SK2382002A3

SK2382002A3 - Drug for treating fractures

Info

Publication number: SK2382002A3
Application number: SK238-2002A
Authority: SK
Inventors: David G Little
Original assignee: Royal Alexandra Hosp Children
Priority date: 1999-08-19
Filing date: 2000-08-17
Publication date: 2002-09-10
Also published as: ZA200202160B; PL353485A1; WO2001013922A1; HK1048441B; HUP0202396A3; CN100345548C; EP1214079A1; KR20020027562A; CN1370071A; NZ517538A; CA2381302A1; AUPQ232599A0; NO20020784D0; IL148166A0; HK1048441A1; BR0013416A; JP2003507426A; HUP0202396A2; NO20020784L; EP1214079A4

Description

Vynález sa týka nových indikácií určitej skupiny liečiv. Konkrétne sa vynález týka použitia bisfosfonátov na podporu rastu kostí a na liečenie zlomenín kostí. Z bisfosfonátov zoledronát a pamidronát sa ukázali byť obzvlášť f účinné pri použití na uvedený účel.

Doterajší stav techniky

Bisfosfonáty sú charakterizované väzbou P-C-P, ktorá má silnú afinitu k minerálnym látkam v kostiach. Sú analogické k pyrofosfátom, pričom obsahujú atóm uhlíka namiesto atómu kyslíka. To ich robí úplne rezistentnými voči enzymatickému odbúraniu in vivo.

Bisfosfonáty sa odlišujú vo svojom účinku a účinnosti v závislosti od konfigurácie vedľajšieho reťazca. Bisfosfonáty inhibujú resorpciu kostí priamym ovplyvnením funkcie osteoklastov tiež inhibujú osteoblastický nárast osteoklastov. Z týchto dôvodov zostáva vápnik viazaný v kostre a následne vzrastá úroveň parathyroidného ( hormón prištítnej žľazy ) hormónu (PTH) a 1,25-(OH)₂ vitamínu D čo vedie k nárastu intestinálnej absorpcie vápnika. V prípade rastúcich potkanov toto má za následok nárast kostnej hmoty (Licata, „Bisphosphonate Therapy“ Am. J. Med. Sci. 1997 Jan; 313(1):17-22 ). Pri veľmi vysokých dávkach bisfosfonáty môžu dokonca inhibovať tvorbu kostí a funkciu osteoblastov. V skutočnosti jedna z doteraz dobre zdokumentovaných indikácií bisfosfonátov sa týka prevencie heterotopickej osifikácie po úraze miechy alebo po artroplastii bederného kĺbu. (Stover et al „Disodium etidronate in the prevention of postoperative recurrence of heterotopic ossification in spinal-cord injury patients“ J. Bone Joint. Surg. Am. 1976; 58(5):683-8 a Finerman and Stover „Heterotopic ossification following hip replacement or spínal cord injury.

31883/Th

Two clinical studies with EHDP.“ Metab. Bone Dis. Relat. Res. 1981:3:337-42 a Banovac and Gonzales „Evaluation and management of heterotopic ossification in patients with spínal cord injury “. Spínal Cord 1997;35:158-62.)

Bisfosfonát etidronát bol po prvý raz skúšaný na liečenie primárnej osteoporózy pred mnohými rokmi. Výsledky ukázali čiastočný úspech v náraste hustoty kostí a snáď aj v regulácii výskytu zlomenín (Licata. supra).

Odvtedy sa stalo použitie bisfosfonátov dobre známe pri liečení a prevencii osteoporózy. Sú obzvlášť cenné pri zvládaní postmenopauzálnej osteoporózy ale indikácie týchto liečiv pri liečení iných porúch ovplyvňujúcich kosti sú takisto dobre známe.

Pretože bisfosfonáty sú schopné inhibovať resorpciu kostí, používajú sa ako účinné terapeutikum za rôznych podmienok charakterizovaných zvýšeným narušením štruktúry kostí, zahrňujúcich Pagetovu chorobu, hyperkalcinémiu pri malígnych a metastatických chorobách kostí ( Lombardi, Clinical trials with bisphosphonates“ Ann. Ital. Med. Int. 1992 Jul-Sep: 7(3 Suppl):158S-165S). Boli tiež indikované pri liečení mnohonásobného nádoru kostnej drene, metastáz rakoviny prsníka a zvýšenej lámavosti kostí.

Zlomeniny kostí sú často súčasťou priebehu mnohých takýchto porúch. Dokonca aj keď sa vyhneme zlomeninám riziko ich výskytu dramaticky narastá pri uvedených poruchách. V dôsledku toho väčšina výskumu v oblasti použitia bisfosfonátov na liečenie takýchto porúch sa sústredila na bezpečnosť priebehu liečení otvorených zlomenín. Mnohé z týchto štúdií potvrdili, že bisfosfonáty nemajú nežiadúce účinky pri obnove mechanickej pevnosti dlhých kostí po zlomeninách alebo pri hojení zlomenín ( pozri, napríklad, Goodship a spol. Use of a bisphosphonate (pamidronate) to modulate fracture repair in ovine bone Ann. Oncol. 1994;5 Suppl 7:S53-5; pozri tiež Li et al. „Effect of Bisphosphonate (Incadronate) on Fracture Healing of Long Bones in Rats“ J. Bone Miner. Res. 1999 June; 14(6):969-79).

Hoci použitie bisfosfonátov pri hore uvedených a aj iných poruchách je

31883/Th dobre zdokumentované, ich spôsob účinku stále nie je objasnený. Ich úplný terapeutický potenciál sa však postupne rozširuje ( pozri abstrakt Russell a spol., „Bisphosphonates: from the laboratory to the clinic and back again Bone 1999 Jul:25(1)97-106).

Predkladaný vynález podáva významný počet nových a dôležitých údajov o podávaní bisfosfonátov.

Podstata vynálezu

Po prvé sa predkladaný vynález týka liečiva vybraného zo skupiny pozostávajúcej aspoň z jedného bisfosfonátu použitého na podporu rastu kostí.

Prednostne je rast kosti podporovaný na mieste zlomeniny. Okrem toho sa počíta s tým , že rast kostí je podporovaný medzi kosťou a protézou, fixačným zariadením alebo akýmkoľvek iným kostným alebo dentálnym implantátom.

Po druhé sa predkladaný vynález týka liečiva vybraného zo skupiny pozostávajúcej aspoň z jedného bisfosfonátu použitého na liečenie zlomenín.

Výhodne je liečivom podľa prvého alebo druhého aspektu vynálezu bisfosfonát Zoledronát.

V ďaľšom výhodnom uskutočnení je liečivom podľa prvého alebo druhého aspektu vynálezu bisfosfonát Pamidronát.

V ďalšom uskutočnení môže byť liečivom iné zo skupiny pozostávajúcej z bisfosfonátov alebo kombinácie dvoch alebo viacerých bisfosfonátov.

Podľa tretieho aspektu predkladaný vynález spočíva v použití liečiva vybraného zo skupiny pozostávajúcej aspoň z jedného bisfosfonátu použitého na výrobu liekovej formy na podporu rastu kostí.

V ďalšom uskutočnení podľa tretieho aspektu liečivo podporuje rast kostí

31883/Th na mieste zlomeniny.

V ďalšom vyhotovení liečivo podporuje rast kosti v mieste medzi kosťou a protézou.

Podľa štvrtého aspektu predkladaný vynález spočíva v použití liečiva vybraného zo skupiny pozostávajúcej aspoň z jedného bisfosfonátu použitého na výrobu liekovej formy na liečenie zlomenín kostí.

Podľa piateho apsektu predkladaný vynález spočíva v spôsobe liečenia zlomenín kostí, spôsobe zahrňujúcom podávanie terapeuticky účinného množstva liečiva, vybraného zo skupiny pozostávajúcej aspoň z jedného bisfosfonátu, pacientovi so zlomenou kosťou.

Prednostne sa liečivo podáva pacientovi v jednej dávke. Ďalej je uprednostnené podávanie jednej dávky liečiva v skorých štádiách liečenia zlomenej kosti.

i ¹ . '

Podľa šiesteho aspektu predkladaný vynález pozostáva zo spôsobu liečenia zlomeniny kosti pričom spôsob zahŕňa nasledujúce kroky;

(a) podávanie terapeuticky účinného množstva liečiva, vybraného zo skupiny pozostávajúcej aspoň z jedného bisfosfonátu, pacientovi so zlomenou kosťou:a (b) zabezpečenie vibračnej stimulácie zlomenej kosti.

Výhodné uskutočnenia odhaľujú, že použitie liečiva zo skupiny bisfosfonátov na podporu rastu kostí alebo na liečenie zlomenín môže byť využité pri všetkých klinických alternatívach ošetrenia zlomenín kostí: mnohé zlomeniny sú najvhodnejšie ošetrené jednoduchým použitím sadrového obväzu na mieste, kde sa stala zlomenina a umožnením kosti aby sa zahojila kým je v dlahe; niektoré zlomeniny jednoducho vyžadujú, aby bol pacient v kľude; niektoré zlomeniny môžu vyžadovať chirurgický zákrok v určitom rozsahu; iné zlomeniny sú vhodne ošetrené kombináciou posledných dvoch možností.

31883/Th

Okrem toho, ako alternatíva alebo ako dodatočná možnosť, môže byť za určitých okolností žiadúci krok zabezpečujúci vibračnú stimuláciu zlomenej kosti. Nech je použitý ktorýkoľvek z týchto, alebo iných spôsobov ošetrenia zlomenín kostí predkladaný vynález odhaľuje podávanie aspoň jedného liečiva zo skupiny bisfosfonátov pacientovi.

Používanie aspoň jedného liečiva zo skupiny bisfosfonátov na liečenie zlomenín kostí má viacero výhod. Mnohé z nich sú detailne popísané ďalej. Predsa len, z dôvodov, ktoré budú teraz zrejmé, stojí za zmienku niekoľko všeobecných výhod na začiatok. Tie zahŕňajú, ale nie sú obmedzené len na nasledujúce: bisfosfonáty môžu stimulovať proliferáciu osteoblastov a nárast tvorby kalusov; sú tiež účinným inhibítorom osteoklastickej resorpcie kostí; pomáhajú pri prevencii osteoporózy a tým znižujú imobilizačnú osteoporózu, spojenú s úrazom; a môžu tiež významne znížiť čas, potrebný na hojenie zlomenín kostí.

