SK178698A3

SK178698A3 - Treating urinary incontinence using (s)-oxybutynin and (s)-desethyloxybutynin

Info

Publication number: SK178698A3
Application number: SK1786-98A
Authority: SK
Inventors: Gunnar Aberg; John R Mccullough
Original assignee: Sepracor Inc
Priority date: 1996-06-28
Filing date: 1997-06-27
Publication date: 1999-09-10
Also published as: BR9710031A; NO985896L; CA2257121C; NZ333282A; NO985896D0; WO1998000126A1; CA2257121A1; EP0914113A1; US5736577A; AU732568B2; PL330752A1; RU2195276C2; UA61916C2; JP2000513724A; PL190483B1; AU3513797A; CZ428398A3

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka opticky čistého (S)-oxybutyninu (S-OXY) a (S)-deetyloxybutyninu (S-DEO) a dávkovacích foriem s ich obsahom používajúcich sa na liečbu močovej inkontinencie.

Doterajší stav techniky

Na liečbu intestinálnej hypermotility a na liečbu močovej inkontinencie v dôsledku nestability vypudzovača sa používa terapeuticky racemický oxybutynin (OXY). Racemický oxybutynin vyvíja priamy antispastický účinok na hladké svalstvo a inhibuje účinok acetylcholínu na hladké svalstvo. Má len jednu pätinu anticholinergného účinku atropínu na vypudzovač králika, ale stvor- až desaťnásobný antispastický účinok. Je dosť selektívny pre muskarínové receptory v prítomnosti nikotínových receptorov a v dôsledku toho sa nepozorovali žiadne blokujúce účinky na skeletových neuromuskulárnych spojoch alebo autonómnych gangliách.

Racemický oxybutynin uvoľňuje hladké svalstvo močového mechúra a u pacientov so stavmi, ktoré sa vyznačujú mimovoľnými kontrakciami močového mechúra, ukázali cystometrické štúdie, že racemický oxybutynin zvyšuje kapacitu mechúra, znižuje frekvencie mimovoľných kontrakcii vypudzovača a odďaľuje nutkavý pocit močenia. Je preto užitočný pri liečbe a prevencii ako inkontinencie, tak častej potreby močenia. Účinok racemického oxybutyninu v močovom mechúre sa pripočítal kombinácii antimuskarínového, priameho spazmického a lokálne anestetického účinku na hladký sval vypudzovač. Vzhľadom na antimuskarínový účinok racemického liečiva sú zvyčajné vedľajšie účinky xerostómia (sucho v ústach) a mydriáza (rozšírené zornice), ktoré zahrňujú muskarínové cholinergné receptory. Najmenej jeden výskumný pracovník referoval o „nevyhnutných symptómoch mydriázy, xerostómie, tachykardie atď., ktoré sprevádzali aplikáciu racemického oxybutyninu (Lisch a spol. Árch. Int. Pharmacodyn. 156, 467 až 488 (1965), 481). Vysoký výskyt anticholinergných vedľajších účinkov (40 až 80 %) má často za následok zníženie dávkovania alebo prerušenie terapie.

Farmakologické štúdie jednotlivých enantiomérov ukazujú na to, že účinným enantiomérom je R-enantiomér. Noronha-Blob a spol. (J. Pharmacol. Exp. Ther. 256, 562 až 567 (1991) prišli k záveru, že cholinergný antagonizmus racemického oxybutyninu (zmeraný in vitro jeho afinitou k subtypom receptorov Mi, M₂ a M₃a in vivo k rôznym fyziologickým odpovediam) sa môže pripísať hlavne aktivite (R)-enantioméru. Pre všetky odpovede zistili uvedení autori rovnaké poradie účinnosti racemického oxybutyninu a jeho enantiomérov, a síce pri (R)-oxybutyníne väčšiu alebo rovnakú ako pri racemickom oxybutyníne, pri ktorom je oveľa väčšie ako pri (S)-oxybutyníne, pričom (S)-oxybutynin je o 1 až 2 rádu veľkosti menej účinný ako (R)-oxybutynin.

Podstata vynálezu

Teraz sa neočakávane zistilo, že v podstate opticky čistý (S)-enantiomér oxybutyninu a jeho deetylmetabolit poskytujú lepšiu terapiu na liečbu močovej inkontinencie.

Opticky čistý (S)-oxybutynin (S-OXY) a (S)-deetyloxybutynín (S-DEO) zaisťujú túto liečbu, pričom podstatne znižujú vedľajšie účinky, ktoré primárne vznikli pri anticholergnej aktivite, a ktoré sú spojené s aplikáciou racemického oxybutyninu. Tieto zahrňujú, xerostómiu, mydriázu, ospalosť, nauzeu, zápchu, palpitáciu a tachykardiu, ale neobmedzujú sa na ne. Zlepšenie kardiovaskulárnych vedľajších účinkov racemického oxybutyninu, ako tachykardie a palpitácie, aplikáciou (S)-oxybutyninu alebo

S-DEO má obzvlášť veľkú terapeutickú hodnotu.

Aktívne zlúčeniny týchto prostriedkov a spôsobov sú optické izoméry oxybutyninu a deetyloxybutyninu. Príprava racemického oxybutyninu je opísaná v britskom patentovom spise 940.540. Chemicky sú aktívne zlúčeniny (1) S enantiomér a 4-(dietylamino)-2-butinyl-a-cyklohexyl-hydroxybenzénacetátu, známy tiež ako

4-(dietylamino-2-butinylfenylcyklohexylglykolát a ďalej uvádzaný ako oxybutynin, a (2) S enantiomér 4-etylamino)-2-butinyl-a-cyklohexyl-a-hydroxybenzénacetátu a ďalej uvádzaný ako deetyloxybutynin. Generický názov, ktorý dala hydrochloridovej soli racemického oxybutyninu rada USAN, je oxybutyninchlorid. Predáva sa pod obchodným názvom Ditropan®.

