SK12762003A3 - Peptid, farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a použitie peptidu - Google Patents

Description

Peptid, farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a použitie peptidu

Oblasť techniky

Popisujú sa nové peptidy, ktoré je možné použiť ako antagonistov β₂ integrínov pre farmaceutické prostriedky obsahujúce uvedené peptidy. Peptidy je možné použiť pri výrobe farmaceutických prostriedkov na liečbu zápalových ochorení a leukémií u človeka a pri inhibícii adhézie a migrácie leukocytov. Ďalej sa nové peptidy používajú pri terapeutickej a profylaktickej liečbe zápalových ochorení a leukémií u človeka a ako antagonistov β₂ integrínov pre biochemickú izoláciu a čistenie in vitro.

Doterajší stav techniky

Migrácia lymfocytov telom a rôznymi lymfoidnými orgánmi je nevyhnutný element imunitného systému. Pri cirkulácii v krvi a lymfatických dráhach sú leukocyty v kludovom štádiu s nízkou adhéziou. Keď sú však lymfocyty stimulované signálmi z imunitného systému, ako je expozícia imunitnému komplexu alebo chemokínovému gradientu, aktivujú sa ich integrínové adhezívne receptory. Aktivácia integrínov je podstatná pri mnohých funkciách leukocytov. Takýmito funkciami sú napríklad väzba na bunky prezentujúca antigén, recirkulácia lymfatickými žľazami a migrácia mimo vaskulárny systém a extrabunkovú matricu do miest, kde prebieha zápal. Aktivácia integrínov musí byť prísne regulovaná, pretože nesprávna adhézia leukocytov vedie k podstatným poraneniam normálnych tkanív.

Leukocyty exprimujú špecifickú podsadu rodiny integrínov, β₂ integríny. V súčasnosti sú známy štyria zástupcovia tejto rodiny. Uvedené integríny vykazujú bežný β₂ reťazec (ČD 18), ale odlišné oí podjednotky (oí_l alebo CDlla, oí_m alebo CDllb, a_x alebo CDlle a a_D alebo CDlld) (popisuje sa v publikácii Gahmberg,

C. G., Tolvanen, M., and Kotovuori, P. (1997). Leukocyte adhesion. Structure and function of human leukocyte integrines and their cellular ligands. Eur. J. Biochem. 245, 215-232). Podjednotky a obsahujú konzervovaných 200 zvyškov oblasti A alebo I, ktoré sú nevyhnutné pri naviazaní väčšiny ligandov. Kryštalické štruktúry oblasti I z podjednotiek a_L a a_M indikujú prítomnosť väzobného miesta katiónov, ktoré sa nazýva miesto adhézie závislé na kove. Substitúcia aminokyselín v tomto mieste bráni naviazaniu ligandov (popisuje sa v publikácii Huang, C. and Springer, T. A. (1995) . A binding interface on the I domain of lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA1) required for specific interaction with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1). J. Biol. Chem. 270, 19008-19016, Kamata, T., Wright, R., and Takada, Y. (1995), Critical threonine and aspartic acid residues within the I domains of β₂ integrins for interactions of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and C3bi. J. Biol. Chem. 270, 12531-12535).

Hlavné ligandy týchto integrínov ICAM patria do superrodiny imunoglobulínov a bolo opísaných päť ICAM s málo odlišnými väzobnými špecifikami. Expresia ICAM-1 na endoteliálnych bunkách je predmetom stimulácie pre zápalové cytokíny, ktoré zosilňujú adhéziu sprostredkovanú β₂ integrínami leukocytov na endoteliálnych bunkách. Okrem ICAM, sú známymi ligandami β₂ integrínov fibrinogén a proteín komplementu iC3b, najmä potom α_Μβ₂ (Mac-1) .