Podľa predkladaného vynálezu sú okolnosti, pri ktorých sú bisfosfonáty použiteľné na zvládanie zlomenín veľmi rozsiahle. Vskutku, prednostne sa ukazuje, že prípady kedy bisfosfonáty môžu byť indikované na liečbu zlomenín zahŕňajú aspoň:

(i) nárast tvorby nových kostí pri distrakčnej osteogenéze:

(a) predlžovanie kostí (b) transport kostí (ii) nárast tvorby nových kostí pri zlomeninách liečených otvorenou repozíciou (iii) nárast tvorby nových kostí pri zlomeninách liečených intramedulárnou fixáciou (iv) nárast tvorby nových kostí pri zlomeninách liečených externou fixáciou

31883/Th (v) spomalené zhojenie (vi) zlepšenie schopnosti kosti znášať interné fixačné zariadenie v prípade osteoporotických jedincov alebo pri lokálnych osteoporotických kostných segmentoch (vii) liečenie zlomenín, pri ktorých sú potenciálne prekážky nekomplikovaného hojenia, napríklad:

(a) zlomeniny starých ľudí zahrňujúce: kŕčok stehnovej kosti ; suprakondylové stehno; tíbiu; členok; ramennú kosť; a distálnu vretennú kosť (uvedený zoznam obsahuje len príklady, zatiaľ čo použitie bisfosfonátov podľa tohoto vynálezu nie je v žiadnom prípade obmedzené len na liečenie uvedených zlomenín alebo akýchkoľvek iných zlomenín, ľudí každého veku) (b) únavové zlomeniny lonovej kosti (c) patologické zlomeniny (d) zlomeniny člnkovitej kosti (e) otvorené zlomenina (f) zlomeniny s periosteálnym poškodením (viii) Liečenie zlomenín, ktoré vyžadujú predĺženú imobilizáciu keď sú liečené neoperatívne, napríklad: zlomeniny stehennej kosti, zlomeniny tíbie, a zlomeniny chodidla a členka.

Okrem toho výhodné uskutočnenia tiež ukazujú veľa dodatočných indikácií použitia bisfosfonátov v ortopedických procedúrach. Tieto zahŕňajú podávanie bisfosfonátov na zvýšenie vrastania kostí do pripojených náhradných protéz; a obaľovanie pripojených protéz bisfosfonátmi na lokálne zvýšenie uvedeného vrastania. Takéto liečenie môže tiež znížiť efekt tlaku v okolí protézy. Protetické implantáty môžu byť takto potiahnuté ako alternatíva, alebo ako prídavok k potiahnutiu hydroxyapatitom alebo niektorým osteoinduktívnym

31883/Th povlakom.

Navyše môžu byť bisfosfonáty použité pri umelom znehybnení kĺbu, to znamená pri fúzii s kĺbom kvôli nárastu rýchlosti spojenia.

S výhodou je liekom zo skupiny bisfosfonátov podľa tohoto vynálezu Pamidronát. Ďalej je liekom z tejto skupiny Zoledronát. Avšak okrem toho môžu byť použité aj iné bisfosfonáty ( kde sa neprejavuje nepriaznivá inter-akcia), alebo aj ako alternatíva k Pamidronátu alebo Zoledronátu. Príklady iných f bisfosfonátov zahŕňajú, Aledronát, Tiludronát, Risedronát, Ibandronát a Incadronát, ale nie sú len na ne obmedzené.

Ďalej je s výhodou liek podávaný pacientovi v jednej dávke. V tomto prípade je výhodné, ak sa podanie lieku uskutoční na začiatku liečenia zlomeniny, keďže podanie bisfosfonátu v takomto počiatočnom období má pozitívny efekt na stimuláciu a proliferáciu osteoblastov.

Ako ďalší príklad použitia vynálezu môže byť podaná pacientovi následná ďalšia dávka. V tomto prípade sa doporučuje aby bola odozva na prvú dávku vyhodnotená pred podaním ďalšej dávky.

Spôsob podania môže byť perioperačná intravenózna infúzia, orálne podanie, transdermálne podanie alebo nejaký iný spôsob. Alternatívne môže byť predpísaná orálna kúra bisfosfonátmi. Výhodné a alternatívne spôsoby použitia vynálezu zahŕňajú všetky bežné aj budúce spôsoby podávania liekov.

31883/Th

Takéto spôsoby podávania musia byť, samozrejme prijateľné, pohodlné a musia poskytnúť pacientovi terapeuticky účinnú dávku na liečenie a/alebo podporu hojenia zlomenej kosti.

Predkladaný vynález takisto odhaľuje , že pri niektorých uskutočneniach je výhodné aplikovať vibračný stimul k zlomenej kosti. Vibračný stimul sa môže uskutočniť ultrazvukom, alebo vibráciou , alebo akýmkoľvek iným mechanizmom a/alebo zariadením schopným uskutočniť vibračnú stimuláciu. V niektorých uskutočneniach vibračná stimuácia môže byť aplikovaná s akoukoľvek frekvenciou, ktorá je považovaná za účinnú pri liečení zlomených kostí. Vo výhodnom uskutočnení krok poskytnutia vibračného stimulu zahŕňa periodické opakovanie vibračného stimulu pri rezonančnej frekvencii kosti, pričom rezonančná frekvencia sa vypočíta ako funkcia vibračnej odozvy kosti na vibračný stimul. Aby sme toto mohli dosiahnuť môžeme tento krok rozdeliť na nasledujúce zložky:

(a) vibračná stimulácia zlomenej kosti (b) detegovanie vibračnej odozvy kosti na vibračný stimul (c) generovanie signálu zodpovedajúceho vibračnej odozve (d) spracovanie signálu s cieľom identifikovať aspoň jednu rezonančnú frekvenciu kosti; a (e) vyslať signál s cieľom nastaviť vibračnú stimuláciu kosti tak, aby obsahovala/alebo približne obsahovala, aspoň jednu rezonančnú frekvenciu kosti.

Či sa uskutoční alebo neuskutoční vibračná stimulácia zlomenej kosti, s výhodou sa aspoň jeden bisfosfonát podáva pacientovi v počiatočných fázach liečenia. Treba mať na zreteli, že rôzne kosti a rôzne typy zlomenín sa hoja s rôznou rýchlosťou. V súlade s tým počiatočná fáza závisí od týchto premenných.

31883/Th

Podávanie bisfosfonátov v takejto počiatočnej fáze má pozitívny vplyv na stimuláciu a proliferáciu osteoblastov. V prípadoch, keď sa použije vibračná stimulácia, je výhodné uskutočniť túto stimuláciu neskôr v procese liečby, keďže mechanická stimulácia bude podporovať dozrievanie hojenej zlomeniny. Ako ďalšie je však možné, že oboje, podanie bisfosfonátu aj použitie vibračnej stimulácie sa môže uskutočniť v počiatočných fázach liečenia. Alternatívne môžu byť použité v úplne odlišných časoch, ich použitie sa môže striedať, alebo môžu byť obe použité v neskorších fázach liečenia podľa, toho, čo je považované za najvhodnejšie.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na príkladoch sú ukázané výhodné uskutočnenia vynálezu s odvolaním sa na sprievodné obrázky, na ktorých :

Obr. 1 zobrazuje všeobecný vzorec bisfosfonátu.

Obr. 2 je graf z príkladu 1 ilustrujúci rozdiely v kostnej minerálnej hustote (Bone Minerál Density - BMD) pri regeneráte a lokalizácii oboch proximálneho a distálneho regenerátu v kontrolnej skupine s predlžovaním nôh a kontrolnej skupine s nepredlžovaním nôh ( nie je, samozrejme, žiadna hodnota pre BMD počas regenerácie pre skupinu bez predlžovania nôh);

Obr. 3 je graf z príkladu 1, ktorý ilustruje rozdiely v BMD pri regeneráte a lokalizácii proximálneho a distálneho regenerátu počas liečenia pamidronátom s predlžovaním nôh ( nie je, samozrejme, žiadna hodnota pre BMD počas regenerácie pre skupinu bez predlžovania nôh );

Obr. 4 je graf z príkladu 1 , ktorý ilustruje rozdiely v BMD pri regeneráte a lokalizácii proximálneho a distálneho regenerátu v kontrolnej skupine s predĺžením nôh a pri skupine s predĺžením nôh liečenej pamidronátom;

Obr. 5 ilustruje histopatologické rozdiely medzi vzorkou z kontrolnej

31883/Th skupiny a vzorkou zo skupiny liečenej pamidronátom podľa príkladu 1;

Obr. 6 je graf z príkladu 2 ilustrujúci rozdiely v špičkovom zaťažení pre neoperovanú a operovanú skupinu liečenú pamidronátom a pre neoperovanú a operovanú kontrolnú skupinu; a

Obr. 7 je graf podľa príkladu 2 ilustrujúci rozdiely v nálezoch s ohľadom na Youngov modul (1% napätie) pre neoperovanú a operovanú skupinu liečenú pamidronátom a pre neoperovanú a operovanú kontrolnú skupinu.

f

Obrázky 8A, 8B a 8C sú grafy podľa príkladu 3 ilustrujúce BMC ( bone minerál content - obsah minerálov v kosti) v proximálnom, regenerovanom a distálnom segmente operovanej tíbie po 2, 4 a 6 týždňoch od operácie.

Obrázok 9 je graf podľa príkladu 3 ilustrujúci nárast BMC v regeneráte.

Obrázok 10 je graf podľa príkladu 3 ilustrujúci konečný BMC po šiestich týždňoch meraný QCT.

Obrázky 11 A, 11B a 11C sú grafy podľa príkladu 3 ilustrujúce BMD pre proximálny, regenerovaný a distálny segment operovanej tíbie po 2, 4 a 6 týždňoch od operácie.

Obrázok 12 je graf podľa príkladu 3 ilustrujúci konečný BMD po šiestich týždňoch meraný QCT.

Obrázok 13 je graf podľa príkladu 3 ilustrujúci konečný priečny rez po šiestich týždňoch meraný QCT.

