SK14699A3 - Antithrombotic azacycloalkylalkanoyl peptides and pseudopeptides - Google Patents

Description

Tento vynález sa týka nehygroskopickej stabilnej kryštalickej formy N-[N-[N-(4piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu všeobecného vzorca I.

Táto zlúčenina vykazuje antitrombotické pôsobenie vrátane inhibície agregácie krvných doštičiek a vytvárania trombov u cicavcov a je použiteľná pri prevencii a liečbe trombózy spojenej s chorobnými stavmi, ako sú infarkt myokardu, mŕtvica, periférne arteriáine ochorenie a diseminovaná intravaskuláma koagulácia.

Navyše sa tento vynález týka spôsobu prípravy kryštalickej formy N-[N-[N-(4piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu, jeho farmaceutických prostriedkov a medziproduktov.

Navyše sa tento vynález týka medziproduktov použiteľných na prípravu tetraazacykloalkylalkanoylových peptidových alebo pseudopeptidových zlúčenín.

Hemostáza, biochémia zrážania krvi, je mimoriadne zložitý jav, pri ktorom normálna celková krv a telesné tkanivo spontánne zastavuje krvácanie z poranených ciev. Účinná hemostáza vyžaduje spoločné pôsobenie cievnych, doštičkových a plazmatických faktorov, rovnako tak, ako kontrolných mechanizmov, brániacich

V-15/99/Tä-I 20.4.2000 nadmernému zrážaniu. Chyby, nedostatočné množstvo alebo nadmerné množstvo ktorejkoľvek z týchto zložiek, môžu viesť k hemoragickým alebo trombotickým následkom.

Adhézia doštičiek, rozprestieranie a agregácia na extracelulámych matriciach sú ústredné deje pri vytváraní trombu. Tieto deje sa sprostredkúvajú skupinou adhezívnych glykoproteínov, to znamená fibrinogénu, fibronektínu a von Willebrandovho faktora. Fibrinogén je kofaktorom agregácie doštičiek, zatiaľ čo fibronektín podporuje pripojenie doštičiek a rozprestieranie a von Willebrandov faktor je dôležitý pri pripájaní doštičiek a ich rozprestieraní na subendotelových matriciach. Miesta väzby pre fibrinogén, fibronektín a von Willebrandov faktor, sú na bielkovinovom komplexe membrány doštičiek známom ako glykoproteín llb/IIla.

Adhezívne glykoproteíny, ako je fibrinogén, sa neviažu na normálne doštičky v stave pokoja. Avšak len čo sa doštička aktivuje agonistom, ako je trombín alebo adenozíndifosfát, doštička mení svoj tvar, a tým pravdepodobne sprístupňuje väzbové miesto GPIIb/llIa pre fibrinogén. Zlúčenina, ktorá je predmetom tohto vynálezu, blokuje fibrinogénový receptor, a preto vykazuje vyššie opísanú antitrombotickú účinnosť.

Táto prihláška je čiastočným pokračovaním súčasne prejednávanej US prihlášky č. 08/476 750 registrovanej 7. júna 1995, ktorá je pokračovaním prihlášky súčasne prejednávanej US prihlášky č. 08/628 648 registrovanej 17. októbra 1994, ktorá je čiastočným pokračovaním súčasne prejednávanej prihlášky US prihlášky č. 08/138 820 registrovanej 15. októbra 1993, od ktorej sa teraz upúšťa.

Doterajší stav techniky

Bolo pozorované, že prítomnosť Arg-Gly-Asp (RGD) je nevyhnutná pre fibrinogén, fibronektín a von Willebrandov faktor pri ich interakcii s receptorom bunkového povrchu [E. Ruoslahti, Pierschbacher, Celí, 44, 517-518 (1986)]. Zdá sa, že funkcie fibrinogénu pri pripájaní doštičiek sa taktiež zúčastňujú ďalšie dve aminokyselinové sekvencie, menovite sekvencia Gly-Pro-Arg a dodekapeptidová

V-15/99/Tš-I 20.4.2000 sekvencia His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-GIn-Ala-Gly-Asp-Val. Ukázalo sa, že krátke syntetické peptidy, obsahujúce RGD alebo dodekapeptid, viažu doštičkový receptor GPIIb/llla a inhibujú kompetitívne väzbu fibrinogénu, fibronektínu a von Willebrandovho faktora a rovnako inhibujú agregáciu aktivovaných doštičiek [Plow a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 8057-8061 (1985), Ruggeri a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 5708-5712 (1986), Ginsberg a kol., J. Biol. Chem., 260. 3931-3936 (1985) a Gartner a kol., J. Biol. Chem., 260.11, 891-894 (1987)].

Tjoeng a kol. opisujú v US patentoch č. 5 037 808 a 4 879 313, že indolylové zlúčeniny obsahujúce guanidinoalkanoylové a guanidinoalkenoyl-aspartylové zvyšky, sú inhibítory agregácie doštičiek.

US patent č. 4 992 463 (Tjoeng a kol.), vydaný 12. februára 1991, zverejňuje genericky, že rad arylových a aralkylguanidinoalkylových peptidových mimetických zlúčenín vykazuje inhibíciu agregácie doštičiek a uverejňuje špecificky rad mono- a dimetoxyfenylových peptidových mimetických zlúčenín a bifenylalkylových peptidových mimetických zlúčenín.

US patent č. 4 857 508 (Adams a kol.), vydaný 15. augusta 1989, uverejňuje genericky, že rad guanidinoalkylových peptidových derivátov obsahujúcich terminálne aralkylové substituenty vykazuje inhibíciu agregácie doštičiek, a tento patent špecificky uverejňuje rad O-metyltyrozínových, bifenylových a naftylových derivátov, obsahujúcich terminálnu amidovú funkčnú skupinu.

D. M. Haverstick a kol. opisujú v Blood 66 (4), 946-952 (1985), že rad syntetických peptidov, vrátane arg-gly-asp-ser a gly-arg-gly-asp-ser, je schopný inhibície agregácie doštičiek indukovanej trombínom.

E. F. Plow a kol. uvádzajú v Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 3711-3715 (1982), že tetrapeptidový g^cyl-L-prolyl-L-arginyl-L-prolín inhibuje väzbu fibrinogénu na ľudské doštičky.

V-15/99/Tš-I 20.4.2000

Francúzska patentová prihláška č. 86/17507, registrovaná 15. decembra 1986 uverejňuje, že tetra-, penta- a hexapeptidové deriváty obsahujúce sekvenciu -arg-glyasp- sú použiteľné ako antitrombotické prostriedky.

US patent č. 4 683 291 (Zimmemnan a koľ), vydaný 28. júla 1987, uverejňuje, že peptidy obsahujúce šesť až štyridsať aminokyselín zahrňujúce sekvenciu -arg-glyasp- sú inhibítory väzby doštičiek.

Publikácia európskych patentových prihlášok č. 0 319 506, vydaná 7. júna 1989, uverejňuje, že niekoľko tetra-, penta- a hexapetidových derivátov obsahujúcich sekvenciu -arg-gly-asp- sú inhibítory agregácie doštičiek.

Cyklické peptidové analógy obsahujúce zvyšok Gly-Asp sa uvádzajú ako antagonisty receptorov fibrinogénu v US patente č. 5 023 233.

Peptidy a pseudopeptidy obsahujúce amínové, guanidínové, imidazoloylové a/alebo amidinoalkanoylové a alkenoylové zvyšky sa opisujú ako antitrombotické prostriedky v prejednávaných prihláškach US č. 07/677 006, 07/534 385 a 07/460 777 registrovaných 28. marca 1991, 7. júna 1990 a 4. januára 1990, rovnako tak ako v US patente č. 4 952 562 a v medzinárodnej prihláške č. PCT/US90/05448 registrovanej 25. septembra 1990, ktoré všetky patria rovnakému prihlasovateľovi ako tento vynález.

Peptidy a pseudopeptidy obsahujúce amínové, guanidinoalkylové a alkenylbenzoylové, fenylalkanoylové a fenylalkenoylové zvyšky sa opisujú ako antitrombotické prostriedky v podanej prihláške US č. 07/475 043, registrovanej 5. februára 1990 a v medzinárodnej prihláške č. PCT/US91/02471, registrovanej 11. apríla 1991, publikovanej ako medzinárodná publikácia č. WO 92/13117, vydaná 29. októbra 1992, ktoré patria rovnakému prihlasovateľovi ako tento vynález.

Alkanoylové a substituované alkanoylové a substituované alkanoylazacykloalkylformylové deriváty kyseliny asparágovej sa uvádzajú ako inhibítory agregácie doštičiek v US patente č. 5 053 392 registrovanom 1. decembra

V-l J/99/Tš-I 20.4.2000

1989, ktorý patrí rovnakému prihlasovateľovi a rovnakému vynálezcovi ako tento vynález.

N-substituované azacykloalkylkarbonylové cyklické deriváty kyseliny aminoacylasparágovej sa uvádzajú ako antitrombotiká v US patente č. 5 064 814 registrovanom 5. apríla 1990 od rovnakých vynálezcov, ktorý patrí rovnakému prihlasovateľovi ako tento vynález. Deriváty kyseliny azacykloalkylformylglycylasparágovej sa uvádzajú ako antitrombotiká v US patente č. 5 051 405 registrovanom 10. októbra 1989, ktorý patrí rovnakému prihlasovateľovi ako tento vynález.

Európska patentová prihláška, 0 479 481 publikovaná 8. apríla 1992, uverejňuje azacykloalkylalkanoylové glycylové aspartylové aminokyseliny ako antagonisty fibrinogénových receptorov.

Európska patentová prihláška 0 478 362 publikovaná 1. apríla 1992 uverejňuje azacykloalkylalkanoylové peptidylové β-alaníny ako antagonisty fibrinogénových receptorov.

Publikácia patentovej prihlášky PCT č. WO 95/10295 uverejňuje azacykloalkylalkanoylové peptidy a pseudopeptidy všeobecného vzorca II

O O O ^R -(CH^-N-fCH^C-NH-CH-C-Z _A/ B CH₂COOH najmä N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamid, ktoré inhibujú agregáciu doštičiek a vytváranie trombov u cicavcov a sú použiteľné pri prevencii a liečbe trombózy. N-[N-[N-(4-piperidin-4-yl)butanoyl)-Netylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamid, pripravený podľa publikácie patentovej prihlášky PCT č. WO 95/10295 je amorfný, hygroskopický a je fyzikálne

V-15/99/Tá-I 20.4.2000 nestabilný, pretože absorbuje vlhkosť. Publikácia patentovej prihlášky PCT č. WO 95/10295 uverejňuje nehygroskopickú stabilnú kryštalickú formu N-[N-[N-(4-piperidín4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu.

Publikácia patentovej prihlášky č. WO 95/10295 taktiež opisuje, že azacykloalkanoylové peptidy a pseudopeptidy sa všeobecne pripravia štandardným spôsobom syntézy peptidu v pevnej fáze alebo v roztoku, s použitím východiskových materiálov a/alebo priamo dostupných medziproduktov od spoločností dodávajúcich chemikálie, ako je Aldrich alebo Sigma [H. Paulsen, G. Merz, V. Weichart SolidPhase Synthesis of O-Glycopeptide Sequences, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 27 (1988), H. Mergler, R. Tanner, J. Gosteli a P. Grogg Peptide Synthesis by a Combination of Solid-Phase and Solution Methods I: A New Acid-Nestabile Anchor Group for the Solid-Phase Synthesis of Fully Protected Fragments. Tetrahedron letters, 29, 4005 (1988), Merrifield, R. B., ”Solid Phase Peptide Synthesis after 25 Years: The Design and Synthesis of Antagonists of Glucagon, Macromol. Chem. Macromol. Symp., 19. 31 (1988)]. Ďalej publikácia patentovej prihlášky PCT č. WO 95/10295 uverejňuje prihlášku amorfnej a hygroskopickej formy N-[N-[N-(4-piperidín4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu sekvenčnou syntézou C-terminálnej aminokyseliny, ako znázorňuje schéma I.

Schéma o

II

Ρ,-NH-CH-C — OH + HN

CH₂-C-OP₂ F F O

Λ}\ spojenie O E ΛΛ

SJ—CH—i_cJ—_G--►P₁-NH-CH-C — N—CH—G'

F F ^Γ ÔH₂-C-OP₂ F ^ľ í H ť

O deprotekcia -- NH₂

O F /O\ O n i f n 1 , . D

-CH-C-—N —CH—le J G' + P3-N—{CH₂j—C—OH —

CH₂-C-OP₂ F ^Γ B ^{P 2>} n * spojenie

2) deprotekcia

J? ° F M r

H-N-{CH^-C-NH-CH-C—N—-CH—\Cý— G' + R'-jB ^P CH2-C-OP2 F ^Γ z^N~

II A· o ^A o

II

-{CH₂j--C-OH η spojenie I-(?^(R^ m o deprotekcia fS r4- 1

NO

II

O

II

-(CH₂)—C— N-^CH₂^C—NH^—CH-C ^Π B ^P CH₂COOH

N— CH—^C^—-(

2)

V-15/99/Tš-I 20.4.2000

Publikácia prihlášky PCT č. WO 95/10295 neuverejňuje tvorbu tetraazacykloalkylalkanoylových peptidov a pseudopeptidov ani konkrétne N-[N-[N(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu z centrálneho di(pseudopeptidu alebo peptidu), kde N- a C-terminálne konce centrálneho di(pseudopeptidu alebo peptidu) sú obidva pripojené na pseudoaminokyseliny a/alebo aminokyseliny s vytvorením tetraazacykloalkylalkanoylových peptidov a pseudopeptidov.

Podstata vynálezu

Tento vynález sa týka nehygroskopickej stabilnej kryštalickej formy N-[N-[N-(4piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu všeobecného vzorca I.

HOH (D

Táto zlúčenina vykazuje antitrombotické pôsobenie vrátane inhibície agregácie doštičiek a vytvárania trombov u cicavcov a je použiteľná pri prevencii a liečbe trombózy spojenej s chorobnými stavmi ako je infarkt myokardu, mŕtvica, periférne arteriálne ochorenie a diseminovaná intravaskuláma koagulácia. Tento vynález sa taktiež týka farmaceutického prostriedku obsahujúceho nehygroskopickú stabilnú kryštalickú formu N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)aspartyl]-(L)-0-cyklohexylalanínamidu a medziproduktov tejto zlúčeniny.

Tento vynález sa taktiež týka spôsobu prípravy tetraazacykloalkylalkanoylpeptidových alebo pseudopeptidových zlúčenín všeobecného vzorca II v-15/99/Ts-i 20.4.2000 (II) |—

Ο

II

Ο

II ,ζ

Ν· {CH₂)—C—N-fCH₂)-C-NH-CH-C-Z B ^Ρ CH₂COOH v ktorom

A je atóm vodíka,

B je alkylová skupina, cykloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupina, arylová skupina, aralkylová skupina, alkylarylová skupina alebo alkylaralkylová skupina.

je

COG

I .CH

N \²

E¹ je atóm vodíka,

E² je bočný reťazec prirodzenej α-aminokyseliny, pripojený na uhlík a, atóm vodíka, alkylová skupina, cykloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupina, arylová skupina, substituovaná arylová skupina, aralkylová skupina, substituovaná aralkylová skupina, heterocyklylová skupina, substituovaná heterocyklylová skupina, heterocyklylalkylová skupina, substituovaná heterocyklylalkylová skupina alebo E¹ a E² spolu s atómami dusíka a uhlíka, ku ktorým sú pripojené, vytvárajú azacykloalkánový 4-, 5-, 6- alebo 7-členný kruh,

G je skupina OR¹ alebo NR¹R²,

R¹ a R² sú nezávisle od seba atóm vodíka, alkylová skupina, cykloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová

V-lJW/Tä-I 20.4.2000 skupina, arylová skupina, aralkylová skupina, alkylarylová skupina alebo alkylaralkylová skupina,

R je atóm vodíka, alkylová skupina, arylová skupina alebo aralkylová skupina, m je 1 až 5, n je 0 až 6 a p je 1 až 4 a konkrétne na prípravu nehygroskopickej stabilnej kryštalickej formy N-[N-[N-(4piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu.

Tento vynález sa týka zlúčeniny všeobecného vzorca o o E¹ E² o (VII)

P² -N— (CH₂) p—IL HN—CH —U—N-CH —C—G ⁸ CH₂CO₂P¹ v ktorom

B je alkylová skupina, cykloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupina, arylová skupina, aralkylová skupina, alkylarylová skupina alebo alkylaralkylová skupina.

E¹ je atóm vodíka,

E² je bočný reťazec prirodzenej α-aminokyseliny, pripojený na uhlík a, atóm vodíka, alkylová skupina, cykloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupina, arylová skupina, substituovaná arylová skupina, aralkylová skupina, substituovaná aralkylová skupina, heterocyklylová skupina, substituovaná heterocyklylová skupina,

V-15/99/Tä-I 20.4.2000 heterocyklylalkylová skupina, substituovaná heterocyklylalkylová skupina alebo E¹ a E² spolu s atómami dusíka a uhlíka, ku ktorým sú pripojené, vytvárajú azacykloalkánový 4-, 5-, 6- alebo 7-členný kruh,

G je skupina OR¹ alebo NR¹R²,

R¹ a R² sú nezávisle od seba atóm vodíka, alkylová skupina, cykloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupina, arylová skupina, aralkylová skupina, alkylarylová skupina alebo alkylaralkylová skupina, p je 1 až 4,

P¹ je skupina chrániaca kyselinu nestabilnú pri hydrogenácii a

P² je P² alebo TFA«H- a

P² je skupina chrániaca amín nestabilný v kyslom prostredí.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 predstavuje záznam rôntgenovej práškovej difrakcie vzorky nehygroskopickej kryštalickej formy N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl](L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu, pripraveného v príklade 13, spôsob A.

Obr. 2 predstavuje záznam rôntgenovej práškovej difrakcie vzorky nehygroskopickej kryštalickej formy N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl](L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu, pripravenej v príklade 13, spôsob B(a).

Obr. 3 predstavuje záznam rôntgenovej práškovej difrakcie vzorky nehygroskopickej kryštalickej formy N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl](L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu, pripraveného v príklade 13, spôsob B(b).

V-15/99/TS-I 20.4.2000

Obr. 4 predstavuje záznam rôntgenovej práškovej difrakcie vzorky hygroskopickej kryštalickej formy N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu, pripraveného podľa opisu v príklade 14.

Obr. 5 predstavuje záznam rôntgenovej práškovej difrakcie vzorky nehygroskopickej kryštalickej formy N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycylj(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu, pripraveného podľa opisu v príklade 14.