Vzhladom na dôležitosť β₂ integrínov v prípade funkcie integrínov, ich antagonistami sú potencionálne protizápalové činidlá. Protilátky proti β₂ integrínom alebo ICAM majú terapeutický účinok na zvieracích modeloch imunologických porúch. Činidlá, ktoré sú zamerané na β₂ integríny môžu tiež byť dôležité pri vývoji terapeutických stratégií v prípade leukémií u človeka (popisuje sa v publikácii Lalancette, M., Aoudjit, F., Potworowski, E. F., and St-Pierre, Z. (2000). Resistance of ICAM-1 deficient mice to metastasis overcome by increased aggressiveness of lymphoma cells. Blood 95, 314-319).

Doposiaľ je však opísaných len niekoľko málo malých molekúl antagonistov β₂ integrínov (popisuje sa v publikácii Kallen, J., Welzenbach, K., Ramage, P., Geyl, D., Kriwacki, R., Legge, G., Cottens, S., Weitz-Schmidt, G., and Hommel, U. (1999) . Structural basis for LFA-1 inhibitionupon lovastain binding to the CDlla I-domain. J. Mol. Biol. 292, 1-9, Kelly, T. A., Jeanfavre, D. D., McNeil, D. W., Woska, Jr., J. R., Reilly, P.L., Mainolfi, E. A., Kishimoto, K. M., Nabozny, G. H., Zinter, R., Bormann, B.-J., and Rothlein , R. (1999). A small molecule anatagonist of LFA-l-mediated celí adhesion. J. Immunol. 163, 5173-5177). Nedostatok takýchto zlúčenín bráni detailnému skúmaniu úlohy každého člena rodiny β₂ integrínov pri šírení leukémie rovnako ako zápalových ochorení. Potrebné je najmä navrhnúť zlúčeniny, ktoré rozlišujú aktívne a neaktívne štádium integrínov. Modelovanie takých malých molekúl inhibítorov je sťažené veľkým rozmerom doposiaľ vyvinutých peptidových ligandov. Lineárne peptidy, keď sa vyskytujú volne v roztoku, nemajú často dobre definovanú štruktúru. Medzi niekoľkými málo objavenými ligandami β₂ integrínov je peptid, známy ako PI, obsahujúci 22 aminokyselín, ktorý sa získal z ICAM-2 (popisuje sa v publikácii Li, R., Nortamo, P., Valmu., L., Tolvanen, M., Huuskonen, J., Kantor, C., and Gahmberg, C. G. (1993) . A peptide from ICAM-2 binds to the leukocyte integrin CDlla/CD18 and inhibits endothelial celí adhesion. J. Biol. Chem. 268, 17513-17518) . Tento peptid si uchoval účinok aktivácie integrínov leukocytu, ktorý je typický pre ICAM-2 (popisuje sa v publikácii Li, R., Xie, J., Kantor, C., Koistinen, V., Aitieri, D. C., Nortamo, P., and Gahmberg, C. G. (1995). A peptide derived from the intercellular adhesion molecule-2 regulates the avidity of the leukocyte integrins CDllb/CD18 and CDllc/CDl8. J. Celí. Biol. 129, 1143-1153, Kotovuroi, A., efficient activators affinity. J. Immunol.

Pessa-Morikawa, T., Kotovuori, P., Nortamo, P., and Gahmberg,

C. G. (1999) . ICAM-2 and peptide form its binding domain are of leukocyte adhesion and integrin

162, 6613-6620). Oblasti stanovujúce komplementaritu protilátok proti β₂ integrínom sú ďalším zdrojom ligandových peptidov a jeden z izolovaných peptidov obsahujúci 23 aminokyselín vykazoval podobnosť so sekvenciou prítomnou v ICAM-1 (Feng, Y., Chung, D., Garrar, L., McEnroe, G., Lim, D., Scardina, J., McFadden, K., Guzzetta, A., Lam, A., Abraham, J., Liu, D., and Endemann, G. (1998). Peptides derived from the compleraentarydetermining regions of anti-Mac-1 antibodies block intercellular adhesion molecule-1 interaction with Mac-1. J. Biol. Chem. 273, 5625-5630).