Obrázok 14 zobrazuje QCT sken regenerátu operovanej tíbie králika podľa príkladu 3 z priečneho rezu v každej skupine.

Obrázok 15 je graf podľa príkladu 3 ilustrujúci konečný moment zotrvačnosti po šiestich týždňoch meraný QCT.

Obrázok 16 je zjednodušený pohľad na zariadenie na aplikáciu vibračnej

31883/Th stimulácie na zlomenú kosť.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Vo výhodných uskutočneniach sa zoledronát alebo pamidronát a/alebo ďalšie liečivo z triedy bisfosfonátov používa na výrobu liečiv na podporu rastu kostí alebo liečenie zlomených kostí.

Terapeuticky efektívna dávka liečiva, alebo zoledronátu alebo pamidronátu a/alebo ďalšieho bisfosfonátu samotného je potom pripravená a podaná pacientovi intravenózne.

Podľa výhodného uskutočnenia vynálezu sa takéto podanie lieku udeje včas v priebehu liečenia zlomených kostí. Podávanie bisfosfonátov v ranných štádiách liečenia má pozitívny vplyv na stimuláciu a proliferáciu osteoblastov. Nevyžaduje sa žiadne ďalšie podávanie bisfosfonátov, alebo môžu byť podané ak je to žiadúce po vyhodnotení odozvy pacienta na prvú dávku.

Okrem toho môže byť predpísané pacientovi orálne liečenie podávanými bisfosfonátmi, kedy je orálny bisfosfonát užívaný počas prvých troch počiatočných mesiacov liečenia fraktúry. V prípade ďalšieho liečenia môže byť predpísané pacientovi podávanie orálnych bisfosfonátov neskôr v priebehu hojenia fraktúr na zväčšenie kalusu pri pomalom hojení kostí.

Predkladaný vynález tiež odhaľuje , že v niektorých prípadoch je s výhodou aplikovaná vibračná stimulácia zlomenej kosti, ako opisuje medzinárodná prihláška PCT/AU99/00974 uvedená v odkazoch. Vibračná stimulácia môže byť uskutočňované ultrazvukom a vibračnou stimuláciou, alebo ďalšími mechanizmami a/alebo zariadením schopným uskutočniť vibračnú stimuláciu. V takýchto výhodných prípadoch, krok uskutočňovania vibračnej stimulácie zahrňuje periodicky uskutočňovanú vibračnú stimuláciu pri rezonančnej frekvencii kosti, teda rezonančná frekvencia bola vypočítaná ako funkcia vibračnej odozvy kosti na vibračný stimul.

31883/Th

S odvolaním sa na obrázok 16, vibračné stimulačné zariadenie 10 je prispôsobené na stanovenie špecifickej rezonančnej frekvencie kosti 11, a k subjektu kosti 11 na stimuláciu pri špecifickej rezonančnej frekvencii kosti 11, a udržiavanie stimulácie na tejto frekvencii určitý čas. Toto zabezpečuje optimálnu stimuláciu a tak výhodnú podporu kostnej hmoty, zatiaľ čo sa v tom istom čase zabraňuje riziku nadbytočnej stimulácie alebo preťaženiu a teda fraktúry kosti.

r

Prístroj 10 zahŕňa vibračný stimulátor 12, ktorý, keď je aktivovaný, stimuluje kosť 11 cez rozsah frekvencií, spôsobujúc vibráciu kosti 11. Stimulátor 12 je ovládaný generátorom signálov uloženým v počítači 14. Aktivovaný generátor signálov môže spôsobiť, že stimulátor 12 vibruje cez rozsah frekvencií. Generátor signálov môže, napríklad, prechádzať cez rozsah frekvencií.

Príklady vhodného stimulátora 12 zahŕňajú rotujúcu excentrickú hmotu, elektromagnetický vibrátor a ultrazvukový prevodník pulzujúci s variabilnou frekvenciou. Stimulátor 12 môže v sebe zahŕňať senzor stimulov, ako je prevodník sily, na monitorovanie stimulov uskutočňovaných na kosti stimulátorom 12.

Vibrácia je detegovaná detektorom 13. Detektor 13 môžu tvoriť merač zrýchlenia alebo viac meračov zrýchlenia. Detektor 13 prenáša signály do počítača 14, kde sa signály konvertujú z analógovej na digitálnu formu a potom sú spracované na určenie frekvenčnej doménovej charakteristiky vibračnej odozvy. Počítač 14 môže zahŕňať automatický analyzátor, ktorý určuje akceleráciu/rýchlosť/posun piku na kosti a tak určuje rezonančnú frekvenciu kosti. V ďalšom uskutočnení, počítač môže ukázať číselne a/alebo graficky zmerané charakteristiky vibračnej odozvy a tak umožniť ručne určiť rezonančnú frekvenciu užívateľom prístroja, alebo liečiacim lekárom. Prístroj 10 môže zahŕňať manuálne ovládanie frekvencie 15 na stimuláciu. Prednostne, zo zachytených signálov, počítač 14 identifikuje jednu z rezonančných frekvencií

31883/Th kosti 11 a prenáša signál k stimulátoru 12 na stimuláciu kosti 11 pri rovnakej, alebo približnej rezonančnej frekvencii kosti.

Prístroj môže zahŕňať časovač, ktorý umožňuje čas nastavenia stimulátora 12, aby ho bolo možné nastaviť dopredu pred aktiváciou. Takýto čas môže byť nastavený primeraným vstupom do softvérového programu, ktorý je inštalovaný v počítači 14. Prednostne môže byť nastavenie amplitúdy vibračného stimulu vhodným vstupom do softvéru, ktorý je inštalovaný na počítači 14.

Zatiaľ čo obrázok 16 ukazuje jednoduché zobrazenie zariadenia, kde vibračný stimulátor 12 a detektor 13 sú aplikované na kosť prostredníctvom externej konštrukcie 16, uvažuje sa o tom, že môžu byť aplikované alebo na kožu napadnutej končatiny, zatiaľ čo stimulácia kosti môže byť prenášaná transkutánne, alebo prostredníctvom kostry, alebo inak ako napríklad zariadením obklopujúcim končatinu, predovšetkým v sadrovom obväze.

Ďalej sa uvažuje o tom, že tento spôsob liečby môže byť použitý na mnohé poruchy kostí, aby podporil rast kostného tkaniva a tiež na zachovanie kostnej hmoty. Príklady zahrňujú hojenie na strane zlomeniny zatiaľ čo vibrácia spôsobuje na kosti mikro-pohyb, ohyb alebo skrútenie na strane zlomeniny, ktoré pre zmenu vedie k podpore rastu kosti a k podpore hojenia kosti. Stimulácia tiež spôsobuje mikro-pohyb, ohyb alebo skrútenie intaktnej časti kosti, ktoré pre zmenu vedie k podpore rastu kosti a k podpore hojenia kosti. Keďže stimulácia prenášaná zariadením 10 je regulovaná, aby bola na tej istej, alebo približne na tej istej frekvencii, ako je rezonančná frekvencia kosti, podpora rastu kostného tkaniva je optimalizovaná a intenzívnejšia, ako jednoduchá stimulácia kosti bez súvislosti k rezonančnej frekvencii kosti.

Podobne sa jednoducho uvažuje, že zariadenie 10 môže byť aplikované transkutánne na kosť s fixáciou, ktorá znamená niečo ako intramedulárne upevnenie kúskov kostí klincom dovedna. Pri tomto spôsobe tvorba kosti medzi kúskami kosti môže vzrásť stimuláciou kosti a fixáciou, pri presnej alebo

31883/Th približnej kostnej rezonančnej frekvencii.

Je možné uvažovať, že zariadenie 10 sa môže ľahko premiestňovať a teda používať v domácnostiach pacientov. V tomto smere zariadenie 10 môže byť predprogramované tak, aby všetci pacienti, ktorí potrebujú používať zariadenie, mohli pripojiť vibračný stimulátor 12 a vibračný detektor 13 na postihnutú končatinu, alebo inú časť tela, a aktivovať zariadenie 10.

V prípadoch, kde je využívané vibračné stimulovanie, je výhodné, ak t takéto stimulovanie je využité neskôr v priebehu liečenia, keďže mechanická stimulácia pomáha dozrievaniu hojenej zlomeniny. V ešte ďalšom uskutočnení vynálezu, sa môže oboje, podávanie bisfosfonátu a využívanie vibračných stimulov uskutočniť v skorej fáze procesu liečenia. Ako už bolo uvedené predtým, tieto dva spôsoby liečby môžu byť použité v rozličnom čase, môžu byť striedané, alebo môžu byť poskytnuté v neskorších stupňoch liečby, podľa toho, ako je to považované za výhodné.

Nasledujúce príklady poskytnú detailnejšie analýzy efektov, ktoré má podávanie liekov podľa výhodného uskutočnenia vynálezu na proces hojenia, a teda liečenie zlomenej kosti.

Každý z nasledujúcich príkladov sa vzťahuje k podávaniu bisfosfonátov pri distrakčnej osteogenéze. Jedným z cieľov distrakčnej osteogenézy je predĺženie končatiny na ktorej je procedúra uskutočňovaná. Uskutočňovanie distrakčnej osteogenézy nevyhnutne vyžaduje lámanie kosti. Po umiestnení externej konštrukcie na končatinu je kosť zlomená. Počas hojenia sa formuje nová kosť, zatiaľ čo konštrukcia sa pomaly odstraňuje.

Preto, že kosť je zlomená počas procedúry, ako aj preto, že výsledky štúdie zahrňujú distrakčnú osteogenézu, sú vhodné na ilustráciu účinkov, ktoré má podávanie pamidronátu na kosť.

