SK13992003A3

SK13992003A3 - 4-(Fenyl(piperidin-4-yl)amino)benzamidové deriváty a ich požitie na liečbu bolesti, anxiety alebo gastrointestinálnych porúch

Info

Publication number: SK13992003A3
Application number: SK1399-2003A
Authority: SK
Inventors: William Brown; Andrew Griffin; Christopher Walpole
Original assignee: Astrazeneca Ab
Priority date: 2001-05-18
Filing date: 2002-05-16
Publication date: 2004-04-06
Also published as: BR0209665A; NO20035119D0; US20040142966A1; PL367246A1; IS7033A; IL158700A0; WO2002094785A1; RU2003131963A; CN1527818A; CO5540320A2; EE200300526A; ZA200308642B; CA2446516A1; EP1395557A1; SE0101773D0; BG108334A; JP2005508291A; MXPA03010444A; HUP0401610A2; AR036231A1

Description

Predložený vynález sa týka nových zlúčenín, postupu na ich prípravu, ich použitia a farmaceutických kompozícií obsahujúcich tieto nové zlúčeniny. Tieto nové zlúčeniny sú užitočné v terapii a najmä pri liečbe bolesti, anxiety a funkčných gastrointestinálnych porúch.

Doterajší stav techniky

Receptor δ bol identifikovaný ako receptor s úlohou v mnohých telesných funkciách, napríklad systému obehu a bolesti. Ligandy pre receptor δ môžu preto nájsť potenciálne využitie ako analgetiká a/alebo antihypertoniká. Ukázalo sa tiež, že ligandy pre receptor δ majú imunomodulačné aktivity.

Identifikácia aspoň troch rôznych populácií receptorov opiátov (μ, δ a κ) je teraz dobre etablovaná a všetky tri sú evidentné v centrálnych a periférnych nervových systémoch mnohých druhov vrátane človeka. Pri aktivácii jedného alebo viacerých z týchto receptorov sa pozorovala analgézia na rôznych zvieracích modeloch.

S niekoľko málo výnimkami sú momentálne dostupné selektívne opiátové δ ligandy svojou povahou peptidické a sú nevhodné na podanie systémovými cestami. Jeden príklad nepeptidického δ-agonistu je SNC80 (Bilsky E. J. et al., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 273(1), s. 359-366 (1995)). Existuje však stále potreba selektívnych δ-agonistov majúcich nielen zlepšenú selektivitu, ale aj zlepšený profil vedľajších účinkov.

Problémom, ktorý bol základom predloženého vynálezu, bolo teda nájdenie nových analgetík so zlepšenými analgetickými účinkami, ale aj so zlepšeným profilom vedľajších účinkov oproti aktuálnym μ agonistom, ako aj majúcich zlepšenú systémovú účinnosť.

Analgetiká, ktoré boli identifikované a existujú v doterajšom stave techniky, majú mnohé nevýhody v tom, že majú slabú farmakokinetiku a nie sú analgetické, keď sa podajú systémovými cestami. Bolo tiež dokumentované, že výhodné δ agonistické zlúčeniny opísané v doterajšom stave techniky vykazujú pri systémovom podaní signifikantne konvulzívne účinky.

Objavili sme isté zlúčeniny, ktoré vykazujú prekvapujúco zlepšené vlastnosti, medzi inými zlepšenú potenciu proti δ-agonistom, in vivo potenciu, farmakokinetickú biologickú dostupnosť, in vitro stabilitu a/alebo nižšiu toxicitu.

Podstata vynálezu

Nové zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sú definované vzorcom I kde

R¹ je vybrané z nasledujúcich:

(i) fenyl;

(ii) pyridinyl (iii) tienyl (iv) furanyl (v) imidazolyl (vi) triazolyl (vii) pyrolyl (viii) tiazolyl

(ix) pyridyl-N-oxid kde každý fenyl R¹ a heteroaromatický kruh R¹ môže byť voliteľne a nezávisle ďalej substituovaný 1, 2 alebo 3 substituentmi nezávisle vybranými spomedzi nasledujúcich: lineárny a rozvetvený CrC₆ alkyl, NO₂, CF₃, C1-C6 alkoxy, chlór, fluór, bróm, a jód. Substitúcie na fenyle a na heteroaromatickom kruhu môžu prebehnúť v ktorejkoľvek polohe na týchto kruhových systémoch;

Keď je fenyl R¹ a heteroaromatický kruh R¹ substituovaný, výhodné substituenty sú nezávisle vybrané spomedzi nasledujúcich: CF₃, metyl, jód, bróm, fluór a chlór.

Ďalším uskutočnením predloženého vynálezu je zlúčenina podľa obrázka I, kde R¹ má vyššie uvedený význam a každý fenylový kruh R¹ a heteroaromatický kruh R¹môže byť nezávisle ďalej substituovaný metylovou skupinou.

Ďalším uskutočnením predloženého vynálezu je zlúčenina podľa obrázka I, kde R¹ je fenyl, pyrolyl, pyridinyl, tienyl alebo furanyl, voliteľne s 1 alebo 2 z výhodných substituentov na fenyle R¹ alebo heteroaromatickom kruhu R¹.

Ďalším uskutočnením predloženého vynálezu je zlúčenina podľa obrázka I, kde R¹ je fenyl, pyrolyl alebo pyridinyl, voliteľne s 1 alebo 2 z výhodných substituentov na fenyle R¹ alebo heteroaromatickom kruhu R¹.

Ďalším uskutočnením predloženého vynálezu je zlúčenina podľa obrázka I, kde R¹ je tienyl alebo furanyl, voliteľne s 1 alebo 2 z výhodných substituentov na fenyle R¹alebo heteroaromatickom kruhu R¹.

Do rozsahu vynálezu spadajú aj soli a enantioméry zlúčenín vzorca I vrátane solí enantiomérov.

Krok reakcie b v schéme 1 (pozrite ďalej) sa uskutočňuje reakciou intermediátu všeobecného vzorca II

kde PG je uretánová chrániaca skupina, napríklad Boe a CBZ, alebo benzylová alebo substituovaná benzylová chrániaca skupina, napríklad 2,4-dimetoxybenzyl; s A/,/V-diizopropyl-4-brómbenzamidom, použitím paládiového katalyzátora, napr. tris(dibenzylidénacetón) dipaládia(O) (Pd₂(dba)₃), za prítomnosti bázy, napr. tercBuONa a fosfínového ligandu, napríklad bis-difenylfosfanyl-dimetyl-9H-xanténu (xantfos), za vzniku zlúčenín všeobecného vzorca III,

z ktorých sa potom odstránia chrániace skupiny, za štandardných podmienok sa bázický hydrolyzujú a alkylujú pomocou buď;

i) zlúčeniny všeobecného vzorca R¹-CH₂-X, kde R¹ má vyššie uvedený význam a X je halogén, s výhodou bróm alebo chlór, a vhodnej bázy, alebo ii) zlúčeniny všeobecného vzorca R¹-CHO, kde R¹ má vyššie uvedený význam, a vhodného redukovadla, za vzniku zlúčenín všeobecného vzorca I.

Medzi bázy vhodné na použitie v štandardnom vyššie uvedenom alkylačnom kroku i) patria okrem iných trietylamín a uhličitan draselný.

Medzi redukovadlá vhodné na použitie v štandardnom kroku redukcie ii) patria okrem iných kyanobórhydrid sodný a triacetoxybórhydrid sodný.

Nové zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sú užitočné pri terapii, najmä na liečbu rôznych stavov bolesti, napríklad chronickej bolesti, neuropatickej bolesti, akútnej bolesti, rakovinovej bolesti, bolesti spôsobenej reumatoidnou artritídou, migrénou, viscerálnou bolesťou atď. Tento zoznam by sa však nemal vykladať ako vyčerpávajúci.