Obr. 6 predstavuje izotermický mikrokalorimetrický záznam tepelného výkonu ako funkcie času pre tri rôzne pokusy, uskutočnené podľa opisu v pokuse 15. Pokusy sledujú tepelnú aktivitu rôznych kryštalických foriem N-[N-[N-(4-piperidín-4yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu pri expozícii rôznych pár rozpúšťadiel. Stopa (A) na obr. 6 ukazuje, že pri expozícii hygroskopického N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-3cyklohexylalanínamidu, pripraveného podľa príkladu 5 až 11, pri 80 % relatívnej vlhkosti (nasýtený roztok chloridu draselného) pri teplote 40 °C počas 30 h dochádza k silnému exotermickému deju, pri ktorom sa hygroskopická forma zlúčeniny prevádza na jej nehygroskopickú formu. Stopa (B) na obr. 6 ukazuje, že neprichádza k žiadnemu exotermickému konverznému deju pri expozícii hygroskopického N-[N-[N(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(Ľ)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu_I pripraveného podľa príkladu 5 až 11 parám metanolu pri 40 °C (iného rozpúšťadla ako je voda, v ktorom je táto zlúčenina rozpustná), a že teda metanol nepodporuje mobilitu v rámci kryštálov, umožňujúcu prevedenie na nehygroskopickú formu. Stopa (C) na obr. 6 ukazuje, že nenastáva žiadna exotermická konverzia pri expozícii nehygroskopického N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)β-cyklohexylalanínamidu, pripraveného podľa príkladu 13 pri 80 % relatívnej vlhkosti a 40 °C, takže nehygroskopická forma tejto zlúčeniny sa nepodrobuje pri týchto podmienkach konverzii, to znamená, že je stabilnou formou.

Obr. 7 znázorňuje izotermický mikrokalorimetrický zápis tepelného výkonu ako funkcie času pre tri rôzne pokusy, uskutočnené podľa opisu v pokuse 15. Pokusy sledujú tepelnú aktivitu konverzie hygroskopickej kryštalickej formy N-[N-[N-(4piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)43-cyklohexylalanínamidu na

V-15/99/Tä-I 20.4.2000 jeho nehygroskopickú formu pri expozícii 80 % relatívnej vlhkosti pri teplote 40 °C, 50 °C a 60 °C. Tento obrázok ukazuje, že konverzia prebieha zhruba počas 24 h pri teplote 40 °C, 6,5 h pri teplote 50 °C a 3 h pri teplote 60 °C.

Obr. 8 predstavuje izotermický mikrokalorimetrický graf tepelného výkonu ako funkciu času pre štyri rôzne pokusy uskutočnené podľa opisu pokusu 15. Pokusy sledujú tepelnú aktivitu konverzie hygroskopickej kryštalickej formy N-[N-[N-(4piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu, na jeho nehygroskopickú formu pri expozícii 65 % relatívnej vlhkosti, 75 % relatívnej vlhkosti, 80 % relatívnej vlhkosti a 100 % relatívnej vlhkosti pri teplote 60 °C. Významným rysom obr. 8 je, že vyššia relatívna vlhkosť poskytuje rýchlejšiu konverziu. Ďalším významným rysom je, že konverzia na nehygroskopickú formu tejto zlúčeniny nastáva pri 100 % relatívnej vlhkosti a teplote 60 °C bez prechodu na kvapalnú fázu, ktorý nastáva pri hygroskopickej forme pri teplote miestnosti. Na základe týchto výsledkov sa očakáva, že konverzia nehygroskopickej formy je oveľa rýchlejšia ako prechod hygroskopickej formy na kvapalnú fázu pri 60 °C.

Obr. 9 predstavuje porovnanie percentuálnych hmotnostných prírastkov v porovnaní k percentuálnej relatívnej vlhkosti, zaznamenaných pre hygroskopickú () a nehygroskopickú (·) formu N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu, pri 25 °C pri procese prebiehajúcom podľa opisu v pokuse 16. Obr. 9 znázorňuje, že hygroskopická forma zachytáva viac vody ako nehygroskopická forma s vzrastajúcou relatívnou vlhkosťou a s výraznejším účinkom pri relatívnej vlhkosti presahujúcej 60 %. Ďalej obr. 9 znázorňuje, že pri hygroskopickej forme zlúčeniny nedochádza k desorbcii na jej pôvodné hmotnostné percento, zatiaľ čo pri nehygroskopickej forme zlúčeniny k takejto desorbcii prichádza.

Nasleduje podrobný opis vynálezu.

Nasledujúce pojmy tak, ako sú použité vyššie i v celom texte tohto vynálezu, majú nasledujúci význam, pokiaľ nie je uvedené inak.

V-15/99/Tš-I 20.4.2000

Nasledujúce skratky, ktoré sa tu používajú, zahŕňajú:

BOC (ŕerc-butyloxykarbonyl), CBZ (benzyloxykarbonyl), Gly (glycín), Asp (kyselina asparágová), OBzl (benzyloxy), TFA (kyselina trifluóroctová), Cha (βcyklohexylalanín), EtOAc (etylacetát), DMF (dimetylfluóramid), DCC (dicyklohexylkarbodiimid), HOBT (hydroxybenzotriazol), TBTU (2-1H-benzotriazol-1yl)-1,1,3,3-tetrametylurónium-tetrafluórborát), Dl (deionizovaná voda), PNP (pnitrofenol), PFP (pentafluórfenol), DCU (dicyklohexylmočovina), NMM (Nmetylmorfolín), MTBE (metyl-ŕerc-butylester), RH (relatívna vlhkosť), THF (tetrahydrofurán), PipBu (kyselina 4-piperidínmaslová) a PipBuen [kyselina (4piperidín)butylidénylkarboxylová] je zlúčenina vzorca

NH co₂h

Pojem “pacient” zahŕňa človeka aj iné cicavce.

“Farmaceutický prijateľná soľ “ znamená formu soli materskej zlúčeniny všeobecného vzorca I, ktorá je pre pacienta pomerne neškodná, ak sa podáva v terapeutických dávkach, takže prospešné farmaceutické vlastnosti materskej zlúčeniny I nie sú narušené vedľajšími účinkami, ktoré by sa dali pripísať prítomnosti iónu tejto formy soli. Farmaceutický prijateľná soľ taktiež zahŕňa obojaký ión alebo vnútornú soľ zlúčeniny všeobecného vzorca I.

“Alkylová skupina” znamená nasýtenú alifatickú uhľovodíkovú skupinu, ktorá môže byť priama alebo rozvetvená a môže mať približne 1 až 20 atómov uhlíka v reťazci. Rozvetvená znamená, že sa k lineárnemu alkylovému reťazcu pripája nižšia alkylová skupina, ako je metylová skupina, etylová skupina alebo propylová skupina. Preferovanými priamymi alebo rozvetvenými alkylovými skupinami sú “nižšie alkylové skupiny, čo sú alkylové skupiny majúce od 1 do približne 10 atómov uhlíka. Najpreferovanejšie nižšie alkylové skupiny majú od 1 do približne 6 atómov uhlíka.

V-15/99/Tí-I 20.4.2000 “Cykloalkylová skupina” znamená nasýtenú karbocyklickú skupinu majúcu jeden alebo viacej kruhov a približne 3 až približne 10 atómov uhlíka. Preferované cykloalkylové skupiny zahŕňajú cyklopropylovú skupinu, cyklobutylovú skupinu, cyklopentylovú skupinu, cyklohexylovú skupinu, cykloheptylovú skupinu a dekahydronaftylovú skupinu.

“Cykloalkylalkylová skupina” znamená alkylovú skupinu substituovanú cykioalkylovou skupinou. Preferované cykloalkylové skupiny zahŕňajú cyklopentylmetylovú skupinu, cyklohexylmetylovú skupinu, cyklohexyletylovú skupinu, dekahydronaft-1-ylmetylovú skupinu a dekahydronaft-2-ylmetylovú skupinu.

“Alkylcykloalkylová skupina” znamená cykloalkylovú skupinu substituovanú alkylovou skupinou. Príklady alkylcykloalkylových skupín zahŕňajú 1-, 2-, 3- alebo 4metyl alebo etyl-cyklohexylovú skupinu.

“Alkylcykloalkylalkylová skupina” znamená alkylovú skupinu substituovanú alkylcykloalkylovou skupinou. Príklady alkylcykloaikylalkylových skupín zahŕňajú 1-, 2-, 3- alebo 4-metyl alebo etylcyklohexylmetylovú skupinu alebo zahŕňajú 1-, 2-, 3alebo 4-metyl alebo etylcyklohexylovú skupinu.

“Azacykloalkán znamená nasýtený alifatický kruh obsahujúci atóm dusíka. Preferované azacykloalkány zahŕňajú pyrolidín a piperidín.

“Prírodné α-aminokyseliny” znamenajú glycín, alanín, valín, leucín, izoleucín, serín, treonín, fenylalanín, tyrozín, tryptofán, cysteín, metionín, prolín, hydroxyprolín, kyselinu asparágovú, asparagín, glutamín, kyselinu glutámovú, histidín, arginín, ornitín a lyzín.

“α-uhlíkový bočný reťazec prírodných α-aminokyselín” znamená zvyšok, ktorý substituuje α-uhlík prírodnej a-aminokyseliny. Príklady α-uhlíkových bočných reťazcov prírodných α-aminokyselín zahŕňajú izopropylovú skupinu, metylovú skupinu a karboxymetylovú skupinu pre valín, alanín, respektíve kyselinu asparágovú.

V-15/99/TS-I 20.4.2000

Termín “skupina chrániaca amín” znamená ľahko odstrániteľnú skupinu, o ktorej je v odbore známe, že chráni aminokyselinu proti nežiaducim reakciám počas syntézy, a ktorú je možné selektívne odstrániť. Použitie skupiny chrániacej amín je v odbore dobre známe na ochranu skupín proti nežiaducim reakciám počas syntézy a veľa z týchto chrániacich skupín je známych napríklad z monografie T. H. Greene a P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. vydanie, John Wiley & Sons, New York (1991), ktoré sú sem zahnuté formou odkazu. Preferované skupiny chrániace amín sú acylová skupina vrátane formylovej skupiny, acetylové skupiny, chlóracetylové skupiny, trichlóracetylové skupiny, o-nitorfenylacetylové skupiny, onitrofenoxyacetylové skupiny, trifluóracetylové skupiny, acetoacetylové skupiny, 4chlórbutyrylové skupiny, izobutyrylové skupiny, o-nitrocinamoylové skupiny, pikolinoylové skupiny, acylizotiokyanátové skupiny, aminokaproylové skupiny, benzoylové skupiny a podobne a acyloxyskupina vrátane metoxykarbonylovej skupiny, 9-fluórenylmetoxykarbonylovej skupiny, 2,2,2-trifluóretoxykarbonylovej skupiny, 2-trimetylsilyletoxykarbonylovej skupiny, vinyloxykarbonylovej skupiny, alyloxykarbonylovej skupiny, ŕerc-butyloxykarbonylovej skupiny (BOC), 1,1dimetylpropinyloxykarbonylovej skupiny, benzyloxykarbonylovej skupiny (CBZ), pnitrobenzyloxykarbonylovej skupiny, 2,4-dichlórbenzyloxykarbonylovej skupiny a podobne.

Pojem “skupina chrániaca amín nestabilný v kyslom prostredí znamená skupinu chrániacu amín, ako je definované vyššie, ktorú je možné ľahko odstrániť spracovaním kyselinou, avšak voči iným činidlám zostáva relatívne stabilná. Preferovanou skupinou chrániacou amín nestabilný v kyslom prostredí je tercbutoxykarbonyl (BOC).

Pojem “skupina chrániaca amín nestabilný pri hydrogenácii” znamená skupinu chrániacu amín, ako je definované vyššie, ktorú je možné ľahko odstrániť hydrogenáciou a pritom je relatívne stabilná voči iným činidlám. Preferovanou skupinou chrániacou amín nestabilný pri hydrogenácii je benzyloxykarbonylová skupina (CBZ).

V-15/99/Tš-I 20.4.2000

Pojem “skupina chrániaca kyselinu znamená ľahko odstrániteľnú skupinu, o ktorej je v odbore známe, že chráni karboxylovú skupinu (-CO₂H) proti nežiaducim reakciám v priebehu syntézy a ktorú je možné selektívne odstrániť. Použitie skupín chrániacich karboxylovú skupinu je v odbore dobre známe a sú známe mnohé takéto chrániace skupiny uvedené napríklad v T. H. Greene a P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. vydanie, John Wiley & Sons, New York (1991), ktoré sú tu zahrnuté formou odkazu. Príklady skupín chrániacich karboxylovú kyselinu zahŕňajú estery, ako sú metoxymetylester, metyltiometylester, tetrahydropyranylester, benzyloxymetylester, substituovaný a nesubstituovaný fenacylester, 2,2,2trichlóretylester, ŕerc-butylester, cinamylester, substituovaný a nesubstituovaný benzylester, trimetylsilylester a podobne a amidy a hydrazidy vrátane N,Ndimetylamidu, 7-nitroindolylamidu, hydrazidu, N-fenylhydrazidu a podobne.

Termín “skupina chrániaca kyselinu nestabilnú pri hydrogenácii” znamená skupinu chrániacu kyselinu, ako je definované vyššie, ktorú je možné odstrániť hydrogenáciou a pritom zostáva relatívne stabilná pri pôsobení iných činidiel. Preferovanou skupinou chrániacou kyselinu nestabilnú pri hydrogenácii je benzylová skupina.

“Arylová skupina” znamená fenylovú skupinu alebo naftylovú skupinu.

“Substituovaná arylová skupina” znamená fenylovú skupinu alebo naftylovú skupinu, substituovanú jedným alebo viacerými substituentami arylovej skupiny, ktoré môžu byť rovnaké alebo odlišné, kde “substituent arylovej skupiny” zahŕňa alkylovú skupinu, alkenylovú skupinu, alkinylovú skupinu, arylovú skupinu, aralkylovú skupinu, hydroxylovú skupinu, alkoxyskupinu, aryloxyskupinu, aralkoxyskupinu, hydroxyalkylovú skupinu, acylovú skupinu, formylovú skupinu, karboxyskupinu, alkenoylovú skupinu, aroylovú skupinu, atóm halogénu, nitroskupinu, trihalometylovú skupinu, kyanoskupinu, alkoxykarbonylovú skupinu, aryloxykarbonylovú skupinu, aralkoxykarbonylovú skupinu, acylaminoskupinu, aroylaminoskupinu, karbamoylovú skupinu, alkylkarbamoylovú skupinu, dialkylkarbamoylovú skupinu, arylkarbamoylovú skupinu, aralkylkarbamoylovú skupinu, alkylsulfonylovú skupinu, alkylsulfinylovú skupinu, arylsulfonylovú skupinu, arylsulfinylovú skupinu, aralkylsulfonylovú skupinu,

V-15/99/TŠ-I 20.4.2000 aralkylsulfmylovú skupinu alebo skupinu -NR_aRb, kde R_a a R_b sú nezávisle od seba atóm vodíka, alkylová skupina, arylová skupina alebo aralkylová skupina.

“Aralkylová skupina” znamená alkylovú skupinu substituovanú arylovým radikálom. Preferované aralkylové skupiny zahŕňajú benzylovú skupinu, naft-1ylmetylovú skupinu, naft-2-ylmetylovú skupinu a fenetylovú skupinu.

Substituovaná aralkylová skupina” znamená aralkylovú skupinu substituovanú na arylovej časti jedným alebo viacerými substituentami arylovej skupiny.

“Heterocyklylová skupina znamená 4- až 15-členný monocyklický alebo multicyklický kruhový systém, v ktorom jeden alebo viacej atómov v kruhu je iným prvkom ako uhlík, napríklad atóm dusíka, kyslíka alebo síry. Preferované heterocyklylové skupiny zahŕňajú pyridylovú skupinu, pyrimidylovú skupinu a pyrolidylovú skupinu.

“Substituovaná heterocyklylová skupina znamená heterocyklylovú skupinu substituovanú jedným alebo viacerými substituentami arylovej skupiny.

“Heterocyklylalkylová skupina a “substituovaná heterocyklylalkylová skupina znamená alkylovú skupinu, ktorá je substituovaná heterocyklylovou skupinou, respektívne substituovanou heterocyklylovou skupinou.

“Hygroskopickost” znamená sorpciu so získaním množstva alebo stavov vody dostatočných na ovplyvnenie fyzikálnych a chemických vlastností látky (red. J. Swarbrick a J. C. Boylan, Encyclopedia od Pharmaceutical Technology, zv. 10, str. 33).

Ďalej sa opisujú výhodné uskutočnenia tohto vynálezu.

Preferovanú zlúčeninu pripravenú podľa tohto vynálezu opisuje vzorec II, v ktorom E² je atóm vodíka, alkylová skupina, hydroxymetylová skupina, 1V-15/99/Tä-I 20.4.2000 hydroxyetylová skupina, merkaptometylová skupina, 2-metyltioetylová skupina, karboxymetylová skupina, 2-karboxyetylová skupina, 4-aminobutylová skupina, 3guanidinopropylová skupina, cykloaikylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupina, arylová skupina, substituovaná arylová skupina, aralkylová skupina, substituovaná aralkylová skupina, heterocyklylová skupina, substituovaná heterocyklylová skupina, heterocyklylalkylová skupina, substituovaná heterocyklylalkylová skupina alebo E¹ a E² spolu s atómami dusíka a uhlíka, ktorými sú E¹ a E² pripojené, vytvárajú 4-, 5-, 6alebo 7-členný azacykloalkánový kruh s podmienkou, že heterocyklylalkylová skupina je iná ako indol-3-ylmetylová skupina.

Preferovanejšiu zlúčeninu pripravenú podľa tohto vynálezu opisuje všeobecný vzorec II, v ktorom E² je atóm vodíka, alkylová skupina, hydroxymetylová skupina, 1hydroxyetylová skupina, merkaptometylová skupina, 2-metyltioetylová skupina, karboxymetylová skupina, 2-karboxyetylová skupina, 4-aminobutylová skupina, 3guanidinopropylová skupina, cykloaikylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupina, arylová skupina, substituovaná arylová skupina, aralkylová skupina, substituovaná aralkylová skupina alebo E¹ a E² spolu s atómom dusíka a uhlíka, ktorými sú E¹ a E² pripojené, vytvárajú 4-, 5-, 6- alebo 7-členný azacykloalkánový kruh.

Ešte preferovanejšia zlúčenina pripravená podľa tohto vynálezu sa opisuje vo všeobecnom vzorci II, v ktorom E² je atóm vodíka, alkylová skupina, hydroxymetylová skupina, 1-hydroxyetylová skupina, merkaptometylová skupina, 2-metyltioetylová skupina, karboxymetylová skupina, 2-karboxyetylová skupina, 4-aminobutylová skupina, 3-guanidinopropylová skupina, cykloaikylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupina alebo E¹ a E² spolu s atómami dusíka a uhlíka, ktorými sú E¹ a E² pripojené, vytvárajú 4-, 5-, 6alebo 7-členný azacykloalkánový kruh.

Ďalšia preferovaná zlúčenina pripravená podľa tohto vynálezu sa opisuje vo všeobecnom vzorci II, v ktorom B je alkylová skupina, cykloaikylová skupina,

V-15/99/Tš-I 20.4.2000

cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina alebo alkylcykloalkylalkylová skupina.

Zvláštny prípad zlúčeniny pripravenej podľa tohto vynálezu sa opisuje vo všeobecnom vzorci II a.