Izomér oxybutyninu, ktorý má absolútnu stereochémiu S (číslo registrácie 119618-22-3), je pravotočivý a je znázornený vzorcom I:

S enantiomér

(II)

Syntéza (S)-oxybutyninu bola opísaná (Kachur a spol., J.Pharmacol. Exp. Ther. 247, 867 až 872 (1988), ale (S)-oxybutynin sám nie je v súčasnosti komerčne dostupný. Všetky uvádzané klinické výsledky, ktoré sa publikovali, sa získali racemickou zmesou, hoci farmakológia jednotlivých enantiomérov sa opísala na morčatách a krysách (pozri Kachur a spol., J. Pharmacol. Exp. Ther. 247, 867 až 872 (1988) a Noronha-Blob a spol. J. Pharmacol. Exp. Ther. 256, 562 až 567 (1991)). Syntézu a farmakológiu (S)-deetyloxybutynínu sme opísali v PCT prihláške WO 96/234292.

Podľa jedného význaku sa vynález týka spôsobu liečby močovej inkontinencie so zamedzením súčasnej náchylnosti na vedľajšie účinky, ktorý spočíva v tom, že sa aplikuje človeku, ktorý potrebuje túto liečbu terapeuticky účinné množstvo (S)-oxybutynínu, (S)-deetyloxybutynínu alebo jej farmaceutický prijateľnej soli, v podstate bez zodpovedajúceho R enantioméru.

Podľa iného význaku sú predmetom vynálezu farmaceutické prostriedky, ktoré obsahujú (S)-oxybutynin, (S)-deetyloxybutynin alebo ich farmaceutický prijateľná soľ, v podstate bez ich (R)-enantiomérov, a farmaceutický prijateľný nosič. Výrazy „v podstate bez ich R enantioméru a „v podstate bez zodpovedajúceho R enantioméru, tak, ako sa tu používajú, znamenajú, že prostriedok obsahujúci najmenej 90 % hmotn. (S)-oxybutynínu alebo (S)-deetyloxybutynínu a 10 % hmotn. alebo menej (R)-oxybutynínu alebo (R)-deetyloxybutynínu. Podľa výhodnejšieho uskutočnenia obsahujú prostriedky najmenej 99 % hmotn. S enantiomérna 1 % alebo menej R enantioméru.

V podstate opticky čistý (S)-oxybutynin alebo (S)-deetyloxybutynín sa môže aplikovať parenterálne, rektálne, intravezikálne, transdermálne, orálne alebo ako aerosól. Prednosť sa dáva orálnej a transdermálnej aplikácii v množstve asi 0,1 mg až asi 1 gram za deň.

Podľa iného význaku sa vynález týka farmaceutickej jednotkovej dávkovacej formy v podobe tablety, mäkkej elastickej tobolky alebo transdermálnej aplikačnej formy, obsahujúcej terapeuticky účinné množstvo (S)-oxybutynínu, (S)-deetyloxybutynínu alebo ich farmaceutický prijateľnej soli, ktoré sú v podstate bez zodpovedajúceho R stereoizoméru, a farmaceutický prijateľný nosič. Tablety a mäkké, elastické želatínové tobolky sa môžu pripraviť zvyčajnými metódami, dobre známymi v odbore, a množstvo (S)-oxybutynínu, (S)-deetyloxybutynínu alebo ich farmaceutický prijateľnej soli v každej jednotkovej dávke je výhodne asi od 0,1 mg do 500 mg, výhodnejšie asi od 25 mg do 250 mg a ešte výhodnejšie asi od 100 mg do 200 mg. Transdermálna aplikácia sa zlepší, keď sa do transdermálnej liekovej formy pridá prostriedok zlepšujúci prenikanie.

S enantioméry oxybutynínu a DEO sa môžu získať rozštiepením mandľovej kyseliny ako medziproduktu a nasledujúcej esterifikácii. Esterifikácia sa môže vykonať ako je opísané Kachurom a spol. (pozri citácie predtým) pre OXY, alebo zdokonalenou metódou opísanou v PCT prihláške WO 96/23492. Alebo sa

S enantioméry OXY a DEO môžu získať rozštiepením racemického oxybutynínu alebo DEO použitím zvyčajných prostriedkov ako frakčnej destilácie diastereomérnych solí s chirálnymi kyselinami. Tiež sa môžu použiť štandardné metódy rezolúcie známej odborníkom v odbore vrátane jednoduchej kryštalizácie a chromatografie na chirálnom substráte, bez toho aby sa obmedzovali .

Grafické znázornenie racemických ambiskalemických a skalemických alebo enantiomérne čistých zlúčenín tu použité sú prevzaté z Maehr J. Chem. Ed. 62, 114 až 120 (1985) . Teda plné a prerušované kliny (ako je naznačené vo vzorci I) sa používajú na označenie absolútnej konfigurácie chirálnaho prvku. Obrysy klinu a bodkované alebo prerušované čiary označujú enantiomérne čisté zlúčeniny neurčitej absolútnej konfigurácie.