S cielom vývoja malých peptidových ligandov pre β₂ integríny, sa testovali náhodné peptidové knižnice vyjadrené vo vláknitom fágu. Výsledkom spôsobu vyjadrenia vo fágu sú selektívne peptidové ligandy voči druhom integrínov οί₅βι (popisuje sa v publikácii Koivunen, E., Wang, B., and Ruoslathi, E. (1994). Isolation of a híghly specific ligand for the οί₅βι integrin from a phage display library. J. Celí. Biol. 124, 373-380), α_νβ3/β5 (popisuje sa v publikácii Koivunen,

E., Wang, B., and Ruoslahti, E. (1995). Phage Libraries displaying cyclic peptides with different ring sizes: ligand specificities of the RGD-directed integrins. Bio/Technology 13, 265-270) a α_νβ₆ (popisuje sa v publikácii Kraft, S.,

Diefenbach, B., Mehta, R., Jonczyk, A., Luckenbach, G.A., and Goodman, S. L. (1999). Definition of an unexpected ligand recognition motif for α_νβ₆ integrin. J. Biol. Chem. 274, 19791985) . Testovanie fágovej knižnice tiež potvrdilo, že predošlé zistenia, že tripeptidová sekvencia RGD je bežnou rozoznávacou sekvenciou podsady integrínov (popisuje s v publikácii

Pierschbacher, M. D., and Ruoslahti, E. (1984) . The celí attachment activity of fibronectin can be duplicated by small fragments of the raolecule. Náture. 309,30-33) . Navyše sa skúmali zjavné nabité analógy RGD, ako sú RLD, KGD a NGR. Je známe, že integríny leukocytov α₄βι a α₄β₇ vykazujú špecifickosť pre peptidy obsahujúce iný typ tripeptidovej sekvencie LDV (popisuje sa v publikácii Komoríya, A., Green, L. J., Mervic, M., Yamada, S. S. Yamada, K. M., and Humphries, M. J. (1991). The minimal essential sequence for a major celí type-specific adhesion site (CS1) within the alternatively spliced type III connecting segment domain o fibronectin is leucine-aspartic acid-valine. J. Biol. Chem. 266, 15075-15079).

Podstata vynálezu

Bolo zistené, že β₂ integríny špecifické pre leukocyty rozoznávajú motív obsahujúci tri aminokyseliny. Ukázalo sa, že tripeptid vhodný pre α_Μβ₂ integrín bol skôr neznámy adhezívny motív LLG. Motív LLG je prítomný na ICAM-1, čo je hlavný ligand β₂ integrínu, ale tiež na niekolkých matricových proteínoch zahrnujúcich von Willebrandov faktor a kolagény. Vyvinul sa nový β₂ integrínový antagonistický peptid nazvaný LLG-C4, ktorý vykazuje štruktúru s votknutým disulfidom, ako sa stanovilo pomocou NMR. Tento bis-cyklický peptid je silným inhibítorom leukocytovej bunečnej adhézie a migrácie a je novou vedúcou zlúčeninou pri vývoji protizápalových činidiel.

Predmetom vynálezu ktoré zahrnujú štruktúru	je	vytvorenie	nových peptidov,
LLG,
alebo ich štruktúrne	alebo	chemické	analógy, ktorých
štruktúra zodpovedá sekvencií	zobrazenej	v sekvencií SEQ ID

NO: 1 uvedenej na zozname sekvencií.

Vynález ďalej popisuje nové peptidy obsahujúce štruktúru

CXCXLLGCC, ktorá zodpovedá sekvencií zobrazenej v sekvencii SEQ ID NO: 2 uvedenej na zozname sekvencií, kde symbol X je ľubovoľný aminokyselinový zvyšok, alebo ich štrukturálne alebo chemické analógy.