Zlúčeniny podľa vynálezu sú užitočné ako imunomodulátory, najmä na autoimunitné choroby, ako je artritída, na kožné štepy, orgánové transplantáty a podobné chirurgické potreby, na kolagénové choroby, rôzne alergie, na použitie ako protinádorové prostriedky a protivírusové prostriedky.

Zlúčeniny podľa vynálezu sú užitočné pri chorobných stavoch, kde je prítomná alebo implikovaná degenerácia alebo dysfunkcia opiátových receptorov. To môže zahŕňať použitie izotopovo označených verzií zlúčenín podľa vynálezu v diagnostických technikách a zobrazovacích aplikáciách, napríklad v pozitrónovej emisnej tomografii (PET).

Zlúčeniny podľa vynálezu sú užitočné na liečbu hnačky, depresie, anxiety a so stresom súvisiacich porúch, ako sú poruchy poúrazového stresu, panická porucha, generalizovaná anxietná porucha, sociálna fóbia a obsedantná kompulzívna porucha, inkontinencie moču, rôznych psychických chorôb, kašľa, edému pľúc, rôznych gastrointestinálnych porúch, napr. zápchy, funkčných gastrointestinálnych porúch ako syndróm dráždivého čreva a funkčná dyspepsia, Parkinsonova choroba a iné

Ρ Γ f motorické poruchy, traumatického poranenia mozgu, mŕtvice, kardioprotekcie po infarkte myokardu, zranení chrbtice a závislosti od drog, vrátane liečby zneužívania alkoholu, nikotínu, opiátov a iných drog a na poruchy sympatického nervového systému, napríklad hypertenzie.

Zlúčeniny podľa vynálezu sú užitočné na liečbu hnačky, depresie, anxiety, inkontinencie moču, rôznych psychických chorôb, kašľa, edému pľúc, rôznych gastrointestinálnych porúch, zranení chrbtice a závislosti od drog, vrátane liečby zneužívania alkoholu, nikotínu, opiátov a iných drog a na poruchy sympatického nervového systému, napríklad hypertenzie.

Zlúčeniny podľa vynálezu sú užitočné ako analgetické prostriedky na použitie počas celkovej anestézie a monitorovanej anestetickej starostlivosti. Kombinácie prostriedkov s rôznymi vlastnosťami sa často používajú na dosiahnutie rovnováhy účinkov potrebných na udržanie anestetického stavu (napr. amnézie, analgézie, svalovej relaxácie a upokojenia). V tejto kombinácii sú zahrnuté inhalované anestetiká, hypnotiká, anxiolytiká, neuromuskulárne blokátory a opiáty.

Do rozsahu vynálezu spadá aj použitie ktorejkoľvek zo zlúčenín vyššie uvedeného vzorca I na výrobu liečiva na liečbu ktoréhokoľvek z vyššie diskutovaných stavov.

Ďalším aspektom vynálezu je spôsob liečby subjektu trpiaceho ktorýmkoľvek z vyššie diskutovaných stavov, pri ktorom sa podá účinné množstvo zlúčeniny vyššie uvedeného vzorca I pacientovi s potrebou takej liečby.

Ďalším aspektom predloženého vynálezu sú intermediáty všeobecného vzorca

II a III, e ·

kde PG je uretánová chrániaca skupina, napríklad Boe a CBZ alebo benzylová alebo substituovaná benzylová chrániaca skupina, napríklad 2,4-dimetoxybenzyl.

Ďalším aspektom predloženého vynálezu sú intermediáty vzorca X;

kde R¹ má význam podľa vyššie uvedeného vzorca I.

V ďalšej alternatívnej syntetickej ceste sa krok reakcie b v schéme 2 (pozrite ďalej) uskutočňuje reakciou intermediátu všeobecného vzorca IV

kde PG je uretánová chrániaca skupina, napríklad Boe a CBZ, alebo benzylová alebo substituovaná benzylová chrániaca skupina, napríklad 2,4-dimetoxybenzyl; s /V,/V-diizopropyl-4-brómbenzamidom, použitím paládiového katalyzátora, napr. tris(dibenzylidénacetón) dipaládia(O) [Pd₂(dba)₃], za prítomnosti bázy, napr. tercBuONa a fosfínového ligandu, napríklad bis-difenylfosfanyl-dimetyl-9H-xanténu (xantfos), za vzniku zlúčenín všeobecného vzorca V,

z ktorej sa potom odstráni chrániaca skupina a zlúčenina sa alkyluje vyššie opísanými prostriedkami buď redukčné zlúčeninou všeobecného vzorca R¹-CHO alebo priamo použitím zlúčeniny všeobecného vzorca R¹-CH₂-X s nasledujúcou konverziou ketálovej funkcie na primárny amid za štandardných podmienok i) hydrolýzou ketálu na aldehyd VI, potom ii) oxidáciou aldehydu na zodpovedajúcu karboxylovú kyselinu VII a iii) amidáciou chloridom amónnym na primárny amid za vzniku zlúčenín všeobecného vzorca I.

Vhodné podmienky hydrolýzy na použitie pri štandardnom hydrolytickom kroku (i) zahŕňajú okrem iných vodnú kyselinu chlorovodíkovú v tetrahydrofuráne.

Vhodné podmienky pre oxidačný krok (ii) zahŕňajú okrem iných miešanie pri 0 °C vo vodnom dihydrogenfosforečnane sodnom a chloritane sodnom za prítomnosti nadbytku 2-metyl-2-buténu.

Vhodné podmienky pre amidačný krok (iii) zahŕňajú okrem iných pôsobenie nadbytkom chloridu amónneho za prítomnosti spájacieho činidla, napríklad benzotriazol-1-yloxytrisfosfónium hexafluórfosfátu (ďalej len Py-BOP) a 1hydroxybenzotriazolu (HOBT) za prítomnosti vychytávača kyselín, napríklad diizopropyletylamínu (DIPEA).

Spôsoby prípravy

Príklady uskutočnenia vynálezu

Vynález bude teraz opísaný podrobnejšie nasledujúcimi schémami a príkladmi, ktoré sa nemajú vysvetľovať ako obmedzenie rozsahu vynálezu.

Schéma 1: Syntéza intermediátu 3 (substrát na redukčnú amináciu)

c

Intermediát 1: 3-(1-Benzylpiperidin-4-ylamino)-4-fluórbenzonitril

Do suchej banky obsahujúcej 3-bróm-4-fluórbenzonitril (6,56 g, 1 ekv.) sa pridal suchý toluén (100 ml), 4-amino-1-benzylpiperidín (1,2 ekv.), racemický BINAP (612 mg, 0,03 ekv.), octan paládnatý (220 mg, 0,02 ekv.) a ferc-butoxid sodný (4,4 g, 1,4 ekv.). Reakčná zmes sa 20 hodín zahrievala na 80 °C pod inertnou atmosférou, ochladila sa, zriedila etylacetátom (200 ml) a premyla sa vodou (100 ml). Spojené organické vrstvy sa vysušili (MgSO4), prefiltrovali a nakoncentrovali. Vyčistením flash chromatografiou elúciou 3 % metanolom v dichlórmetáne sa získal amín (1) vo forme žltej tuhej látky (6,655 g, 66 %).

