CZ386991A3

CZ386991A3 - combined process for preparing blood plasma free of infectious germs

Info

Publication number: CZ386991A3
Application number: CS913869A
Authority: CZ
Inventors: Horst Dr Schwinn; Dieter Dr Wolter
Original assignee: Octapharma Ag
Priority date: 1991-12-18
Filing date: 1991-12-18
Publication date: 1993-08-11
Also published as: SK279910B6; CZ282181B6; SK386991A3

Abstract

A process for the preparation of non-infectious blood plasma comprises treating the plasma with non-ionic tensides tri-N- -butylphosphate and/or 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol ethoxylate; adding biologically compatible lipids selected from vegetable oils, especially soya-bean oil and/or castor oil, prior to separation of the lipid phase; separating the lipid phase and removing the non-ionic surfactant by solid phase extraction on hydrophobic materials, with the proviso than said hydrophobic materials are octadecyl residuals which are connected with silica gel, polystyrene or polyglycidylmethacrylate thereby forming a matrix.

Description

Předmětem předloženého vynálezu je kombinovaný způsob výroby krevní plasmy bez infekčních zárodků·The object of the present invention is a combined process for the production of infectious germ-free blood plasma.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Krevní plasma se v lékařství používá pro velké množství indikací· V. souhlasu s tím má velký klinický význam . Krevní plasma se získává oddělením krevních buněk z plné krve, která byla odebrána dárcům· Aby se zabránilo infikování pacienta pathogenními složkami., jako viry hepatitidy a HIV z plasmy dárce, musí být tato prosta intaktní ch virů .Proto bylo až dosud možné používat jen plasmy jednotlivých dárců,kteří mohli být po delší době pozorování považování za zdravé ve smyslu toho, že jsou prosti virů. Smíchání / Poolen/ plasem více dárců bylo vyloučené*Blood plasma is used in medicine for a large number of indications. Blood plasma is obtained by separating blood cells from whole blood that has been collected from donors. individual donors who may have been considered healthy for a longer period of observation in terms of being free of viruses. Mixing / Poolen / Plasma multiple donors excluded *

Nedostatkem tohoto způsobu je enormní náklad , který je nutné vynaložit v důsledku jednotlivých příprav· Kon tinuální způsob práce není pomocí dnes existujících pra covních technických postupů možný . V důsledku toho se objevuje další nedostatek . Standardizované plasmatické preparáty se dají připravit jen neúměrně vysokým,stěží obhaj itelným nákladem. S ohledem na jednotlivou příprava kolísá například obsah proteinu v dárcovské frakci. Proto se musí při použití plasmy vyrobené jednotlivou přípravou zohledňovat vždy aktuální obsah proteinu dotyčné šarže.The drawback of this method is the enormous cost that has to be incurred as a result of the individual preparations. · Continuous working methods are not possible using the existing technical working methods. As a result, there is another shortcoming. Standardized plasma preparations can only be prepared with disproportionately high, hardly defensible costs. For example, with respect to the individual preparation, the protein content of the donor fraction varies. Therefore, when using the plasma produced by the individual preparation, the actual protein content of the batch in question must always be considered.

V principu je možné inaktivovat viry přísadou che mických látek. Velký problém předtsvaje odstranění pro středku použitého pro inaktivací infekčních složek.PodleIn principle, it is possible to inactivate viruses by adding chemicals. A major problem is the removal of the medium used to inactivate the infectious components

-2pracovního postupu vyvinutého New-Xork -Blood-Center se pro inaktivací viru používají detergenty* Velký problém spočívá v tom, že-je nutné tyto d.etergenty po provedené inaktivaci viru z plasmy opět odstraniti . Horowitz navrhuje zbavit přípravky zpracovené detergenty těchto detergentů po mocí.hydrofobní chromatografie pomocí materiálů obrácených fází.The process developed by New-Xork-Blood-Center uses detergents to inactivate the virus. A major problem is that these detergents need to be removed from the plasma again after the virus has been inactivated. Horowitz suggests removing detergent-treated detergents after hydrophobic chromatography using reversed phase materials.