Vynález ďalej popisuje peptidy obsahujúce štruktúru

CPCFLLGCC, ktorá zodpovedá sekvencii uvedenej v sekvencii SEQ ID NO:

v zozname sekvencií, alebo jej ich štrukturálne a chemické analógy.

Výhodné sú peptidy so sekvenciou SEQ ID NO: 3, kde peptid obsahuje dve disulfidové väzby. Osobitne výhodný je peptid s jednou disulfidovou väzbou medzi cysteínami Cl a C8 a druhá disulfidová väzba je medzi cysteínami C3 a C9.

Vynález tiež popisuje použitie nových peptidov ako farmaceutických prostriedkov. Vynález ďalej popisuje farmaceutické prostriedky obsahujúce nové peptidy v spojení s farmaceutický prijateľným nosičom.

Vynález tiež zahrnuje použitie nových peptidov pri výrobe farmaceutických prostriedkov na liečbu zápalových ochorení a leukémií u človeka a všeobecne, pre inhibíciu adhézie a migrácie leukocytu. Ďalej vynález popisuje spôsob terapeutickej a profylaktickej liečby zápalových ochorení u človeka, ktorý zahrnuje aplikáciu alebo profylaktický účinného množstva nového peptidu podľa vynálezu subjektu, ktorý potrebuje uvedenú liečbu.

Nové peptidy podľa vynálezu sa môžu tiež použiť ako agonistov β₂ integrínu pri biochemickej izolácii a čistenie rôznych druhov integrínov a rôznych typov buniek leukocytov in vitro.

Použitím metódy vyjadrenia fágom sa vyvinuli nový vysoko špecifický peptidový antagonisty obsahujúci neočakávaný tripeptidový väzobný motív LLG. Nové peptidy inhibujú adhéziu a leukémií terapeuticky leukocytov a keď sú imobi 1 izované podporujú adhéziu leukocytov. Najviac aktívnym antagonistom CPCFLLGCC (nazývaný LLG-C4) je biscyklický nonapeptid, ktorého štruktúru si vynútili dve disulfidové väzby, a obsahuje tripeptidový väzobný motív LLG, ktorý je výhodný pre β₂ integríny. Peptid LLG-C4 špecificky blokuje adhéziu leukocytov spôsobenou β₂ integrínami a inhibuje naviazanie leukocytov na hlavný ligand ICAM-1. Ako typický ligand integrínu peptid podporuje bunkovú adhéziu, keď sa imobilizuje na plaste a viaže bunkové línie leukocytov, ale nie bunky, ktoré nemajú β₂ integríny. Účinnosť a špecifickosť leukocytov peptidu sa vysvetľuje ich schopnosťou reagovať s I-doménou, ktorá je známa ako aktívne miesto v integrínoch leukocytov. Je zaujímavé, že nielen ICAM-1, ale tiež rad iných adhéznych proteínov zahrnujúcich von Willenbrandov faktor a kolagén typu IV obsahujú konvenčnú sekvenciu PP/XXLLG identifikovanú vyjadrením fágom. Štúdie poukazujú na to, že von Willebrandov faktor a kolagén typu IV sú potencionálnymi ligandami pre β₂ integríny leukocytov.

Aktivita najviac aktívneho antagonistu, ktorým je nonapeptid LLG-C4, je striktne závislá na správnom usporiadaní dvoch disulfidových mostíkov. Je dvadsaťnásobný rozdiel v aktivitách dvoch biscyklických konfomérov, ktoré sa líšia len usporiadaním disulfidových mostíkov. Aktívnejší peptid má veľmi kompaktnú štruktúru, čo spôsobuje „skrížené usporiadanie disulfidových väzieb, ako sa zobrazilo pomocou NMR. Je zaujímavé, že bočné reťazce leucínu vyčnievajú z cyklickej štruktúry ako antény, čo naznačuje, že môžu priamo reagovať s integrínom. Malé zvyšky glycínu môžu nastaviť správnu vzdialenosť medzi dvoma bočnými reťazcami leucínov.