, O O O o . . II / \ II II II {ch₂)—-c— n-^ch₂^—c—nh-ch-c-nh—ch-c-l b ^p ch₂cooh j (Ha) v ktorom

B je alkylová skupina, cykloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupina, arylová skupina, aralkylová skupina, alkylarylová skupina alebo alkylaralkylová skupina,

J je atóm vodíka, alkylová skupina, cykloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupina, arylová skupina, substituovaná arylová skupina, aralkylová skupina alebo substituovaná aralkylová skupina,

L je skupina OR¹ alebo NR¹R²,

R¹ a R² sú nezávisle od seba atóm vodíka, alkylová skupina, cykloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupina, arylová skupina, aralkylová skupina, alkylarylová skupina alebo alkylaralkylová skupina, m je 1 až 5, n je 2 až 6 a

V-U/99/Tš-I 20.4.2000 p je 1 alebo 2. .

Preferovanejším zvláštnym uskutočnením je zlúčenina pripravená podľa tohto vynálezu, opisovaná všeobecným vzorcom Ha, v ktorom

B je alkylová skupina, cykloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupina,

J je atóm vodíka, alkylová skupina, cykloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupina, m je 3 a n je 3 alebo 4.

Ďalším preferovaným zvláštnym uskutočnením je zlúčenina pripravená podľa tohto vynálezu opísaná všeobecným vzorcom lla, v ktorom

B je alkylová skupina,

J je alkylová skupina, cykloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina,

R¹ a R² sú nezávisle od seba atóm vodíka, alkylová skupina, cykloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina alebo alkylcykloalkylalkylová skupina, m je 3, n je 3 alebo 4 a

P je1·

V-15/99/Tš-I 20.4.2000

Ďalším preferovaným zvláštnym uskutočnením je zlúčenina pripravená podľa tohto vynálezu, opisovaná všeobecným vzorcom Ha, ktorá je N-[N-[N-(4-piperidín-4yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamid.

Ďalším uskutočnením tohto vynálezu je vytvorenie stabilnej nehygroskopickej kryštalickej formy N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-3cyklohexylalanínamidu. Podľa tohto vynálezu je možné túto zlúčeninu použiť na vývoj stabilného prostriedku obsahujúceho túto zlúčeninu. Stabilná nehygroskopická kryštalická forma N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyI)-N-etylgIycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-pcyklohexylalanínamidu má taktiež vysokú teplotu topenia a nevykazuje žiadnu snahu absorbovať vodu. Stabilná forma taktiež vykazuje jedinečnú neočakávanú stabilitu voči vplyvom vlhkosti a teploty, ktoré sú nadmerné v porovnaní s vplyvmi, s ktorými sa stretávame pri preprave, príprave dávkovej formy alebo dlhodobej doprave alebo skladovaní. Tieto vlastnosti taktiež umožňujú prípravu dávkovej formy. Prevedenie na stabilnú formu taktiež nevedie ku strate materiálu alebo jeho čistoty a neovplyvňuje nepriaznivo vlastnosti častíc.

Preferovaným uskutočnením podľa tohto vynálezu je zlúčenina všeobecného vzorca VII, v ktorom

B je alkylová skupina,

E¹ je atóm vodíka,

E² je cykloalkylalkylová skupina,

G je NR¹ R²,

R¹ a R² sú atómy vodíka a

P je1·

V-15/99/TS-I 20.4.2000

Ďalším preferovaným uskutočnením podľa tohto vynálezu je zlúčenina všeobecného vzorca VII, v ktorom

B je etylová skupina,

E¹ je atóm vodíka,

E² je cyklohexylmetylová skupina,

G je NR¹R²,

R¹ a R² sú atómy vodíka a

P je1Ďalším preferovaným uskutočnením podľa tohto vynálezu je zlúčenina všeobecného vzorca VII, v ktorom

B je etylová skupina,

E¹ je atóm vodíka,

E² je cyklohexylmetylová skupina,

G je NR¹ R²,

R¹ a R² sú atómy vodíka a

P je1,

P¹ je benzylová skupina a

P² je skupina TFA*H-.

V-15/99/Tä-I 20.4.2000

Ďalším preferovaným uskutočnením podľa tohto vynálezu je zlúčenina všeobecného vzorca VII, v ktorom

B je etylová skupina,

E¹ je atóm vodíka,

E² je cyklohexylmetylová skupina,

G je NR¹ R²,

R¹ a R² sú atómy vodíka a

P j® t

P¹ je benzylová skupina a

P² je ŕerc-butoxykarbonylová skupina.

Je potrebné uvážiť, že tento vynález pokrýva všetky kombinácie preferovaných zlúčenín, preferovaných vyhotovení a zvláštnych vyhotovení, ako sú tu definované.

Zlúčenina podľa tohto vynálezu je použiteľná vo forme voľnej bázy alebo kyseliny, jej amfotémej soli alebo vo forme jej farmaceutický prijateľných solí. Všetky formy spadajú do rámca tohto vynálezu.

Ak je zlúčenina podľa tohto vynálezu substituovaná bázickým zvyškom, vytvorí sa kyslá adičná soľ, ktorá je vhodnejšia na použitie a v praxi použitie tejto soli zodpovedá použitiu formy vhodnej bázy. Kyselina, ktorú je možné použiť na prípravu kyslej adičnej soli, prednostne zahŕňa takú kyselinu, ktorá v kombinácii s voľnou bázou poskytuje farmaceutický prijateľnú soľ, to znamená soľ, ktorej anión je netoxický pre pacienta pri farmaceutických dávkach soli, takže prospešné inhibičné

V-15/99/Tš-I 20.4.2000 účinky na agregáciu doštičiek a vytváranie trombov, ktoré sú charakteristické pre

keď sa preferujú farmaceutický prijateľné soli týchto bázických zlúčenín, je možné použiť všetky kyslé adičné soli ako zdroje formy voľnej bázy, dokonca aj keď sa daná soľ ako taká požaduje iba ako medziprodukt, napríklad, keď sa soľ tvorí len na účely čistenia a identifikácie alebo keď sa používa ako medziprodukt na prípravu farmaceutický prijateľnej soli spôsobmi iónovej výmeny. Farmaceutický prijateľné soli v rámci tohto vynálezu sú tie, ktoré sa odvodzujú od nasledujúcich kyselín: minerálne kyseliny, ako je kyselina chlorovodíková, kyselina sírová, kyselina fosforečná a kyselina sulfámová a organické kyseliny ako je kyselina octová, kyselina citrónová, kyselina mliečna, kyselina vínna, kyselina malónová, kyselina metánsulfónová, kyselina etánsulfónová, kyselina benzénsulfónová, kyselina p-toluénsulfónová, kyselina cyklohexylsulfámová, kyselina chinová a podobne. Zodpovedajúce kyslé adičné soli zahŕňajú nasledujúce: hydrohalidy, napríklad hydrochlorid a hydrobromid, sulfáty, fosfáty, nitráty, sulfamáty, acetáty, citráty, laktáty, tartráty, malonáty, oxaláty, salicyláty, propionáty, sukcináty, fumaráty, maleáty, metylén-bis-p-hydroxynaftoáty, gentisáty, mesyláty, izotionáty a di-p-toluoyltartrátmetánsulfonáty, etánsulfonáty, benzénsulfonáty, p-toluénsulfonáty, cyklohexylsulfamáty a chináty.

V súlade s ďalšou vlastnosťou tohto vynálezu sa kyslé adičné soli zlúčeniny podľa tohto vynálezu pripravia reakciou voľnej bázy s príslušnou kyselinou použitím alebo adaptáciou známych metód. Adičné soli zlúčeniny podľa tohto vynálezu sa napríklad pripravia rozpustením voľnej bázy vo vodnom alebo vodnoalkoholovom roztoku alebo v iných vhodných rozpúšťadlách, obsahujúcich príslušnú kyselinu a izoláciou soli odparením roztoku alebo reakciou voľnej bázy a kyseliny v organickom rozpúšťadle a v tomto prípade sa soľ separuje priamo alebo sa môže získať odparením roztoku.

Kyslé adičné soli zlúčeniny podľa tohto vynálezu sa môžu regenerovať zo solí s použitím alebo adaptáciou známych metód. Napríklad je možné materské zlúčeniny podľa tohto vynálezu regenerovať z ich kyslých adičných solí, spracovaním bázickými prostriedkami, napríklad vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného alebo vodným roztokom amoniaku.

V-15/99/Tš-I 20.4.2000

Ak je zlúčenina podľa tohto vynálezu substituovaná kyslým zvyškom, môžu sa vytvoriť bázické adičné soli, ktoré predstavujú jednoduchú a vhodnejšiu formu na použitie a v praxi použitie tejto formy soli zodpovedá použitiu formy voľnej kyseliny. Báza, ktorú je možné použiť na prípravu týchto bázických adičných solí, zahŕňa prednostne tie, ktoré v kombinácii s voľnou kyselinou poskytujú farmaceutický prijateľné soli, to znamená soli, ktorých katióny sú netoxické pre živočíšny organizmus vo farmaceutických dávkach soli, takže prospešné inhibičné účinky na agregáciu doštičiek a vytváranie trombov, charakteristické pre voľnú kyselinu, nie sú narušené vedľajšími účinkami, ktoré je možné pripísať katiónom. Farmaceutický prijateľné soli zahŕňajú napríklad soli alkalických kovov a kovov alkalických zemín, v rámci tohto vynálezu sú soli odvodené od nasledujúcich báz: hydrid sodný, hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid vápenatý, hydroxid hlinitý, hydroxid lítny, hydroxid horečnatý, hydroxid zinočnatý, hydroxid amónny, etyléndiamín, N-metylglukamín, lyzín, arginín, omitín, cholín, Ν,Ν'-dibenzyletyléndiamín, chlórprokaín, dietanolamín, prokaín, N-benzylfenetylamín, dietylamín, piperazín, tris(hydroxymetyl)aminometán, tetrametylamóniumhydroxid a podobne.

Kovové soli zlúčenín podľa tohto vynálezu sa môžu získať stykom hydridu, hydroxidu, karbonátu alebo podobnej reaktívnej zlúčeniny zvoleného kovu vo vodnom alebo organickom rozpúšťadle s formou vodnej kyseliny zlúčeniny. Použitým vodným rozpúšťadlom môže byť voda alebo zmes vody s organickým rozpúšťadlom, prednostne s alkoholom, ako je metanol alebo etanol, ketónom, ako je acetón, alifatickým éterom ako je tetrahydrofurán alebo esterom, ako je etylacetát. Tieto reakcie sa normálne uskutočňujú pri teplote prostredia, avšak v prípade požiadavky sa môžu uskutočňovať pri zahrievaní.

Amínové soli zlúčenín podľa tohto vynálezu sa môžu získať stykom amínu vo vodnom alebo organickom rozpúšťadle s formou vodnej kyseliny zlúčeniny. Vhodným vodným rozpúšťadlom je voda a zmesi vody s alkoholmi, ako je metanol alebo etanol, étery, ako je tetrahydrofurán, nitrily, ako je acetonitril alebo ketóny, ako je acetón. Soli aminokyselín sa môžu pripravovať podobným spôsobom.

V-15/99/Tš-I 20.4.2000

Bázické adičné soli zlúčenín podľa tohto vynálezu sa môžu regenerovať zo solí aplikáciou alebo adaptáciou známych metód. Napríklad sa môže materská zlúčenina podľa tohto vynálezu regenerovať zo svojej bázickej adičnej soli spracovaním kyselinou, napríklad kyselinou chlorovodíkovou.

Soli zlúčeniny podľa tohto vynálezu sa môžu okrem svojho použitia ako vlastných aktívnych zlúčenín využiť na čistenie zlúčenín, napríklad s použitím rozdielu v rozpustnosti medzi soľou a materskou zlúčeninou, vedľajším produktom a/alebo východiskovými materiálmi, spôsobmi dobre známymi tomu, kto má skúsenosti v odbore.

Zlúčenina podľa tohto vynálezu môže obsahovať asymetrické centrá. Tieto asymetrické centrá môžu byť nezávisle od seba v konfigurácii R alebo S. Pre toho, kto má skúsenosti v odbore, bude taktiež jasné, že určité zlúčeniny všeobecného vzorca I môžu vykazovať geometrickú izomériu. Geometrické izoméry zahŕňajú formy cis a trans zlúčenín podľa tohto vynálezu s alkenylovýmí zvyškami. Tento vynález zahŕňa jednotlivé geometrické izoméry a stereoizoméry a ich zmesi.

Tieto izoméry je možné separovať zo zmesí použitím alebo adaptáciou známych metód, napríklad chromatografických spôsobov a rekryštalizačných spôsobov alebo sa môžu pripraviť oddelene z príslušných izomérov svojich medziproduktov, napríklad aplikáciou alebo adaptáciou tu opisovaných spôsobov.

Patentové prihlášky US č. 08/138 820 a 08/476 750, ktoré sú tu zahrnuté formou odkazu, opisujú spôsoby prípravy amorfnej zlúčeniny všeobecného vzorca II a najmä amorfnej zlúčeniny všeobecného vzorca I.

Nový spôsob prípravy zlúčeniny všeobecného vzorca II a najmä kryštalickej zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa tohto vynálezu sa opisuje syntézou znázornenou v schéme II, v ktorej

V-15/9ÍOTÍ-I 20.4.2000

B, E¹, E², G, R, m, n, a p sú definované vyššie a

P¹ je skupina chrániaca kyselinu nestabilnú pri hydrogenácii, ako je benzylová skupina,

P² je skupina chrániaca amín v nestabilnom kyslom prostredí, ako je tercbutoxykarbonylová skupina (BOC) a

P³ je skupina chrániaca amín nestabilný pri hydrogenácii ako je benzyloxykarbonylová skupina (CBZ).

V-I5/99/TS-I 20.4.2000

Schéma II

O

II

O

II

P²-N-(CH₂)p-COH + H₂N-CH-COH

CH2CO2P¹ ; Spojovací prostriedok 0 O —ÍL hn—πη—r.i

Spojovací prostriedok

P²-N—(CH₂)p B

E² 0 I I II HN—CH-C-G

P²-N- (CH₂)p—ÍL _hn__ ch—ll—Ň—ch-c’-q l

C^CO^¹

TFA •CH-CO₂H

CH₂CO₂P¹

ŤFA HN-(CH₂)_p B —L-hn—

CH I ch₂co₂p¹

E¹ E² O I I II N — ¹ CH—C—G

Spojovací prostriedok _R_rt^(R)2)

I

N0

II

P³'

P³ [Η?^(Η)2)π> O {•CHd—C —N— (CH₂)_p ' 'n 1 B •OH

O E¹ E² O

II ^{1 1} —HN—CH—N-CH-C —G

CH₂CO₂P¹ hydrogénácia (napríklad plynným vodíkom .. alebo chemickým prenosom)

RO

II

-ACHyV· -C — N— (CH₂)_P \ z_n 1 B

O O —ILhn—ch ch₂co₂h

E¹ E² O

I I II

N—CH-C —G

V-15/99/Tä-I 20.4.2000

Počas prípravy zlúčeniny všeobecného vzorca II alebo jej medziproduktu, môže byť taktiež žiaduce alebo nevyhnutné zabrániť krížovej reakcii medzi chemicky aktívnymi substituentami prírodných aminokyselín alebo pseudoaminokyselín. Tieto substituenty je možné chrániť štandardnými blokujúcimi skupinami, ktoré je možné potom odstrániť alebo zachovať podľa požiadavky, spôsobmi známymi na získanie žiadaných produktov alebo medziproduktov (pozri napríklad Greene “Protective Groups in Organic Synthesis”, Wiley, New York, 1981). Selektívna protekcia alebo deprotekcia môže byť taktiež nevyhnutná alebo žiaduca na umožnenie premeny alebo odstránenie existujúcich substituentov alebo na umožnenie následnej reakcie na získanie konečného žiadaného produktu.

Spôsob schémy II je vysvetlený na príklade prípravy zlúčeniny všeobecného vzorca II, avšak je treba uvažovať, že s použitím príslušných východiskových materiálov sa pripraví zlúčenina všeobecného vzorca I. Pri príprave zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa schémy II je B etylová skupina, E je atóm vodíka, F je cyklohexylmetylová skupina, G je aminoskupina, R je atóm vodíka, m je 3, n je 3, p je 1, P¹ je benzylová skupina, P² je BOC a P³ je CBZ.

Alternatívny spôsob podľa tohto vynálezu na prípravu zlúčeniny všeobecného vzorca I je rovnaký ako v schéme II, okrem toho, že sa použije zlúčenina všeobecného vzorca III, v ktorom je P³ definované vyššie,

(Hl) namiesto zlúčeniny všeobecného vzorca IV, v ktorom

R je atóm vodíka,

V-15/99/Tš-I 20.4.2000 m je 3, n je 3, p je 1 a

P³ je

(IV)

CBZ so získaním medziproduktu všeobecného vzorca V, v ktorom

B je etylová skupina,

E¹ je atóm vodíka,

E² je

P³—N

O E¹

C-N-(CH₂)pB •HN—CH I

CH2CO2P¹

NE²

I

CH·

O

II

C—G (V) cyklohexylmetylová skupina,

G je aminoskupina,

V-15/99/TS-I 20.4.2000

P je t p¹ je benzylová skupina a

P³ je CBZ.

Schéma II znázorňuje spôsob v piatich krokoch na prípravu zlúčeniny podľa tohto vynálezu, počínajúc vytvorením centrálneho dipeptidového medziproduktu podľa tohto vynálezu všeobecného vzorca VI, v ktorom

B, p, P² a

P²-N-(CH₂) i

B

JL ¹ p—U-HN—CH— I íl co₂h ch₂co₂p¹ (VI)

P¹ je definované vyššie.

V prípade prípravy zlúčeniny všeobecného vzorca I je centrálnym dipeptidovým medziproduktom podľa tohto vynálezu BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)OH. Centrálny dipeptidový medziprodukt sa pripraví bez ochrany voľného zvyšku karboxylovej kyseliny.

V kroku 2 schémy II sa môže pripojenie s vytvorením centrálneho dipeptidu uskutočniť buď v dichlórmetáne alebo v zmesiach etylacetátu s alebo bez dimetylformamidu ako pomocného rozpúšťadla - a organických báz, ako je NMM a môže sa uskutočniť pri teplotách od teploty miestnosti približne do 40 °C. Aktivácia aminokyseliny alebo pseudoaminokyseliny nasledujúceho vzorca na spojenie sa môže uskutočniť s použitím o

P²-N-(CH₂)_p— QQ_H B

V-15/99/Tš-I 20.4.2000 neizolovaných aktívnych esterov s p-nitrofenolom, pentafluórfenolom a Nhydroxysukcínimidom pôsobením dicyklohexylkarbodiimidii. Čas spájania sa pohybuje od 1 do približne 20 h, v závislosti na aminokyselinách alebo pseudoaminokyselinách, ktoré sa majú spájať, aktivačnom činidle, rozpúšťadle a teplote. Centrálny dipeptidový produkt kroku 1 sa nemusí izolovať. Reakčná zmes kroku 1 sa zvyčajne premýva vodou alebo zriedenou vodnou kyselinou (napríklad vodnou kyselinou chlorovodíkovou) a potom sa používa priamo bez sušenia v kroku 2. V prípade použitia aktívnych esterov na báze fenolu sa centrálny dipeptidový produkt extrahuje do alkalickej vody s reakčnou zmesou, potom sa reextrahuje z okysleného vodného roztoku späť do organického rozpúšťadla a roztok reaguje priamo ako v kroku 2.