Intermediát 2: [(1-Benzylpiperidin-4-yl)-(5-kyano-2-fluórfenyl)amino]-/\/,A/diizopropylbenzamid

Do roztoku amínu (1) (3,625 g, 1 ekv.) v suchom toluéne (50 ml) sa pridal arylbromid (5,03 g; 1,5 ekv.), xantfos (546 mg; 0,08 ekv.), Pd₂(dba)₃ (433 mg; 0,04 ekv.) a ŕerc-butoxid sodný (1,70 g; 1,4 ekv.). Reakčná zmes sa zahrievala na reflux 14 hodín, ochladila sa a zriedila sa etylacetátom (100 ml). Roztok sa premyl vodou (100 ml), organické vrstvy sa vysušili (MgSO₄), prefiltrovali a nakoncentrovali. Vyčistením flash chromatografiou elúciou 50 % etylacetátu a 50 % hexánov sa získal amín 2 vo forme oranžovej peny (5,16 g, 85 %).

Intermediát 3: [(5-Kyano-2-fluórfenyl)piperidin-4-yl-amino]-/\/,/\/-diizopropylbenzamid

Do roztoku amínu 2 (5,16 g, 1 ekv.) v 1,2-dichlóretáne (80 ml) pri 0 °C sa pridal 1-chlóretyl chlórformát (1,25 ml, 1,15 ekv.). Po 15 minútach pri 0 °C sa reakčná zmes nechala ohriať na teplotu miestnosti a zahrievala sa na 70 °C 90 minút. Reakčná zmes sa ochladila a nakoncentrovala. Zvyšok sa rozpustil v metanole (80 ml) a zahrieval sa na 70 °C 1 hodinu. Roztok sa ochladil a nakoncentroval. Vyčistením flash chromatografiou elúciou 20 % metanolom v dichlórmetáne až 40 % metanolom v dichlórmetáne sa získal amín 3 vo forme žltej peny (3,301 g, 76 %).

Schéma 2: Alternatívna syntéza cez intermediát 7

NH,

N'

b

Pd₂(dba)₃, xantfos, NaOtBu toluén, 110 °C

Pd(OAc)₂, BINAP, NaO’Bu, toluén (4)

NaOCI₂, NaH₂PO₄ 'BuOH, H,O, /tí

Intermediát 4: (1-Benzylpiperidin-4-yl)-(5-[1,3]dioxolan-2-yl-2-fluórfenyl)amín

Do suchej banky obsahujúcej 2-(3-bróm-4-fluórfenyl)-1,3-dioxolán (1,0 ekv.) a 4-amino-N-benzylpiperidín (1,2 ekv.) v suchom toluéne sa pridal BINAP (0,03 ekv.), octan paládnatý (0,02 ekv.) a ŕerc-butoxid sodný (1,4 ekv.). Reakčná zmes sa zahrieva na 80 °C pod dusíkom. Po 2 hodinách sa roztok ochladí, zriedi etylacetátom a premyje jednou dávkou vody. Organický podiel sa vysuší nad bezvodým síranom horečnatým, prefiltruje a nakoncentruje. Zvyšok sa vyčistí flash chromatografiou elúciou gradientom metanolu v dichlórmetáne.

e * * » e ť· r r· f c r- f

Intermediát 5: [(1 -Benzylpiperidin-4-yl)-(5-[1,3]dioxolan-2-yl-2-fluórfenyl)amino]-/\/,A/diizopropylbenzamid

Do suchej banky obsahujúcej amín 4 v suchom toluéne (asi 6 ml na milimól 4) sa pridal arylbromid (1,4 ekv.), xantfos (0,06 ekv.), Pd₂(dba)₃ (0,03 ekv.) a terc-butoxid sodný (1,4 ekv.). Reakčná zmes sa zahrieva na 110 °C pod dusíkom. Po približne 24 hodinách sa roztok ochladí, zriedi etylacetátom a premyje jednou dávkou vody. Organický podiel sa vysuší nad bezvodým síranom horečnatým, prefiltruje a nakoncentruje. Zvyšok sa vyčistí flash chromatografiou elúciou gradientom metanolu v dichlórmetáne.

Intermediát 6: [(1 -Benzylpiperidin-4-yl)-(2-fluór-5-formylfenyl)amino]-/\/,/\/diizopropylbenzamid

Do roztoku acetálu 5 v tetrahydrofuráne sa pridá 2 N roztok HCI (2,0 ekv.). Po 16 hodinách pri laboratórnej teplote sa pridá dichlórmetán a vodná vrstva sa neutralizuje nasýteným vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného. Organická vrstva sa oddelí a vodná vrstva sa extrahuje dvoma dávkami dichlórmetánu. Spojené organické extrakty sa vysušia (MgSO₄), prefiltrujú a nakoncentrujú a zvyšok sa vyčistí flash chromatografiou elúciou etylacetátom.

Intermediát 7: Kyselina [(1-benzylpiperidin-4-yl)-(4diizopropylkarbamoylfenyl)amino]fluórbenzoová

Do roztoku aldehydu 6 (1,0 ekv.) v terc-butanole sa pridá 2-metyl-2-butén (10,0 ekv.) a roztok sa ochladí na 0 °C. Pridá sa roztok dihydrogenfosforečnanu sodného (9 ekv.) a chloritanu sodného (9 ekv.) vo vode a reakčná zmes sa mieša 30 minút pri 0 °C. 7erc-butanol sa oddelí a reakčná zmes sa extrahuje dichlórmetánom (5 x). Spojené organické extrakty sa vysušia (MgSO4), prefiltrujú a nakoncentrujú a zvyšok sa vyčistí flash chromatografiou elúciou gradientom metanolu v dichlórmetáne.

Príklad 2: Kyselina [(1 -benzylpiperidin-4-yl)-(4diizopropylkarbamoylfenyl)amino]fluórbenzoová

Do roztoku kyseliny 7 (1,0 eq) v DMF sa pridá pyBOP (1,5 eq); HOBt (1,5 ekv.), diizopropyletylamín (4,0 ekv.) a chlorid amónny (2 ekv.). Po 16-24 hodinách pri teplote miestnosti sa reakčná zmes nakoncentruje. Zvyšok sa rozpustí v etylacetáte a premyje sa dvoma dávkami vody a jednou dávkou nasýteného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Organická vrstva sa vysuší (MgSO₄), prefiltruje a nakoncentruje a zvyšok sa vyčistí flash chromatografiou elúciou gradientom metanolu v dichlórmetáne.

Zlúčeniny z ďalších príkladov sa syntetizovali všeobecnými postupmi opísanými nižšie.

A. Redukčná aminácia intermediátu 3:

Do roztoku amínu 3 v suchom tetrahydrofuráne (THF) alebo dichlóretáne sa pridá aldehyd (1 - 1,5 ekv.) apo ňom triacetoxybórhydrid sodný (1 - 1,6 ekv.). Reakčná zmes sa mieša pri laboratórnej teplote pod dusíkovou atmosférou dlhší čas (6 - 48 hodín), aby sa zabezpečilo úplné zreagovanie. Reakčná zmes sa potom podrobí štandardnému spracovaniu a štandardnému čisteniu. Množstvo THF alebo (alebo dichlóretánu) nie je podstatné. Výhodné je množstvo zodpovedajúce asi 1 ml/30 mg.

Postup 1A v syntéze zlúčeniny z príkladu 1 uvedeného nižšie je typický.

R¹

R¹'

Do roztoku kyanointermediátu v terc-butanole sa pridá pomletý hydroxid draselný (KOH) (2,5 ekv.) a výsledná zmes sa zahrieva na reflux asi dve hodiny. Zmes sa potom ochladí na laboratórnu teplotu a podrobí sa štandardnému spracovaniu a štandardnému čisteniu. Množstvo terc-butanolu nie je podstatné. Výhodné je množstvo zodpovedajúce asi 1 ml/30 mg.

Postup 1B v syntéze zlúčeniny z príkladu 1 uvedeného nižšie je typický.