Predošlé štúdie prezentovali, že syntetické peptidy obsahujúce oblasť LLG ICAM-1 (popisuje sa v publikácii Ross,

L., Hassmann, F., and Molony, L., (1992). Inhibition of Moltendothelial adherence by synthetic peptides from the sequence of ICAM-1. J. Biol. Chem. 267, 8537-8543) alebo zodpovedajúcej oblasti ICAM-2 (popisuje sa v publikácii Li, R., Nortamo,' P., Valmu., L., Tolvanen, M., Huuskonen, J., Kantor, C., and Gahmberg, C. G. (1993) . A peptide from ICAM-2 binds to the leukocyte integrin CDlla/CD18 and inhibits endothelial celí adhesion. J. Biol. Chem. 268, 17513-17518) podporuje adhéziu leukocytov, v prípade, že sú peptidy imobilizované na plaste. V rozpustných formách peptidy blokujú naviazanie leukocytov na ICAM-1 exprimovaný na vrstve endoteliálnych buniek. Nonapeptid LLG-C4 je podstatne menší pri porovnaní s opísanými peptidovými ligandami v prípade β₂ integrínov a vykazujú vysokú aktivitu, hoci nevykazujú negatívne nabitý aminokyselinový zvyšok, ako je glutamát. Tiež pentapeptid GLLGC inhiboval bunkovú adhéziu. Tak sa môžu zostaviť ligandy cielené na β₂ integrin založené na motíve LLG, ktorý nemá náboj. To je v súlade s kryštalickými štruktúrami a štrukturálnymi modelmi prvej domény Ig ICAM-1, kde sekvenciu LLG je možno vidieť ako časť krátkeho β reťazca, ktorá je zjavne schopná priamo kontaktovať I-doménu integrínov (popisuje sa v publikácii Casasnovas, J. M., Stehle, T., Liu, J., Wang, J., and Springer, T. A. (1998). A dimeric crystal structure for the N-terminaltwo domains of intercellular adhesion molecule-1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 4134-4139, Bella, J., Kolatkar, P. R., Marlor, C. W. , Greve, J. M. and Rossmann, M. G. (1998) . The structure of hte two arainoterminal domains of human ICAM-1 suggests how it functions as a rhinovirus receptor and as an LFA-1 integrin ligand. Proc. Natl. Acad. Sci. uSA 95, 4140-4145). Alanínová skenovacia mutagenézová štúdia jednotlivých aminokyselín v prvej oblasti Ig ICAM-1 ukázala, že oblasť LLG je dôležitá pre naviazanie integrínov na ICAM-1. Mutácia jedného leucínového zvyšku čiastočne znižuje väzobnú aktivitu ICAM-1 a mutácia glycínu úplne potláča väzobnú aktivitu (popisuje sa v publikácii Fisher, K. L., Lu, J., Riddle, L., Kim, K. J., Presta, ‘L. G., and Bodary, S. C. (1997) . Identification of the binding site in intercellular adhesion molekule 1 for its recepotr, leukocyte function-associated antigén 1. Mol. Biol. Celí. 8, 501-515). Deaktivácia ICAM-1 mutácií glycínu, naznačuje, že glycínový zvyšok nemá úlohu v štruktúre, ale skôr priamo reaguje s integrínom. Mutácia zodpovedajúceho valínu a glycínu v ICAM-2 na alaníny umožňuje vznik proteínov s porušenou väzobnou aktivitou integrínu (popisuje sa v publikácii Casasnovas, J. M., Pieroni, C., and Springer, T. A. (1999). Lymphocyte function-associated antigen-1 binding residues in intercellular adhesion molecule-2 (ICAM-2) and the integrin binding surface in the ICAM subfamily. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 3017-3022).