Dipeptidový medziprodukt všeobecného vzorca VI sa použije na prípravu tripeptidového medziproduktu podľa tohto vynálezu vzorca VII, v ktorom B, E¹, E², G, pa

P²'-N-(CH₂)_r

B

O P E¹ E² O

-tt-HN—CH—U—N CH—C—£

CH₂CO₂P’ (VII)

P¹ sú definované vyššie a P² je P² alebo TFA*H-. Pokiaľ P² je TFA*H-, potom symbol predstavuje disociáciu kyseliny trifluóroctovej (TFA) s vytvorením F₃CCO₂- a H⁺, pri ktorej H⁺ protónuje terminálny amín v zlúčenine všeobecného vzorca VII, to znamená poskytuje soľ kyseliny trifluóroctovej všeobecného vzorca Vila. V prípade prípravy zlúčeniny

CF3CO₂'

H₂N—(θΡ2)ρ B

O E¹

II i

HN—CH—^U—NI

CH₂CO₂P¹

I II CH-C — G (Vila) všeobecného vzorca I je tripeptidovým medziproduktom podľa tohto vynálezu P²-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(l_)-Cha-NH₂.

V-15/99/Tš-I 20.4.2000

V kroku 2 je možné pripojenie aminokyseliny alebo pseudoaminokyseliny k centrálnemu dipeptidu uskutočniť buď v dichlórmetáne alebo v zmesi etylacetátu a dimetylfluórmamidu alebo tetrahydrofuránu pri teplote miestnosti alebo pri nižšej teplote. Aktivácia centrálneho dipeptidu nasledujúceho vzorca na spájanie p2-N-(CH₂)p·

B

J-

sa môže uskutočniť s použitím neizolovaných aktívnych esterov pentafluórfenolu alebo N-hydroxysukcínimidu pôsobením dicyklohexylkarbodiimidu. Aktivácia sa taktiež môže uskutočniť s použitím izopropylchlórmravčanu. Reakčné časy sa menia v závislosti od aminokyselín alebo pseudoaminokyselín, ktoré sa majú spájať, od aktivačného činidla, rozpúšťadla a teploty a pohybujú sa od 1 do 20 h. Tripeptidový produkt sa nemusí izolovať. Keď sa tripeptidový produkt neizoluje, premyje sa reakčná zmes vodnou organickou bázou, ako je vodný N-metylmorfolín a vodnou kyselinou, ako je vodný roztok kyseliny chlorovodíkovej a reaguje ako taký spôsobom kroku 3 po vodnom premytí a bez sušenia.

V kroku 3 schémy II sa môže odstránenie chrániacej skupiny ako je BOC, z tripeptidového produktu kroku 2 uskutočniť s použitím roztoku kyseliny trifluóroctovej v dichlórmetáne alebo s použitím roztoku kyseliny trifluóroctovej v dichlórmetáne alebo s použitím zmesi kyseliny bromovodíkovej v kyseline octovej a etylacetátu. Reakcia môže prebiehať približne pri teplote miestnosti a reakcia vyžaduje trvanie 1 h (spôsob s kyselinou bromovodíkovou) a približne 2 h (spôsob s kyselinou trifluóroctovou). Produkt kyslej soli tripeptidu sa izoluje filtráciou ako kryštalická pevná látka buď priamo z reakčnej zmesi (spôsob s kyselinou bromovodíkovou) alebo po čiastočnom odstránení rozpúšťadla destiláciou a prídavkom nepolárneho rozpúšťadla k zvyšku v reakčnej nádobe.

Ďalší spôsob podľa tohto vynálezu sa opisuje ako jednoduchý zreťazený spôsob na rýchlu a jednoduchú prípravu TFA*H-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ z BOC-N(Et)Gly-OH, čo je reakcia uskutočňovaná v jednej nádobe, zahrňujúca prvé

V-13/99/TŠ-I 20.4.2000 dva spojovacie kroky v schéme II a spracovanie kyselinou trifluóroctovou. Získa sa jednotlivo TFA*H-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH_2l lebo kryštalizuje priamo z roztoku zreťazenej reakcie. Zreťazený spôsob sa vyhýba zodpovedajúcim trom oddeleným reakciám v schéme II a rieši problém získania jednotlivej časovo a cenovo účinnej syntézy, ktorá je použiteľná pri výrobe.

Schéma II znázorňuje tvorbu polypeptidu v opačnom poradí, počínajúc aminokyselinou s chránenou aminoskupinou s následným postupným prídavkom ku karboxylovému koncu oproti konvenčnému poradiu, ktorým sa tvorí polypeptid následnými amidáciami na amínovom konci aminokyseliny s chráneným uhlíkovým koncom. Tento reverzný syntetický spôsob podľa tohto vynálezu požaduje ochranu dusíka len pri prvej aminokyseline s umožnením použitia od tohto miesta následných aminokyselín, nemajúcich žiadnu ochranu na konci s amínovou alebo karboxylovou skupinou (okrem funkčných skupín bočného reťazca). Tieto reverzné syntetické metódy rovnako usmerňujú tvorbu zlúčeniny všeobecného vzorca II a najmä zlúčeniny všeobecného vzorca I tým, že umožňujú použitie prúdového spôsobu výroby oproti vsádzkovému typu normálne požadovanému v chémii peptidov. Nový prístup znižuje výrobné náklady odstránením požiadaviek na nákup aminokyselín chránených na amínovom konci. Nevyžaduje sa žiadne zvláštne vybavenie, činidlá alebo analytické spôsoby.

Ďalším spôsobom podľa tohto vynálezu je tvorba stabilného nehygroskopického kryštalického N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)aspartyl]-(L)-p-cyklo-hexylalanínamidu, získaného reprodukovateľné novou premenou v pevnej fáze z hygroskopického kryštalického N-[N-[N-(4-piperidín-4yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu, pripraveného spôsobom opísaným v schéme II a v uvedených alternatívnych reakčných krokoch.

Hygroskopická kryštalická forma N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-Netylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu je fyzikálne nestabilná a prevádza sa expozíciou podmienkam vlhkosti a teploty na vysoko stabilnú nehygroskopickú kryštalickú formu N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycylj(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu.

V-15/99/Tš-I 20.4.2000

Všeobecné podmienky podľa tohto vynálezu na prevedenie hygroskopickej kryštalickej formy N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(Ľ)-3cyklohexylalanínamidu na vysoko stabilnú nehygroskopickú kryštalickú formu N-[N[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu sa zaisťujú pri statických a dynamických podmienkach.

Statický spôsob podľa tohto vynálezu sa opisuje ako statická konverzia, pretože zahŕňa expozíciu hygroskopickej kryštalickej formy N-[N-[N-(4-piperidín-4yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu umiestnenej v nepohyblivej nádobe, ako sú fľaštičky alebo misky, určitým podmienkam teploty a vlhkosti v kontrolovanej klimatickej komore. “Statická” konverzia sa uskutočňuje pri teplotách a relatívnych vlhkostiach pohybujúcich sa od približne 20 °C do približne 80 °C, v preferovaných prípadoch pri približne 40 °C až približne 80 °C a pri 40 až 100 % relatívnej vlhkosti, prednostne pri približne 65 až približne 80 % relatívnej vlhkosti.

Dynamický spôsob podľa tohto vynálezu sa opisuje ako dynamická konverzia, pretože zahŕňa expozíciu hygroskopickej kryštalickej formy N-[N-[N-(4-piperidín-4yl)butanoyl)-N-etylgIycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-3-cyklohexylaIanínamidu pri hladinách vlhkosti a teploty ako v statickom modeli, avšak za podmienok miešania, vrátane premiešania hygroskopickej kryštalickej formy N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-NetylglycyI]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu v rotačnej odparovacej banke alebo v cylindrickej nádobe (v komore s vlhkosťou) pri miešaní pomocou vrtuľky.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nasledujúce príklady slúžia na ilustráciu a nemajú obmedzovať rozsah tohto vynálezu.

Pokiaľ nie je uvedené inak, pochádzajú údaje o hmotnostnej spektrálnej analýze z uskutočnenia bombardovania rýchlymi atómami s nízkym rozlíšením na VG 70SE s “výpočítanými” hodnotami (M+H)⁺. Spektrálne údaje nukleárnej magnetickej rezonancie (NMR) sa získajú na Brucker ACF 300 v D₂O. Okamžitá chromatografia

V-15/99/Tš-I 20.4.2000 sa uskutočňuje na silikagéli. Vysokovýkonná kvapalinová chromatografia (HPLC) sa uskutočňuje na stĺpcoch s reverznou fázou C-18 s rozmerom častíc medzi 8 a 15 μπι.

Pokiaľ nie je uvedené inak, pochádzajú grafy rôntgenovej práškovej difrakčnej analýzy od použitia difraktometra Siemens D5000 s radiačným zdrojom Cu (1,8 kW, 45 kV, a 40 mA) na snímanie práškových vzoriek. Vzorky sa pred meraním melú na elimináciu účinku veľkosti častice na intenzitu vrcholov. Do držiaku vzorky 1,5 x 1 cm sa umiestni približne 60 mg vzorky a sníma sa v rozmedzí 3 až 40° 2 theta s veľkosťou kroku 0,04° a celkovou expozíciou 12 s na krok.

Príklad 1

Príprava BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH (Krok 1 schémy II)

Do banky s guľatým dnom s tromi hrdlami s obsahom 1 liter sa umiestni 51 g (0,25 mol) BOC-N(Et)Gly-OH, 35 g (0,25 mol) PNP, 400 ml etylacetátu a 100 ml dimetylformamidu. Zmes sa mieša za získania roztoku a ochladení sa na 4 až 6 °C. Po kvapkách sa pridáva roztok 51,5 g (0,25 mol) dicyklohexylkarbodiimidu v 125 ml etylacetátu počas 10 min pri udržovaní teploty od približne 5 °C do približne 8 °C. Po pridaní všetkého dicyklohexylkarbodiimidu sa chladiaci kúpeľ odstráni a zmes sa mieša počas 1,5 h a pritom sa ohreje na teplotu miestnosti (20 až 22 °C). V priebehu tohto času sa vytvára DCU vo forme pevnej zrazeniny. Úplnosť tvorby esteru PNP sa stanoví analytickou vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou [vymiznutie BOC-N(Et)Gly-OH]. Reakčná zmes sa prefiltruje a zvyšok DCU sa premyje podielmi 2 až 50 ml etylacetátu a podiely prejdené filtrom sa pridajú k filtrátu. DCU sa odstráni.

K miešanému prefiltrovanému roztoku sa pridá 67 g (0,3 mol) H2N-(L)Asp(OBzl)-OH vo forme suspenzie v 150 ml (138 g, 1,36 mol) NMM. Zmes sa zahrieva na 38 až 40 °C a udržuje sa pri tejto teplote počas 41 h, čo je čas, po uplynutí ktorého analytická vysokovýkonná kvapalinová chromatografia ukazuje na úplnú spotrebu BOC-N(Et)Gly-OPNP. Reakčná zmes sa ochladí na 25 °C a

V-15/99/TŠ-I 20.4.2000 nezreagovaný H₂N-(L)-Asp(OBzl)-OH sa odfiltruje. Roztok sa ochladí a opäť prefiltruje na získanie ďalších 1,2 g [21,7 g spätného získania, 11,2 g predstavuje pridaný 20 % prebytok a 10,5 g (0,047 mol) predstavuje nezreagovanú látku].

Prefiltrovaný roztok sa extrahuje vSquibbovom lieviku s obsahom 2 litre s jedným podielom 500 ml deionizovanej vody a nasledujúcimi dvoma podielmi 250 ml. Spojený vodný roztok sa extrahuje 3 podielmi po 300 ml zmesi MTBE/etylacetát na odstránenie zvyškového PNP (1:1) (analýza vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou vykazuje len stopové zvyšky). Potom sa ochladí na 5 °C a okyslí sa z pH 8,9 na pH 1,79 pridávaním 150 ml koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej po kvapkách. Okyslený vodný roztok sa extrahuje dvoma podielmi 200 ml etylacetátu. Analýza pevnej fázy vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou nevykazuje žiadny zvyškový žiadaný produkt. Etylacetátové extrakty sa spoja, vysušia síranom horečnatým, prefiltrujú a odparia na rotačnej odparke pri 35 °C. Výsledná svetlooranžová olejová kvapalina sa čerpá pri 35 °C na maximálne odstránenie zvyškového rozpúšťadla za získania 85,68 g BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH vo forme olejovej kvapaliny (21,3 mmol, výťažok 85,5 %, bez korekcie na zvyškové rozpúšťadlo).

Charakteristika:

NMR (250 MHz): 7,3 ppm (s), 5,1 ppm (s), 3,3 ppm (dq), 3,0 (dq), 1,4 ppm (s),

1.1 (t)

MS : M - 408, M+1_pozorov. = 409

Vysokovýkonná kvapalinová chromatografia: 90,79A % (3.87A % p-nitrofenol, bez korekcie na e)

Elementárna analýza: C₂₀H₂₈N₂O₇: H, N, C_nájd. 57,54, Cvy_P. 58,81.

Príklad 2

V-1J/99/TS-I 20.4.2000

Príprava BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ (Krok 2 schémy II)

Spôsob A

Izopropylchlórmravčanový spôsob

Jeden ekvivalent BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH sa rozpustí v etylacetáte (6 až 8 objemov, 1:6,5 hm:obj) a udržiava sa na teplote medzi -15 až 0 °C. Pridá sa NMM (1 ekvivalent) pri udržovaní na teplote približne od -15 °C do približne 0 °C. Izopropylchlórmravčan (1 až 1,1 ekvivalentu) sa pridá do roztoku chráneného dipeptidu pri teplote medzi -15 a 0 °C. Reakčná zmes sa udržiava na teplote medzi 15 °C a 0 °C počas 2 až 5 min. Roztok H₂N-(L)-Cha-NH₂ (1 ekvivalent) v tetrahydrofuráne (10 objemov, 1:10 hm:obj) sa pridá k ochladnutému roztoku dipeptidu pri udržiavaní teploty na približne -15 °C až približne 0 °C. Reakčná zmes sa sleduje vzorkami odobratými v priebehu procesu pomocou vysokovýkonnej kvapalinovej chromatografie počas 15 min, 1 h a 2 h na vyhodnotenie úplnosti reakcie. (Reakcia je úplná, pokiaľ množstvo pozorovaného dipeptidu je menšie ako 10 % na základe vyhodnotenia plochy pri analýze vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou).

BOC-tripeptidový produkt sa zráža priamo z reakčného roztoku a oddelí sa filtráciou z reakčnej zmesi, premyje sa etylacetátom (2x, 1 objem, hm:ojb) a suší sa vo vákuu. Obvyklé výťažky sú vyššie ako 60 % s čistotou viac ako 90A %, <1A % epimémeho diastereoizoméru kyseliny asparágovej.

Resuspenzácia v etylacetáte poskytuje konečné výťažky okolo 60 % BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ a zlepšuje čistotu na >95A % so znížením diastereoizoméru na <0,5 %.

Na špecifický prípad izopropylchlórmravčanového spôsobu, pri ktorom sa postupuje podľa všeobecného spôsobu príkladu A s použitím 4,55 g (8,1 mmol) BOCV-15/99/TŠ-I 20.4.2000

N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH je množstvo pripraveného BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)(L)-Cha-NH₂ 3,26 g (čistota 97,9A %, 0,3A % diastereoizoméru), teoretický výťažok 70 %.

Spôsob B

Spôsob komplexu pentafluórfenol-DCC

Pentafluórfenol (PFP, 2,9 ekvivalentov) a dicyklohexylkarbodiimid (1 ekvivalent) sa rozpustí vetylacetáte (5 objemov, 1:5 hm:obj) pri teplote miestnosti a ochladení na teplotu medzi -15 a 0 °C. Jeden ekvivalent BOC-N(Et)Gly-(L)Asp(OBzl)-OH sa rozpustí vetylacetáte (6 objemov, 1:6 hm:obj) a zmieša sa s jedným ekvivalentom H₂N-(L)-Cha-NH_2l ktorý sa predtým rozpustí v dimetylformamide (10 objemov, 1:10 hm:obj). Roztok dipeptid/H₂N-(L)-Cha-NH₂ sa pridáva po kvapkách do roztoku pentafluórfenolu a dicyklohexylbarbodiimidu s udržovaním teploty medzi -15 a 0 °C. Reakčná zmes sa udržuje pri teplote medzi 15 a 22 °C počas 5 až 16 h s kontrolou vzoriek počas procesu pomocou vysokovýkonnej kvapalinovej chromatografie, odoberaných v časoch 1, 2, 3, 4 a 16 h na vyhodnotenie skončenia reakcie. (Reakcia je skončená, pokiaľ je množstvo pozorovaného dipeptidu nižšie ako 2 % na základe analýzy plochy vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou.

Reakčná zmes sa prefiltruje a filtračný koláč (DCU) sa premyje etylacetátom (2x 0,5 objemov, hm:obj). Filtrát sa spracuje vodou (10 objemov, 1:10 hm:obj) a vodná vrstva sa odstráni. Etylacetátová vrstva sa premyje vodou (1x5 objemov: 1:5 hm:obj). Etylacetátová vrstva sa ochladí na vyzrážanie produktu, ktorý sa filtruje a premyje etylacetátom (2x 0,4 objemy, 1:0,4 hm:obj). Izolované molárne výťažky >60 % s obvyklou čistotou >90A %, s 1 až 4A % epimérneho diastereoméru kyseliny asparágovej.

Resuspenzácia etylacetátu poskytuje konečné výťažky okolo 60 % BOCN(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ a zlepšuje čistou na >99A % so znížením diastereoméru na <0,5 %.

V-15/99/TŠ-I 20.4.2000

Pri špecifickom prípade spôsobu komplexu pentafluórfenol-DCC s použitím všeobecného spôsobu B a 10 g (24,5 mmol) BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH je množstvo pripraveného BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ 8,15 g (čistota 99A %, 0,49A % diastereoméru), teoretický výťažok 59 %.