Príklad 1: [(4-Diizopropylkarbamoylfenyl)-(1 -furan-3-ylmetylpiperidin-4yl)amino]fluórbenzamid

1A: [(5-Kyano-2-fluórfenyl)-(1-furan-3-ylmetylpiperidin-4-yl)amino]-/\/,/\/diizopropylbenzamid

Do roztoku amínu (406 mg) v suchom 1,2-dichlóretáne (12 ml) sa pridal 3furaldehyd (110 μΙ; 1,3 ekv.) a triacetoxybórhydrid sodný (286 mg; 1,4 ekv.). Reakčná zmes sa miešala pri teplote miestnosti pod dusíkom. Po 24 hodinách sa reakčná zmes e r zriedila dichlórmetánom a premyla nasýteným vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného. Vodná fáza sa extrahovala dvoma dávkami dichlórmetánu a spojené organické fázy sa vysušili nad bezvodým síranom horečnatým, prefiltrovali a nakoncentrovali. Zvyšok sa vyčistil flash chromatografiou elúciou 50 % etylacetátu a 50% hexánov až 90% etylacetátu a 10% hexánov. Získala sa bezfarebná pena (347,2 mg; 72 %).

1B: [(4-Diizopropylkarbamoylfenyl)-(1-furan-3-ylmetylpiperidin-4yl)amino]fluórbenzamid

Do roztoku nitrilu (347,2 mg) v terc-butanole (8 ml) sa pridal pomletý hydroxid draselný (97 mg; 2,5 ekv.) a reakčná zmes sa zahrievala na reflux. Po 90 minútach sa roztok ochladil, zriedil dichlórmetánom a premyl jednou dávkou vody. Organická fáza sa oddelila a vodná sa neutralizovala a extrahovala dvoma dávkami dichlórmetánu. Spojené organické fázy sa vysušili nad bezvodým síranom horečnatým, prefiltrovali a nakoncentrovali. Zvyšok sa vyčistil flash chromatografiou elúciou 7 % metanolu v dichlórmetáne. Získala sa bezfarebná pena (264,1 mg; 73 %). Pena sa rozpustila v éteri (8 ml) obsahujúcom trošku dichlórmetánu a pridala sa 1 N HCl v éteri (760 μΙ; s

1,5 ekv.). Po 1 hodine sa roztok nakoncentroval a tuhá látka sa vysušila pod vysokým vákuom.

Ďalšie látky boli pripravené analogicky. Analytické údaje pre syntetické príklady sú uvedené v tabuľke 1 na nasledujúcich stranách.

Tabuľka 1: Analytické údaje pre syntetické príklady

Pr.	R¹	Názov	Údaje NMR (400 MHz, CD₃OD)
1	X	[(4-Diizopropylkarbamoylfenyl)(1 -furan-3-ylmetylpiperidin-4yl)amino]fluórbenzamid	1,40 (brs, 12 H, CH₃); 1,751,82 (m, 2 H, CH₂); 2,39 (d, J = 14 Hz, 2 H, CH₂); 3,27-3,31 (m, 2 H, NCH₂); 3,63 (d, J = 13 Hz, 2 H, NCH₂); 3,88 (brs, 2 H, NCH); 4,26 (s, 2 H, NCH₂Ar); 4,464,52 (m, 1 H, NCH); 6,65 (d, J = I, 5 Hz, 1 H, Ar-H); 6,76 (d, J = 9 Hz, 2 H, Ar-H); 7,23-7,28 (m, 2 H, Ar-H); 7,46 (t, J = 9 Hz, 1 H, Ar-H); 7,68 (t, J = 1,5 Hz, 1 H, Ar-H); 7,83 (s, 1 H, Ar-H); 7,89 (dd, J = 2,5, 7 Hz, 1 H, Ar-H); 8,05-8,08 (m, 1 H, Ar-H)
2	X	[(1 -Benzylpiperidin-4-yl)-(4diizopropylkarbamoylfenyl)aminojfluórbenzamid	1,30 (brs, 12 H, CH₃); 1,641,73 (m, 2 H, CH₂); 2,30 (d, J = 12 Hz, 2 H, CH₂); 3,24 (t, J = 12 Hz, 2 H, NCH₂); 3,51 (d, J = 13 Hz, 2 H, NCH₂); 3,80 (brs, 2 H, NCH); 4,28 (s, 2 H, NCH₂Ar); 4,30-4,44 (m, 1 H, NCH); 6,67 (d, J = 8,5 Hz, 2 H, Ar-H); 7,167,18 (m, 2 H, Ar-H); 7,38 (t, J = 9 Hz, 1 H, Ar-H); 7,46 (s, 5 H, ΑγΗ); 7,80 (dd, J = 2, 7,5 Hz, 1 H, Ar-H); 7,96 - 8,00 (m, 1 H, Ar-H)
3	X	[(4-Diizopropylkarbamoylfenyl)(1 -tiazol-2-ylmetylpiperidin-4yl)amino]fluórbenzamid	1,36 (brs, 12 H, CH₃); 1,821,84 (m, 2 H, CH₂); 2,41 (d, J = 14 Hz, 2 H, CH₂); 3,44 (t, J = 12 Hz, 2 H, NCH₂); 3,78 (d, J = 12 Hz, 2 H, NCH₂); 3,90 (brs, 2 H, NCH); 4,47-4,53 (m, 1 H, NCH); 4,78 (s, 2 H, NCH₂Ar); 6,75 (d, J = 8,5 Hz, 2 H, Ar-H); 7,21-7,24 (m, 2 H, Ar-H); 7,45 - 7,48 (m, 1 H, Ar-H); 7,84 (d, J = 3,5 Hz, 1 H, Ar-H); 7,90 (dd, J = 2,5, 7,5 Hz, 1 H, Ar-H); 8,00 (d, J = 3,5 Hz, 1 H, Ar-H); 8,058,08 (m, 1 H, Ar-H)

» p f » - ' '

Λ * r - r p p f r r r * ^ŕ r e , *· * f

Pr.	R¹	Názov	Údaje NMR (400 MHz, CD₃OD)
4	tí	[(4-Diizopropylkarbamoylfenyl)- (1-pyridin-2-ylmetylpiperidin-4- yl)amino]fluórbenzamid	1,41 (brs, 12 H, CH₃); 1,891,96 (m, 2 H, CH₂); 2,39 (d, J = 14 Hz, 2 H, CH₂); 3,47 - 3,52 (m, 2 H, NCH₂); 3,71 (d, J = 12,5 Hz, 2 H, NCH₂); 3,92 (brs, 2 H, NCH); 4,54-4,57 (m, 1 H, NCH); 4,60 (s, 2 H, NCH₂Ar); 6,79 (d, J = 8,5 Hz, 2 H, Ar-H); 7,27-7,29 (m, 2 H, Ar-H); 7,48 (t, J = 9 Hz, 1 H, Ar-H); 7,62 7,64 (m, 1 H, Ar-H); 7,71 (d, J = 8 Hz, 1 H, Ar-H); 7,92 (dd, J = 2, 7,5 Hz, 1 H, Ar-H); 8,08-8,11 (m, 2 H, Ar-H); 8,76-8,78 (m, 1 H, Ar-H).
5	X^s	[(4-Diizopropylkarbamoylfenyl)- (1-tiofen-3-ylmetylpiperidin-4- yl)amino]fluórbenzamid	1,36 (brs, 12 H, CH₃); 1,741,81 (m, 2 H, CH₂); 2,38 (d, J = 14 Hz, 2 H, CH₂); 3,30 - 3,36 (m, 2 H, NCH₂); 3,59 (d, J = 12 Hz, 2 H, NCH₂); 3,86 (br s, 2 H, NCH); 4,39 (s, 2 H, NCH₂Ar); 4,464,51 (m, 1 H, NCH); 6,75 (d, J = 9 Hz, 2 H, Ar-H); 7,22-7,28 (m, 3 H, Ar-H); 7,46 (t, J = 9 Hz, 1 H, Ar-H); 7,63 (dd, J = 2, 5 Hz, 1 H, Ar-H); 7,73 - 7,74 (m, 1 H, Ar-H); 7,88 (dd, J = 2,5, 7,5 Hz, 1 H, ArHj; 8,04-8,07 (m, 1 H, Ar-H).
6	A	[(4-Diizopropylkarbamoylfenyl)(1-pyridin-4-ylmetylpiperidin-4yl)amino]fluórbenzamid	1,41 (brs, 12 H, CH₃); 1,99 (q, J = 12 Hz, 2 H, CH₂); 2,41 (d, J = 14 Hz, 2 H, CH₂); 3,51 (t, J = 12 Hz, 2 H, NCH₂); 3,69 (d, J = 11,5 Hz, 2 H, NCH₂); 3,90 (br s, 2 H, NCH); 4,54-4,58 (m, 1 H, NCH); 4,76 (s, 2 H, NCH₂Ar); 6,78 (d, J = 8 Hz, 2 H, Ar-H); 7,27 (d, J = 8,5 Hz, 2 H, Ar-H); 7,48 (t, J = 9 Hz, 1 H, Ar-H); 7,92 (d, J = 5,5 Hz, 1 H, Ar-H); 8,078,09 (m, 1 H, Ar-H); 8,38 (d, J = 6,5 Hz, 2 H, Ar-H); 9,06 (d, J = 6,5 Hz, 2 H, Ar-H).