31883/Th

Príklad 1 Pamidronát v distrakčnej osteogenéze (dávka 3mg/kg )

Metódy:

Návrh experimentu

Dvadsať osem týždňov starí samčekovia NZW králikov sa podrobili predlžovaniu tíbie. Podobné vzorky králikov boli publikované. Po predošlom podaní IM Ketamínu 15 mg/kg a Xylazínu 4 mg/kg, bola dosiahnutá anestézia Halothanom, 2% a kyslíkom, 11/min. Na každom králikovi bola uskutočnená mid-tibiálna osteotómia vyvŕtaním diery, a bol aplikovaný fixátor Ortofix M-100 použitím štyroch Ortofix 3 mm polovičných klincov (Orthofix , Bussolengo, Italy). Po 24-och hodinách čakania sa tíbia predĺžila o 0,375 mm každých 12 hodín počas 15 dní, produkujúc tak 11,25 mm rozptýlenie. Fixácia bola ponechaná in situ 27 dní, aby sa regenerát spevnil. Pamidronát 3,0 mg/kg zriedený na 30 mg/100 ml bol podávaný formou jednej vnútroperačnej infúzie počas dvoch hodín 10-tim z králikov; 10-tim kontrolným zvieratám bol podávaný fyziologický roztok. Na konci chirugického zákroku bol podávaný Buprenorphine 0,05 mg/kg a potom znovu 12 hodín po operácii. Zvieratám boli dodávané králičie tablety a voda ad libitum (ľubovoľne). Po 42-och dňoch boli králiky utratené podaním IV Lethobarb 150 mg/ kg.

Rôntgenové analýzy a analýzy kostnej minerálnej hustoty

Obe zadné končatiny boli vykĺbené v kolene a mäkké tkanivá zostali nedotknuté. Končatiny boli orientované v štandardnej predozadnej a laterálnej projekcii a rôntgenový snímok snímaný Siemens Multi H/UPH zoskupením za použitia digitálnych luminiscenčných kaziet s 50 kV a 4 mA expozíciou na film zo vzdialenosti 1,1 metra. Vzdialenosti medzi polohami klinca z každej odobratej vzorky boli zmerané tak, že každý rôntgenový snímok mohol byť opätovne premeraný s ohľadom na meranie dĺžky regenerovanej nohy.

Meranie kostnej minerálnej hustoty ( bone minerál density=BMD ) bolo

31883/Th robené za použitia x-ray denzitometra s duálnou energiou (LUNAR DPX, Radiation Corps, Madison Wisconsin). DXA bolo použité v kontexte s predošlými údajmi. BMD snímky boli robené na tíbii orientovanej v predozadnej a laterálnej projekcii za použitia softvéru špeciálne navrhnutého pre meranie malých zvierat ( LUNAR DPX, Small Animal Software, 1.0c LUNAR, Radiation Corps, Madison, Wisconsin ). Bol použitý „HiRes<0,5 kg Slow“ snímací modus („jemná“ kolimácia, veľkosť vzorky 0,6x1,2 mm a interval vzorky 1/16 sekúnd). Aby sme vypočítali CV prístroja bolo robených tridsať snímaní králičích predných končatín počas trvania štúdie. CV BMD, merané umiestnením troch boxov na každej snímke, boli 3,6%, 4,5% a 5,7% v poradí od proximálnej po distálnu.

Regionálne BMD údaje boli získané umiestnením oblastí záujmu (regions of interest = ROl's) 9,6 mm vysoko na zosnímanom obrázku. Na každej predĺženej tíbii, jeden ROI bol umiestnený na regeneráte, jeden proximálne k nemu a jeden distálne k nemu. Na neoperovanej tíbii boli umiestnené dve ROľs tak, že zodpovedali proximálnej a distálnej ROI predĺženej tíbie (t.j. v rovnakej vzdialenosti od koncov kostí). Spolu boli robené tri merania pre každú predĺženú tíbiu a dve pre každú neoperovanú tíbiu, pre každé zobrazenie. Hodnoty BMD boli vyjadrené v g/cm² a údaje za skupinu publikované so strednou a štandardnou odchýlkou. Vzorky predĺženej a neoperovanej vzorky tíbie boli porovnávané s použitím párových t-testov; nepárové testy boli použité na porovnanie medzi skupinami.

Histologická analýza

Histologické analýzy boli vykonané naslepo dvomi patológmi, ktorí boli pozorovatelia. Päť párov tíbií z Pamidronátovej skupiny a päť kontrol, ktoré boli vyrezané sub-periosteálne a uchovávané v 10% pufrovanom formaldehyde. Každá kosť bola priečne rozrezaná na proximálny, regenerovaný a distálny kostný segment pred odvápnením v štandardnom roztoku EDTA počas 48 hodín. Každý segment sa potom pozdĺžne rozrezal a polovička bola uložená do parafínového bloku, získalo sa šesť blokov z jedného králika. Pre mikroskopiu

31Θ83/Τ h boli časti narezané na hrúbku 5 mikrónov a zafarbené hematoxylínom a eozínom. Obaja patológovia skúmali všetky častí a urobili zhodný odhad o množstve novoutvorenej kosti, kortikálnej hrúbke, rozsahu pretvorenia a tvorbe kostí v okolí klincov. Keďže kortikálna hrúbka sa môže meniť v závislosti od rozrezania, nebola zmeraná presne. Aktivita osteoklastov v regeneráte bola vyjadrená ako číslo v poli s vysokou energiou (Olympus, BH2, 40x objektív). Bol tiež posúdený stupeň osteoblastického ohraničenia.

Výsledky:

Vylúčenia

Bolo potrebné vylúčiť tri postoperatívne komplikácie z analýzy DXA: jedna tíbiálna fraktúra zaznamenaná prvý deň v blízkosti miesta s distálnym klincom ( pamidronátová skupina ); jedna fraktúra femorálnej ( stehennej) kosti na 23 deň vyžadovala eutanáziu ( pamidronátová skupina ); a jedno obyčajné ochrnutie lýtkového svalu ( kontrola ).

Kontrolná vzorka králikov

Spoľahlivo sa zistila tvorba kostí v distrakčnom úseku. Všetky tíbie boli klinicky a róntgenograficky zjednotené na 42. deň. Hodnoty BMD z predozadného snímania predlžovaných a neoperovaných kostí sú na obrázku č.2. V oboch segmentoch, proximálnom aj distálnom, obklopujúcich predĺženie, bola významná redukcia v BMD v porovnaní s príslušnými miestami v neoperovaných končatinách (p < 0,02). Podobne významné rozdiely boli prítomné na laterálnych snímkach.

Pamidronátová skupina

V pamidronátovej skupine nebola pozorovaná redukcia v BMD v proximálnych a distálnych segmentoch, nebol pozorovaný žiadny významný rozdiel v BMD medzi kosťami operovaných a neoperovaných končatín po šiestich týždňoch ( p=0,332 proximálne, p=0,256 distálne ) (Obrázok 3). Ten

31883/Th istý efekt bol pozorovaný na laterálnych snímkach.

Obrázok 4 porovnáva BMD z AP snímok operovaných končatín králikov, ktorým bol podávaný pamidronát oproti kontrole. BMD proximálnej a distálnej kosti obklopujúcej regenerát, sa zvýšil o priemer 40% a 39% jednotlivo ( p < 0,01 ). BMD sa v regeneráte zvýšila v priemere o 43% v porovnaní s kontrolnou králičou tíbiou ( p = 0,017 ). Laterálne snímky tiež potvrdili uvedené významné rozdiely.

t

BMD neoperovaných končatín kontrolnej a pamidronátovej skupiny nebola významne rozdielna. Tieto výsledky sú porovnané v tabuľke 1. Pri pamidronátovej skupine bol pozorovaný nárast regenerovanej plochy v priemere o 22% ( p < 0,05 ).

Histológia

Z desiatich odobratých preparátov bolo deväť testovaných histologický. Králik vyradený na 23. deň nebol zahrnutý do analýz. Tíbiam z pamidronátovej skupiny trvala dekalcifikácia o 24-48 hodín dlhšie než kontrolným preparátom. Pamidronátová skupina demonštrovala nárast tvorby regenerátu významným osteoblastickým ohraničením a poklesom počtu osteoklastov ( 2,4/HPF oproti 3,4/HPF v kontrole ) spolu so zaznamenaním menšieho výskytu kostného preformovania (Obr.5). Zaznamenaný bol tiež nárast vnútrokostnej tvorby v povrchovej vrstve kosti , priliehajúcej k regenerátu, produkujúci nárast hrúbky kortikálnej vrstvy. (Obr.5). Bol tiež zaznamenaný významný nárast kostnej tvorby okolo polohy klincov v pamidronátovej skupine. Miera premenlivosti týchto faktorov v pamidronátovej skupine bola ako pri BMD hodnotách.

Diskusia

V tomto experimente bola podávaná jednotlivá dávka 3 mg/kg pamidronátu králikom na začiatku predlžovania, aby sa minimalizovali negatívne efekty kostného preformovania. Táto stratégia skoncovala s osteoporózou zaznamenanou v kontrole a mala zjavne pozitívny efekt na

31883/Th aktivitu osteoblastov a na prírastok kostných minerálov v regeneráte. Počet osteoklastov a ich aktivita zostala redukovaná na 42. deň. Keďže pamidronát bol podávaný v čase chirurgického zákroku, významný nárast tvorby regenerátu a mineralizácie je najzaujímavejšií. Pamidronát z okolitej kosti bol buď aplikovaný do regenerovanej kosti aby sa uplatnil lokálny vplyv alebo bol nárast v regeneráte spôsobený anabolickým efektom sekundárnym k zmenám v PTH a 1,25-(OH)2 vitamínu D. Potvrdenie tejto hypotézy vyžaduje ďalší výskum.

Predpokladalo sa, že striedavé preddávkovanie môže byť žiadúce súčasne s chirurgickým zákrokom. Keďže pamidronát má veľkú afinitu ku kostným minerálom, je možné nasýtiť kostru striedavým preddávkovaním, ktoré bude takto pozitívne pôsobiť od troch do šiestich mesiacov (Glorieux et al, „Cyclic administration of pamidronate in children with severe osteogenesis imperfecta“ N.Engl. J.Med 1998; 339: 947-52). Li et al (supra), popísal ako sa dá určiť či pacient prijímajúci pokračujúcu bisfosfátovú liečbu, by mal toto liečenie ukončiť v prípade zlomeniny. Ukázali nárast tvorby kalusu pri potkaních femorálnych fraktúrach predliečených incadronátom. Pri pokračovaní terapie šestnásť týždňov po fraktúre tvorba kalusu narastá naďalej, ale nová kosť sa nemodeluje do tvaru „kortikálnej“ schránky ako u predliečenej skupiny. Prišlo sa k záveru, že terapia by mohla byť pozastavená aby bolo umožnené znovu vytvorenie kosti, ale je potrebný ďalší výskum.