Veľkosť profilaktickej alebo terapeutickej dávky (S)-oxybutynínu alebo S-DEO pri akútnom alebo chronickom zvládaní choroby sa bude meniť podľa vážnosti a povahy stavu, ktorý sa má liečiť, a podľa cesty aplikácie. Dávka a možná frekvencia dávok sa bude tiež meniť podľa veku, telesnej hmotnosti a odpovedi jednotlivých pacientov. Všeobecne je celkové denné rozmedzie dávok pre (S)-oxybutynín alebo S-DEO pre tu opísané podmienky asi od 0,1 mg do asi 1 g, výhodne asi od 0,4 mg asi do 600 mg, výhodnejšie od asi 100 mg asi do 1 g, ešte výhodnejšie asi od 240 mg asi do 750 mg a najvýhodnejšie od 300 do 600 mg v jednej dávke alebo výhodne v rozdelených dávkach. Pri liečbe pacienta by sa s terapiou malo začať pri nižšej dávke, napríklad asi pri 80 mg, a dávkovanie by sa malo zvyšovať v závislosti na celkovej odpovedi pacienta, napr. až asi do 600 mg/deň.

Ďalej sa odporúča, aby pacienti vo veku nad 65 rokov a tí, ktorý majú zhoršenú renálnu a hepatickú funkciu dostávali na jednotlivých v niektorých rozmedzí, ako a aby sa dávky a krvných hladín, použitie dávkovania upravili na

Môže byť vo vnútri

Ďalej je potrebné ako a báze nutné týchto začiatku nízke dávky odpovedí prípadoch bude zrejmé odborníkom v odbore.

poznamenať, že kliník alebo ošetrujúci lekár bude vedieť, kedy prerušiť, upraviť alebo ukončiť terapiu v súvislosti s odpoveďou jednotlivého pacienta. Výrazy „terapeuticky účinné množstvo” a „množstvo dostatočné na liečbu inkontinencie ale nedostatočné na vyvolanie vedľajších účinkov” sú zahrnuté pod hore uvedenými množstvami dávok a plánom frekvencie dávok.

Na podanie účinnej dávky (S)-oxybutynínu alebo S-DEO pacientovi sa môže použiť ľubovoľná cesta aplikácie. Môže sa použiť orálna, rektálna, parenterálna (subkutánna, intramuskulárna, intravenózna), transdermálna, aerosólová a podobná forma aplikácie. Ďalej sa môže liečivo aplikovať priamo do močového mechúra močovodom, ako je opísané pre racemický oxybutynín Massadom a spol. (J. Urol. 148, 559 až 597 (1992)). Dávkovacie formy zahrňujú tablety, pilulky, disperzie, suspenzie, roztoky, tobolky, transdermálne aplikačné systémy a. podobne.

Farmaceutické prostriedky podlá vynálezu obsahujú ako účinnú zložku (S)-oxybutynín alebo S-DEO alebo ich farmaceutický prijateľnú soľ a môžu tiež obsahovať farmaceutický prijateľný nosič a prípadne iné terapeutické ingredencie.

Výrazy „farmaceutický prijateľné soli” alebo „ich farmaceutický prijateľná soľ sa týkajú solí pripravených z farmaceutický prijateľných netoxických kyselín. K vhodným farmaceutický prijateľným adičným soliam s kyselinami pre zlúčeninu podlá vynálezu patria adičné soli s octovou kyselinou, s benzénsulfónovou kyselinou (besylát), s benzoovou kyselinou, s gáforsulfónovou kyselinou, s citrónovou kyselinou, s etánsulfónovou kyselinou, s fumarovou kyselinou, s glukónovou kyselinou, s glutámovou kyselinou, s bromovodíkovou kyselinou, s chlorovodíkovou kyselinou, s izetiónovou kyselinou, s mliečnou kyselinou, maleínovou kyselinou, jablčnou kyselinou, s mandľovou kyselinou, s metánsulfónovou kyselinou, so slížovou kyselinou, s kyselinou dusičnou, s pantoténovou kyselinou, kyselinou fosforečnou, s jantárovou kyselinou, s kyselinou sírovou, s kyselinou vínnou, s p-toluénsulfónovou kyselinou a podobne. Hydrochlorid je obzvlášť užitočný a preto sa použil v ďalej opísaných štúdiách.

Prostriedky podľa vynálezu zahrňujú suspenzie, roztoky, elixíry alebo pevné dávkovacie formy. V prípade pevných orálnych prípravkov (ako práškov, toboliek a tabliet) sú vhodné nosiče ako škroby, cukry a mikrokryštalická celulóza, riedidlá, granulačné činidlá, lubrikanty, spojivá, dezintegračné činidlá a podobne a orálne pevné prípravky sú výhodnejšie ako orálne kvapalné prípravky. Vzhladom na jednoduchosť ich aplikácií predstavujú tablety a tobolky jedny z najvýhodnejších foriem, pričom v tomto prípade sa používajú pevné farmaceutické nosiče. Tablety môžu byť prípadne povlečené štandardnou vodnou alebo nevodnou technikou.