♦ ·» t • · r * » r e * p r

Pr.	R¹	Názov	Údaje NMR (400 MHz, CD₃OD)
7		[(4-Diizopropylkarbamoylfenyl)- (1-pyridin-3-ylmetylpiperidin-4- yl)amino]fluórbenzamid	1,38 (brs, 12 H, CH₃); 1,921,98 (m, 2 H, CH₂); 2,41 (d, J = 13,5 Hz, 2 H, CH₂); 3,49 (t, J = 12 Hz, 2 H, NCH₂); 3,71 (d, J = 12 Hz, 2 H, NCH₂); 3,88 (br s, 2 H, NCH); 4,54-4,58 (m, 1 H, NCH); 4,70 (s, 2 H, NCH₂Ar); 6,79 (d, J = 8,5 Hz, 2 H, Ar-H); 7,27 (d, J = 8,5 Hz, 2 H, Ar-H); 7,47 (t, J = 9 Hz, 1 H, Ar-H); 7,91 (d, J = 5,5 Hz, 1 H, Ar-H); 8,06 8,09 (m, 1 H, Ar-H); 8,24 (dd, J = 6,8 Hz, 1 H, Ar-H); 8,88 (d, J = 8 Hz, 1 H, Ar-H); 9,06 (d, J = 6 Hz, 1 H, Ar-H); 9,23 (s, 1 H, Ar-H).
8	A)	[(4-Diizopropylkarbamoylfenyl)(1 -tiofen-2-ylmetylpiperidin-4yl)amino]fluórbenzamid	1.41 (brs, 12 H, CH₃); 1,771,81 (m, 2 H, CH₂); 2,42 (d, J = 14 Hz, 2 H, CH₂); 3,33-3,38 (m, 2 H, NCH₂); 3,66 (d, J = 12,5 Hz, 2 H, NCH₂); 3,90 (brs, 2 H, NCH); 4,49-4,54 (m, 1 H, NCH); 4,64 (s, 2 H, NCH₂Ar); 6,78 (d, J = 9 Hz, 2 H, Ar-H); 7,23 (dd, J = 3,5, 5 Hz, 1 H, ΑγΗ); 7,27 (d, J = 9 Hz, 2 H, Ar-H); 7.41 - 7,42 (m, 1 H, Ar-H); 7,48 (t, J = 9 Hz, 1 H, Ar-H); 7,71 (dd, J = 1,5 Hz, 1 H, Ar-H); 7,92 (dd, J = 2, 7,5 Hz, 1 H, Ar-H); 8,078,10 (m, 1 H, Ar-H).

Pr.	R¹	Názov	Údaje NMR (400 MHz, CD₃OD)
9	F>	[(4-Diizopropylkarbamoylfenyl)(1 -furan-2-ylmetylpiperidin-4yl)amino]fluórbenzamid	1,42 (brs, 12 H, CH₃); 1,751,83 (m, 2 H, CH₂); 2,42 (d, J = 14 Hz, 2 H, CH₂); 3,33 - 3,38 (m, 2 H, NCH₂); 3,63 (d, J = 12,5 Hz, 2 H, NCH₂); 3,85 (brs, 2 H, NCH); 4,47 (s, 2 H, NCH₂Ar); 4,48-4,52 (m, 1 H, NCH); 6,61 (dd, J = 2, 3,5 Hz, 1 H, Ar-H); 6.79 (d, J = 9 Hz, 2 H, Ar-H); 6.80 (d, J = 3 Hz, 1 H, Ar-H); 7,27 (d, J = 9 Hz, 2 H, Ar-H); 7,47-7,50 (m, 1 H, Ar-H); 7,74 (dd, J = 1,2 Hz, 1 H, Ar-H); 7,91 (dd, J = 2, 7,5 Hz, 1 H, Ar-H); 8,07-8,10 (m, 1 H, Ar-H).
10	ζΚ H	[(4-Diizopropylkarbamoylfenyl)(1 -pyrol-2-ylmetylpiperidin-4yl)amino]fluórbenzamid

Farmaceutické kompozície

Nové zlúčeniny podľa predloženého vynálezu možno podávať orálne, sublingválne, intramuskulárne, subkutánne, lokálne, intranazálne, intraperitoneálne, intratorakálne, intravenózne, epidurálne, intratekálne, intracerebroventrikulárne a injekciou do kĺbov.

Výhodnou cestou podania je orálne, intravenózne alebo intramuskulárne podanie.

Dávka bude závisieť od cesty podania, závažnosti choroby, veku a váhy pacienta a ďalších faktorov bežne zvažovaných ošetrujúcim lekárom pri určovaní individuálneho režimu a úrovne dávkovania ako najvhodnejšej pre konkrétneho pacienta.

f »

Na prípravu farmaceutických kompozícií zo zlúčenín podľa tohto vynálezu môžu byť inertné farmaceutický prijateľné nosiče buď tuhé alebo kvapalné. Medzi prípravky v tuhej forme patria prášky, tablety, dispergovateľné granuly, kapsuly, oblátky a supozitóriá.

Tuhým nosičom môže byť jedna alebo viacero látok, ktoré môžu pôsobiť aj ako riedidlá, príchute, solubilizátory, mazadlá, suspendačné prostriedky, spojivá alebo tabletové dezintegrátory; môže to byť aj puzdrový materiál.

V práškoch je nosičom jemne rozomletá tuhá látka, ktorá je v zmesi s jemne rozomletou aktívnou zložkou. V tabletách je aktívna zložka zmiešaná s nosičom majúcim potrebné väzobné vlastnosti vo vhodných pomeroch a zlisovaná do požadovaného tvaru a veľkosti.

Pri príprave kompozícií supozitórií sa nízko topiaci vosk, napríklad zmes glyceridov mastných kyselín a kakaového masla, najprv roztopí a aktívna zložka sa v ňom disperguje napríklad miešaním. Roztavená homogénna zmes sa potom naleje do foriem vhodnej veľkosti a nechá sa vychladnúť a stuhnúť.

Vhodnými nosičmi sú uhličitan horečnatý, stearan horečnatý, mastenec, laktóza, cukor, pektín, dextrín, škrob, tragant, metylcelulóza, nátrium karboxymetylcelulóza, nízko topiaci vosk, kakaové maslo a podobne.