Odhliadnuc od negatívnych efektov prestavby kostí, pokračujúce dávkovanie bisfosfonátov nemusí byť žiadúce pri distrakčnej osteogenéze vzhľadom na škodlivý vplyv na pozdĺžny rast. Pri štúdii, keď sa denne aplikoval podkožné alendronát, normálne rastúce myši vykázali zmenšenie dĺžky nohy ako aj zmenšenie húževnatosti kosti po liečbe ( Raggio et al. „Alendronát potláča zlomeniny bez nárastu pevnosti kostí pri modeli rastových myší s vrodenou lámavosťou kostí Proceedings of Paediatric Orthopaedic Society of North America, May, 1999 ). V experimente neboli zaznamenané žiadne významné zmeny v dĺžke nohy, hoci tu bol náznak inhibície rastu neoperované končatiny v kontrolnej skupine boli dlhšie o 1,4-mm než tie z

31883/Th pamidronátovej skupiny. V čase operácie nebolo robené žiadne meranie končatín, a tak tento rozdiel nemohol byť pripísaný podpore rastu s absolútnou istotou. Avšak inhibícia rastu mohla byť veľmi dobre minimalizovaná podaním jednej dávky. Výskum Li et al (supra) nekomentoval pozdĺžny rast, ale porovnanie róntgenových snímok naznačuje, že nepretržite liečené potkanie stehenné kosti boli kratšie, než tie, ktoré boli predliečené alebo pri kontrolnej skupine.

Histologické nálezy v tejto štúdii poukazovali na nárast tvorby kosti ako aj pokles v kostnej resorpcii nasledujúcej po podávaní pamidronátu. Toto bolo zistené obzvlášť v endosteálnej oblasti kosti obklopujúcej predĺženia ako aj v regeneráte a bolo zrejmejšie pri operovanej nohe. Ďalšie výskumy v poslednom čase poukazovali na to, že bisfosfonáty ovplyvňujú bunky osteoblastickej línie v spôsobe inhibičného vplyvu na osteoklasty ( Giuliani et al. Bisphosphonates stimulate formation of osteoblast precursors and mineralized nodules in murine and human bone marrow cultures in vitro and promote early osteoblastogenesis in yuong and aged mice in vivo „ Bone 1998, May, 22(5):455-61 ).

Keďže pamidronát spôsobuje nárast schopnosti tvoriť kosti v regeneráte, je možné, že jeho použitie môže zvýšiť riziko predčasného spevnenia kostí. Dĺžka regenerátu bola znížená v priemere o 0,8 mm (8%) u králikov, ktorým bol podávaný pamidronát. Kým toto malé množstvo nie je alarmujúce, rozdiel dosiahol štatisticky významnú hodnotu, takú, že sa musia urobiť starostlivé pozorovania, ak by bol palmidronát použitý klinicky.

Jeden králik, ktorému bol podávaný nepretržite pamidronát utrpel femorálnu fraktúru na končatine na 23.deň. Toto mohol byť nahodilý úkaz, avšak je možné, že vplyvom pamidronátu sa kosť mohla stať krehkou.

Toxikologické účinky bisfosfonátov na deti ešte len musia byť preskúmané. Dávka 3 mg/kg pre tento experiment bola vybraná preto, že to je dávka zvyčajne podávaná deťom s vrodenou lámavosťou kostí ( Glorieux et al.

supra).

31883/Th

Veľký nárast v BMD počas predlžovania končatiny, ktorý nasledoval po jednej dávke pamidronátu môže mať pozitívny terapeutický vplyv na deti, ktoré sa podrobujú predlžovaniu končatín. Fakt, že pamidronát zvyšuje množstvo vytvoreného regenerátu poskytuje sľubné východisko hodné ďalšieho skúmania. Ďalšie výskumy mechanických vlastnosti kosti po liečbe pamidronátom, spresnenie spôsobu dávkovania a testovanie možných toxikologických účinkov sú požadované pred klinickým skúšaním.

Tabuľka I

Porovnanie priemerných hodnôt medzi pamidronátovou a kontrolnou skupinou. Štandardná odchýlka ± 95%. Limity hladiny významnosti sú uvedené v zátvorkách.
Premenná	Pamidronát	Kontrola	Rozdiel	95% C!	p hod- nota
Dĺžka predĺženej končatiny(mm)	100,0(3,4)	107,6 (4,5)	-1,57	-5,76.2,63	0,44
Dĺžka neoperovanej končatiny(mm)	97,4 (2,0)	98,8 (2,2)	-1,45	-3,59.0,74	0,16
Hmotnosť predĺženej tíbie (g)	10,9(0,6)	8,7(0,9)	2,2	(1,37.3,03)	<0,001
Hmotnosť neoperovanej tíbie (g)	9,8 (0,5)	8.1(0,4)	1,19	(0,71.1,67)	<0,001
Regenerovaná dĺžka (mm)	9.6 (0,6)	10,4(0,7)	-0,75	(-1,45.-0,04)	0,04

31883/Th

Regenerovaná plocha (cm²)	0,83(0,09)	0,68(0,13)	0,15	(0,03.0,27)	0,017
AP BMD proximálne k regenerátu (g/cm²)	0.51 (0,07)	0,36 (0,09)	0,14	(0,00.0,23)	0,004
AP BMD v regeneráte (g/cm²)	0,47 (0,11)	0.33 (0,11)	0,14	(0,03.0,25)	0,017
AP BMD distálne k regenerátu (g/cm²)	0,48 (0,10)	0,34 (0,08)	0,14	(0,04.0,23)	0,007
AP BMD v proximálnej neoperovanej končatine (g/cm²)	0,48 (0,05)	0,44 (0,03)	0,04	(0,00.0,00)	0,053
AP BMD v distálnej neoperovanej končatine (g/cm²)	0,44 (0,04)	0,42(0,02)	0,02	(-0,02.0,05)	0,31

Zhrnutie výsledkov skúmania

Bol skúšaný vplyv jednotlivej dávky 3 mg/kg pamidronátu ( Novartis ) na kostnú minerálnu hustotu (BMD) na modeli distrakčnej osteogenézy na nedospelých králikoch.

Sedemnásť králikov (9 kontrolných, 8-im bol podávaný pamidronát) bolo testovaných duálnou X-lúčovou absorbciometriou (DXA). Významný nárast v BMD bol zistený v pamidronátovej skupine v porovnaní s kontrolou. Priemerný rozsah BMD (g/cm²) v kosti proximálnej a distálnej k regenerovanej kosti narástol o 40% a 39% v porovnaní s kontrolou (p < 0,05). BMD regenerovanej kosti vzrástla priemerne o 43% v porovnaní s kontrolu (p < 0,05). Bol tiež

31683/Th pozorovaný priemerný 22% nárast plochy vytvoreného regenerátu v pamidronátovej skupine (p < 0,05).

Histologické analýzy deviatich králikov (5 kontrolných, 4 pamidronátových) ukázali nárast v osteoblastickom ohraničení a mineralizácii regenerátu v pamidronátovej králičej tíbii. Vzrástla tiež tvorba kostí v okolí klincov a tiež kortikálna šírka kosti priľahlej k regenerátu u králikov, ktorým bol podávaný pamidronát.

Pamidronát mal významne pozitívny efekt na tento model predlžovania končatiny. Nielen redukuje „atrofiu z nepoužívania“ normálne spojenú s predlžovaním a použitím externého fixátora, tiež vzrastá množstvo a hustota regenerovanej kosti. Vyžaduje sa ďalší výskum mechanických vlastností regenerátu po podávaní pamidronátu.

Príklad 2: Pamidronát pri distrakčnej osteogenéze (dávkovanie 1 mg/kg)

Metódy:

Návrh experimentu

Dvadsať osem týždňov starí samčekovia NZW králikov sa podrobili predlžovaniu tibie. Podobné modely králikov boli publikované. Po predošlom podaní IM Ketamínu 15 mg/kg a Xylazínu 4 mg/kg, bola dosiahnutá anestézia Halothanom 2% a kyslíkom, 1 l/min. Na každom králikovi bola uskutočnená mid-tibiálna osteotómia vyvŕtaním diery“, a bol aplikovaný fixátor Ortofix M-100 použitím štyroch Ortofix 3 mm polovičných klincov (Orthofix , Bussolengo, Italy). Po 24 hodinách čakania sa tíbia predĺžila o 0,375 mm každých 12 hodín počas 15 dní, produkujúc tak 11,25 mm predĺženie celkom. Fixácia bola ponechaná in situ 27 dní, aby sa regenerát spevnil. Pamidronát 1,0 mg/kg zriedený na 30 mg/100 ml bol podávaný formou jednej vnútrooperačnej infúzie počas dvoch hodín 10-tim z králikov; 10-tim kontrolným zvieratám bol podávaný fyziologický roztok. Na konci chirugického zákroku bol podávaný Buprenorphine 0,05 mg/kg a potom znovu 12 hodín po operácii. Zvieratám boli dodávané králičie tablety a

31883/Th voda ad libitum . Po 42 dňoch boli králiky utratené podaním IV Lethobarb

150 mg/ kg.

Róntgenové analýzy a analýzy kostnej minerálnej hustoty

Obe zadné končatiny boli vykĺbené v kolene a mäkké tkanivá zostali nedotknuté. Končatiny boli orientované v štandardnej predozadnej projekcii a laterálna projekcia a róntgenový snímok snímaný Siemens Multi H/UPH zoskupením za použitia digitálnych luminiscenčných kaziet s 50 kV a 4 mA expozíciou na film zo vzdialenosti 1,1 metra. Vzdialenosti medzi polohami klinca z každej odobratej vzorky boli zmerané tak, že každý róntgenový snímok mohol byť opätovne premeraný s ohľadom na meranie dĺžky regenerovanej nohy.