Podlá výhodného uskutočnenia môžu byť farmaceutické prostriedky podlá vynálezu spracované na dávkovaciu jednotku vo forme mäkkej, elastickej želatínovej tobolky použitím bežných metód dobre známych v odbore (pozri napr. Ebert, Pharm. Tech. 1(5): 44-50 (1977)). Mäkké, elastické želatínové tobolky majú mäkké, sférické želatínové puzdro trochu hrubšie, ako majú tvrdé želatínové glycerínu, tobolky sa zmäkčovadla tobolky, pričom sorbitolu alebo môže zmeniť konzervačné i je želatína zmäkčená prídavkom podobného polyolu. Tvrdosť puzdra zmenou typu želatíny a želatínové puzdra môžu rastu húb, ako sorbovú. Účinná ingredencia v kvapalnom nosiči, ako sú rastlinné glykoly ako povrchovo ich kombinácia.

a vody. Mäkké činidlo na zamedzenie propylparabény a kyselinu rozpustiť alebo suspendovať alebo minerálne oleje, propylénglykol, triglyceridy, polysorbáty, alebo želatínovej tobolke (S)-deetyloxybutynín asi do 500 mg, výhodnejšie v množstve a ešte výhodnejšie asi od 100 mg asi do podlá vynálezu prítomný výhodne množstva obsahovať metyl- a sa môže polyetylénglykol a aktívne činidlá ako

V mäkkej (S)-oxybutynín od je v množstve asi asi od 25 mg asi

200 mg.

elastickej alebo do

0,1 mg

250 mg

Okrem hore uvedených dávkovacích foriem sa môžu zlúčeniny podľa vynálezu aplikovať tiež inými prostriedkami s riadeným uvoľňovaním a aplikačnými prostriedkami známymi odborníkom v odbore.

Farmaceutické prostriedky podlá vynálezu vhodné na orálnu aplikáciu sa môžu vyrobiť ako jednotlivé jednotky, napríklad ako tobolky, ako prášky v oblátke alebo tablety, z ktorých každá obsahuje vopred stanovené množstvo účinnej ingredencie, ako prášku alebo granúl, alebo ako mäkké, elastické tobolky, v ktorých je aktívna ingredencia rozpustená alebo suspendovaná na kvapalnom nosiči, alebo ako roztok alebo suspenzia vo vodnej kvapaline, nevodnej kvapaline, emulzii oleja vo vode alebo kvapalnej emulzii vody v oleji. Tieto prostriedky sa môžu pripraviť ľubovoľnou farmaceutickou metódou, ale všetky metódy zahrňujú operáciu, spočívajúcu v tom, že sa privedie do styku aktívna ingredencia s nosičom, ktorý tvorí jednu alebo viac nutných ingredencií. Všeobecne sa prostriedky pripravujú tým, že sa aktívna ingredencia rovnomerne a dôkladne mieša s kvapalnými nosičmi alebo s jemne mletými pevnými nosičmi alebo obidvoma a potom sa prípadne produkt vytvaruje do žiadanej formy tak, ako je známe pre racemickú zmes.

Prekvapujúca užitočnosť (S)-enantioméru ako OXY tak DEO sa preukázala nasledujúcimi štúdiami.

Enantioméry oxybutynínu

Viazanie (R)~ a (S)-oxybutynínu na ľudské muskarínové receptorové subtypy Μχ, M₂, M3 a M₄.

Zdroj proteínu

Pokusy sa uskutočnili na membránach pripravených z buniek SF9 infikovaných baculovírusom, aby sa exprimovali ľudské rekombinantné muskarínové receptové subtypy Μχ, M₂, M3 a M₄.

Testy na viazanie

Tabuľka 1

Receptor	Rádioaktívny ligand	Kone.	Nešpecific.	Inkubácia	Referenčná zlúčenina
Mih	(³H) pirenzepin	2 nM	atropín d μΜ)	60 min. 27 °C	pirenzepin
M2H	(³H)AF-DX 384	2 nM	atropín (1 μΜ.)	60 min. 27 °C	metokramin
M₃h	(³H) 4-DAMP	0,8 nM	atropín d μΜ)	60 min. 27 °C	4-DAMP
M_4H	(³H) 4-DAMP	0,3 nM	atropín d μΜ)	60 min. 27 °C	4-DAMP

Po inkubácii sa vzorky rýchle prefiltrovali za vákua cez filtre zo sklenených vlákien GF/B (Whitman) a premyli sa ľadovo studeným pufrom použitím Brandel Celí Harvester-u. Viazaná rádioaktivita sa stanovila použitím kvapalinového scintilačného prístroja (LS 6000, Beckman) použitím kvapalného scintilačného koktailu (Formula 99, DuPont NEN).

Experimentálny protokol

Zlúčeniny sa testovali dvojmo na každom receptore v 10 koncentráciách, aby sa získali konkurenčné krivky. Pri každom pokuse sa súčasne testovala dvojmo referenčná zlúčenina pre skúšaný receptor v 8 koncentráciách, aby sa získala konkurenčná krivka vyhodnocujúca pokus.

Analýza a vyjadrenie výsledkov

Špecifické viazanie každého receptora na rádioaktívny ligand sa definovalo ako rozdiel medzi celkovým viazaním a nešpecifickým viazaním stanoveným v prítomnosti nadbytku neznačeného ligandu. Hodnoty IC50 (koncentrácia potrebná na inhibíciu 50 % špecifického viazania) sa stanovili nelineárnou regresnou analýzou konkurenčných kriviek. Tieto parametre sa získali prekladaním bodov regresnou krivkou použitím softvéru Sigmaplot ™. IC₅₀ pre R- a S-OXY sú uvedené v tabuľke 2.

Tabuľka 2

Viazanie R-oxybutynínu a S-oxybutyninu na ľudské muskarínové podtypy Ml - M4

Receptor	R-OXY IC50 (nM)	S-OXY IC₅₀ (nM)	Referenčná zlúčenina IC₅₀ (nM)
Ml	0,99	47,6	pirenzepin, 11,9
M2	9,9	178	metoktramin, 14,6
M3	1,8	149	4-DAMP, 1,6
M4	1,2	100	4-DAMP, 0,87

Tieto výsledky naznačujú, že S-OXY má nižšiu afinitu k muskarínovým receptorovým subtypom ako R-OXY.