Medzi soli patria okrem iných aj farmaceutický prijateľné soli. Medzi príklady farmaceutický prijateľných solí v rámci rozsahu predloženého vynálezu patria: acetát, benzénsulfonát, benzoát, bikarbonát, bitartrát, bromid, kalcium acetát, kamzylát, karbonát, chlorid, citrát, dihydrochlórid, edetát, edisylát, estolát, esylát, fumarát, glukaptát, glukonát, glutamát, glykolylarzanilát, hexylrezorcinát, hydrabamín, hydrobromid, hydrochlorid, hydroxynaftoát, isetionát, laktát, laktobionát, malát, maleát, mandelát, mezylát, metylbromid, metylnitrát, metylsulfát, mukát, napsylát, nitrát, pamoát (embonát), pantotenát, fosfát/difosfát, polygalakturonát, salicylát, stearát, subacetát, sukcinát, sulfát, tanát, tartrát, teoklát, trietjodid a benzatín.

f » e r e

Medzi príklady farmaceutický neprijateľných solí v rámci rozsahu predloženého vynálezu patria: hydrojodid, perchlorát a tetrafluórborát. Mohli by byť využiteľné aj farmaceutický neprijateľné soli vzhľadom na svoje výhodné fyzikálne a/alebo chemické vlastnosti, napríklad kryštalinitu.

Výhodné farmaceutický prijateľné soli sú hydrochloridy, sírany a bitartráty.

Hydrochloridové a síranové soli sú osobitne výhodné.

Pojem kompozícia zahŕňa prípravok aktívnej zložky s púzdrovým materiálom ako nosičom tvoriacim kapsulu, v ktorej je aktívna zložka (s ďalšími nosičmi alebo bez nich) obalená nosičom, ktorý je takto v spojení s ňou. Podobne sú zahrnuté aj oblátky.

Tablety, prášky, oblátky a kapsuly možno použiť ako tuhé liekové formy vhodné na orálne podanie.

Medzi kvapalné kompozície patria roztoky, suspenzie a emulzie. Ako príklady vodných prípravkov vhodných na parenterálne podanie možno spomenúť roztoky aktívnej zlúčeniny v sterilnej vode alebo vodno-propylénglykolové roztoky. Kvapalné kompozície možno formulovať aj v roztoku vo vodno-polyetylénglykolovom roztoku.

Vodné roztoky na orálne podanie možno pripraviť rozpustením aktívnej zložky vo vode a pridaním vhodných farbív, príchutí, stabilizátorov a zahusťovadiel podľa potreby. Vodné suspenzie na orálne použitie možno pripraviť dispergovaním jemne rozomletej aktívnej zložky vo vode spolu s viskóznym materiálom, napríklad prírodnými syntetickými gumami, živicami, metylcelulózou, nátrium karboxymetylcelulózou a ďalšími suspendačnými prostriedkami známymi v oblasti farmaceutických formulácií.

Farmaceutická kompozícia je s výhodou v jednotkovej liekovej forme. V takej forme je kompozícia rozdelená na jednotkové dávky obsahujúce vhodné množstvá aktívnej zložky. Jednotkovou liekovou formou môže byť balený prípravok, pričom balenie obsahuje diskrétne množstvá prípravku, napríklad balené tablety, kapsuly a prášky v liekovkách alebo ampulkách. Jednotkovou liekovou formou môže byť aj kapsula, oblátka alebo tableta samotná, alebo to môže byť vhodné množstvo ktorýchkoľvek z týchto balených foriem.

Biologické hodnotenie

In vitro model

Bunková kultúra

A. Ľudské bunky 293S exprimujúce klonované ľudské receptory μ, δ a κ a neomycínovú rezistenciu sa kultivovali v suspenzii pri 37 °C a 5 % CO₂v trepačkových bankách obsahujúcich bezkalciový DMEM 10 % FBS, 5 % BCS, 0,1 % Pluronic F-68 a 600 μg/ml geneticínu.

B. Myšacie a potkanie mozgy sa odvážili a prepláchli v ľadovo studenom PBS (obsahujúcom 2,5 mM EDTA, pH 7,4). Mozgy sa homogenizovali polytrónom 15 s (myš) alebo 30 s (potkan) v ľadovo studenom lýznom tlmivom roztoku (50 mM Tris, pH 7,0, 2,5 mM EDTA, s fenylmetylsulfonyl fluoridom pridaným bezprostredne pred použitím do 0,5 mM z 0,5 M zásobného roztoku v DMSO:etanol).

Príprava membrán

Bunky sa granulovali a resuspendovali v lýznom tlmivom roztoku (50 mM Tris, pH 7,0, 2,5 mM EDTA s prídavkom PMSF bezprostredne pred použitím na 0,1 mM z 0,1 M zásobného roztoku v etanole), inkubovali sa na ľade 15 min a potom sa homogenizovali polytrónom počas 30 s. Suspenzia sa centrifugovala pri 1000 g (max) počas 10 min pri 4 °C. Supernatant sa odložil na ľad a granuly sa resuspendovali a centrifugovali ako predtým. Supernatanty z oboch centrifugovaní sa skombinovali a centrifugovali pri 46 000 g (max) počas 30 min. Granuly sa resuspendovali v studenom tlmivom roztoku Tris (50 mM Tris/CI, pH 7,0) a centrifugovali sa znova. Konečné granuly sa resuspendovali v membránovom tlmivom roztoku (50 mM Tris, 0,32 M sacharózy, pH 7,0). Alikvóty (1 ml) v polypropylénových skúmavkách sa zmrazili v suchom ľade s etanolom a uložili sa pri -70 °C až do použitia. Proteínové koncentrácie sa určili modifikovaným Lowryho testom pomocou SDS.

Skúšky viazania

Membrány sa roztopili pri 37 °C, ochladili sa na ľade, pretlačili sa 3 krát cez ihlu veľkosti 25 a zriedili sa do väzobného tlmivého roztoku (50 mM Tris, 3 mM MgCI₂, 1 mg/ml BSA (Sigma A-7888), pH 7,4, ktorý sa uložil pri 4 °C po prefiltrovaní cez 0,22 m filter a do ktorého sa čerstvo pridalo 5 pg/ml aprotinínu, 10 μΜ bestatínu, 10 μΜ diprotínu A, žiadny DTT). Alikvóty po 100 μΙ sa pridali do ľadom chladených 12 x 75 mm polypropylénových skúmaviek obsahujúcich 100 μΙ príslušného rádioligandu a 100 μΙ testovanej zlúčeniny pri rôznych koncentráciách. Celkové (TB) a nešpecifické (NS) viazanie bolo určené za neprítomnosti a prítomnosti 10 μΜ naloxónu. Skúmavky sa vírili a inkubovali pri 25 °C počas 60 - 75 min, na čo sa obsah rýchlo odsal a premyl približne 12 ml/skúmavku ľadového premývacieho tlmivého roztoku (50 mM Tris, pH 7,0, 3 mM MgCI₂) cez filtre GF/B (Whatman) namočené najmenej 2 h vopred v 0,1 % polyetylénimíne. Rádioaktivita (dpm) zachytená na filtroch sa zmerala pomocou beta počítača po máčaní filtrov počas aspoň 12 h v miniampulkách obsahujúcich 6 - 7 ml scintilačnej tekutiny. Ak sa test robí v 96-jamkových platničkách s hlbokými jamkami, filtrácia sa robí cez 96-miestne unifiltre namočené v PEI, ktoré sa premyjú 3 x 1 ml premývacieho tlmivého roztoku a vysušia v peci pri 55 °C počas 2 h. Filtračné platničky sa spočítali v prístroji TopCount (Packard) po pridaní 50 μΙ MS-20 scintilačnej tekutiny na jednu jamku.