Spôsob C

Spôsob hydroxybenzotriazolu (HOBT)/2-(1 H-benzotriazol-1 -y l)-1,1,3,3-tetrametyluróniumtetrafluórborátu (TBTU)

Jeden ekvivalent BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH sa rozpustí v dimetylformamide (9 až 10 objemov, 1:10 hm:hm) a udržuje sa pri teplote okolia. K tomuto roztoku sa pridá H₂N-(L)-Cha-NH2 (1 ekvivalent) a hydroxybenzotriazol (HOBT, 1 ekvivalent). Výsledný roztok sa ochladí na približne 0 °C až približne 10 °C a pridá sa NMM (1 až 1,1 ekvivalentu). Spojovací prostriedok, 2-(1 H-benzotriazol-1 yl)-1,1,3,3-tetrametyluróniumtetrafluórborát (1 až 1,1 ekvivalentu) sa rozpustí v dimetylformamide (4 až 5 objemov, 1:5 hm:hm) k roztoku chráneného dipeptidu pri teplote 0 °C až približne 10 °C. Tento roztok sa mieša pri približne 10 °C až približne 25 °C počas asi 3 h tak dlho, až analýza vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou ukazuje skončenie reakcie (menej ako 2 % východiskového materiálu podľa plochy). Reakčná zmes sa pridá k miešanej zmesi 5 % vodného roztoku chloridu sodného (približne 4 objemy oproti objemu reakčnej zmesi) a etylacetátu (približne 2 objemy oproti objemu reakčnej zmesi). Fázy sa oddelia a vodná fáza sa extrahuje ďalším podielom etylacetátu (približne 1,5 objemu oproti objemu reakčnej zmesi). Organické fázy sa spoja a postupne sa premývajú vodným 0,5 N roztokom kyseliny citrónovej (približne 0,6 až 0,7 objemov oproti objemu organickej fázy), 10 % vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného (2x 0,6 až 0,7 objemu oproti objemu organickej fázy pri každom premytí) a 25 % vodným roztokom chloridu sodného (približne 0,3 až 0,4 objemu oproti objemu organickej fázy). Výsledná organická fáza sa odparí na približne 1/4 až 1/2 objemu pri zníženom tlaku pri približne 30 až 50 °C a k tomuto teplému roztoku sa pridá rovnaký objem heptánu. Zmes sa mieša a nechá sa ochladiť na približne 0 °C až približne 20 °C na vyzrážanie žiadaného tripeptidu. Táto tuhá látka sa prefiltruje, premyje zmesou

V-15/99/TS-I 20.4.2000 etylacetátu a heptánu a vysuší sa. Zvyčajný výťažok je väčší ako 60 % s obvyklou čistotou väčšou ako 95,7A % a hladinami epimémeho diastereoméru kyseliny asparágovej < 2A %.

Na použitie špecifického príkladu spôsobu HOBT/TBTU, kde sa dodržuje všeobecný postup s použitím 10 g (24,5 mol) BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH sa pripraví 9,3 g BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ (čistota 96,1 A %, 1,77A % diastereoméru Asp), 67,7 % teoretického výťažku.

Hmotnostná spektrometria: M_w 560,7, M+1_po»_r 561

Teplota topenia 182,17 (DSC) ¹H NMR (δ oproti TMS, D₆ DMSO): 0,89 m (1H), 0,94 m (1H), 1,0 dt (2H), 1,15 m (2H), 1,06-1,3 M (4H), 1,36 d (9H), 1,4-1,74 m (6H), 2,65 m (1H), 2,85, m (1H), 3,18, m (2H), 3,75, d (2H), 4,2, s (1H), 4,66, d (1H), 5,08, s (2H), 7,02, s (1H), 7,18, d (1H), 7,36, s (5H), 7,88, dd (1H), 8,24, dd (1H).

Príklad 3

Príprava TFA-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ (Krok 3 schémy II)

BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ sa rozpustí v dichlórmetáne (približne T. 12 hm/hm) a k roztoku sa pridá kyselina trifluóroctová pri teplote okolia. Roztok sa potom mieša tak dlho, až vysokovýkonná kvapalinová chromatografia ukazuje ukončenie reakcie (3 až 5 h). Roztok sa odparí približne na jednu polovicu objemu pri 40 až 45 °C. K tomuto teplému roztoku sa pridá MTBE [približne 1:10 hm/hm oproti BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂] pri udržovaní teploty vyššej ako 40 °C. Zmes sa pomaly ochladí približne na 5 °C a mieša sa počas 1 h na zaistenie úplnej kryštalizácie. Výsledná tuhá látka sa prefiltruje a premyje ochladeným MTBE. Tuhé látky sa vysušia pri zníženom tlaku a analyzujú sa na

V-15/99/Tä-I 20.4.2000 obsah TFA«N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2 (HPLC analýza hm/hm). Výťažok je všeobecne takmer kvantitatívny, čistota vyššia ako 95A %.

Hmotnostná spektrometria: Mvyp: 460 (voľná báza), Μ+1_ροΖο_Γ: 461

Elementárna analýza: C26H37O7F3, H, N, F, C 54, 35, nájdené 53,82.

¹H NMR (δ oproti TMS, D⁶ DMSO): 0,9, m (2H), 1,15, t (6H), 1,5, m (1H), 1,51,8, m (6H), 2,65, dd (1H), 2,9, m (3H), 3,7, s (2H), 3,9, m (2H), 4,2, m (1H), 4,75, m (1H), 5,1, s (2H), 7,0, s (1H), 7,15, s (1 H), 7,2, s (5H), 8,13, d (1 H), 8,7-8,8, m (3H).

¹³C NMR (význačné signály, δ oproti TMS, D6 DMSO): 10,76, 25,49, 25,68, 25,96, 31,66, 33,07, 33,36, 36,25, 38,59, 41,88, 47,02, 49,40, 50,47, 65,71, 127,81128,34, 135,82, 165,10, 169,34, 173,79.

Špecifické príklady deprotekcie ukazuje tabuľka A.

Tabuľka A

Lab. príklad	Množstvo (BOC-N(Et)Gly-(L)Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2)	Výťažok a čistota A % (TFA’N(Et)Gly- (L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2)
Príklad 1	7,5 g (13,3 mmol)	7,4 g (12,9 mmol) 97 % výťažok, čistota 98,8A %
Príklad 2	6,53 g (11,6 mmol)	6,4 g (11,1 mmol) 96 % výťažok, čistota 98.47A %

Príklad 4

Príprava CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ (Krok 4 schémy II)

V-15/99/Tä-I 20.4.2000

Pripraví sa suspenzia približne ekvimolámych množstiev TFA*N(Et)Gly-(L)Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH_2l CBZ-PipBu a TBTU v etylacetáte, dimetylformamide a vode (100:8:4 obj/obj, približne 11:1 celkový objem obj/hm oproti TFA*N(Et)Gly-(L)Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂). Táto suspenzia sa ochladí na 0 až 10 °C a pridajú sa približne 3 až 4 ekvivalenty NMM. Táto zmes sa nechá ohriať na teplotu miestnosti a mieša sa tak dlho, až HPLC ukáže skončenie reakcie (1 až 3 h, počas tohto času sa objaví roztok). Pridá sa voda (2- až 3-násobok pôvodného množstva vody) a fázy sa nechajú oddeliť. Vodná fáza sa zachová a organická fáza sa premyje dvoma ďalšími podielmi vody. Kombinované vodné podiely z premytia sa spätne extrahujú etylacetátom a kombinované organické fázy sa premyjú 25 % vodným roztokom chloridu sodného. Organická fáza sa odparí pri zníženom tlaku na približne 1/2 objemu a pridá sa MTBE (približne 1/2 obj/obj oproti objemu roztoku). Táto zmes sa ponechá kryštalizovať (niekoľko hodín) a tuhé látky sa oddelia filtráciou, premyjú ochladnutou zmesou etylacetátu a MTBE. Tuhé látky sa vysušia pri zníženom tlaku. Obsah CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ sa analyzuje vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou hm/hm. Výťažok je všeobecne vyšší ako 80 %, čistota vyššia ako 95A %.

Pri špecifickom prípade vyššie opísanej prípravy s dodržiavaním všeobecného spôsobu kroku 4, s použitím 7,25 g TFA*N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ sa získa 7,9 g CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ (čistota vyššia ako 99A %, 0,08A % diastereoméru pri Asp), teoretický výťažok 84 %.

Elementárna analýza: C^HszNsOe, H, N, C, 65,84, nájdené 65,38.

Hmotnostná spektrometria: Mvy_P 747, M+1_pOzor748.

Teplota topenia: 101,6 °C (DSC).

’H NMR (δ oproti TMS, CDCfe): 0,88, m (1H), 0,98, m (1H), 1,13 (2H), 1,23, m (6H), 1,4, m (1H), 1,62-1,76, m (8H), 1,86, qd (1H), 2,35, t (1H), 2,74, dd (2H), 3,25, dd (1H), 3,47, q (2H), 3,7, d (1H), 3,84, d (1H), 4,15, ds (2H), 4,5, qd (1H), 4,68 dt (1H), 5,07, d (1H), 5,14 bd (2H), 5,16, d (1H), 7,28-7,39, m (1 OH), 7,57, dd (1H).

V-15/99/TŠ-I 20.4.2000 ¹³C NMR (δ oproti TMS, CDCI₃): [význačné vrcholy] 66,93 (obidva benzylové uhlíky), 127,78-128,64 (oba fenylové kruhy), 155,249, 170,00, 170,24, 171,69, 174,27,175,21 (všetky karbonylové uhlíky).

Príklad 5

Príprava hygroskopickej kryštalickej formy N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-Netylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-P-cyklohexylalanínamidu (Krok 5 schémy II)

Zmes CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2, mravčanu amónneho a 10 % paládia na uhlíku v zmesi alkoholu a vody 20:1 [10:1 obj/hm oproti CBZ-PipBuN(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂] sa pripraví. Táto zmes sa zahrieva na 40 až 50 ^eC a mieša sa tak dlho, až HPLC ukazuje skončenie reakcie (1 až 2 h). Zmes sa ochladí na teplotu miestnosti a prefiltruje sa za účelom odstránenia katalyzátora. Výsledný roztok sa zahrieva na 40 až 50 °C a pridá sa acetón (objem približne rovnaký ako objem filtrovaného roztoku) a roztok sa nechá ochladiť na 35 až 40 °C. Zmes sa naočkuje N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-pcyklohexylalanín-amidom a pri teplote miestnosti (niekoľko hodín) kryštalizuje hygroskopická forma N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl](L)-p-cyklohexylalanínamidu. Tuhá látka sa oddelí filtráciou pod vrstvou dusíka a premyje sa acetónom. Ďalej sa tuhá látka vysuší pri zníženom tlaku a analyzuje sa na obsah hygroskopickej kryštalickej formy N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-Netylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-P-cyklohexyl-alanínamidu (analýza vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou hm/hm). Výťažok je všeobecne väčší ako 85 %, čistota vyššia ako 95A %.

Pri špecifickom prípade vyššie opísanej prípravy s dodržaním všeobecného spôsobu kroku 5 a s použitím 5 g CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ sa získa 3,1 g hygroskopickej kryštalickej formy N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-Netylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-3-cyklohexylalanínamidu vo forme bielej tuhej látky (čistota 99,6A %) so stechiometrickým výťažkom 89,4 %.

V-15/99/TŠ-I 20.4.2000

Ostatné zlúčeniny pripravené podľa príkladu 1 až 5 vyššie, avšak s použitím príslušných východiskových materiálov zahŕňajúcich nasledujúce:

- N-[N-[N-(4-(piperidín-4-yl)butanoyI)-N-etylg!ycyl]aspartyl]-valín,

- N-[N-[N-(4-(piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]aspartyl]-D-valín,

- N-[N-[N-(3-(piperidín-4-yl)propanoyl)-N-etylglycyl]aspartyl]-valín,

- N-[N-[N-(5-(piperidín-4-yl)pentanoyl)-N-etylglycyl]aspartyl]-valín,

- N-[N-[N-(4-(piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]aspartyl]-L-a-cyklohexylglycín,

- N-[N-[N-(4-(piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]aspartyl]-norleucín,

- N-[N-[N-(4-(piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]aspartyl]-L-a-(2,2-dimetyl)prop-3yl-glycín

- N-[N-[N-(4-(piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]aspartyl]-L-p-dekahydronaft-1-ylalanín,

- N-[N-[N-(4-(piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]aspartyl]-L-a-(2-cyklohexyletyl)glycín,

- N-[N-[N-(4-(piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]aspartyl]-fenylalanín,

- N-[N-[N-(4-(piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]aspartyl]-L-p-naft-1-yl-alanín,

- N-[N-[N-(4-(piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]aspartyl]-L·β-naft-2-yl-alanín_I

- etylester N-[N-[N-(4-(piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]aspartyl]-L-pcyklohexylalanínu,

- N-[N-[N-(4-(piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]aspartyl]-L-p-c/'s-dekahydronaft-2yl-alanín,

- kyselina N-[N-[N-(4-(piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]aspartyl]-aaminocyklohexánkarboxylová

- N-[N-[N-(4-(piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]aspartyl]-p-cyklohexyl-D-alanín,

- N-[N-[N-(4-(piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]aspartyl]-p-dekahydronaft-1-ylalanín,

- etylamid N-[N-[N-(4-(piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]aspartyl]-p-cyklohexylalanínu,

- N-[N-[N-(4-(piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]aspartyl]-p-cyklooktylalanín,

- N-[N-[N-(4-(piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]aspartyl]-p-cyklohexylmetylalanínamid,

V-15/99/Tä-I 20.4.2000

- N-[N-[N-(4-(piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]aspartyl]-p-adamant-1-yl-alanín,

- N-[N-[N-(4-(piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]aspartyl]-p-(1,2,3,4)tetrahydronaft-5-yl-alanín,

- N-[N-[N-(4-(piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]aspartyl]-p-(4cyklohexyl)cyklohexylalanín,

- N-[N-[N-(4-(piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]aspartyl]-p-cykloheptylalanín,

- N-[N-[N-(4-(piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]aspartyl]-p-cyklooktylalanínamid,

- N-[N-[N-(4-(piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]aspartyl]-a-cyklohexylpropylglycín,

- N-[N-[N-(4-(piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]aspartyl]-p-cyklooktylmetylalanín,

- N-[N-[N-(4-(piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]aspartyl]-p-cyklopentylalanín a

- etylester N-[N-[N-(4-(piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]aspartyl]-pcyklohexylmetylalanínu.

Príklad 6

Príprava 4-N-CBZ-piperidónu

Zmes 40 kg N-benzyloxykarbonyloxysukcínimidu a 26 kg (175 mol) 4piperidón. HCI.H₂O v 38,8 kg vody a 88 kg tetrahydrofuránu sa mieša pri 15 °C ± 5 ⁰ C do úplného rozpustenia (približne počas 15 min). NMM (22,8 kg) sa pridá k miešanej zmesi (exotermická reakcia) pri udržovaní teploty na alebo pod 20 °C. Zmes sa mieša pri 20 °C ± 5 °C počas 2,5 h a po tomto čase ukazuje vysokovýkonná kvapalinová chromatografia ukončenie reakcie. Zmes sa zriedi 115,2 kg MTBE a 38,8 kg vody a mieša sa pri 20 °C ± 5 °C počas 5 min. Miešanie sa zastaví, vrstvy sa nechajú oddeliť a vodná (spodná) vrstva sa odstráni do odpadu. Organická vrstva sa premyje 2x 129,6 kg vody [miešajte počas 5 min, oddeľte fázy, odstráňte do odpadu vodnú (spodnú) vrstvu]. Organická vrstva sa premyje 5,2 kg chloridu sodného v 46,8 kg vody [miešajte počas 5 min, oddeľte fázy, odstráňte do odpadu vodnú (spodnú) vrstvu]. Organická vrstva sa spracuje 11,5 kg síranu horečnatého pri miešaní počas 1 h a potom sa zmes prefiltruje. Reakčná nádoba sa premyje 8 kg MTBE (prefiltruje, filtrát sa spojí s hlavným filtrátom, celkový obsah vody filtrátu: 0,52 %). Objem zmesi sa zníži na polovicu destiláciou pri zníženom tlaku pri teplote 30 °C. Vákuum sa

V-15/99/Tš-I 20.4.2000 nahradí atmosférou vodíka a zvyšok sa ochladí na 20 °C (obsah vody zvyšku v nádobe: 0,43 %). Zvyšok sa zriedi 57,6 kg MTBE, potom sa objem zmesi opäť zníži na polovicu destiláciou pri zníženom tlaku pri 30 °C. Vákuum sa nahradí atmosférou dusíka a zmes sa ochladí na 20 °C (obsah vody zvyšku v nádobe: 0,25 %). To sa opakuje ešte 5x. Konečný zvyšok v nádobe sa zriedi 28,8 kg MTBE a mieša sa počas 5 min, a potom sa zisťuje obsah vody a obsah 4-N-CBZ-piperidónu (voda: 0,05 %, 4N-CBZ-piperidón rozbor hm/hm: 22,66 hmotnostných percent, 35,36 kg, 155 mol, stechiometrický výťažok 88,6 %).

Príklad 7

Príprava PipBu

Za podmienok premývania dusíkom a miešania sa pripraví roztok 53,5 kg 3karboxypropyltrifenylfosfóniumbromidu v 230,1 kg 1,2-dimetoxyetánu. Počas 35 min sa pridáva kálium-ŕerc-butoxid/tetrahydrofurán (20 hmotnostných percent, 141,8 kg roztoku) pri teplote 24 až 28 °C. Zmes sa mieša pri tejto teplote počas 0,5 h a po tomto čase ukazuje vysokovýkonná kvapalinová chromatografia ukončenie reakcie. Miešaná zmes sa ochladí na 10 °C ± 2 °C, potom sa k zmesi pridá 96,45 kg (titer: 1,15 M) 4-CBZ-piperidónu v MTBE počas 40 min, takže teplota zmesi zostáva na 12⁰ C ± 2 °C. Zmes sa mieša pri tejto teplote počas 10 min, potom sa zahrieva na 20 °C ± 2 °C a mieša sa pri tejto teplote počas 2 h. K miešanej zmesi sa pridá roztok 22,5 kg koncentrovanej vodnej kyseliny chlorovodíkovej v 245,6 kg vody tak, aby sa zmes udržovala na teplote 20 °C ± 2 °C, konečné pH je 0,5. Zmes sa extrahuje pri miešaní 214,0 kg metyl-ŕerc-butyléteru. Miešanie sa zastaví, počká sa na oddelenie fáz a vodná vrstva (spodná) sa odstráni do odpadu. Organická fáza sa premyje 133,75 kg vody [miešajte počas 5 min, oddeľte, odstráňte do odpadu vodnú (spodnú) vrstvu], potom 10,7 kg 50 % roztoku hydroxidu sodného v 126,8 kg vody [miešajte počas 10 min, oddeľte vrstvy, odstráňte do odpadu organickú (hornú) vrstvu]. Vodná vrstva sa premyje 2x 123,05 kg etylacetátu [miešajte počas 5 minút, oddeľte vrstvy, odstráňte do odpadu organickú (hornú) vrstvu]. K miešanej vodnej vrstve sa pridá 13,1 kg koncentrovanej vodnej kyseliny chlorovodíkovej na dosiahnutie pH 2,5 až 3,5 (konečné pH 2,82) a zmes sa extrahuje 123,05 kg etylacetátu [miešajte počas 5 min,

V-15/99/Tä-I 20.4.2000 oddeľte vrstvy, odstráňte do odpadu vodnú (spodnú) vrstvu]. Etylacetátový roztok sa premyje 133,75 kg vody [miešajte počas 5 min, oddeľte vrstvy, odstráňte do odpadu vodnú (spodnú) vrstvu], potom analyzujte (hm/hm) na obsah CBZ-PipBuen [celková hmotnosť: 194,86 kg, 17,05 % CBZ-PipBuen [(33,22 kg, 108 mol) stechiometrický výťažok 87,9 %].