Viazanie (R)- a (S)-oxybutynínu na vápnikové kanáliky

Testy na viazanie

Testy na viazanie sa vykonali použitím nasledujúcich metód:

Tabuľka 3

Receptory	Membrány	Referenčné zlúčeniny	Referencie
Ca kanálik (T+L, väzbové miesto diltiazemu)	krysia mozgová kôra	diltiazem	Shoemaker a Langer (1985)
Ca kanálik (T+L, väzbové miesto verapamilu)	krysia mozgová kôra	D600	Reynolds a spol. (1986)

Pokusné podmienky boli nasledujúce:

Tabuľka 4

Receptory	Ligandy	Koncentrácie	Nešpecif.	Inkubácia
Ca kanálik (T+L, väzbové miesto verapamilu)	(³H) diltiazem	5 nM	diltiazem (10 μΜ)	120 min. 25 °C
Ca kanálik (T+L, väzbové miesto verapamilu)	(³H)D 888	0,5 nM	D 600 (10 μΜ)	60 min. 22 °C

Po vo vákuu cez filter premyli

Viazaná inkubácii sa vzorky rýchle prefiltrovali so sklenenými vláknami GF/B sa ľadovým pufrom použitím rádioaktivita sa stanovila alebo GF/C (Whatman) a

Brandel Celí

Harvester-u.

prístrojom (LS 6000, Beckman) použitím koktailu (FORMULA 989, DuPont NEN).

kvapalinovým kvapalného scintilačným scintilačného

Experimentálne protokoly

Zlúčeniny sa testovali dvojnásobne na každom receptore pri koncentrácii 10⁵ M. Pri každom pokuse sa referenčná zlúčenina pre skúšaný receptor súčasne testovala dvojnásobne v 8 koncentráciách na získanie konkurenčnej krivky, aby sa zhodnotil pokus.

Analýza a vyjadrenie výsledkov

Špecifické viazanie rádioaktívneho ligandu na každý receptor sa definovalo ako rozdiel medzi celkovým viazaním a nešpecifickým viazaním stanoveným v prítomnosti nadbytku neznačeného ligandu. Stredné hodnoty vyjadrené ako percento inhibície špecifického viazania sú uvedené v tabuľke 5. Hodnoty IC₅₀ (koncentrácia potrebná na inhibíciu 50 % špecifického viazania) sa stanovili nelineárnou regresnou analýzou ich konkurenčných kriviek. Tieto parametre sa získali prekladaním bodov regresnou krivkou použitím softvéru Sigmaplot™.

Tabuľka 5

Viazanie R-oxybutynínu a S-oxybutynínu na vápnikové kanáliky (inhibícia (v %) viazanie diltiazemu a verapamilu na receptory vápnikových kanálikov)

Receptor	R-OXY (10~⁵ M)	S-OXY (10^-5 M)	Referenčná zlúčenina IC₅o (nM)
vápnik (diltiazem)	86	59	diltiazem, 55,8
vápnik (verapamil)	86	68	D 600, 36,4

Tieto výsledky naznačujú, že S-OXY má blokovaciu účinnosť na vstup vápnika podobnú ako R-OXY.

Enantioméry deetyloxybutynínu

Hlavným metabolitom racemického oxybutynínu je RS-deetyloxybutynín (DEO). Pred našimi štúdiami neboli R a S enantioméry DEO opísané a antispastická aktivita a blokovacia aktivita vstupu vápnika jednotlivých enantiomérov R- a S-DEO neboli známe. Syntetizovali sme tieto enantioméry a študovali sme ich antimuskarínový a spazmolytický účinok, ako aj ich blokovací účinok na vstup vápnika na modeloch viazania receptora a funkcie močového mechúra. Zistili sme, že každý enantiomér metabolitu si zachováva relatívny farmaceutický profil svojho „materského oxybutynínového enantioméru.

Viazanie na muskarínové receptorové subtypy

Percentuálna inhibícia špecifického viazania rádioaktívneho koncentráciami každej zlúčeniny (R-, Sna klonovaných ľudských muskarinových (Ml - M4) , ako je opísané hore Dole uvedené tabuľky (tabuľky 6 a Ďalej pre

7) ligandu, vyvolaná tromi a RS-DEO) sa testovala receptorových subtypoch enantioméry oxybutynínu.

uvádzajú percentuálnu inhibíciu pri každom subtype. stanovili hodnoty IC50 pre ľudské receptorové subtypy Mi a ktoré sú uvedené v tabuľke 6.

sa

M₂,

Tabuľka 6

	Mih	M₂h
10^-9 M	10^-7 M	10’⁵ M	IC50 (nM)	10^-9 M	10’⁷	M	10^-5 M	IC₅₀ (nM)
R-DEO	63	100	100	1,2	21	97	102	14,7
S-DEO	-	82	101	25, 4	-	36	101	177
RS-DEO	43	100	100	1,8	-	94	99	7,0

Tabuľka 7

	M3H	m_4h
10^-9 M	10'⁷ M	10’⁵ M	10‘⁹ M	10^-7 M	10’⁵ M
R-DEO	58	100	100	58	100	99
S-DEO	-	63	99	-	43	99
RS-DEO	36	99	101	34	99	95

Tieto výsledky naznačujú, že S-DEO má nižšiu afinitu k muskarínovým receptorovým subtypom ako R- tak racemický DEO.