Von Willebrandov faktor obsahuje dve sekvencie LLG, ale nespomína sa schopnosť týchto sekvencií reagovať s integrínami. Von Willebrandov faktor je multifunkčný adhezívny ligand viažuci niekoľko proteínov a brániaci krvácaniu pri poranení vaskulárneho systému pomocou adhézie krvných doštičiek na obnažené subendotelium. Uvedený faktor obsahuje dve sekvencie RGD, pričom aspoň jedna z nich je dôležitá pri naviazaní krvných doštičiek na integrin αιη>β3 · Známe sú mutácie sekvencií LLG spojené s poruchami krvácania pri von Willebrandovom ochorení. Zistilo sa, že leukocytové bunky aktivované esterom forbolu sa pevne viažu na von Willebrandov faktor. Väzbu prevažne sprostredkováva motív LLG, pričom táto väzba bola inhibovaná peptidami LLG cielenými na β₂ integríny a protilátkou 7E4 blokujúcu β₂ integrin, ale nie protilátkou proti β₂ integrínom. Je potrebné poznamenať, že okrem sekvencií LLG von Willebrandov faktor obsahuje doménu I, ktorá je podobná tej prezentovanej v podjednotkách α β₂ integrínov. Je možné, že existujú intramolekulárne alebo intermolekulárne interakcie medzi sekvenciami LLG a priľahlými doménami I, ktoré ovplyvňujú zabalenie proteínu. Ak sa také interakcie objavia, môžu čiastočne vysvetliť deaktiváciu plazmatickej formy von Willebrandovho faktoru. Naše výsledky naznačujú, že leukocyty sa môžu viazať na imobi1izovanú formu von Willebrandovho faktoru, ktorá je prítomná vo vaskulárnom subendotéliu alebo na iných povrchoch a interakcie môžu hrať úlohu v počiatočných fázach zápalu.

Sekvencia LLGRPGEA a reťazce kolagénu IV, ktorá sa identifikovala skúmaním homológie vykazuje sekvenčnú podobnosť s peptidom podobnom kolagénu s kritickým motívom GFOGER (0=hydroxyprolín), ktorý sa viaže na α₂βι integrín (popisuje sa v publikácii Emsley, J., Knight, C. G., Farndale, R. W., Barnes, M. J., and Liddington, R. C. (2000). Structural basis of collagen recognition by integrin α₂βι· Celí 100, 4756). Známe je, že glutamátový zvyšok peptidu koordinuje s iónom kovu v kryštálovej štruktúre komplexu medzi peptidom podobným kolagénu a I doménou α₂βι integrínu. Možné je, že pri naviazaní na integrín, glutamát umiestnený na C-konci voči motívu LLG má podobnú úlohu naviazania na ión kovu v prípade ICAM-1 a reťazca kolagénu IV.

Nonapeptid LLG-C4 je kratší a najúčinnejší peptid, ktorý sa doteraz vyvinul pre β₂ integríny a poskytuje vedúcu štruktúru pri vývoji antagonistov β₂ integrínov a potencionálnych protizápalových činidiel. Pretože β₂integríny sa exprimujú v krvných bunkách a v prekurzoroch krvných buniek v kostnej dreni, tieto integríny by mali byť ľahko prijateľné pre cielené cirkulujúce ligandy. Avšak je známe, že β₂ integríny sú v neaktívnom štádiu a aktivujú sa len po fyziologickom stimule, ako napríklad chemokínami alebo kontaktom s bunkami prezentujúcimi antigén. Preto je potrebné a klinicky použiteľné vytvoriť zlúčeniny, ktoré sa s výhodou viažu na bunky nosiace aktivované integríny. Našiel sa peptid LLG-C4 vykazujúci také vlastnosti, ako: imobilizované peptidy sa pevne viažu na bunky až v momente, kedy sú ich integríny úplne aktivované. Prítomnosť sekvencii podobných LLG vó von Willebrandovom faktore a kolagénoch naznačujú novú funkciu proteínov pri sprostredkovaní adhézie nie len krvných doštičiek, ale tiež leukocytov na π