EB-A-0 239 859 popisuje způsob čištění krevní plasmy . extrakcí.přírodními rostlinnými oleji , jako například olejem ze sojových bohů.EB-A-0 239 859 discloses a method for purifying blood plasma. extraction with natural vegetable oils such as soybean oil.

Technický problém,který tvoří základ, vynálezu je tedy dán tím,že. je třeba dát k dispozici kontinuální způsob výroby krevní plasmy prosté zárodků.Z tohoto vyplývající problémy se mimo jiné týkají bezpečného a spolehlivého způ sobu odstranění, detergentů inaktivujících virus*. Kromě toho je žádoucí získat již při výrobě plasmatického preparátu preparáty se standardizovaným obsahem proteinu*The technical problem underlying the invention is therefore due to:. a continuous process for the production of germ-free blood plasma must be made available. Amongst these problems are, inter alia, a safe and reliable method of removal, virus inactivating detergents *. In addition, it is desirable to obtain standardized protein preparations in the manufacture of plasma preparations *

Z předem, nepublikovaného EP-A-0 366 946 je znánuzpůsob odstranění detergentů z krevní plasmy pomocí hydrofóbní chromatografie s obrácenými.fázemi , se silikagelovou matricí povlečenou oktadecylem.A previously unpublished EP-A-0 366 946 discloses a method of removing detergents from blood plasma by reverse phase hydrophobic chromatography, with an octadecyl coated silica gel matrix.

Další technický, problém vyplývá ze skutečnosti,látky, nosiče, sestávající ze silikátu,používané při chromatografii s obrácenými fázemi,ztrácí při extrakci v menší míře svůj povlak.Takto vznikající nepovleóené silikátové čá štice aktivují ale faktory vytvářející v krevní plasmě snaženinu a vedou k jejímu nežádoucímu rozrušení.A further technical problem arises from the fact that the silicate substance used in reversed phase chromatography loses its coating to a lesser extent. undesirable upset.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Technické problémy,které tvoří základ vynálezu,byly vyřešeny kombinovaným způsobem výroby krevní plasmy presté infekčních zárodků,při kterém se plasma zpracuje neiontovými tensidy,před oddělením lipidové vrstvy se přidají biologicky kompatibilní lipidy,lipidová fáze se oddělí a. neionogenní tensid se oddělí extrakcí pevné fáze na hydrofóbních materiálech.The technical problems underlying the invention have been solved by a combined process for producing blood plasma of infectious germs in which plasma is treated with nonionic surfactants, biologically compatible lipids are added prior to lipid layer separation, lipid phase is separated, and nonionic surfactant is separated by solid phase extraction on hydrophobic materials.

Krevníplasma^- mužs^při tom 'pocházet 'jak^z^čerstvě.....vy—··* robených plasmatických preparátů , tak i z hluboko zmražených . frakcí. Při tom se zmražená plasma nechá roztát ve vodní lázni.Jakmile se dosáhne určitá teplota,která činí sKrevníplasma ^- Muzsa ^ during the 'come' as a ^ ^ ..... freshly vy- ·· * disburse plasma specimens, and from deep-frozen. fractions. In this case, the frozen plasma is thawed in a water bath

I výhodou 25 °C, plasma se popřípadě zfiltruje a kontroluje se hodnota pH roztoku. Pochod tání se s výhodou provede v λ čase,který činí asi 1 až 2 hodiny. Hodnota pH roztoku činí s výhodou 7 až 7,4.Preferably, 25 ° C, the plasma is optionally filtered and the pH of the solution is checked. The melting step is preferably performed at λ time, which is about 1 to 2 hours. The pH of the solution is preferably 7 to 7.4.

Potom se takto zpracovaná krevní plasma zpracuje směsí sestávající z neionogenních tensidů a destilované vody přiThereafter, the blood plasma thus treated is treated with a mixture consisting of non-ionic surfactants and distilled water at

Ε - 20 až 40 °C,s výhodou při 30 °C. Jako neionogenní tensidy u přichází v úvahu zejména tri-N-butylfosfát /TNBP/ a/nebo .- 20 to 40 ° C, preferably at 30 ° C. Particularly suitable nonionic surfactants are tri-N-butyl phosphate (TNBP) and / or.