Vykĺbené kosti boli zbavené mäkkých tkanív a analyzované použitím Stratec XCT-960A pQCT skeneru a analytického softvéru (Stratec Medizintechnik Gmbh, Pforzheim, Germany). Odoberali sa 2 mm plátky, 15 plátkov z pravej (predĺženej) tíbie a 10 z neoperovanej tíbie. 5 plátkov sa takto získalo z regenerátu, proximálnej a distálnej kosti a zo zodpovedajúcej oblasti proximálnej a distálnej kosti v neoperovanej končatine. Kvantitatívna CT je neinvazívna metóda s najsilnejšou predikčnou schopnosťou pre mechanickú pevnosť novoformovanej kosti (Harp et al., 1994). Softvér umožňuje analýzu a generovanie dát o kostnej minerálnej hustote (BMD) v mg/cm³, kostného minerálneho obsahu (mg) a priečnej plochy (mm²). Dáta boli získané aj z mechanickej analýzy, menovite momentu zotrvačnosti (mm⁺), a maximálnej y koordináty (vertikálna vzdialenosť od neutrálnej roviny ohybu v mm).

Napätie bolo vypočítané pre každú vzorku podľa vzorca 1:

Napätie = 12Dy/L²

D = odchýlka y = vertikálna vzdialenosť od centra hmoty

31883/Th

L = rozpätie

Vnútorné pnutie bolo vypočítané v 2 mm intervaloch pozdĺž centrálneho rezu vzorky podľa vzorca 2:

Vnútorné pnutie = My/I

M = moment pri x = dávka.x/2-dávka.(x-L/4)/2 y = vertikálna vzdialenosť od centra hmoty

I = druhý moment zotrvačnosti x = vzdialenosť pozdĺž kosti z ľavého valčeka

Youngov modul elasticity bol vypočítaný ako sklon lineárnej časti krivky vnútorné pnutie/napätie pre každý „plátok“ alebo 2 mm interval.

Priemerná hodnota Youngovho modulu pre kontrolnú a liečenú skupinu ako pre stredový „plátok“, tak pre priemerné dáta nad centrálnym 1 cm rezom regenerátu, boli porovnávané použitím nepárového „two tailed“ t-testu.

Plocha pod krivkou vnútorné pnutie/napätie pre stredový plátok bola vypočítaná pre naťahovanú tíbiu pre kontrolnú aj pamidronátovú skupinu. Tieto boli opäť porovnávané použitím nepárového „two tailed“ t-testu.

Výsledky:

Tvorba kostí v distrakčnom úseku bola hodnoverne pozorovaná. Všetky tíbie boli klinicky a rôntgenograficky zjednotené na 42. deň. Pozoroval sa výrazný nárast kostnej minerálnej hustoty proximálne aj distálne v porovnaní s regenerátom v pamidronátovej skupine ( Tabuľka II ). Pozoroval sa tiež výrazný nárast kostného minerálneho obsahu. Pozoroval sa 13% nárast plochy kostí, aj keď toto nebolo štatisticky významné (p = 0,2).

Predĺžené tíbie v pamidronátovej skupine boli o 32% pevnejšie pri

31883rľh špičkovom zaťažení ( p = 0,004 ) ( Obr.6 ). Špičkové zaťaženie predĺženej tíbie v pamidronátovej skupine bolo to isté ako pre neoperovanú kontrolnú tíbiu. Youngov modul nebol významne odlišný v operovanej skupine a bol redukovaný na asi 30% hodnoty intaktnej tíbie ( Obr. 7 ).

Diskusia:

Pri tomto experimente jedna dávka 1,0 mg/kg podaná králikom na začiatku predlžovania spôsobila významné zlepšenie maxima piku pri šesťtýždňovom meraní ohybu v štyroch bodoch. Tak ako aj pri predchádzajúcich experimentoch bola redukovaná osteoporóza obklopujúca predĺženie. Aj keď štatisticky nevýznamný, bol pozorovaný nárast plochy kalusu, ale nie taký význačný ako sa objavil vo vzorkách pri predchádzajúcom experimente, liečbe s 3,0 mg/kg pamidronátu.

Nárast pri špičkovom zaťažení je pravdepodobne spôsobený ako nárastom regenerovaného objemu tak i nárastom obsahu minerálov po šiestich týždňoch. Skutočnosť, že modul elasticity zostáva nezmenený s podaním pamidronátu indikuje, že kosť asi nie je viac dozretá ako pri kontrole. Kombinovaná bisfosfonátová liečba a mechanická stimulácia sa môže ukázať užitočnou: predpokladá sa, že bisfosfonáty zlepšia rannú osteoblastickú proliferáciu a zvýšia kostný obsah minerálov, zatiaľ čo mechanická stimulácia by mala zrýchliť dozrievanie kalusov.

31883/Th

Tabuľka II

Porovnanie dát pri pamidronátovej a pri kontrolnej skupine
	kontrola	Pamidronát
	Priemer	SD	Priemer	SD	% nárast	P hodnota
TOT BMC Prox	27,98	6,68	34,52	8,27	23%	0,03
TOT BMC Regen	26,13	10,70	30,47	6,67	17%	NS
TOT BMC Dist	28,04	4,65	34,47	4,34	23%	0,004
Total BMD Prox	585,53	69,61	650,73	47,06	11%	0,03
Total BMD Regen	530,06	77,61	575,03	62,12	8%	NS
Total BMD Dist	650,40	79,40	739,37	56,48	14%	0,01
Plocha Prox	52,97	7,94	48,26	7,41	10%	NS
Plocha Regen	53,13	9,71	46,90	11,91	13%	NS
Plocha Dist	46,85	5,73	43,37	6,54	8%	NS

Príklad 3: Zoledronát pri distrakčnej osteogenéze (dávkovanie 0,1 mg/kg)

Metódy:

Návrh experimentu:

Dvadsaťštyri osem týždňov starých samčekov NZW králikov sa podrobilo predlžovaniu tíbie. Podobné modely králikov boli publikované. Po predošlom podaní IM Ketamínu 15 mg/kg a Xylazínu 4 mg/kg, bola dosiahnutá anestézia Halothanom, 2% a kyslíkom, 1 l/min. Po príprave pravej dolnej končatiny sme uskutočnili otvorenú mid-tibiálnu osteotómiu vyvŕtaním diery, a aplikovali fixátor Ortofix M-100 použitím štyroch Ortofix 3 mm polovičných klincov (Orthofix , Bussolengo, Italy). Ľavá predná končatina zostala nedotknutá. Po 24

31883/Th hodinách čakania sa tíbia predĺžila o 0,375 mm každých 12 hodín počas 14 dní, produkujúc tak celkovo 10,5 mm predĺženie. Fixácia bola ponechaná in situ 28 dní, aby sa regenerát spevnil.

Zvieratá boli rozdelené tak, že osem zvierat bolo operovaných a bola im podaná infúzia fyziologického roztoku (kontrola), ôsmim zvieratám bol podaný zoledronát, 0,1 mg/kg počas 20 min. počas operácie (zoledronát v jednej dávke), a ďalším ôsmim zvieratám bola podaná druhá dávka zoledronátu 0,1 mg/kg 14-ty deň (opakovaná dávka zoledronátu).

Na konci chirugického zákroku bol podávaný Buprenorphine 0,05 mg/kg a potom znovu 12 hodín po operácii všetkým zvieratám. Zvieratám boli dodávané králičie tablety a voda ad libitum . Po 42 dňoch boli králiky utratené podaním IV Lethobarb 150 mg/ kg.

Róntgenové analýzy a analýzy kostnej minerálnej hustoty

Merania kostného obsahu minerálov (BMC) a hustoty (BMD) boli robené po dvoch, štyroch a šiestich týždňoch použitím x-ray denzitometra s duálnou energiou (LUNAR DPX, Radiation Corps, Madison Wisconsin). DXA snímky boli robené na zaťaženej tíbii predo-zadnou (AP) projekciou za použitia softvéru špeciálne navrhnutého pre meranie malých zvierat (LUNAR DPX, Small Animal Software, 1.0c LUNAR, Radiation Corps, Madison, Wisconsin). Bol použitý HiRes<0,5 kg Slow snímací mód („Presná“ kolimácia, veľkosť vzorky 0,6x1,2 mm a interval vzorky 1/16 sekúnd).

Regionálne BMC a BMD údaje boli získané umiestnením „oblastí záujmu“ (regions of interest = ROl's) 9,6 mm vysoko na zosnímanom obrázku. Na každej predĺženej tíbii, jeden ROI bol umiestnený na regeneráte, jeden proximálne k nemu a jeden distálne k nemu. Na neoperovanej tíbii boli umiestnené dve ROl's tak, že zodpovedali proximálnej a distálnej ROI predĺženej tíbie (t.j. v rovnakej vzdialenosti od koncov kostí). Spolu boli robené tri merania pre každú predĺženú tíbiu a dve pre každú neoperovanú tíbiu, pre každé zobrazenie. Hodnoty BMC boli vyjadrené v gramoch (g) a hodnoty BMD

31883/T h v g/cm² a údaje za skupinu sú uvedené so strednou a štandardnou odchýlkou a 95% intervalom spoľahlivosti.

Po vybratí boli obe zadné končatiny vykĺbené v kolene a mäkké tkanivá zostali nedotknuté. Končatiny boli orientované v štandardnej predo-zadnej a laterálnej projekcii a rontgenový snímok snímaný Siemens Multi H/UPH konfiguráciou za použitia digitálnych luminiscenčných kaziet s 50 kV a 4 mA expozíciou na film zo vzdialenosti 1,1 metra. Kalibrované značky na filme umožnili, že obraz bol opätovne premeraný s ohľadom na meranie dĺžky v milimetroch (mm).

Pre rozšírenie analýz po šiestich týždňoch boli vykĺbené kosti zbavené mäkkých tkanív a analyzované použitím Stratec XCT-960A pQCT skeneru a analytického softvéru (Stratec Medizintechnik Gmbh. Pforzheim, Germany). Odoberali sa 2 mm plátky, 15 plátkov z pravej (predĺženej) tibie a 10 z neoperovanej tibie. 5 plátkov sa takto získalo z regenerátu, proximálnej a distálnej kosti a zo zodpovedajúcej oblasti proximálnej a distálnej kosti v neoperovanej končatine. Softvér umožňuje analýzu a generovanie dát o kostnej minerálnej hustote (BMD) v g/cm³, kostného minerálnaho obsahu (mg) a priečnej plochy (mm²). Dáta boli získané aj z mechanickej analýzy, menovite momentu zotrvačnosti (mm⁺), a maximálnej y koordináty (vertikálna vzdialenosť od neutrálnej roviny ohybu v mm).