Etylacetátový roztok PipBuen spolu s 6,6 kg 5 % paládia na uhlíku (50 hmotnostných percent vody) sa naplní pri miešaní do tlakovej nádoby z nehrdzavejúcej ocele, potom sa zmes zahreje na 55 °C ± 2 °C. Pridá sa mravčan draselný (38,2 kg) rozpustený v 66,4 kg vody tak, aby teplota reakčnej zmesi zostávala na 55 °C ± 2 °C (približne počas 30 min). Zmes sa mieša pri 55 °C ± 2 °C počas 2 h, čo je čas, po uplynutí ktorého je reakcia ukončená (zistenie na základe vysokovýkonnej kvapalinovej chromatografie). Do reakčnej nádoby sa pridá 6,6 kg celitu a 33,2 vody, zmes sa mieša a potom sa prefiltruje. Reakčná nádoba sa premyje 33,2 kg vody (prefiltruje a pridá sa do hlavného filtrátu). Filtrát sa umiestni do novej nádoby, ochladí sa na 20 až 25 °C, počká sa do oddelenia vrstiev a organická vrstva sa odstráni do odpadu. Vodná vrstva sa okyslí 52,1 kg koncentrovanej vodnej kyseliny chlorovodíkovej na pH 2 až 3 (konečné pH 2,82), potom sa extrahuje 4x 129,5 kg metylénchloridu [miešajte počas 5 min, oddeľte vrstvy, odstráňte do odpadu organickú (spodnú) vrstvu]. Vodná fáza sa upraví na pH 6,1 prídavkom pri miešaní 17,85 kg 50 % vodného hydroxidu sodného. Zmes sa prefiltruje a získa sa 224 kg roztoku obsahujúceho 17,6 kg (103 mol) 4-(3'-karboxypropyl)piperidínu.

Príklad 8

Príprava CBZ-PipBu

224 kg roztoku 4-(3'-karboxypropyl)piperidínu vo vodnom hydroxide sodnom sa spojí s 55,3 kg tetrahydrofuránu a zmes sa ochladí pri miešaní na 8 °C ± 2 °C. Pridá sa NMM (20,9 kg) pri udržovaní teploty nižšej ako 10 °C. Po pridaní sa teplota upraví na 8 °C ± 2 °C, potom sa pridá 25,7 kg 1-(benzyloxokarbonyl)sukcínimidu rozpusteného v 49,8 kg tetrahydrofuránu počas 1 h pri udržovaní teploty na nižšej ako 15 °C. Reakcia sa ukončí (kontrola analytickou vysokovýkonnou kvapalinovou

V-15/99/TŠ-I 20.4.2000 chromatografiou) po 3 h pri 10 až 15 °C. Pridá sa koncentrovaná vodná kyselina chlorovodíková (29,9 kg) na úpravu pH na 2,5 až 3,5 (konečné pH 3,3) a potom sa pridá 61,4 kg MTBE a zmes sa mieša počas 5 min. Miešanie sa ukončí, počká sa do oddelenia vrstiev a vodná (spodná) vrstva sa oddelí (odpad). Vrstva MTBE sa premyje tromi podielmi 83,1 kg vody (10 min, potom 5 min a 5 min miešania), vodná vrstva sa nechá oddeliť a odstráni sa (odpad) v každom prípade. Roztok 8,3 kg 50 % vodného hydroxidu sodného v 95,7 kg vody sa pridá bez miešania, po skončení pridávania sa zmes zmieša počas približne 5 min. Miešanie sa ukončí, počká sa do oddelenia fáz a organická (vrchná) fáza sa oddelí a odloží do odpadu. Vodná vrstva sa vráti do reakčnej nádoby a extrahuje 2x 38,4 kg metyl-ŕerc-butyléteru [miešanie 5 min, oddelenie vrstiev, odstránenie organickej (vrchnej) vrstvy do odpadu]. Tento krok sa opakuje s použitím 18,5 kg metyl-ŕerc-butyléteru. Vodná vrstva sa vráti do reakčnej nádoby, okyslí sa na pH 2,5 až 3,5 (konečné pH 3,37) 9,9 kg koncentrovanej vodnej kyseliny chlorovodíkovej. Zmes sa extrahuje 76,4 kg metylŕerc-butyléteru [miešanie 5 min, oddelenie vrstiev, spodná (vodná) vrstva sa oddelí do odpadu]. Organická vrstva sa premyje (5 min miešania) roztokom 1,1 kg hydrogenuhličitanu sodného v 12,4 kg vody [miešanie 5 min, oddelenie vrstiev, vodná (spodná) vrstva sa oddelí do odpadu], potom 41,5 kg vody [miešanie počas 5 min, oddelenie vrstiev, vodná (spodná) vrstva sa oddelí do odpadu]. Reakčná nádoba sa umiestni pod znížený tlak a prchavé rozpúšťadlá sa odstraňujú pri 55 °C do skončenia prúdu destilátu. Pridá sa toluén (32,4 kg) a zmes sa destiluje pri atmosférickom tlaku do ukončenia prúdu destilátu, zatiaľ čo teplota vsádzky stúpa na 90 až 95 °C. Potom sa zmes ochladí na 30 až 35 °C, do reakčnej nádoby sa pridá heptán (56,85 kg) (dve fázy), zmes sa zahrieva na 90 až 95 °C (jedna fáza), potom sa opäť ochladí na 38 až 42 °C. Naočkujú sa kryštály CBZ-PipBu a produkt kryštalizuje zo zmesi počas 1 h. Pevná látka sa oddelí filtráciou a premyje sa 19,35 kg zmesi toluén/heptán 1:2, a potom 33,4 kg heptánu. Filtračný koláč sa vysuší vo vákuu pri 40 °C (po stratu sušením 0,13 %) so získaním 22,4 kg (72,96 mol, stechiometrický výťažok z 4-piperidónu 42 %) CBZ-PipBu.

Príklad 9

Príprava CBZ-PipBuenu

V-lJ/99/Tä-I 20.4.2000

K suspenzii 82 g 3-karboxypropyltrifenylfosfóniumbromidu v 407 ml 1,2dietoxyetánu sa pri 14 °C pridáva počas 25 min 220 g 20 % (hm) kálium ŕezc-butoxid v tetrahydrofuráne pri udržovaní teploty reakčnej zmesi na 24 až 28 °C. Zmes sa mieša počas 1 h, ochladí sa na 10 °C, potom sa pridáva počas 30 min roztok 52,5 g 4-N-CBZ-piperidónu vo 246 ml ŕerc-butylmetyléteru pri pokračujúcom chladení. Po skončení pridávania je zmes na teplote 12 °C počas 10 min, potom sa ohreje na 20 ⁰ C a mieša sa počas ďalších 30 min. Reakčná zmes sa spracuje 410 ml 1 N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkovej počas 10 min, zriedi sa 328 ml ŕerc-butylmetyléteru a potom sa oddelia fázy. Organická fáza sa premyje 205 ml vody, potom 210 ml 1 N vodného roztoku hydroxidu sodného. Vrstva hydroxidu sodného, ktorá obsahuje produkt sa zbiera oddelene, premyje sa 3 podielmi po 189 g etylacetátu, okyslí na pH 3,48 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou a potom sa extrahuje 189 ml etylacetátu. Etylacetátová vrstva sa oddelí, premyje sa 211 ml vody a potom sa suší počas 30 min 10 g síranu horečnatého, prefiltruje a odparí sa vo vákuu. Olejovitý zvyšok (50,7 g) sa kryštalizuje zo zmesi toluén/heptán za získania celkového množstva 29,46 g CBZ-PipBuenu (výťažok 50,9 %, čistota približne 95A %).

Hmotnostná spektrometria: Mvy_P 303, M+1_poZor304.

¹H NMR (δ oproti TMS, CDCI₃): 2,2, t (2H), 2,25, t (2H), 2,35, m (4H), 3,45, m (4H), 5,15, s (2H), 5,2, m (1H), 7,33, 2 (5H).

¹³C NMR (δ oproti TMS, CDCI₃): 22,43, 28,2, 34,26, 35,66, 44,88, 45,74, 67,20, 122,02, 127,83, 127,95, 128,45, 128,69, 128,90, 136,17, 136,72, 155,34, 178,39.

Príklad 10

Príprava CBZ-PipBuen-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂.

(Alternatívny krok 4 schémy II)

V-lS/99/Τϊ-Ι 20.4.2000

CBZ-PipBuen (70 g, 0,23 mol) a dimetylformamid (230 ml) sa pridá do opláštenej banky s obsahom 1 liter a mieša sa pri ochladzovaní na 0 °C, potom sa naraz pridá TBTU (74,9 g, 0,23 mol). Teplota sa udržuje na 0 °C a začne sa s pridávaním diizopropyletylamínu (61,9 g, 0,61 mol). Po 45 min sa pridá TFAN(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ (138,7 g, 0,24 mol) vo forme roztoku v dimetylformamide (230 ml). pH sa upraví na 7 až 8 pridaním diizopropyletylamínu (45 ml) a zmes sa nechá ohriať na teplotu okolia. Po 2 h je reakcia ukončená (overené analýzou pomocou vysokovýkonnej kvapalinovej chromatografie). Zmes sa naleje do vody (2,5 litra) a extrahuje sa etylacetátom (1 liter). Vodná fáza sa spätne extrahuje etylacetátom (0,3 litra). Organické vrstvy sa spoja, premyjú vodným roztokom kyseliny citrónovej (5 hmotnostných percent, 2x 1 liter), premyjú sa vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného (5 hmotnostných percent, 2x 1 liter) a premyjú sa vodou (2 litre). Etylacetátová vrstva sa prenesie do banky s obsahom 2 litre a pri miešaní sa pridáva heptán (500 ml) na ovplyvnenie kryštalizácie. Pevná látka sa získa odsávaním na Buchnerovom lieviku, premyje sa zmesou etylacetát/heptán (2:1 obj/obj, 1 liter) a vysuší sa na konštantnú hmotnosť za získania CBZ-PipBuenN(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ (143,2 g, 0,19 mol, výťažok 83 %).

Elementárna analýza: 04ΐΗ₅5Ν₅0_7ι C: vypočítané 66,02, nájdené 65,53, H, N.

Hmotnostná spektrometria: Mvy_P 745,91, M+1_poZor746.

¹H NMR (δ oproti TMS, CDCI₃): 0,86, qd (1H), 0,98, qd (1H), 1,16, t (2H), 1,24, dt (6H), 1,37, m (1H), 1,64-1,78, m (4H), 1,86, qd (1H), 2,2 bd (4H), 2,35, m (1H), 2,4, m (2H), 2,74, dd (1H), 3,07, m (4H), 3,52, d (1H), 3,85, d (1H), 4,12, q (1H), 4,49, qd (1H), 4,68, dt (1H), 5,07, d (1H), 5,14, s (1H), 5,16, d (1H), 5,22, t (2H), 6,45, s (1H), 7,28, d (1H), 7,26, s (5H), 7,35, s (5H), 7,56, d (1H).

¹³C NMR (δ oproti TMS, CDCl₃): 14,15, 22,68, 24,95, 25,61, 26,03, 26,45, 28,20, 31,71, 32,89, 33,80, 33,89, 34,00, 35,63, 38,37, 44,79, 45,13, 45,65, 50,23,

51,34, 60,40, 66,87, 67,06, 76,50, 77,13, 77,77, 122,46, 126,88, 127,80-128,60, 135,15, 155,19, 170,11, 170,20, 171,61, 173,76, 175,35.

V-15/99/Tš-I 20.4.2000

Príklad 11

Príprava hygroskopickej kryštalickej formy N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-Netylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu (Alternatívny krok 5 schémy II)

CBZ-PipBuen-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ (140 g, 0,19 mol), mravčan amónny (61 g, 0,96 mol) a 10 % paládium na uhlíku (50 % vlhkosti, typ degussa, 28 g) sa pridá do opláštenej banky s obsahom 5 litrov. Pridá sa etylalkohol (200°, 1260 ml), izopropanol (70 ml) a voda (deionizovaná, 70 g). Táto zmes sa zahrieva na 40 až 50 °C a mieša sa tak dlho, až vysokovýkonná kvapalinová chromatografia ukazuje ukončenie reakcie (5 h). Zmes sa ochladí na teplotu miestnosti a prefiltruje sa kvôli odstráneniu katalyzátora. Výsledný roztok sa zahrieva na 40 až 50 °C, pridá sa acetón (približne rovnaký objem oproti filtrovanému roztoku) a roztok sa nechá ochladiť na 35 až 40 ^eC. Zmes sa naočkuje N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-Netylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidom a z nej kryštalizuje hygroskopická forma N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl](L)-p-cyklohexylalanínamidu pri schladení na teplotu miestnosti (niekoľko h). Pevná látka sa oddelí odsávaním na Buchnerovom lieviku pod vrstvou dusíka, koláč sa premyje acetónom a vysuší sa na vzduchu na konštantnú hmotnosť za získania N-[N[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu (84,3 g, 0,16 mol, výťažok 84,8 %, väčší ako 95A %).

Príklad 12

Zreťazená príprava TFA-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ (Alternatívne kroky 1 až 3 schémy II)

Banka s obsahom 500 ml s pripojeným činidlom teploty sa naplní BOCN(Et)Gly (20,3 g, 0,1 mol), N-hydroxysukcínimidom (11,5 g, 0,1 mol) dichlórmetánom (200 ml). Zmes sa mieša miernou rýchlosťou a do výsledného roztoku sa pridá

V-15Z99/TŠ-I 20.4.2000 dicyklohexylkarbodiimid (20,6 g, 0,1 mol) v jednom podiele vo forme tuhej látky. Tento roztok sa mieša počas 1 h, pričom sa zaznamenáva mierny exotermický priebeh (teplota vzrastá z 20 °C na 28 °C) a vyzráža sa DCU. Výsledná suspenzia sa filtruje vo vákuu s použitím Búchnerovho lievika a filtračného papiera Whatman 1. Koláč sa premyje dichlórmetánom (2x 25 ml). Filtráty sa vrátia do pôvodnej banky s obsahom 500 ml a potom sa postupne pridáva (L)Asp(OBzl) (22,3 g, 0,1 mol), NMM (33,8 ml, 0,3 mol) a dimetylformamid (80 g, 1,01 mol). Po miešaní počas 2 h pri teplote miestnosti je vytváranie BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl) ukončené (sledovanie pomocou vysokovýkonnej kvapalinovej chromatografie). Reakčná zmes sa vyleje do extrakčného lievika obsahujúceho ľadovú vodu (100 ml). Zmes sa okyslí kyselinou chlorovodíkovou (36 %, 25 ml) po dosiahnutie pH 1. Vrstvy sa rozdelia a dichlórmetánová vrstva sa premyje ľadovou vodu (100 ml) a fázy sa rozdelia (pH vodnej fázy 3 až 4). Dichlórmetánová vrstva sa vráti do pôvodnej banky s obsahom 500 ml, ktorá sa postupne naplní NH₂-(L)-Cha-NH₂ (17 g, 0,1 mol), Nhydroxysukcínimidom (11,5 g, 0,1 mol) a dicyklohexylkarbodiimidom (20,6 g, 0,1 mol) v jednom podiele, každá látka v tuhej forme. Po miešaní počas 2 h pri teplote miestnosti je vytváranie BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ ukončené (sledovanie pomocou vysokovýkonnej kvapalinovej chromatografie) a DCU sa odfiltruje vo vákuu s použitím Búchnerovho lievika s filtračným papierom Whatman 1. Filtračný koláč sa premyje dichlórmetánom (2x 25 ml). Filtrát sa prenesie do extrakčného lievika a premyje deionizovanou vodou (200 ml) obsahujúcou Nmetylmorfolín (15 ml, pH 8 až 9). Fázy sa rozdelia a dichlórmetánová vrstva sa opäť premyje vodou (deionizovaná, 2x 25 ml). Dichlórmetánová fáza sa premyje 150 ml 1 N roztoku kyseliny chlorovodíkovej (pH 1). Fázy sa rozdelia a dichlórmetánová vrstva sa premyje deionizovanou vodou (200 ml, pH 3). Dichlórmetánový roztok BOCN(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ sa vráti do čistej banky s obsahom 500 ml a potom sa pridá kyselina trifluóroctová (100 ml). Po miešaní počas 2 h pri teplote miestnosti je vytváranie TFA«HN(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ ukončené (sledovanie vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou). Na odstránenie dichlórmetánu a väčšiny kyseliny trifluóroctovej sa reakčná zmes destiluje vo vákuu. Potom sa pridá MTBE (500 ml) a zmes sa naočkuje na uskutočnenie kryštalizácie produktu. Zmes sa filtruje vo vákuu pomocou Buchnerovho lievika s filtračným papierom Whatman 1. Filtračný koláč sa premyje MTBE (2x 25 ml) a vysuší vo vákuu

V-1J/99/TÍ-I 20.4.2000 za získania TFA«H-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ (46,8 g, výťažok 81,5 %) vo forme bielej tuhej látky (čistota >97 A %, <0,2A % diastereoméru D-Asp).

Príklad 13

Príprava nehygroskopickej kryštalickej formy N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-Netylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-3-cyklohexylalanínamidu

Spôsob A

Statická konverzia

Hygroskopická kryštalická forma N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-Netylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu (7,45 kg) sa melie v kladivovom mlyne. Výsledná tuhá látka (7,35 kg) sa umiestni do misky sušiarne z nehrdzavejúcej ocele (90 x 28 cm) a tá sa zakryje perforovanou hliníkovou fóliou. Miska sa potom uzavrie vo vlhkostnej komore (LUNAIRE Humidity Cabinet model, č. modelu CEO 941W-3) a komora sa udržuje uzatvorená počas konverzného procesu okrem odoberania vzoriek na analýzu. Komora sa nastaví na 40 % relatívnej vlhkosti a 60 °C a udržuje sa pri týchto hodnotách počas 1 h. Potom sa komora upraví na 80 % relatívnej vlhkosti a 60 °C a udržuje sa na týchto hodnotách počas 12 h. Odoberie sa vzorka po 18 h pri 80 % relatívnej vlhkosti a 60 °C a overí sa rôntgenovou práškovou difrakčnou analýzou konverzia nehygroskopickej kryštalickej formy N-[N-[N-(4piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu. Vlhkostná komora sa opäť uzavrie a nastaví sa na 40 % relatívnej vlhkosti a 60 °C a udržuje sa na týchto hodnotách počas 2 h. Komora sa opäť nastaví na podmienky okolia, potom sa miska vyberie z komory a nehygroskopická kryštalická forma N-[N[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu sa získa v množstve 7,2 kg (výťažok 96,6 %). Overenie konverzie sa uskutoční na základe rôntgenového práškového difrakčného grafu (obr. 1). Výsledky rôntgenovej práškovej difrakcie sú taktiež v tabuľke ako hodnoty vzrastajúceho uhla difrakcie (2Θ), zodpovedajúce interplanárnej vzdialenosti kryštálu (d) v jednotkách nm, impulzov za s (Cps) a relatívnej intenzity vrcholu (%) (tabuľka 1).