kolagén prípade, subendoteliálnej matrici poškodených krvných ciev. Následne, je možné klinicky využiť inhibíciu naviazania zápalových buniek a tiež buniek leukémie na von Willebrandov faktor a typu IV pomocou peptidov podľa vynálezu. V že ICAM-1 funguje ako receptor pre rinovírusy, ktoré spôsobujú bežnú nádchu, peptidy napodobňujúce ICAM-1 by mohli tiež pomôcť pri vývoji nových antivírusových zlúčenín (popisuje sa v publikácii Casasnovas, J. M., Stehle, T., Liu, J., Wang, J., and Springer, T. A. (1998). A dimeric crystal structure for the N-terminaltwo domains of intercellular adhesion molecule-1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 4134-4139, Bella, J., Kolatkar, P. R., Marlor, C. W., Greve, J. M. and Rossmann, M. G. (1998) . The structure of hte two aminoterminal domains of human ICAM-1 suggests how it functions as a rhinovirus receptor and as an LFA-1 integrin ligand. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 4140-4145). Peptidy podľa vynálezu je možné tiež použiť pri liečbe zápalových ochorení, ktoré zahrnujú, ale nie sú obmedzené na cukrovku, reumatickú artritídu, Crohnovu chorobu, lupienku, roztrúsenú sklerózu a odmietnutie transplantátu.

Pri metóde terapeutickej a profylaktickej liečby zápalového ochorení a leukémií u človeka terapeuticky a profylaktický účinné množstvo peptidov podlá vynálezu, ktoré sa aplikuje subjektu, ktorý uvedenú liečbu potrebuje, sa mení v závislosti na stave, telesnej hmotnosti, veku atď. subjektu. V prípade myši vhodné účinné množstvo je napríklad 0,2 až 1 mg denne, aplikuje sa intravenózne alebo intraperitoneálne, alebo približne 10 mg počas jedného týždňa. S úmyslom dosiahnuť okamžitý účinok na leukocyty v prípade väčších zvierat alebo ľudí je účinné množstvo v jednej dávke napríklad 10 až 100 mg intravenózne.

Peptidy podľa vynálezu sa môžu tiež využiť na identifikáciu typu buniek leukocytov, ktoré exprimujú β integríny a môžu byť výhodné pri typovaní zápalových buniek alebo pri diagnostike leukémií. Bunky exprimujúce aktivovanú formu α_Μβ₂ integrínu sa môžu napríklad izolovať z krvi alebo tkaniva tým, že populácia buniek prejde cez povrch kolóny a potom sa bunky eluujú pomocou EDTA alebo kompetítorovým peptidom. Túto metódu je možné použiť najmä pri izolácii subsady populácie lymfocytov, ktoré exprimujú panel integrínov.

Peptidy podľa vynálezu sa môžu tiež použiť na vyvolanie zachytenia buniek exprimujúcich β₂ integríny na peptidovom povrchu alebo umelej peptidovej matrici. Takáto umelá peptidová matrica môže pôsobiť ako kostná dreň alebo lymfatický systém a pomáha pri produkcii tkanivových transplantátov. Na druhej strane peptid v rozpustnej forme predchádza reakciám hostiteľa proti tkanivovému transplantátu, pokial peptid inhibuje migráciu makrofágov riadenú β₂ integrínom a doprevádzajúcu zápalové reakcie.

Prehľad obrázkov na výkrese

Obr. 1 zobrazuje ako LLG-C4-GST sa viaže na β₂ integrín leukocytov a jeho I-doména je závislá od dvojmocného katiónu. Na Obr.l(A) integrín pochádzajúci z lyzátu krvných buniek bol imunologický značený v mikrotitračných priehlbeninách použitím protilátky podjednotky cc_M MEM170 alebo 0KM1 alebo protilátky podjednotky a_x TS2/4. Čistený LLG-C4-GST alebo kontrolný GST (2 pg v jednej priehlbine) sa nechali viazať počas jednej hodiny za neprítomnosti alebo za prítomnosti EDTA. Po premytí sa naviazaný proteín GST stanovil použitím protilátok proti GST. Výsledky zobrazujú priemernú hodnotu ± SD vyrátanú z troch priehlbín. Experiment sa zopakoval tri razy s podobnými výsledkami.