Funkčné testy

Agonistická aktivita zlúčenín sa meria určovaním stupňa, v ktorom komplex zlúčenín s receptorom aktivuje viazanie GTP na G-proteíny, na ktoré sú receptory naviazané. V teste viazania GTP sa GTP[y]³⁵S kombinuje s testovanými zlúčeninami a membránami z buniek HEK-293S exprimujúcich klonované ľudské opiátové receptory alebo z homogenizovaného potkanieho a myšacieho mozgu. Agonisti stimulujú viazanie GTP[y]³⁵S v týchto membránach. Hodnoty EC50 a E_max zlúčenín sa určujú z kriviek dávka - odozva. Uskutočňujú sa posuny krivky dávka - odozva doprava pomocou delta agonistu naltrindolu, aby sa overilo, či je agonistická aktivita sprostredkovaná cez delta receptory.

r t

Postup pre GTP potkanieho mozgu

Membrány potkanieho mozgu sa rozmrazia pri 37 °C, 3 krát sa nechajú prejsť cez ihlu veľkosti 25 s tupým koncom a zriedia sa vo väzobnom roztoku GTPyS (50 mM Hepes, 20 mM NaOH, 100 mM NaCI, 1 mM EDTA, 5 mM MgCI₂, pH 7,4, pridá sa čerstvé: 1 mM DTT, 0,1 % BSA). 120 μΜ GDP v konečnej koncentrácii sa pridá do membránových zriedení. EC₅o a Emax zlúčenín sa vyhodnotí z 10-bodových kriviek dávka - odozva nameraných v 300 pl s vhodným množstvom membránového proteínu (20 pg/jamka) a 100 000 - 130 000 rozpadov za minútu GTPy³⁵S na jamku (0,11 0,14 nM). Bazálne a maximálne stimulované viazanie sa určí za neprítomnosti a za prítomnosti 3 pM SNC-80.

Analýza dát

Špecifické viazanie (SB) sa vypočítalo ako TB-NS a SB za prítomnosti rôznych testovaných zlúčenín sa vyjadrilo ako percento kontrolného SB. Hodnoty IC₅₀a Hillových koeficientov (n_H) pre ligandy pri vytesňovaní špecificky viazaného rádioligandu sa vypočítali z logaritmických kriviek alebo programov na prekladanie kriviek bodmi ako Ligand, GraphPad Prism, SigmaPlot alebo ReceptorFit. Hodnoty K, sa vypočítali z Cheng-Prussoffovej rovnice. Stredné ± S.E.M. hodnoty pre IC₅₀, K, a n_Hsa udávajú pre ligandy testované aspoň troma krivkami vytesňovania. Biologická aktivita zlúčenín podľa predloženého vynálezu je uvedená v tabuľke 2.

Tabuľka 2: Biologické údaje

Pr. č.	H Delta (nM)	Potkaní mozog (nM)	Myšací mozog (nM)
	IC50	EC50	%EMax	EC50	%EMax	EC50	%EMax
1-9	0,4- 1,155	0,38- 4,558	86,77- 106,11	3,203- 59,76	115- 176,433	3,509- 51,477	99,535- 155,587

Experimenty nasýtenia receptorov

Hodnoty Kg rádioligandov sa určili uskutočnením testov viazania na bunkových membránach s vhodnými rádioligandmí pri koncentráciách od 0,2 do 5-násobku odhadovanej Kg (až do 10 krát, ak sú potrebné množstvá rádioligandu praktické). Špecifické viazanie rádioligandu sa vyjadrilo v pmol/mg membránového proteinu. Hodnoty Kg a B_max z jednotlivých experimentov sa získali z nelineárnych závislostí špecificky viazaného (B) oproti nM voľného (F) rádioligandu z jednotlivca podľa jednomiestneho modelu.

Určenie mechano-alodýnie pomocou Von Freyovho testu

Test sa uskutočnil medzi 08:00 a 16:00 h použitím metódy, ktorú opísal Chaplan et al. (1994). Potkany sa umiestnili do plexisklových klietok na dne z drôteného sita, ktoré umožňovalo prístup k labkám, a nechali sa udomácniť 10-15 min. Testovanou oblasťou bol stred chodidla zadnej labky vyhýbajúc sa menej citlivým chodidlovým vankúšikom. Labky sa dotýkalo pomocou série 8 Von Freyových vlasov s logaritmický narastajúcou tuhosťou (0,41, 0,69, 1,20, 2,04, 3,63, 5,50, 8,51 a 15,14 gramov: Stoelting, III, USA). Von Freyov vlas sa aplikoval odspodu cez podlahu z drôteného sita kolmo na povrch chodidla s dostatočnou silou, aby sa spôsobilo mierne prehnutie oproti labke, a držal sa približne 6-8 sekúnd. Pozitívna odozva sa zaznamenala, ak bola labka prudko odtiahnutá. Myknutie okamžite po odstránení vlasu sa tiež považovalo za pozitívnu odozvu. Chôdza sa považovala za nejednoznačnú reakciu a v takých prípadoch sa stimul opakoval.

Protokol testu

Zvieratá sa testovali na pooperačný deň 1 pre skupinu ošetrenú FCA. Prah 50 % uhýbania sa určil pomocou Dixonovej metódy zdola nahor (1980). Testovanie sa začalo 2,04 g vlasom uprostred série. Stimuly sa vždy prezentovali postupne, či vzostupne alebo zostupne. Za neprítomnosti reakcie odtiahnutia labky na prvotne vybraný vlas sa prezentoval silnejší stimul; v prípade odtiahnutia labky sa zvolil nasledujúci slabší stimul. Výpočet optimálneho prahu touto metódou vyžaduje 6 reakcií v bezprostrednej blízkosti 50 % prahu a počítanie týchto 6 reakcií začalo, keď sa objavila prvá zmena v reakcii, teda keď sa prvýkrát prekročil prah. V prípadoch, kedy prahy spadali mimo intervalu stimulov, priradili sa hodnoty 15,14 (normálna citlivosť) alebo 0,41 (maximálne alodynické). Výsledný vzor pozitívnych a negatívnych reakcií sa vyjadril v tabuľkovej forme pomocou konvencie X = žiadne odtiahnutie; O = odtiahnutie a 50 % prah odťahovania sa interpoloval pomocou vzorca:

% g prah = 10^{(Xf + kô)}/10 000 kde Xf = hodnota posledného použitého von Freyovho vlasu (logaritmické jednotky); k = tabuľková hodnota (z Chaplan et al. (1994)) pre vzor pozitívnych/negatívnch reakcií; a δ = stredný rozdiel medzi stimulmi (logaritmické jednotky). Tu δ = 0,224.

Von Freyove prahy sa skonvertovali na percento maximálneho možného účinku (% MPE) podľa Chaplan et al. 1994. Na výpočet % MPE sa použila nasledujúca rovnica:

% MPE = Prah pod pôsobením liečiva (g) - prah alodýnie (g) x 100 kontrolný prah (g) - prah alodýnie (g)

Podávanie testovanej látky

Potkanom sa injekčné podala (subkutánne, intraperitoneálne, intravenózne alebo orálne) testovaná látka pred von Freyovým testom, pričom čas medzi podaním testovanej zlúčeniny a von Freyovým testom sa menil v závislosti od povahy testovanej zlúčeniny.

Test zvíjania

Kyselina octová vyvoláva brušné kontrakcie pri intraperitoneálnom podaní myšiam. Tie potom typickým spôsobom vystierajú telo. Keď sa podajú analgetiká, tento opísaný pohyb sa pozoruje menej často a liečivo je potenciálne dobrým kandidátom.