í Triton-X-100» Je výhodné ,když se směs zpracovává po nějaký čas mícháním^Lehkým při zvýšené teplotě. Před odstřelováním se lipidová frakce obohatí biologicky snesitelnými lipidy, jako například rostlinným olejem, zejména olejem ze ^y sojových bobů. a/nebo ricinovým olejem. Potom se lipidová frakce. odstraní odstředěním . Je ale také možné oddělit lipidovou frakcifiltrací přes hydrofobní filtr od krevní plasmy. Při výhodné formě provedení se přidává asi 10 rostlinného oleje.Po odstředění se oddělí lipidová vrstva _ř a plasmatická vrstva. Toto se může stát pomocí sifonu ne' bo kontinuálně pracující odstředivky s automatickým děle» ním fází.Triton-X-100 It is preferred that the mixture is treated for some time by stirring at light temperature. Before centrifugation, the lipid fraction enriched with biologically tolerable lipids, such as vegetable oils, particularly of ^y soybeans. and / or castor oil. Then, the lipid fraction. remove by centrifugation. However, it is also possible to separate from the plasma by lipid fraction filtration through a hydrophobic filter. In a preferred embodiment, addition of about 10 vegetable oleje.Po centrifugation was collected and the lipid layer _of the plasma layer. This can be done by means of a siphon or continuously operating centrifuge with automatic phase separation.

Plasmatická vrstva se shromáždí, zatím co lipidová vrstva se zahodí.. Potom se popřípadě připojí filtrační krok,načež se zbylý, ještě přítomný neionogenní detergent z plasmy odstraní pomocí extrakce a< pevným? fázžmž . S výhodou je hydrofobní materiál používaný pro extrakci s pevnými fázemi materiál známý z chromatografie s obráee nými fázemi / reversed phase chromatographie/, K tomutoThe plasma layer is collected while the lipid layer is discarded. Then, optionally, a filtration step is added, whereupon the remaining nonionic detergent still present is removed from the plasma by extraction and solidification. phasežmž. Preferably, the hydrophobic material used for solid phase extraction is a material known from reversed phase chromatography.

-4patří s výhodou materiály nosičů povlečené C-18,které se používají také při vysokotlaké kapalinové chromatografií. Jako materiál nosiče se mimo jiné používá silikagel,který má ale tu nevýhodu,že v případě kdy schází povlečení vyvolává v krevní plasmě aktivaci faktorů, které vedou k jejímu rozrušení. Tomuto nežádoucímu účinku lze ěelit výběrem vhodných organických materiálů nosičů, jako je Sephacryl,Superose / firmy Pharmacia/ nebo Practogel^^ TSK /E. Merck/. Při výhodné formě provedení se může extrakce s pevnými fázemi provádět jako chromatografie.Poměr mezi objemem lůžka a objemem zpracovávané plasmy činí s výhodou 1 :Preferably, carrier materials coated with C-18 are also used in high pressure liquid chromatography. Silica gel is used inter alia as the carrier material, but has the disadvantage that, when the coating is absent, it causes the activation of factors in the plasma that cause it to be disrupted. This adverse effect can be resolved by selecting suitable organic carrier materials such as Sephacryl, Superose (Pharmacia) or Practogel® TSK / E. Merck /. In a preferred embodiment, solid phase extraction can be performed as chromatography. The ratio between bed volume and plasma volume is preferably 1:

až 1 : 20, nejvýhodněji 1 : 10.to 1:20, most preferably 1:10.

Po extrakci s pevnými fázemi se připojuje popřípadě kontrola hodnoty pH.Hodnota'pH roztoku se nastavuje na pH 7,0 až 7,4. Potom se připojuje sterilní filtrace,načež se krevní plasma popřípadě suší vymrazováním v přítomnosti obvyklých lyofilizačních prostředků, jako lysinu- nebo glycinu.After solid phase extraction, a pH control is optionally added. The pH of the solution is adjusted to a pH of 7.0 to 7.4. Sterile filtration is then added, whereupon the blood plasma is optionally freeze-dried in the presence of conventional lyophilizing agents such as lysine or glycine.