Výsledky

Vylúčenia

Jeden králik zoledronátovej skupiny, ktorému bola podaná jedna dávka, zomrel náhle na gastrointestinálne ochorenie 9 dní po chirurgickom zákroku. Jeden králik v opakovane dávkovanej skupine mal zlyhanie pri náprave zlomeniny a predčasnom spevnení a bol vylúčený. Toto spôsobilo, že v kontrolnej skupine zostalo osem králikov a sedem králikov v každej zoledronátovej skupine.

31883/T h

Obsah minerálov v kostiach (Bone Minerál Content = BMC)

BMC zmeraný prostredníctvom DXA bol podobný po dvoch týždňoch vo všetkých skupinách (Obr.8). V skupine zvierat testovaných na zolendronát bol pozorovaný prudký nárast v mineralizácii všetkých troch oblastí operovaných končatín medzi druhým a štvrtým týždňom. Významný rozdiel bol pozorovaný pri liečených skupinách v porovnaní s kontrolou vo všetkých oblastiach okrem jednorázovo dávkovaných zvierat v distálnom segmente (t test p < 0,01). Bol zaznamenaný pokles BMC medzi štvrtým a šiestym týždňom vo všetkých oblastiach. Tento jav bol najvýznamnejší v kontrolnej skupine zvierat, menej významný v skupine, kde bola podaná jedna dávka a minimálny v tej, kde boli podané dve dávky, takže tieto obe liečené skupiny mali významný nárast BMC v šiestom týždni v porovnaní s kontrolou. Rozdiel medzi zvieratami, ktorým bola podaná jedna dávka a dve dávky pre BMC bol významný v šiestom týždni v proximálnom a distálnom segmente, ale nie v regeneráte (p < 0,01).

Rýchlosť prírastku kostných minerálov v regeneráte bola výrazne vyššia medzi druhým a štvrtým týždňom pri liečených zvieratách (Obr. 9, p < 0,01). V období medzi štvrtým a šiestym týždňom, kedy všetky skupiny strácali časť kostných minerálov, bolo toto takmer rovnaké v prípade skupiny s opakovaným podaním zoledronátu (p < 0,05 oproti kontrole, NS oproti jednorazovému podaniu).

Po šiestich týždňoch BMC merané prostredníctvom QCT výrazne narástlo vo všetkých oblastiach v prípade zvierat liečených zoledronátom (p < 0,01, ANOVA) (Obr. 10). Tento efekt bol zosilnený v skupine s opakovaným podaním v prepočte na dávku. Dodatočný t-test ukázal, že rozdiely medzi jedným podaním oproti kontrole a opakovaným podaním oproti jednému podaniu boli v oboch prípadoch výrazné (p < 0,05). Pri skupine s neoperovanou tíbiou nebola výrazná zmena BMC.

31883/Th

Hustota minerálov v kostiach (BMD)

Pri kontrolnej skupine BMD meraná prostredníctvom DXA, v regeneráte narástla medzi druhým a štvrtým týždňom ale poklesla opäť na úroveň z druhého týždňa (obr. 11). BMD poklesla progresívne v proximálnej a v distálnej oblasti čo je očakávaný efekt tienenia vnútorného napätia (Obr. 11). Oproti tomu BMD v regeneráte zoledronátom liečených zvierat narástlo rýchlejšie a zostalo zväčša zachované. Zoledronát slúžil ako ochrana proximálnej a distálnej oblasti pred efektom tienenia vnútorného napätia tak, že BMD zostalo zachované nad úrovňou po dvoch týždňoch aj po šiestich týždňoch. Obe zoledronátom liečené skupiny mali plošné hodnoty BMD výrazne odlišné od kontroly po štyroch aj šiestich týždňoch podľa DXA, ale skupina s jednou dávkou a skupina s opakovaným podaním neboli nikdy výrazne vzájomne odlišné čo sa týka plošného BMD.

Objemová BMD meraná prostredníctvom QCT narástla výrazne vo všetkých oblastiach pri zvieratách liečených zoledronátom (p <0,01, ANOVA) (Obr. 12). Dodatočný t-test ukázal rozdiely medzi jedným podaním oproti kontrole (p <0,01), ale žiaden rozdiel medzi opakovaným podaním oproti jednému podaniu (p > 0,05). Pri neoperovanej tíbii nebola výrazná zmena BMC. Zoledronátom liečené zvieratá si zachovali BMD vo všetkých oblastiach tíbie podobnú neoperovanej kontrole, zatiaľ čo kontrola s operovanou tíbiou ukázala výrazné množstvo osteoporózy vo všetkých oblastiach.

Meranie dĺžky po šiestich týždňoch

Pozoroval sa rozdiel v dĺžke tibie v závislosti od dávky pri neoperovanej tíbii králikov, a to taký, že priemerná dĺžka tibie v skupine s jednou dávkou bola redukovaná o 3% v porovnaní s kontrolou a pri skupine s opakovaným podaním o 7% (ANOVA p < 0,01 Tab. III). Skupina s opakovaným podaním mala výrazne kratšiu aj operovanú pravú tíbiu, ale regenerát bol rovnako dlhý pri všetkých skupinách. Tieto údaje naznačujú malý ale s určitosťou dávkovo závislý negatívny efekt zoledronátu na pozdĺžny rast rastovej platničky.

31883/Th

Meranie plochy priečneho rezu po šiestich týždňoch

Pri zoledronátom liečených zvieratách sa pozoroval výrazný nárast plochy priečneho rezu vo všetkých oblastiach meraný QCT (p < 0,01, ANOVA). Pri neoperovanej tíbii sa nepozoroval žiaden efekt na plochu priečneho rezu (Obr. 13). Najvýraznejší efekt bol pozorovaný pri regeneráte, s nárastom 56% v skupine s jednou dávkou a 105% v skupine s opakovanou dávkou, ale pozoroval sa tiež pozoruhodný nárast plochy priečneho rezu priľahlých oblastí, v rozsahu od 29% do 72%. Stredný QCT záznam z hľadiska plochy priečneho rezu pre každú skupinu je ukázaný na obrázku 14.

Pozoroval sa dokonca ešte väčší nárast momentu zotrvačnosti ako je úmerné r⁴ (Obr. 14). Moment zotrvačnosti pre regenerát bol zvýšený o 111% v skupine s jednou dávkou a o 213% v skupine s opakovanou dávkou (p = 0,02 ANOVA). Rozdiel medzi jednou dávkou zoledronátu a kontrolou bol výrazný podľa dodatočného nepárovaného t testu (p = 0,02). Ďalší nárast momentu v skupine s opakovaným podaním nebol významný pre vysokú variabilitu (p = 0,3). Nárasty momentu zotrvačnosti v okolitých oblastiach boli od 57% do 180%.

Je žiadúce ďalšie skúmanie mechanických vlastností regenerátu po podaní Zoledronátu.

Diskusia

Hoci bola použitá jednoduchá IV infúzia, v tejto štúdii bol dokumentovaný výrazne užitočný efekt podania zoledronátu na špecifický cieľový orgán(Obr. 10, 12, 13, 14). Bol produkovaný masívny nárast oboch, množstva vytvorenej kostnej hmoty a jej mineralizácia, a to nielen v regeneráte ale aj v priľahlých oblastiach. Zatiaľ sa pozoroval len malý alebo žiaden efekt pri neoperovanej tíbii. Vysvetliť to môže niekoľko možných hypotéz. Aj keď spôsob alebo dokonca vysvetlenie na bunkovej úrovni sa zatiaľ nepodarilo, zdá sa, že

31883/Th zoledronát vytvára nespôsobilosť kosti vnímať jej mechanické okolie. Na rozdiel od kontrolnej tíbie, pri ktorej BMD postupne klesalo, kostné minerály sa nestrácali v kostiach obklopujúcich osteotómiu a distrakciu. Nová kosť vznikala mohutnejším spôsobom ako pri kontrole, dokonca aj keď bola kosť pevne držaná vo fixátore.

Iná možnosť je, že osteoklastická inhibícia spomaľuje prestavbu kým sa nevytvorí väčšie ako obvyklé množstvo kalusov. Je tiež možné, že bisfosfonáty pôsobia priamo na osteoblasty, možno cez bázický fibroblastový rastový faktor (basic fibroblast growth factor - bFGF ). Je žiadúci ďalší výskum na vyskúšanie a exaktné objasnenie, ktorý rastový faktor je stimulovaný alebo inhibovaný pri podaní bisfosfonátov.

Dôležité je pozorovanie, že BMD sa vrátila na hodnotu kontrolnej neoperovanej končatiny a nárasty BMC boli zväčša spôsobené nárastom množstva novej kosti bežnej hustoty. Ak by sa jednoducho zvýšila hustota nad normálnu úroveň bez zvýšenia množstva vytvorenej kosti, potom by kosť bola osteopetrotická, t.j. krehká a bez zvýšenia pevnosti.

Jednoduché IV dávkovanie počas chirurgickej operácie pomerne dosť pripomína situáciu, keď sa zvláda skeletálna trauma. Zoledronát má dobre zdokumentovaný profil bezpečnosti pri podávaní násobných dávok pacientom s rakovinou (Major p, Lortholary, Hon J et al. Zoledronic acid is superior to pamidronate in the treatment of tumor induced hypercalcaemia: a pooled analysis.“ Proc ASCO New Orleans, May 2000 19;209 (Abstrakt 814)). Jednoduché dávkovanie počas operácie pacientom s dobrou hydratáciou by malo byť dobre tolerované, ak by tu bola obava o hydratáciu liečbu je možné odložiť kým nie je adekvátna. Toto by malo redukovať teoretickú možnosť nefrotoxicity alebo nefrokalcinózy.