Väzba na vápnikové kanáliky

Percentuálna inhibícia viazania špecifického rádioaktívneho ligandu vyvolaná každou zlúčeninou (R-, S- a RS-DEO) sa testovala na diltiazemových a verapamilových miestach vápnikového kanálika typu L. Výsledky sú uvedené v tabuľke 8.

Tabuľka 8

Receptor	R-DEO 10^-5 M	S-DEO 10^-5 M	RS-DEO 10^-5 M
vápnik (diltiazem)	86	72 •	88
vápnik (verapamil)	96	76	89

Tieto výsledky naznačujú, že S-DEO má aktivitu blokujúcu vstup vápnika podobnú tejto aktivite R- a racemického DEO.

Funkčná charakterizácia antimuskarinovej/antispastickej aktivity

Účinky R-, S- a RS-oxybutynínu (OXY) a R-, S- a RS-DEO sa študovali na in vitro modeli funkcie močového mechúra. Ako je nižšie opísané, izolované vzorky hladkého svalu močového mechúra morčaťa sa uložili do tkanivového kúpeľa a nechali sa stiahnuť buď muskarinovým antagonistom karbacholom alebo stúpajúcimi koncentráciami vonkajšieho draslíka.

Vzorky zo steny močového mechúra

Pokusy sa uskutočnili použitím metód podobných tým, ktoré opísali Kachur a spol., 1988 a Noronha-Blob a Kachur, 1991. Zo steny močového mechúra samčích morčiat Hartley s hmotnosťou 400 až 600 g (Elm Hill Breeding Laboratories, Chelmsford, MA) sa odobrali vzorky tkaniva (približne 10 mm dlhé a 1,5 mm široké). Tkanivá sa suspendovali v okysličenom pufre nasledujúceho zloženia: 133 mM NaCl, 4,7 mM KC1, 2,5 mM CaC12, 0,6 mM MgSOí,

1,3 mM NaH2PO4, 16,3 mM NaHCO3 a 7,7 mM glukózy. Udržovali sa pri 37,5 °C. Kontrakcie sa zaznamenávali izometrickými transduktormi (Model FT-10) a atramentovým zapisovacím polygrafom (Model 7) (Astro-Med., ľne., Grass Inštrument Div., West Warwick, RI) . Na všetkých tkanivách sa trvalo udržovalo kludové napätie 0,5 gramov.

Pri každom pokuse sa odoberalo až sedem vzoriek z jediného močového mechúra, tieto sa suspendovali v jednotlivých tkanivových komorách a nechali sa ustáliť do rovnovážneho stavu s kúpeľom počas jednej hodiny pred spracovaním podľa vynálezu.

Karbacholom vyvolané kontrakcie

Jedna séria pokusov sa zamerala na anticholinergné účinky oxybutynínu. Pri týchto pokusoch boli, aby sa stanovila schopnosť samostatnej existencie každého tkaniva a aby to slúžilo ako rámec referencií, kontrakcie každej vzorky tkaniva zaznamenávané najskôr v odpovedi na vystavenie tkanivovému médiu, v ktorom NaCl bolo nahradené KC1 tak, aby sa dosiahla koncentrácia 137,7 mM KC1 v médiu. Potom nasledoval návrat do štandardného média a potom vystavenie progresívne stúpajúcim koncentráciám karbacholu s oddelenými expozíciami každej koncentrácie, až sa dosiahla maximálna odpoveď. Potom sa ponechala jedna vzorka bez spracovania alebo/a jedna vzorka sa exponovala 17 mM etanolu, aby slúžila ako kontrolne tkanivo (tkanivá), pričom každá zo zostávajúcich vzoriek sa exponovala počas jednej hodiny jednou koncentráciou antagonistu. Použili sa etanolové kontroly, pretože vzhľadom na malú rozpustnosť sa museli zásobné roztoky testovaných látok pripraviť v etanole, následkom čoho mali tkanivové kúpele účinnú koncentráciu 17 mM. Nakoniec sa druhý krát zaznamenávali odpovede na stúpajúcu koncentráciu karbacholu, ktorá nasledovala pôsobenie 137,7 mM KC1.

Draslíkom vyvolaná kontrakcia

Druhá séria pokusov sa zamerala na spazmolytické pôsobenie študovaných látok. Zaznamenali sa kontrakcie v odpovedi na postupne sa zvyšujúce koncentrácie draslíka v médiu.