V-15/99ZTŠ-I 20.4.2000

2Θ	“d---	---Cps---	---%—
5,065	1,74314	86,00	5,82
6,323	1,39672	248,00	16,78
7,518	1,17489	221,00	14,95
8,163	1,08222	496,00	33,56
8,780	1,00633	155,00	10,49
10,383	0,85125	218,00	14,75
11,351	0,77886	112,00	7,58
12,596	0,70218	999,00	67,59
13,858	0,63852	316,00	21,38
15,191	0,58274	1338,00	90,53
16,476	0,53759	481,00	32,54
16,745	0,52901	556,00	37,62
17,980	0,49294	679,00	45,95
18,572	0,47735	1079,00	73,00
18,799	0,47165	1230,00	83,22
19,147	0,46315	1229,00	83,15
19,619	0,45211	1380,00	93,37
20,200	0,43924	1246,00	84,30
20,466	0,43360	1478,00	100,00
20,870	0,42528	1088,00	73,61
21,625	0,41061	584,00	39,51
22,088	0,40210	891,00	60,28
22,840	0,38903	613,00	41,47
23,947	0,37129	597,00	40,39
24,569	0,36203	680,00	46,01
25,608	0,34757	506,00	34,24
27,015	0,32978	1100,00	74,42
27,837	0,32022	420,00	28,42
27,967	0,31877	400,00	27,06
29,255	0,30502	536,00	36,27
29,689	0,30066	603,00	40,80
30,665	0,29130	518,00	35,05
31,318	0,28538	451,00	30,51
31,894	0,28036	533,00	36,06
33,370	0,26829	518,00	35,05
33,562	0,26679	552,00	37,35
33,919	0,26407	581,00	39,31
34,840	0,25730	561,00	37,96
35,789	0,25069	559,00	37,82
35,940	0,24967	560,00	37,89
36,780	0,24416	740,00	50,07
37,042	0,24249	736,00	49,80
37,959	0,23684	683,00	46,21
39,017	0,23066	643,00	43,50

V-15/99/Tš-I 20.4.2000

Spôsob B

Dynamické podmienky

a. Konverzia formy

Hygroskopická kryštalická forma N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-Netylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-3-cyklohexylalanínamidu (50 g) sa umiestni do kalibrovaného valca 400 ml (výška náplne 6 cm) na kruhový držiak vybavený mechanickou miešačkou. Prístroj sa umiestni do komory s riadenou vlhkosťou (LUNAIRE Humidity Cabinet, model č. CEO 941W-3). Miešanie sa nastaví na frekvenciu otáčania 275 min'¹ a teplota a relatívna vlhkosť sa upraví počas 30 min na 60 °C a 40 %. Zlúčenina sa udržuje v týchto podmienkach počas 1 h, potom sa podmienky zmenia v priebehu 45 min na 80 % relatívnej vlhkosti/60 °C. Zlúčenina sa potom udržuje v týchto podmienkach počas 16 h pred novým nastavením komory na 40 % relatívnej vlhkosti/60 °C a v týchto podmienkach sa komora udržuje počas 3,25 h. Potom sa umožní návrat zlúčeniny k podmienkam okolia (výška náplne 4 cm), náplň sa potom vyberie z valca so získaním nehygroskopickej kryštalickej formy N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p cyklohexylalanínamidu (výťažok >95 %). Overenie konverzie sa uskutoční rôntgenovou práškovou difrakčnou analýzou (obr. 2). Výsledky rôntgenovej práškovej difrakcie sú taktiež v tabuľke ako hodnoty vzrastajúceho uhla difrakcie (2Θ), zodpovedajúce interplanámej vzdialenosti kryštálu v jednotkách nm, počtu impulzov za s (Cps) a relatívnej intenzity vrcholu (%) (tabuľka 2).

V-15/99/Tä-I 20.4.2000

20	---d---	---Cps---	%—
5,186	1,70268	196,00	8,43
6,371	1,38615	722,00	31,07
7,570	1,16689	516,00	22,20
8,232	1,07323	1094,00	47,07
8,817	1,00206	257,00	11,06
10,428	0,84761	365,00	15,71
11,377	0,77714	129,00	5,55
11,600	0,76223	117,00	5,55
12,667	0,69828	1805,00	77,67
13,913	0,63599	551,00	23,71
14,398	0,61468	178,00	7,66
15,226	0,5844	2285,00	98,32
16,538	0,53557	861,00	37,05
16,773	0,52814	929,00	39,97
18,019	0,49190	1132,00	48,71
18,672	0,47483	1871,00	80,51
18,815	0,47125	2052,00	88,30
19,204	0,46178	2071,00	89,11
19,654	0,45132	2226,00	95,78
20,237	0,43845	1939,00	83,43
20,523	0,43240	2324,00	100,00
20,934	0,42400	1656,00	71,26
21,691	0,40938	923,00	39,72
22,143	0,40112	1411,00	60,71
22,910	0,38786	994,00	42,77
24,007	0,37037	964,00	41,48
24,642	0,36097	991,00	42,64
25,642	0,36097	991,00	42,64
27,070	0,32913	1687,00	72,59
27,855	0,32002	688,00	29,60
29,497	0,30258	843,00	36,27
29,497	0,30013	878,00	37,78
30,751	0,29051	809,00	34,81
31,916	0,28017	821,00	35,33
33,982	0,26360	882,00	37,95
35,200	0,25475	865,00	37,22
36,001	0,24926	841,00	36,19
36,927	0,24322	1106,00	47,59
38,389	0,23429	968,00	41,65

V-15/99/Tä-I 20.4.2000

b. Konverzia formy

Hygroskopická kryštalická forma N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-Netylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu (370 g) sa naplní do rotačnej odparovacej banky s obsahom 2 litre. Banka sa umiestni na rotačnú odparku (Heidolph UV 2002) a ponorí sa do kúpeľa (Heidolph MR 2002) predhriateho na 58 ° C. Aparatúra sa umiestni do vákua 6 kPa (60 mbar) s využitím vákuového čerpadla (Divatrion DV1), potom sa vákuum preruší kontrolovaným spôsobom na umožnenie vytvorenia vlhkej atmosféry do oddelenej zahrievanej banky s obsahom vody. Spustenie vlhkej atmosféry sa kontroluje aparatúrou na kontrolu vlhkosti (Vausalo Humiditique and Temperature Traumettor) na získanie relatívnej vlhkosti v aparatúre 79 % [13 až 18 kPa (130 až 180 mbar) vnútorného tlaku]. Rotačná odparovacia nádoba sa potom otáča pri rýchlosti otáčania 145 až 160 min'¹ počas 5 h pri udržiavaní kúpeľa približne na 60 °C a relatívnej vlhkosti v nádobe 71 až 79 %. Potom sa vákuum preruší s vpustením dusíka, nádoba a jej obsah sa nechá ochladiť na teplotu okolia a produkt sa odoberie za získania nehygroskopickej kryštalickej formy N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-3cyklohexylalanínamidu. Druhý podiel 317 g hygroskopickej kryštalickej formy N-[N-[N(4-piperidín-4-yl) butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu sa spracuje podobne za získania nehygroskopickej kryštalickej formy N-[N-[N-(4piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu. Overenie konverzie sa uskutoční rôntgenovou práškovou difrakčnou analýzou (obr. 3). Tieto dva podiely spolu poskytujú 667 g nehygroskopickej kryštalickej formy N-[N[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyI]-(L)-3-cyklohexylalanínamidu (celkový výťažok 97 %). Overenie konverzie sa uskutoční rôntgenovou práškovou difrakčnou analýzou (obr. 3). Výsledky rôntgenovej práškovej difrakcie sú taktiež v tabuľke ako hodnoty vzrastajúceho uhla difrakcie (2Θ), zodpovedajúce interplanárnej vzdialenosti kryštálu (d) v nanometroch (nm), počtu impulzov za s (Cps) a relatívnej intenzity vrcholu (%) (tabuľka 3).

V-15/99/Ti-I 20.4.2000

2Θ	_„d---	---Cps---	---%
5,124	1,72309	180,00	10,17
6,328	1,39565	408,00	23,05
7,574	1,16623	305,00	17,23
8,191	1,07851	556,00	31,41
8,797	1,00432	166,00	9,38
10,398	0,85004	244,00	13,79
12,628	0,70040	1198,00	67,68
13,871	0,63791	353,00	19,94
15,218	0,58172	1543,00	87,18
15,723	0,56317	187,00	10,56
16,538	0,53558	589,00	33,28
16,751	0,52882	621,00	35,08
18,024	0,49175	869,00	49,10
18,640	0,47563	1156,00	65,31
18,809	0,47141	1241,00	70,11
19,191	0,46210	1521,00	85,93
19,659	0,45120	1413,00	79,83
20,865	0,44064	1303,00	73,62
20,495	0,43299	1770,00	100,00
20,865	0,42539	1120,00	63,28
21,616	0,41077	683,00	38,59
22,113	0,40166	919,00	51,92
22,950	0,38719	697,00	39,38
24,117	0,36871	659,00	37,23
24,618	0,36132	716,00	40,45
25,644	0,34709	662,00	37,40
26,297	0,33862	486,00	27,46
27,052	0,32934	1270,00	71,75
27,960	0,31885	518,00	29,27
29,640	0,30115	705,00	39,38
30,744	0,29058	695,00	39,27
33,465	0,26755	697,00	39,38
33,840	0,26467	764,00	43,16
35,812	0,25053	736,00	41,58
36,811	0,24396	858,00	48,47
37,076	.0,24228	919,00	51,92
38,185	0,23549	870	49,15
39,622	0,22728	882,00	49,83

V-15/99/Τϊ-Ι 20.4.2000

Príklad 14

Rôntgenové práškové difrakčné grafy vzorky N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-Netylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu v jeho hygroskopickej kryštalickej forme a po prevedení na nehygroskopickú kryštalickú formu

Vzorka hygroskopického kryštalického N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-Netylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu sa pripraví podľa príkladu 5 alebo 11a prevedie sa na zodpovedajúcu nehygroskopickú kryštalickú formu podľa spôsobu v príklade 13. Grafy rôntgenovej práškovej difrakcie hygroskopickej kryštalickej formy sú na obr. 4 a 5. Výsledky rôntgenovej difrakcie hygroskopickej kryštalickej formy a nehygroskopickej kryštalickej formy tú taktiež v tabuľke ako hodnoty vzrastajúceho uhla difrakcie (2Θ), zodpovedajúce interplanárnej vzdialenosti kryštálu (d) v nanometroch (nm), počtu impulzov za s (Cps) a relatívnej intenzity vrcholu (%) v tabuľkách 4 respektíve 5.

V-15/99/Tš-I 20.4.2000

20	---d---	---Cps---	---%---
5,073	1,74037	1487,00	86,50
6,451	1,36905	447,00	26,00
7,837	1,12712	411,00	23,91
8,491	1,04049	602,00	35,02
9,699	0,91119	93,00	5,41
10,488	0,84278	421,00	24,49
11,570	0,76423	92,00	5,35
12,550	0,70474	411,00	23,91
13,576	0,65168	760,00	44,21
15,327	0,57763	606,00	35,25
15,790	0,56080	456,00	26,53
16,179	0,54739	346,00	20,13
16,770	0,52824	938,00	54,57
17,085	0,51856	685,00	39,85
17,750	0,49927	924,00	53,75
18,151	0,48835	741,00	43,11
18,504	0,47909	593,00	34,50
19,323	0,45897	930,00	54,10
19,714	0,44996	792,00	46,07
20,545	0,43194	1719,00	100,00
21,388	0,41510	897,00	52,18
22,381	0,39691	373,00	21,70
22,870	0,38852	258,00	15,01
23,640	0,37604	563,00	32,75
23,841	0,37292	680,00	39,56
24,048	0,36976	623,00	36,24
24,746	0,35949	338,00	19,66
25,200	0,35311	366,00	21,29
25,792	0,34513	590,00	34,32
26,266	0,33901	731,00	42,52
26,959	0,33045	555,00	32,29
27,426	0,32494	769,00	44,74
27,967	0,31876	528,00	30,72
29,020	0,30744	771,00	44,85
29,922	0,29837	491,00	28,56
30,970	0,28851	384,00	22,34
31,552	0,28332	510,00	29,67
33,338	0,26854	627,00	36,47
34,838	0,25731	520,00	30,25
35,873	0,25012	653,00	37,99
36,107	0,24855	639,00	37,17
37,162	0,24174	683,00	39,73
38,509	0,23359	775,00	45,08
39,701	0,22684	784,00	45,61

V-I5/99/TŠ-I 20.4.2000

Tabuľka 5

-N-	2Θ	---d---	---CDS---	---%—
1	5,152	1,71371	123,00	7,34
2	6,386	1,38287	483,00	28,84
3	7,580	1,16540	389,00	23,22
4	8,225	1,07410	752,00	44,90
5	8,801	1,00390	180,00	10,75
6	10,408	0,84928	276,00	16,48
7	12,660	0,69863	1399,00	83,52
8	13,914	0,63594	391,00	23,34
9	15,251	0,58047	1675,00	100,00
10	16,541	0,53548	608,00	36,30
11	16,771	0,52818	652,00	38,93
12	18,047	0,49112	775,00	46,27
13	18,676	0,47472	1078,00	64,36
14	18,902	0,46910	1099,00	65,61
15	19,182	0,46231	1151,00	68,72
16	19,697	0,45035	1164,00	69,49
17	20,240	0,43838	1049,00	62,63
18	20,568	0,43147	1403,00	83,76
19	20,933	0,42403	1024,00	61,13
20	21,684	0,40951	569,00	33,97
21	22,122	0,40150	746,00	44,54
22	22,970	0,38685	564,00	33,67
23	24,080	0,36927	546,00	32,60
24	24,218	0,36720	556,00	33,19
25	24,694	0,36023	618,00	36,90
26	25,680	0,34662	510,00	30,45
27	26,400	0,33732	403,00	24,06
28	27,105	0,32871	1093,00	65,25
29	27,929	0,31920	450,00	26,87
30	29,360	0,30395	555,00	33,13
31	29,724	0,30031	595,00	35,52
32	30,340	0,29435	429,00	25,61
33	30,693	0,29105	552,00	32,96
34	31,353	0,28507	476,00	28,42
35	31,822	0,28098	531,00	31,70
36	32,006	0,27940	545,00	32,54
37	32,885	0,27213	485,00	28,96
38	33,508	0,26722	547,00	32,66
39	34,040	0,26316	606,00	36,18
40	34,839	0,25730	580,00	34,63
41	35,998	0,24928	596,00	35,58
42	36,680	0,24480	629,00	37,55
43	36,948	0,24309	727,00	43,40
44	37,197	0,24152	703,00	41,97
45	39,602	0,22739	697,00	41,61

V-15/99/Tš-I 20.4.2000

Príklad 15

Izotermické mikrokalorimetrické experimenty na hygroskopickej a nehygroskopickej kryštalickej forme N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-pcyklohéxylalanínamidu

Izotermické mikrokalorimetrické experimenty na hygroskopickej a nehygroskopickej kryštalickej forme N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etyIglycyl](L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu sa uskutočňujú s použitím termometrického monitora tepelnej aktivity (TAM). Konverzie rôznych kryštalických foriem v pevnom stave sa študujú expozíciou týchto foriem rôznym vlhkostiam alebo parám rozpúšťadla pri rôznych teplotách. Používajú sa nasýtené roztoky nasledujúcich solí na získanie rôznych vlhkostí: chlorid draselný (relatívna vlhkosť 80 %, chlorid sodný (relatívna vlhkosť 75 %) a bromid sodný (relatívna vlhkosť 65 %). Množstvo týchto foriem približne 100 mg sa naváži do sklenenej ampuly TAM a do tejto ampuly sa umiestni mikrohygrostat, obsahujúci roztok nasýtenej soli (prebytok tuhej látky) alebo organické rozpúšťadlo. Ampula sa uzavrie, umožní sa vyrovnanie na teplotu experimentu a ponorí sa do polohy merania v TAM. Na referenčnej strane sa umiestni rovnaký systém obsahujúci premytý morský piesok namiesto testovanej vzorky. Tepelný výkon (μ\Λ/) sa meria ako funkcia času (obr. 6 až 8).

Príklad 16

Izotermy sorpcie vlhkosti hygroskopickej a nehygroskopickej kryštalickej formy N-[N[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-3-cyklohexylalanínamidu

Izotermy sorpcie vlhkosti hygroskopickej a nehygroskopickej kryštalickej formy N-[N-[N-(4-piperidín-4-yl)butanoyl)-N-etylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-p-cyklohexylalanínamidu sa získajú na váhach na stanovenie vlhkosti VTI MB 300G. Pokusy sa uskutočňujú buď podrobením približne 15 mg kryštalickej formy, vzrastajúcim a klesajúcim krokom relatívnej vlhkosti v % a sledovaním hmotnostného prírastku (v každom rovnovážnom kroku) ako funkcie relatívnej vlhkosti v % (obr. 9) alebo

V-15/99/TS-I 20.4.2000 udržiavaním vzorky kryštalickej formy na konštantnej vlhkosti a sledovaním hmotnostného prírastku ako funkcie času.

Zlúčenina všeobecného vzorca II vykazuje užitočné farmakologické pôsobenie a v súlade stým sa používa ako zložka farmaceutických prostriedkov na liečbu chorých, trpiacich určitými patologickými stavmi.

Tento vynález sa taktiež zameriava na spôsob liečby chorého, trpiaceho stavmi, ktoré je možné zlepšiť alebo ktorým je možné zabrániť podaním inhibítora agregácie doštičiek inhibíciou väzby fibrinogénu na aktivované doštičky a ďalších adhezívnych glykoproteínov, ktoré sa zúčastňujú agregácie doštičiek a zrážania krvi. Ďalej sa tento vynález zameriava na spôsoby prevencie alebo liečby trombózy, súvisiacej s určitými chorobnými stavmi, ako je infarkt myokardu, mŕtvica, periférne arteriálne ochorenia a diseminovaná intravaskulárna koagulácia u ľudí a iných cicavcov.

Pojem liečba je tu treba chápať tak, že zahŕňa profylaktickú liečbu rovnako tak ako liečbu stavov, ktoré už nastali.

Rozsah tohto vynálezu taktiež zahŕňa farmaceutické zloženie obsahujúce farmaceutický prijateľné množstvo aspoň jednej zlúčeniny všeobecného vzorca I v spojení s farmaceutický prijateľnou nosnou látkou alebo pomocnou látkou.