Vo vybraných situáciách by malo byť ľahko a bezpečne dosiahnuté IV podanie zoledronátu formou 5-20 minútovej infúzie počas operácie. Žiadúci je tu ďalší výskum.

31883/T h

Ak ošetrujúci lekár považuje odozvu na jednu perioperatívnu dávku za sub-optimálnu, alebo je priebeh liečenia nezvyčajne zdĺhavý, táto štúdia jasne ukazuje, že ďalšia dávka zabezpečí dodatočný úžitok. Avšak keďže jedna dávka poskytuje viac ako 50% nárastu tvorby novej kosti v tomto modeli, ďalšia dávka nemusí byť bežne nevyhnutná. Podobne ako pri pediatrickej populácii musí byť venovaná primeraná pozornosť negatívnym efektom pozdĺžneho rastu vo vzťahu k podávaniu bisfosfonátov. Táto štúdia ukázala negatívny efekt na pozdĺžny rast v závislosti od dávky, aj keď to boli iba 3% pri jednej dávke a 7% pri zvieratách s opakovanou dávkou, ukazuje to, že predĺžené podávanie zoledronátu rastúcim deťom môže byť škodlivé.

Nárast plochy priečneho rezu je veľmi významný úžitok. Zlyhanie regenerácie bolo dokumentované najmä pri ohybe a zlomeniny dlhých kostí sa stávajú buď pri ohybe alebo pri skrútení. Pri oboch, ohybe aj skrútení je moment zotrvačnosti úmerný r⁴ , alebo štvorcu plochy priečneho rezu. 56%-ný nárast plochy priečneho rezu regenerátu tak vysvetľuje 111%-ný nárast momentu zotrvačnosti. 105%-ný nárast pri skupine s opakovaným podaním zodpovedá 213%-nému nárastu momentu zotrvačnosti. Aj index pevnosti regenerátu narástol úmerne k ploche priečneho rezu (Tabuľka IV).

Efekty pozorované pri tomto experimente sú v súlade s predtým uvedenými pozorovaniami pri podaní pamidronátu.

Keďže uvádzaný model sleduje zvieratá len počas šiestich týždňov, nie je možné urobiť žiaden uzáver ohľadom prestavby novovytvorenej kosti. Predpoklad, že plocha priečneho rezu sa zmenší s prestavbou kosti je skôr intuitívny. Produkovanie takého veľkého množstva kalusu môže umožniť ostránenie fixátora skôr než dôjde k prestavbe. Táto stratégia by mohla spôsobiť, že prestavba nastane v prostredí vystavenom fyziologickej záťaži, keď bisfosfonáty už nepôsobia, skôr než prestavba pod vplyvom efektu tienenia vnútorného napätia okolia fixátora. Sú žiadúce ďalšie štúdie, ktoré budú sledovať správanie sa kostí po odstránení fixátora.

31883/Th

Tabuľka III

Tíbiálne a regenerátové dĺžky v kontrolnej skupine, zoledronátovej skupine a opakovane dávkovanej zoledronátovej skupine
	Kontrola	Zoledronát 1	Zoledronát 2
Počet	8	7	7
Ľavá tíbia	Priemer	98,00	95,14*	91,14*
	SD	1,41	2,48	2,79
Pravá tibia	Priemer	107,75	107,43	101,57*
	SD	2,12	4,08	3,21
Regenerát	Priemer	10,38	11,29	10,57
	SD	1,30	1,50	1,90
Znamenajú významne rozdielne hodnoty podľa ANOVA a dodatočného nepárového t-testu

31883/Th

Tabuľka IV

Stupeň regeneračného indexu pre kontrolu, zoledronátovú skupinu a opakovane dávkovanú zoledronátovú skupinu
	Kontrola	Zoledronát 1	Zoledronát 2
RSI % v porovnaní s kontrolou	2,09	3,26	4,49
		56%	114%

Odborníci v predmetnej oblasti ocenia početné možnosti a/alebo modifikácie, ktoré je možné urobiť podľa vynálezu, ako je naznačené v jednotlivých príkladoch bez toho, aby sme prekročili rámec vynálezu tak ako je vo všeobecnosti opísaný. Predkladané príklady použitia vynálezu sú teda vo všetkých ohľadoch ilustratívne a nie vyčerpávajúce.

Claims

1. Liečivo zo skupiny, pozostávajúcej z najmenej jedného bisfosfonátu na použitie na podporu tvorby nových kostí na strane zlomeniny.

t

2. Liečivo zo skupiny, pozostávajúcej z najmenej jedného bisfosfonátu na použitie na liečenie zlomených kostí.

3. Liečivo podľa nároku 1 alebo 2, kde bisfosfonátom je Zoledronát.

4. Liečivo podľa nároku 1 alebo nároku 2, kde liečivo je kombináciou dvoch alebo viacerých bisfosfonátov.

5. Liečivo Zoledronát na použitie na podporu tvorby nových kostí.

6. Liečivo podľa nároku 5, na použitie na podporu tvorby nových kostí medzi kosťou a protézou, fixačným zariadením alebo akýmkoľvek iným kostným alebo zubným implantátom.

7. Liečivo podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich patentových nárokov ak je podané subjektu v jednej dávke.

8. Liečivo podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich patentových nárokov ak je podané subjektu počas operácie.

9. Použitie liečiva vybraného zo skupiny pozostávajúcej z najmenej jedného bisfosfonátu na výrobu liečiva na podporu tvorby nových kostí na strane

31883/Th zlomeniny.

10. Použitie liečiva vybraného zo skupiny pozostávajúcej z najmenej jedného bisfosfonátu na výrobu liečiva na liečenie zlomených kostí.

11. Použitie liečiva podľa nároku 9 alebo 10, kde liečivom je Zoledronát.

12. Použitie liečiva podľa nároku 9 alebo 10, kde liečivo j$ kombináciou dvoch alebo viacerých bisfosfonátov.

13. Použitie Zoledronátu na výrobu liečiva na podporu tvorby nových kostí.

14. Spôsob liečenia zlomených kostí, zahrňujúci podávanie terapeuticky účinného množstva liečiva, vybraného zo skupiny pozostávajúcej z najmenej jedného bisfosfonátu, subjektu so zlomeninou kosti.

15. Spôsob podľa nároku 14, kde je liečivo podané subjektu v jednej dávke.

16. Spôsob podľa nároku 15, kde je jedna dávka liečiva podaná v rannom štádiu liečenia zlomenej kosti.

17. Spôsob podľa nároku 14, kde spôsobom podania je intravenózna infúzia počas operácie.

18. Spôsob podľa nároku 14, kde je spôsob podania orálny.

19. Spôsob podľa nároku 14, kde je spôsob podania transdermálny.

20. Spôsob liečenia zlomených kostí, pozostávajúci z týchto krokov:

31883/Th (a) podávanie terapeuticky účinného množstva liečiva, vybraného zo sklupiny pozostávajúcej z najmenej jedného bisfosfonátu, subjektu so zlomeninou kosti; a (b) uskutočnenie vibračnej stimulácie zlomenej kosti

21. Spôsob podľa nároku 20, kde sa vibračné stimuly vykonávajú ultrazvukovou stimuláciou alebo vibračnou stimuláciou.

t

22. Spôsob podľa nároku 20 alebo 21, kde vibračné stimuly zahrňujú periodicky uskutočňované vibračné stimuly pri rezonančnej frekvencii kosti.

23. Spôsob podľa nároku 22, kde rezonančná frekvencia je vypočítaná ako funkcia odozvy kostnej vibrácie k vibračným stimulom.

24. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 20 až 23, kde sú vibračné stimuly uskutočňované v neskoršom štádiu liečenia zlomenej kosti.

25. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 20 až 23, kde krok vibračnej stimulácie sa uskutočňuje súčasne s podávaním terapeuticky účinného množstva liečiva.

26. Spôsob podľa nároku 25, kde sú vibračné stimuly uskutočňované a terapeuticky účinné množstvo liečiva podávané v rannom štádiu liečenia zlomenej kosti.

27. Liečivo vybrané zo skupiny pozostávajúcej aspoň z jedného bisfosfonátu, použité na podporu rastu nových kostí na strane zlomeniny pri jedincoch trpiacich oneskoreným hojením zlomenín.

31883/Th

28. Spôsob podpory tvorby nových kostí na strane zlomeniny pri jedincoch trpiacich oneskoreným hojením zlomenín, spôsob zahrňujúci podávanie terapeuticky účinného množstva liečiva vybraného zo skupiny pozostávajúcej aspoň z jedného bisfosfonátu.

29. Spôsob podľa nároku 28, kde aspoň jeden bisfosfonát je podávaný parenterálne v jednej dávke, v čase alebo takmer v čase chirurgického zákroku.

I

30. Spôsob podľa nároku 29, kde je ďalšia parenterálna dávka aspoň jedného bisfosfonátu podávaná asi štyri alebo šesť týždňov po počiatočnej dávke.

31. Spôsob podľa nároku 29, kde je ďalšia orálna dávka aspoň jedného bisfosfonátu podávaná denne alebo obdeň počínajúc štvrtým alebo šiestym týždňom po úvodnej dávke počas asi dvoch mesiacov alebo kým bola vytvorená dostatočná hmotnosť novej kosti.

32. Spôsob podpory tvorby novej kosti pri jedincoch, spôsob zahrňujúci chirurgický krok uskutočňujúci proces distrakčnej osteogenézy a zahrňujúci podávanie liečiva vybraného zo skupiny pozostávajúcej aspoň z jedného bisfosfonátu jedincovi.

33. Spôsob podľa nároku 32 kde je aspoň jeden bisfosfonát podávaný parenterálne v jednej dávke v čase alebo takmer v čase chirurgického zákroku.

34. Spôsob podľa nároku 33 kde je ďalšia parenterálna dávka aspoň jedného bisfosfonátu podávaná buď na konci distrakčnej periódy alebo do troch mesiacov po počiatočnej dávke.

35. Spôsob podľa nároku 33 kde sú ďalšie orálne dávky podávané denne, obdeň alebo raz za týždeň.

31883/Th

36. Spôsob podľa patentového nároku 35 kde režim podávania začína asi jeden až tri mesiace po podaní počiatočnej parenterálnej dávky a trvá asi dva mesiace.