Analýza údajov

Na stanovenie, či antagonisty znížili maximálnu odpoveď na agonisty, bolo maximálne napätie, vyvinuté každou vzorkou počas druhej sady stanovení, vyjadrené ako percento maximálneho napätia vyvinutého počas prvého stanovenia účinku koncentrácie. Potom sa analyzovali pre každého antagonistu výsledné údaje na zistenie rozdielov súvisiacich so spracovaním jednocestnou analýzou rozptylu (ANOVA). Pretože na každej vzorke z močového mechúra sa študovala len jedna koncentrácia antagonistu, použili sa postupy podľa Arunlakshana a Shilda (1959) v modifikovanej forme na stanovenie pA2 a sklonu Shildovej regresie. Najprv sa stanovili koncentrácie agonistu produkujúce polomaximánu odpoveď (EC50) pre každú vzorku z druhej sady údajov o účinku koncentrácie. EC50 sa získal z lineárnych regresných čiar zodpovedajúcich logaritmu koncentrácie liečiva a odpovediam vymedzujúcim polomaximálnu hladinu odpovede. Pre každú vzorku spracovanú liečivom sa vypočítal „koncentračný pomer (CR) ako pomer EC50 spracovaného tkaniva delený EC50 nespracovaného tkaniva. Pre každý pokus, pri ktorom sa vystavili dva alebo viac vzoriek pôsobeniu tej istej chemikálie, ale s rozdielnou koncentráciou, bol logaritmus tohto pomeru mínus jedna (t.j. log(CR-l)) vynesený oproti logaritmu koncentrácie antagonistu, ktorého pôsobeniu bola vzorka vystavená, aby sa vytvorili Schieldove grafy. Na vytvorenie pA2 a sklonu regresnej čiary sa použila regresná analýza vzťahujúca log(CR-l) k logaritmu koncentrácie antagonistu. Nakoniec sa pokusy zoradili podľa chemikálie a vypočítal sa priemer ± štandardná chyba pA2 a sklonu. 95 %-ný interval spoľahlivosti (CL) sklonu sa vypočítal z jeho štandardnej chyby použitím štandardných metód. Z pokusov, pri ktorých sa pôsobeniu danej chemikálie vystavila len jedna vzorka, sa vypočítalo pKD ako (koncentrácia antagonistu)/(CR-1) a negatívny logaritmus KD potom sa spojil s hodnotami pA2, čím sa získala rozšírená sada hodnôt pA2.

Účinky racemického oxybutynínu a DEO a ich príslušných enantiomérov na karbacholom vyvolanú kontrakciu sú zhrnuté v ďalej uvedenej tabuľke 9. Uvedené hodnoty predstavujú súhrn Schieldových analýz, ktorý dáva hodnoty pA2 (priemer ± SE) a sklon (priemer ± SE) .

Tabuľka 9

Antagonista	Číslo pokusu	pA2	Sklon
R-OXY	4	8,80 ± 0,27	1,28 ± 0,26
S-OXY	4	7,09 ± 0,13	1,13 ± 0,17
RS-OXY	4	8,81 ± 0,29	1,34 ± 0,15
R-DEO	4	9,04 ± 0,32	1,16 ± 0,11
S-DEO	4	7,31 ± 0,35	0,87 ± 0,11
RS-DEO	4	8,55 ± 0,32	1,35 ± 0,25

Tieto výsledky naznačujú, že ako S-OXY, tak S-DEO sú menej účinné antagonisty muskarinových receptorov močového mechúra ako R- a racemický OXY a R- a racemický DEO.

Účinky racemického oxybutyninu a jeho enantiomérov na vápnikom vyvolanú kontrakciu sú zhrnuté nižšie v tabuľke 10. (Uvedené hodnoty znamenajú veľkosť kontrakcie vyvolanej 137,7 mM K⁺ po 60 minútach pôsobenia zlúčeniny delené veľkosťou kontrakcie vyvolanej pred vystavením účinku liečiva).

Tabuľka 10

Antagonista	Stredné % predbežného spracovania ± štandardná chyba (n=3)
R-OXY	32 ± 8 *
S-OXY	26 ± 9 *
RS-OXY	20 ± 1 *
R-DEO	36 ± 5 *
S-DEO	42 ± 5 *
RS-DEO	47 ± 8 *

* významne odlišné od zodpovedajúcej hodnoty nespracovaných tkanív (p < 0,01)

Tieto výsledky naznačujú, že oxybutynin a jeho enantioméry a deetyloxybutynín a jeho enantioméry sú rovnako účinné ako spazmolytiká hladkého svalstva močového mechúra.

Zatiaľ čo je dobre známe, že normálne vyprázdňovanie močového mechúra sa ovláda cholinergnými mechanizmami, nestabilita močového mechúra, ktorá sa môže pozorovať u pacientov trpiacich inkontinenciou, sa zdá, že súvisí s necholinergnými kontrakciami močového mechúra. Anderson a spol. (Neurourol Urodyn 5, 579 až 586 (1986)) ukázali na zvieratách, že vypudzovač, ktorý je odolný voči’ atropínu, je veľmi senzitívny na antagonisty vápnika.

Štúdie receptorových väzbových afinít (R)- a (S)-oxybutyninu na receptorové miesta blokátorov vápnikových kanálikov diltiazem a verapamil, opísané vyššie, umožňujú prísť k záveru, že S-oxybutynín a (S)-deetyloxybutynín majú terapeutické účinky na mimovoľné močenie, zatiaľ čo (na rozdiel od R-izomérov a racemátov) majú veľmi malý účinok na normálny vyprázdňovací mechanizmus. Ako S-OXY, tak S-DEO tiež majú významne nižšie anticholinergné vedľajšie účinky v porovnaní zo zodpovedajúcim R-izomérom a racemátom. Vyvarovanie sa kardiovaskulárnych vedľajších účinkov, ktoré vznikajú anticholinergným účinkom racemického oxybutyninu, je obzvlášť významné. Môže sa urobiť záver, že S-oxybutynín a S-deetyloxybutynín sú účinné liečivá na liečbu močovej inkontinencie ľudí, s výrazne zníženými vedľajšími účinkami oproti racemátu alebo čistým R-enantiomérom.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Orálny prípravok

Tobolky:

Zloženie	Množstvo	na tobolku v mg v
	A	B	C
S-DEO	50	100	200
laktóza	230	280	330
kukuričný škrob	65	65	65
stearát horečnatý	5	5	5
hmotnosť	350	450	600

S-DEO, laktóza a kukuričný škrob sa miešajú až do homogenity a potom sa do výsledného prášku primieša stearát horečnatý, prášok sa preoseje a naplní zvyčajným zariadením do dvojdielnych tvrdých želatínových toboliek s vhodnou veľkosťou. Iné dávky sa môžu pripraviť zmenou hmotnosti náplne a prípadne zmenou veľkosti toboliek tak, aby vyhovovali.