Způsob podle vynálezu umožňuje ustoupit od Obvyklého jednotlivého zpracování plasmy. Způsob je vhodný pro provádění v průmyslovém měřítku.Zejména umožňuje kontinuální způsob práce.Další výhoda způsobu podle vynálezu spočívá v tom, že na základě kontinuálního provádění způsobu se mohou podmínky volit tak,že konečný produkt vykazuje vždy stejnou nebo při nejmenším velice podobnou koneentraci proteinů. Tím se stává klinické ovládání preparáty krevní plasmy, zejména při vícenásobné dávce,neproblematické,neboň se odstraní proměnné množství proteinu,které vyplývá z jednotlivých příprav.The process according to the invention makes it possible to withdraw from the usual individual plasma treatment. The process is suitable for carrying out on an industrial scale. This makes the clinical control of blood plasma preparations, especially at multiple doses, unproblematic, since the variable amount of protein resulting from the individual preparations is removed.

Příklady provedeni vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Způsob podle vynálezu je vysvětlen blíže pomocí následuj ícíhn příkladu provedení:The method according to the invention is explained in more detail by means of the following exemplary embodiment:

-5Příklad-5Example

1 krevní plasmy / 30 x 250 ml / se nechá roztát vodní ...lázni, při 25 °C/během 1,5, hodiny .^Popřípadě se _ frakce po roztátí zfiltruje přes gázový filtr nebo přes filtrační patronu / například firmy Pal, 100 um/. Potom se plasma naplní při 30 °G do kotle z nerezavějící oceli. Pro l operace míchání se použije vrtulové listové míohadlo. Hod • nota pH roztáté plasmy se přezkouší a/ nastaví se pomocí 0,5 N kyseliny solné na hodnotu pH 7,0 až 7,4 .1 blood plasma (30 x 250 ml) is thawed in a water bath at 25 ° C for 1.5 hours. 100 µm /. Then the plasma is filled at 30 ° C into a stainless steel boiler. A propeller blade mixer is used for 1 mixing operation. The pH of the thawed plasma is checked and / or adjusted to pH 7.0-7.4 with 0.5 N hydrochloric acid.

Vyrobí se směs TNBP, Tritonu X-100 a destilované vody. Množství s výhoduu činí TNBP : Triton X-100-destilovaná voda = 0,5 až 2 : 0,5 až 2 : 2 až 4. U předložené velikosti ' várky bylo při obvzláště výhodném způsobu použito 200 ml i TNEP,200 ml Tritonu X-100 a 800 m}. destilované vody.Směs se rovněž ohřála asi na 30 °C.Potom se přidá směs neinno genních tensidů k plasmě.Směs se míchá opatrně při 30 °C.A mixture of TNBP, Triton X-100 and distilled water is made. The amount is preferably TNBP: Triton X-100-distilled water = 0.5 to 2: 0.5 to 2: 2 to 4. In the present batch size, 200 ml of TNEP, 200 ml of Triton X were used in a particularly preferred manner. -100 and 800 m}. distilled water. The mixture was also heated to about 30 ° C. A mixture of non-genic surfactants was then added to the plasma.

Po 4 hodinách následuje odstřelování plasmy.S výhodou se odstřeluje 4.000 otáčkami za minutu po dobu jedné hodiny t při 12 °G.Pro zvětšení lipidové fáze se přidá asi 10 $ /v/v/ ' oleje ze sojových bobů nebo ricinového oleje před odstřelováním k reakční směsi. Po odstřelování se lipidový vrstva oddělí od plasmatické vrstvy . To se může stát pomocí si fonu nebo filtrací na hydrofóbním popřípadě mikronizovaném $ filtračním materiálu, například Zetaplus DEL I Filter * /firmy Cuno/. Vrstvy plasmy se shromáždí a zfiltrují přes i filtrační membrány, inertní vůči proteinu / například firmy Pal, 3- 5 um/. Získá se 19 1 plasmy.After 4 hours, the plasma is centrifuged. Preferably, it is centrifuged at 4,000 rpm for one hour at 12 ° G. of the reaction mixture. After centrifugation, the lipid layer is separated from the plasma layer. This can be done by Si phoning or by filtration on a hydrophobic or micronized filter material, for example the Zetaplus DEL I Filter * (from Cuno). Plasma layers are collected and filtered through protein-inert filter membranes (e.g., Pal, 3-5 µm). 19 l of plasma are obtained.

