sa sterilné sfiltruje cez membránový filter (0,22 pm) a usuší vymrazovaním. Potom sa naplní do fliaš s objemom 250 ml.The plasma is sterile filtered through a membrane filter (0.22 µm) and freeze-dried. It is then filled into 250 ml bottles.

Claims

PATENT CLAIMS

Method for the production of infectious germ-free blood plasma, characterized in that the plasma is treated with non-ionic surfactants with tri-N-butylphosphate and ^with 4- (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenol ethoxylate, before adding the lipid layer biologically compatible lipids selected from the group of vegetable oils, in particular soybean oil and / or castor oil, the lipid phase is separated, and the nonionic surfactant is removed by solid phase extraction on hydrophobic carrier materials, wherein the hydrophobic materials are octadecyl residues and polyadsyl-octadecyl residues; or polyglycidyl methacrylate to form a matrix.

Method according to claim 1, characterized in that the blood plasma, frozen at a temperature of -18 ° C to -30 ° C, is thawed in a water bath at 20 to 30 ° C and the pH of the blood before being treated with nonionic surfactants. the plasma is adjusted to 7.0 to 7.4.

Process according to claims 1 and 2, characterized in that the non-ionic surfactant used is tri-N-butyl phosphate and / or 4- (1,1,3,3-tetramethylbutyl) -phenol ethoxylate.

Process according to claim 1 or 3, characterized in that an aqueous mixture of tri-N-butyl phosphate and 4- (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenol ethoxylate is used.

The process according to claim 4, wherein the ratio of the mixture of tri-N-butylphosphate: 4- (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenol: water ethoxylate is 0.5 to 2: 0.5 to 2, 2 to 4.

The method according to claim 1, characterized in that the lipid phase is separated by centrifugation.

Method according to claim 1, characterized in that the lipid phase is separated by filtration on a hydrophobic filter material, preferably a micronized filter material.

The method of claim 1, wherein the lipid phase corresponds to an amount of 10% (v / v) based on the total plasma volume.

Method according to claims 1 to 8, characterized in that the solid phase extraction is carried out with reversed phase chromatography materials.

Method according to claim 9, characterized in that octadecyl modified materials are used for reverse phase chromatography.

Process according to claims 1 to 8, characterized in that the solid phase extraction is carried out by means of aliphatic residues of 18 carbon atoms by reversed phase chromatography.

SK 279910 Β6

Process according to claims 1 to 11, characterized in that sterile filtration is carried out after solid phase extraction.

The method according to claim 12, characterized in that the sterile filtration is carried out after solid phase extraction and after pH control with a pH adjustment of 7.0 to 7.4.

Method according to claims 1 to 10, characterized in that the blood plasma is freeze-dried.

15. The method of claim 14, wherein the blood plasma is freeze-dried in the presence of conventional freeze-drying aids.

16. The process of claim 15 wherein the lyophilization aid is lysine or glycine.

17. The method of claim 1 wherein the hydrophobic material is micronized.