Pretože najmenej jedna kryštalická forma zlúčenín podľa vynálezu je ihlicovitá, je žiaduce rozomlieť alebo granulovať aktívnu ingredenciu, aby sa dosiahol voľne tečúci prášok na tabletovanie alebo enkapsuláciu, keď sa použijú techniky so suchým práškom.

Príklad 2

Orálny prípravok

Tablety:

Zloženie	Množstvo na	tabletu v mg
	A	B	C
S-OXY	50	100	200
laktóza	205	245	245
kukuričný škrob	30	50	50
voda (na 1000 tabliet)*	300 ml	500 ml	500 ml
kukuričný škrob	60	100	100
stearát horečnatý	5	5	5
hmotnosť	350	500	600

* voda sa odparuje počas výroby

S-OXY sa mieša s laktózou, až sa vytvorí homogénna zmes. Menšie množstvo kukuričného škrobu sa mieša s vodou na výslednú pastu kukuričného škrobu. Táto sa potom mieša s homogénnou zmesou, až sa vytvorí homogénna vlhká hmota. K výslednej vlhkej hmote sa pridá zostávajúci kukuričný škrob a mieša sa až sa získajú homogénne granule. Granule sa potom vytriedia vo vhodnom mlecom stroji použitím sita z nehrdzavejúcej ocele s veľkosťou ôk 0,635 cm. Rozomleté granule sa sušia vo vhodnej sušiarni až sa dosiahne požadovaný obsah vlhkosti. Vysušené granule sa potom melú vo vhodnom mlecom zariadení, pridá sa stearát horečnatý a výsledná zmes sa vylisuje do tabliet žiadaného tvaru, hrúbky a dezintegrácie. Tablety s inými koncentráciami sa môžu pripraviť zmenou pomeru aktívnych ingredencií k pomocným látkam alebo ku konečnej hmotnosti tablety..

Claims

1. (S)-oxybutynin, (S) -deetyloxybutynin alebo ich farmaceutický prijateľná soľ, v podstate bez svojho R enantioméru na použitie na liečenie močovej inkontinencie s vyvarovanim sa súčasnej náchylnosti na nepriaznivé účinky, u cicavca, ktorý potrebuje túto liečbu, v množstve od asi 100 mg do asi 1 g za deň.

2. (S)-oxybutynin, (S)-deetyloxybutynin alebo ich farmaceutický prijateľná soľ podľa nároku 1, na použitie na liečenie močovej inkontinencie s vyvarovanim sa súčasnej náchylnosti na nepriaznivé účinky, u cicavca, ktorý potrebuje túto liečbu, v množstve od asi 240 mg do asi 750 mg za deň.

3. (S)-oxybutynin, (S)-deetyloxybutynin alebo ich farmaceutický prijateľná soľ podľa nároku 2, na použitie na liečenie močovej inkontinencie s vyvarovanim sa súčasnej náchylnosti na nepriaznivé účinky, u cicavca, ktorý potrebuje túto liečbu, v množstve od asi 300 mg do asi 600 mg za deň.

4. (S)-oxybutynin, (S)-deetyloxybutynin alebo ich farmaceutický prijateľná soľ podľa nároku 1, na použitie na liečenie močovej inkontinencie s vyvarovanim sa súčasnej náchylnosti na nepriaznivé účinky, parenterálne, transdermálne, rektálne, orálne alebo inhaláciou.

5. (S)-oxybutynin, (S)-deetyloxybutynin alebo ich farmaceutický prijateľná soľ podľa nároku 4, na použitie na liečenie močovej inkontinencie s vyvarovanim sa súčasnej náchylnosti na nepriaznivé účinky, orálne alebo transdermálne.

6. Farmaceutická forma dávkovacej jednotky v podobe tablety alebo mäkkej, elastickej želatínovej tobolky, vyznačujúca sa tým, že obsahuje farmaceutický prijateľný nosič a 0,1 až 500 mg jednej zlúčeniny zo skupiny pozostávajúcej z (S)-oxybutynínu, (S)-deetyloxybutynínu alebo z ich farmaceutický prijateľnej soli, v podstate bez jej (R) enantioméru.

7. Farmaceutická forma dávkovacej jednotky podľa nároku 6, vyznačujúca sa tým, že (S)-oxybutynín, (S)-deetyloxybutynin alebo ich farmaceutický prijateľná soľ je prítomná v množstve asi od 25 mg asi do 250 mg.

8. Farmaceutická forma dávkovacej jednotky podlá nároku 7 vyznačujúca sa tým, že (S)-oxybutynín, (S)-deetyloxybutynin alebo ich farmaceutický prijateľná soľ je prítomná v množstve asi od 100 mg asi do 200 mg.

9. Farmaceutická dávkovacia forma v podobe transdermálnej liekovej formy, vyznačujúca sa tým, že obsahuje farmaceutický prijateľný nosič a asi od 100 mg asi do 500 mg jednej zlúčeniny zo skupiny pozostávajúcej z (S)-oxybutynínu, (S)-deetyloxybutynínu alebo z ich farmaceutický prijateľnej soli, v podstate bez jej (R)enantioméru.

10. Farmaceutická dávkovacia forma podľa nároku 9, vyznačujúca sa tým, že farmaceutický prijateľný nosič obsahuje prostriedok zvyšujúci permeáciu.