Toto množství se zpracuje Přen 0-10 adsorbečním řinife· dlem / firmy Waters/ nebo Pro BPO ER 5/5 adsorpčním činí dlem / firmy Pharmacia/. Při odpadajícím množství 19 1 se s výhodou 1,2 kg rozmíchají ve 2,4 1 vody. Ohromatografie se provádí naslounci o průměru 15 em. Proteklé množstvíThis amount is treated with 0-10 adsorption agent (Waters) or Pro BPO ER 5/5 adsorption agent (Pharmacia). With an amount of 19 liters, preferably 1.2 kg are mixed in 2.4 liters of water. The hydromatography is performed on 15-em. Amount flowed

-6činí 300 ml/min. Eluát se kontroluje pomocí BV-monitoru. Vystupující frakce plasmy se shroměžŽuje a popřípadě se nastaví na pH 7,0 až 7,4 0,5 N hydroxidem sodným.-6 is 300 ml / min. The eluate is checked by BV-monitor. The protruding plasma fraction is collected and optionally adjusted to a pH of 7.0 to 7.4 with 0.5 N sodium hydroxide.

Plasma se sterilně zfiltruje přes membránový filtr /o,22 um / a usuší vymrazením_r potom se naplní do lahví o obsahu 250 ml.Plasma was sterile filtered through a membrane filter / o, 22 m / _r freeze-dried and then filled into bottles of 250 ml.

Claims

I. An infectious germ-free blood plasma production process in which plasma is treated with non-ionic surfactants, before the lipid layer is separated, biocompatible lipids are added, the lipid phase is separated and the non-ionic surfactant is removed by solid phase extraction on hadrophobic materials.

φ

The method of claim 1, wherein the deep-frozen blood plasma is gently thawed in a water bath at 20 ° to 30 ° C.

·

Method according to either of claims 1 or 2. at which the pH of the plasma is adjusted to a pH of 7.0 to 7.4.

The process according to any one of claims 1 to 3, wherein tri-N-butyl phosphate (TNBB) and / or Triton X-100 is used as the nonionic surfactant. · ·

The method according to any one of claims 1 to 4, wherein / an aqueous mixture of TNBB and Triton X-100 is used.

AND

The method of claim 5, wherein the ratio of the mixture TNBB: Triton X-100: water = 0.5 to 2: 0.5 to 2: 2 to 4 ·

The method according to one of claims 1 to 6, wherein the lipid phase is separated by centrifugation · f

The method according to one of claims 1 to 7, wherein the lipid phase is sucked off by filtration on a hydrophobic filter material.

Ť

The method of claim 3, wherein the lipid phase derives from about 10 phy

and.'

The process according to any one of claims 1 to 9, wherein the solid phase extraction is performed with reversed phase chromatography material.

II. The method of any one of claims 1 to 10, wherein:

The octadecyl derivatized materials are used for reverse phase chromatography.

The process according to one of claims 1 to 10, wherein the solid phase extraction is carried out by C-18 reverse phase chromatography.

The process according to any one of claims 1 to 12, wherein after the solid phase extraction, the pH is optionally adjusted after adjusting the pH and adjusting the pH to 7.0 to 7.4.

Rile filtration. $

The method according to any one of claims 1 to 12, wherein the secretory plasma is freeze-dried, optionally in the presence of conventional freeze-drying aids.

The method of any one of claims 1 to 14, wherein the hydrophobic material is micronized.