Za kompletný atypický reflex zvíjania sa považuje to, keď sú prítomné nasledujúce prvky: zviera sa nehýbe, dolná časť chrbta je mierne preliačená, sú pozorovateľné dolné plochy chodidiel oboch labiek. V tomto teste zlúčeniny podľa predloženého vynálezu vykazujú signifikantnú inhibíeiu odoziev zvíjania po orálnom podaní 1-100 pmol/kg.

(i) Príprava roztokov

Kyselina octová (AcOH): 120 μΙ kyseliny octovej sa pridá do 19,88 ml destilovanej vody, aby sa získal konečný objem 20 ml s konečnou koncentráciou 0,6 % AcOH. Roztok sa potom pomieša (vírivka) a je pripravený na injekciu.

Zlúčenina (liečivo): Každá zlúčenina sa pripraví a rozpustí v najvhodnejšom vehikule podľa štandardných postupov.

(ii) Podávanie roztokov

Zlúčenina (liečivo) sa podá orálne, intraperitoneálne (i.p.), subkutánne (s.c.) alebo intravenózne (i.v.) pri 10 ml/kg (s prihliadnutím na priemernú telesnú hmotnosť myší) 20, 30 alebo 40 minút (podľa triedy zlúčeniny a jej charakteristík) pred testovaním. Keď sa zlúčenina podáva centrálne - intraventrikulárne (i.c.v.) alebo intratekálne (i.t.), podá sa objem 5 μΙ.

AcOH sa podá intraperitoneálne (i.p.) na dvoch miestach pri 10 ml/kg (s prihliadnutím na priemernú telesnú hmotnosť myší) bezprostredne pred testovaním.

(iii) Testovanie

Zviera (myš) sa pozoruje počas 20 minút a počet výskytov (reflexu zvíjania) sa zaznamená a sumarizuje na konci experimentu. Myši sa držia v individuálnych klietkach typu škatule na topánky s kontaktnou podstielkou. Obyčajne sa súčasne pozorujú 4 myši: jedna kontrolná a tri dávky liečiva.

Pre indikácie anxiety a anxiete podobné indikácie sa účinnosť stanovila Geller Seirterovým testom konfliktu u potkanov.

Pre indikáciu funkčnej gastrointestinálnej poruchy sa účinnosť stanovila testom, ktorý opísal Coutinho S. V. eŕ a/, American Journal of Physiology - Gastrointestinal & Liver Physiology, 282 (2): G307 - 16, február 2002, na potkanoch.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Zlúčenina vzorca I kde

R¹ je vybrané z nasledujúcich:

(i) fenyl;

(ii) pyridinyl

N (iii) tienyl (iv) furanyl (v) imidazolyl (vi) triazolyl

J1 (vii) pyrolyl y \\ (viii) tiazolyl (ix) pyridyl-N-oxid kde každý fenylový kruh R¹ a heteroaromatický kruh R¹ môže byť nezávisle ďalej substituovaný 1, 2 alebo 3 substituentmi nezávisle vybranými spomedzi r ť* r e r r e r e nasledujúcich: lineárny a rozvetvený C^-Ce alkyl, NO₂, CF₃, CrC₆ alkoxy, chlór, fluór, bróm, a jód, ako aj ich soli.
2. Zlúčenina podľa nároku 1, kde každý fenylový kruh R¹ a heteroaromatický kruh R¹ môže byť nezávisle ďalej substituovaný 1, 2 alebo 3 substituentmi nezávisle vybranými spomedzi nasledujúcich: metyl, CF₃, chlór, fluór, bróm, and jód.
3. Zlúčenina podľa nároku 1, kde každý fenylový kruh R¹ a heteroaromatický kruh R¹ môže byť nezávisle ďalej substituovaný metylovou skupinou.
4. Zlúčenina podľa nároku 1, kde R¹ je fenyl, pyrolyl, pyridinyl, tienyl alebo furanyl.
5. Zlúčenina podľa nároku 1, vybraná spomedzi nasledujúcich [(4-diizopropylkarbamoylfenyl)-(1-furan-3-ylmetylpiperidin-4yl)amino]fluórbenzamid, [(1-benzylpiperidin-4-yl)-(4-diizopropylkarbamoylfenyl)amino]fluórbenzamid, [(4-diizopropylkarbamoylfenyl)-(1-tiazol-2-ylmetylpiperidin-4yl)amino]fluórbenzamid, [(4-diizopropylkarbamoylfenyl)-(1-pyridin-2-ylmetylpiperidin-4yl)amino]fluórbenzamid, [(4-diizopropylkarbamoylfenyl)-(1-tiofen-3-ylmetylpiperidin-4yl)amino]fluórbenzamid, [(4-diizopropylkarbamoylfenyl)-(1-pyridin-4-ylmetylpiperidin-4yl)amino]fluórbenzamid, [(4-diizopropylkarbamoylfenyl)-(1-pyridin-3-ylmetylpiperidin-4yl)amino]fluórbenzamid, [(4-diizopropylkarbamoylfenyl)-(1-tiofen-2-ylmetylpiperidin-4yl)amino]fluórbenzamid, [(4-diizopropylkarbamoylfenyl)-(1-furan-2-ylmetylpiperidin-4yl)amino]fluórbenzamid a

F - t ŕ [(4-diizopropylkarbamoylfenyl)-(1-pyrol-2-ylmetylpiperidin-4yl)amino]fluórbenzamid.
6. Zlúčenina podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov vo forme svojho dihydrochloridu, sulfátu, tartrátu, ditrifluóracetátu alebo citrátu.
7. Postup na prípravu zlúčeniny vzorca I, zlúčeniny všeobecného vzorca II vyznačujúci sa tým, že zahŕňa reakciu kde PG je uretánová chrániaca skupina, napríklad Boe a CBZ, alebo benzylová alebo substituovaná benzylová chrániaca skupina, napríklad 2,4-dimetoxybenzyl, s N,N-diizopropyl-4-brómbenzamidom, použitím paládiového katalyzátora, napr. (Pd₂(dba)₃), za prítomnosti bázy, napr. ŕerc-butoxidu sodného, za vzniku zlúčenín všeobecného vzorca III,

N

I

PG (Hl) z ktorej sa potom odstráni chrániaca skupina za štandardných podmienok a alkyluje sa za redukčných podmienok zlúčeninou všeobecného vzorca R¹-CHO za vzniku zlúčenín všeobecného vzorca I.
8. Zlúčenina podľa nároku 1 na použitie pri terapii.
9. Použitie zlúčeniny vzorca I podľa nároku 1 na výrobu liečiva na použitie pri liečbe bolesti, anxiety alebo funkčných gastrointestinálnych porúch.
10. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že zahŕňa zlúčeninu vzorca I podľa nároku 1 ako aktívnu zložku spolu s farmaceutický prijateľným nosičom.
11. Spôsob liečby bolesti, vyznačujúci sa tým, že sa účinné množstvo zlúčeniny vzorca I podľa nároku 1 podá subjektu s potrebou manažmentu bolesti.
12. Spôsob liečby funkčných gastrointestinálnych porúch, vyznačujúci sa tým, že sa účinné množstvo zlúčeniny vzorca I podľa nároku 1 podá subjektu trpiacemu touto funkčnou gastrointestinálnou poruchou.
13. Spôsob liečby anxiety, vyznačujúci sa tým, že sa účinné množstvo zlúčeniny vzorca I podľa nároku 1 podá subjektu trpiacemu touto anxietou.
14. Zlúčenina všeobecného vzorca III

CN

PG (III) kde PG je uretánová chrániaca skupina, napríklad Boe a CBZ alebo benzylová alebo substituovaná benzylová chrániaca skupina, napríklad 2,4-dimetoxybenzyl.

kde R¹ je vybrané spomedzi nasledujúcich: fenyl, pyridinyl, tienyl, furanyl, imidazolyl, triazolyl, pyrolyl, tiazolyl alebo pyridyl-N-oxid.