V praxi sa zlúčeniny alebo prostriedky na liečbu podľa tohto vynálezu môžu podávať akýmikoľvek prijateľnými spôsobmi, napríklad miestne, inhaláciou, parenterálne, rektálne alebo orálne, avšak prednostne sa podávajú orálne.

Zlúčenina všeobecného vzorca II sa môže predkladať vo formách umožňujúcich podávanie najvhodnejšou cestou a tento vynález sa taktiež vzťahuje na farmaceutické zloženia obsahujúce aspoň jednu zlúčeninu podľa tohto vynálezu, ktoré sú vhodné na použitie v humánnom alebo veterinárnom lekárstve. Tieto prostriedky sa môžu pripravovať konvenčnými spôsobmi, s použitím jedného alebo viacerých prijateľných adjuvantov alebo pomocných látok. Adjuvanty zahŕňajú okrem

V-15/99/TS-I 20.4.2000 iného rozpúšťadlá, sterilné vodné prostredia a rôzne netoxické organické rozpúšťadlá. Tieto zloženia sa môžu predkladať vo forme tabliet, pilúl, toboliek, granúl, práškov, vodných roztokov alebo suspenzií, roztokov pre injekcie, elixírov, sirupov a podobne a môžu obsahovať jednu alebo viacej látok zvolených zo skupiny zahŕňajúcej sladidlá, príchute, farbivá, stabilizátory alebo konzervačné prostriedky na získanie farmaceutický prijateľných prípravkov.

Voľba vehikula a obsah aktívnej látky vo vehikuli sa všeobecne stanoví v súlade s rozpustnosťou a chemickými vlastnosťami produktu a s konkrétnym režimom podávania a opatreniami, ktoré je treba plniť vo farmaceutickej praxi. Napríklad pomocné látky, ako je laktóza, citrát sodný, uhličitan vápenatý, dihydrát hydrogenfosforečnanu vápenatého a dezintegračné činidlá, ako je škrob, kyselina alginová a určité komplexné kremičité gély spojené s mazivami, ako je stearát horečnatý, laurylsulfát sodný a mastenec sa môžu použiť na prípravu tabletiek. Na prípravu toboliek je výhodné použiť laktózu a vysokomolekulárne polyetylénglykoly. Pri použití vodných suspenzií môžu obsahovať emulgačné prostriedky alebo prostriedky umožňujúce tvorbu suspenzie. Je možné taktiež použiť riedidlá, ako je sacharóza, etanol, polyetylénglykol, propylénglykol, glycerol a chloroform alebo ich kombinácie, rovnako tak ako iné látky.

Pri parenterálnom podávaní sa používajú emulzie, suspenzie alebo roztoky zlúčenín podľa tohto vynálezu v rastlinnom oleji, napríklad sezamovom oleji, podzemnicovom oleji alebo olivovom oleji alebo vodno-organické roztoky, ako je voda a propylénglykol, organické estery, ktoré je možné podávať v injekciách, ako je etyloleát, rovnako tak ako sterilné vodné roztoky farmaceutický prijateľných solí. Roztoky solí prípravkov podľa tohto vynálezu je možné taktiež použiť pri podávaní v intramuskulámej alebo subkutánnej injekcii. Vodné roztoky, ktoré taktiež zahŕňajú roztoky solí v čistej destilovanej vode, sa môžu použiť pri intravenóznom podávaní s podmienkou, že sa ich pH vhodne upraví, sú rozumne pufrované, je zaručená ich izotonická koncentrácia použitím dostatočného množstva glukózy alebo chloridu sodného a sterilizujú sa zahrievaním, ožarovaním a/alebo mikrofiltráciou.

V-15/99/Τϊ-Ι 20.4.2000

Lokálne podávanie, gély (na báze vody alebo alkoholu), krémy a mastí obsahujúce zlúčeniny podľa tohto vynálezu sa môžu použiť. Zlúčeniny podľa tohto vynálezu môžu byť taktiež súčasťou gélu alebo matricovej bázy na aplikáciu náplasti, ktorá by umožňovala riadené uvoľňovanie zlúčeniny pri prechode transdermálnou bariérou.

Pevné prípravky na rektálne podávanie zahŕňajú čapíky pripravené v súlade so známymi spôsobmi a obsahujú aspoň jednu zlúčeninu všeobecného vzorca II.

Percentuálny obsah účinnej zložky v prostriedky podľa tohto vynálezu sa môže meniť takým spôsobom, že prostriedok obsahuje podiel vhodnej dávky. Obyčajne je možné podávať približne súčasne niekoľko jednotlivých dávkových foriem. Požadovanú dávku môže určiť lekár alebo kvalifikovaný odborník a závisí od požadovaného liečebného účinku, spôsobu podávania a trvania liečby a na stave chorého. Dávkový režim na uskutočnenie spôsobu podľa tohto vynálezu je taký, ktorý zabezpečuje maximálnu terapeutickú odpoveď na získanie zlepšenia a potom minimálnu efektívnu hladinu poskytujúcu úľavu. Všeobecne môže byť perorálna dávka medzi približne 0,1 mg/kg a približne 100 mg/kg, prednostne medzi 0,1 mg/kg až 20 mg/kg a najlepšie medzi 1 mg/kg a 20 mg/kg a intravenózna dávka približne 0,1 pg/kg až približne 100 pg/kg, prednostne medzi 0,1 mg/kg až 50 mg/kg. V každom konkrétnom prípade je možné dávky stanoviť v súlade s faktormi, ktoré charakterizujú pacienta, ktorý sa má liečiť, ako je vek, hmotnosť, celkový zdravotný stav a ďalšie charakteristiky, ktoré môžu ovplyvniť účinnosť zlúčeniny podľa tohto vynálezu.

Ďalej je možné podávať zlúčeninu všeobecného vzorca II tak často, ako je treba na získanie požadovaného terapeutického účinku. Niektorí pacienti môžu vykazovať rýchlu odpoveď na vyššiu alebo nižšiu dávku a môžu považovať oveľa slabšie udržiavacie dávky za primerané. Pre iných pacientov môže byť nevyhnutné použiť dlhodobú liečbu s frekvenciami 1 až 4 perorálnych dávok denne, prednostne jeden až dvakrát denne v súlade s fyziologickými požiadavkami každého konkrétneho pacienta. Všeobecne sa môže aktívny prípravok podávať perorálne

V-15/99/TŠ-I 20.4.2000 jeden až štyrikrát denne. Pre iných pacientov bude ale nevyhnuté predpisovať nie viac ako jednu alebo dve dávky denne.

Zlúčenina všeobecného vzorca II vykazuje významné farmakologické aktivity podľa skúšok opisovaných v literatúre, ktorých výsledky je možné uvažovať v korelácii s farmakologickou aktivitou ľudí a iných cicavcov. Nasledujúce výsledky farmakologických skúšok in vitro a in vivo sú typické pre charakterizáciu zlúčeniny všeobecného vzorca II.

Nasledujúce farmakologické skúšky vyhodnocujú inhibičnú účinnosť zlúčeniny všeobecného vzorca II na agregáciu doštičiek sprostredkovanú fibrinogénom, väzbu fibrinogénu na doštičky stimulovanú trombínom a inhibíciu agregácie doštičiek indukovanú ADP ex-vivo a výsledky týchto skúšok korelujú s inhibičnými vlastnosťami zlúčeniny všeobecného vzorca II in vivo.

Test agregácie doštičiek je založený na opise v Blood 66 (4), 946-952 (1985). Test väzby fibrinogénu je v podstate test, ktorý opísali Z. M. Ruggeri a koľ, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 5708-5712 (1986) a E. F. Plow a koľ, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 8057-8061 (1985). Test inhibície agregácie doštičiek indukovanej ADP ex-vivo je založený na spôsobe Zuckera “Platelet Inhibition Meausured by the Photoeletric Method, Methods in Enzvmoloqy 169.117-133 (1989).

Test agregácie doštičiek

Príprava fixovaných aktivovaných doštičiek

Doštičky sa izolujú z koncentrátu ľudských doštičiek, s použitím spôsobu gélovej filtrácie, ako opisuje G. A. Marguerie a kol., J. Biol. Chem., 254, 5357-5363 (1979) a Z. M. Ruggeri a kol., J. Clin. Invest., 72, 1-12 (1983). Doštičky sa suspendujú pri koncentrácii 2 x 10⁸ buniek/ml v modifikovanom Tyrodeho pufri bez vápnika, obsahujúcom koncentráciu chloridu sodného 127 mM, chloridu horečnatého 2 mM, hydrogenfosforečnanu sodného 0,42 mM, hydrogenuhličitanu sodného 11,9 mM, chloridu draselného 2,9 mM, glukózy 5,5 mM, HEPES 10 mM pri pH 7,35 a 0,35

V-15/99íTŠ-I 20.4.2000 % ľudského sérového albumínu (HSA). Tieto premyté doštičky sa aktivujú prídavkom ľudského a-trombínu pri konečnej koncentrácii 2 jednotky/ml a potom inhibítora trombínu 1-2581 pri konečnej koncentrácii 40 μΜ. K aktivovaným doštičkám sa pridá paraformaldehyd po konečnú koncentráciu 0,50 % a zmes sa inkubuje pri teplote miestnosti počas 30 min. Fixované aktivované doštičky sa potom zbierajú centrifugáciou pri 650 x g počas 15 min. Pelety doštičiek sa premyjú štyrikrát Tyrodeho pufrom s 0,35 % HSA a resuspendujú na 2 x 10⁸ buniek/ml v rovnakom pufri.

Agregácia doštičiek

Fixované aktivované doštičky sa inkubujú s vybranou dávkou zlúčeniny, ktorá sa má skúšať na inhibíciu agregácie doštičiek počas 1 min a agregácia sa začne prídavkom ľudského fibrinogénu po konečnú koncentráciu 250 pg/ml. Zariadenie na profiláciu agregácie doštičiek model PAP-4 sa používa na zaznamenávanie agregácie doštičiek. Rozsah inhibície agregácie sa vyjadruje v percentách rýchlosti agregácie pozorovanej za neprítomnosti inhibítora. Potom sa vypočíta ICso, to je množstvo inhibítora požadované na zníženie rýchlosti agregácie o 50 %, pre každú zlúčeninu /pozri napríklad E. F. Plow a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 80578061 (1985)/.

Test väzby fibrinogénu

Doštičky sa zbavia zložiek plazmy premytím na albumíniovom gradiente hustoty podľa P. N. Walshe a kol., Br. J. Haematol., 281-296 (1977) v modifikácii V. Trapani a Lombardo a kol., J. Clin. Invest., 76, 1950-1958 (1985). V každej experimentálnej zmesi doštičiek v modifikovanom Tyrodeho pufri [Z. M. Ruggeri a kol., J. Clin. Invest., 72, 1-12 (1983)] sa uskutoční stimulácia ľudským a-trombínom pri 22 až 25 °C počas 10 min (3,125 x 10¹¹ doštičiek na liter a trombín v koncentrácii 0,1 jednotiek NIH/ml). Pridá sa hirudín v 25-násobnom prebytku (jednotka/jednotka) v priebehu 5 min pred pridaním fibrinogénu značeného ¹²⁵l a zlúčeniny, ktorá sa má testovať. Po týchto prídavkoch je konečný počet doštičiek v zmesi 1 x 10¹¹ /liter. Po inkubácii počas ďalších 30 min pri 22 až 25 °C sa oddelia viazané a voľné ligandy

V-15/99/Tä-I 20.4.2000 centrifugáciou 50 μΙ zmesi cez 300 μΙ 20 % sacharózy pri 12000 x g počas 4 min. Peleta doštičiek sa potom oddelí od zvyšku zmesi na stanovenie rádioaktivity naviazanej na doštičky. Nešpecifická väzba sa meria v zmesiach obsahujúcich prebytok neznačeného ligandu. Pri analýze väzbových kriviek Scatchardovou analýzou sa nešpecifická väzba získava ako parameter zistení preložením z izotermy väzby pomocou počítačového programu [P. J. Munson, Methods Enzymol., 92, 542576 (1983)]. Na stanovenie koncentrácie každej zlúčeniny potrebnej na inhibíciu väzby 50 % fibrinogénu na doštičky stimulované trombínom (lC₅o) sa každá zlúčenina testuje pri 6 alebo viacerých koncentráciách s fibrinogénom značeným ¹²⁵l pri 0,176 μ mol/liter (60 μς/ηηΙ). IC₅o sa získa vynesením zvyškovej fibrinogénnej väzby oproti logaritmu koncentrácie zlúčeniny vo vzorke.

Inhibícia agregácie doštičiek indukovaná ADP ex-vivo

Experimentálny protokol

Kontrolné vzorky krvi sa získajú 5 až 10 min pred podaním skúšanej zlúčeniny psím krížencom s hmotnosťou 10 až 20 kg. Zlúčenina sa podáva sondou do žalúdka vo vodnom prostredí alebo perorálne v želatínovej tobolke. Potom sa odoberajú vzorky krvi v 30 minútových intervaloch počas 3 h a potom po 6, 12 až 24 h po podaní. Každá vzorka krvi sa získa zvény na hlave a odoberie sa priamo do plastovej injekčnej striekačky, obsahujúcej jeden diel 3,8 % roztoku citrátu sodného na deväť dielov krvi.

Agregácia psích doštičiek ex-vivo

Vzorky krvi sa centrifugujú pri frekvencii otáčania 1000 min'¹ počas 10 min na získanie krvnej plazmy bohatej na doštičky (PRP). Po odstránení PRP sa vzorka centrifuguje počas ďalších 10 min pri frekvencii otáčania 2000 min'¹ na získanie plazmy chudobnej na doštičky (PPP). Počítanie doštičiek v PRP sa uskutoční s použitím Coulterového čítača (Coulter Electronics, Hialeah, FL). Pokiaľ je koncentrácia doštičiek v PRP vyššia ako 300000 doštičiek/μΙ, potom sa PRP zriedi PPP na úpravu počtu doštičiek na 300000 doštičiek/μΙ. Alikvóty PRP (250 μΙ) sa

V-15/W/Tš-I 20.4.2000 potom umiestnia do silikónových sklenených kyviet (7,25 x 55 mm, Bio/Data Corp., Horsham, PA). Potom sa kPRP pridá epinefrín (konečná koncentrácia 1 μΜ) a uskutoční sa inkubácia počas 1 min pri 37 °C. Potom sa kPRP pridá stimulátor agregácie doštičiek ADP s konečnou koncentráciou 10 μΜ. Agregácia sa sleduje spektrofotometricky s použitím agregometra s transmisiou svetla (Bio/Data Platelet Aggregation Profiler, Model PAP-4, Bio/Data Corp., Horsham, PA). Na testovanie zlúčeniny sa rýchlosť zmeny (smernica) transmitancie svetla a maximálna transmitancia svetla (maximálna agregácia) zaznamená v duplicitných vzorkách. Údaje o agregácii doštičiek sa uvedú ako pokles v percentách (stredná hodnota ± SEM) smernice alebo maximálna agregácia v porovnaní s údajmi získanými z kontrolnej PRP, ktorá sa pripraví z krvných vzoriek získaných pred podaním skúšanej látky.

Zlúčenina všeobecného vzorca II vykazuje významnú aktivitu v predchádzajúcich testoch a považuje sa za užitočnú pri prevencii a liečbe trombózy, v súvislosti s určitými chorobnými stavmi. Antitrombotická aktivita v rozbore agregácie psích doštičiek ex-vivo je schopná predpovedať takú aktivitu u ľudí [pozri napr. J. L. Catalfamo a W. Jean Dodds “Isolation of Platelets form Laboratory Animals, Methods Enzymoi., 169, diel A, 27 (1989)]. Výsledky testovania zlúčeniny všeobecného vzorca II vyššie opísanými spôsobmi sa uvádzajú v tabuľke 6 nižšie. V tabuľke sa taktiež uvádzajú výsledky komparatívnych testov 44(piperidyl)butanoylglycylaspartyl-triptofánu, to znamená zlúčeniny uvedenej v publikácii európskej patentovej prihlášky č. 0 479 481.

V-15/99/TŠ-I 20.4.2000

Tabuľka 6

Zlúčenina príkladu č.

Inhibícia agregácie fixovaných doštičiek (ICso μΜ)

Inhibícia agregácie doštičiek indukovanej ADP ex-vivo

Dávka % inhibície agregácie (mg/kg) doštičiek ex-vivo po perorálnom podaní (Zlúčenina

EPA481)

0,097

0,047

1h 3h 6h 12h 24h 100 100 100 98 50 53 <20

Ten, kto má skúsenosti v odbore, ľahko ocení, že tento vynález je dobre prispôsobený svojmu zámeru a získaniu spomínaných výsledkov a výhod. Zlúčeniny, prostriedky a spôsoby, ktoré sú tu opísané, sa predkladajú ako príklady preferovaných uskutočnení alebo sú myslené ako príklady a nie sú určené ako obmedzenie rozsahu tohto vynálezu.

Claims (5)

1. Zlúčenina všeobecného vzorca VII

P²‘.N-(CH₂)pJ o

CH-C—Q (VII) v ktorom

B je alkylová skupina, cykloaikylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupina, arylová skupina, aralkylová skupina, alkylarylová skupina alebo alkylaralkylová skupina,

E¹ je atóm vodíka,

E² je α-uhlíkový bočný reťazec prirodzenej α-aminokyseliny, atóm vodíka, alkylová skupina, cykloaikylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupina, arylová skupina, substituovaná arylová skupina, aralkylová skupina, substituovaná aralkylová skupina, heterocyklylová skupina, substituovaná heterocyklylová skupina, heterocyklylalkylová skupina, substituovaná heterocyklylalkylová skupina alebo E¹ a E² spolu s atómami dusíka a uhlíka, ku ktorým sú E¹ a E² pripojené, vytvárajú azacykloalkánový 4-, 5-, 6- alebo 7-členný kruh,

G je skupina OR¹ alebo NR¹R²,

R¹ a R² sú nezávisle od seba atóm vodíka, alkylová skupina, cykloaikylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupina, arylová skupina, aralkylová skupina, alkylarylová skupina alebo alkylaralkylová skupina,

V-I5/99/TŠ-I 20.4.2000 p je 1 až 4,

P¹ je skupina chrániaca kyselinu nestabilnú pri hydrogenácii a

P² je P² alebo skupina TFA*H- a

P² je skupina chrániaca amín nestabilný v kyslom prostredí.

2. Zlúčenina podľa nároku 1, v ktorej

B je alkylová skupina,

E¹ je atóm vodíka,

E² je cykloalkylalkylová skupina,

G je skupina NR¹ R²,

R¹ a R² sú atómy vodíka a

P je 1.

3. Zlúčenina podľa nároku 2, v ktorej

B je etylová skupina a

E² je cyklohexylmetylová skupina.

4. Zlúčenina podľa nároku 3, v ktorej

P¹ je benzylová skupina a

V-15/99/TŠ-I 20.4.2000

P² je skupina TFA*H-.

5. Zlúčenina podľa nároku 3, v ktorej

P¹ je benzylová skupina a

P² je ŕerc-butoxykarbonylová skupina.

V-15/99/Tä-I 20.4.2000