Na Obr. 1 (B) sa LLG-C4-GST alebo GST inkuboval počas 60 minút v mikrotitračných priehlbeninách potiahnutých izolovanou I-oblasťou podjednotky a_M. Použili sa koncentrácie proteínov GST, ako je uvedené. Po premytí sa stanovil naviazaný GST pomocou protilátok proti GST. Výsledky sú vyjadrené ako priemerné hodnoty ± SD z troch priehlbín. Výsledky boli podobné aj u dvoch iných experimentov.

Na Obr. 1 (C) LLG-C4-GST (10 pg/ml) sa inkubovalo v priehlbeninách potiahnutých I-doménou za neprítomnosti a za prítomnosti EDTA (2,5 mM) alebo peptidu LLG-C4(1) (100 μΜ) alebo neaktívneho peptidu LLG-C4 (2) (100 μΜ). Po 60 minútach inkubácie sa priehlbiny premyli a naviazanie sa stanovilo protilátkami proti GST. Výsledky sú vyjadrené ako priemerné hodnoty ± SD z troch priehlbín.

Obr. 2 znázorňuje, ako LLG-C4 podporuje bunkovú adhéziu riadenú β₂ integrínom. Na Obr. 2 (A) sa nechali bunky

THP-1 aktivované esterom forbolu viazať počas 60 minút na mikrotitračné priehlbeniny potiahnuté LLG-C4-GST, GST alebo albumínom. EDTA sa použilo pri koncentrácii 2,5 mM. Viazané bunky sa stanovili meraním bunkovej fosfatázovej aktivity. Údaje sú priemerné hodnoty z troch priehlbín ± SD. Podobné výsledky sa získali v šiestich ďalších experimentoch.

Na Obr. 2(B) sa bunky THP-1 zmiešali s každou protilátkou proti podjednotke integrínu βι, β₂, β3, ομ, cxm alebo α_χ (ako je to označené) pri koncentrácii 50 pg/ml. Alikvotná časť buniek sa potom preniesla do priehlbín potiahnutých LLG-C4-GST a všetko sa inkubovalo počas 60 minút pri teplote 37 °C. Po premytí sa viazané bunky stanovili fosfatázovým testom. Výsledky sú vyjadrené ako priemerné hodnoty adhézie ± SD z dvoch až štyroch nezávislých experimentov, pričom každý sa uskutočnil v troch priehlbinách.

Na Obr. 2 (C) sa mikrotitračné priehlbiny potiahli peptidom C(l-8;3-9) a C(l-9;3-8) inkubáciou cez noc pri koncentrácii 40 pg/ml v TBS za neprítomnosti alebo za prítomnosti glutaraldehydu. Volné väzobné miesta na plaste sa potom blokovali 5 % BSA. Bunky THP-1 (10⁵ v jednej priehlbine) sa nechali viazať počas 60 minút pri teplote 37 °C. Po premytí PBS sa stanovili viazané bunky a výsledky sú vyjadrené ako priemerné hodnoty z troch priehlbín ± SD. Experiment sa opakoval dva razy.

Na Obr. 2 (D) sa bunky L transfekované α_χβ₂ nechali viazať na LLG-C4-GST alebo GST. Ako kompetítory sa použili protilátky 7E4 a EDTA. Výsledky sú vyjadrené ako priemerné hodnoty % adhézie z troch experimentov uskutočnených v troch priehlbinách ± SD. Rozdiel naviazania na LLG-C4-GST verzus GST je štatisticky významný (p=0,016).

Obr. 3 zobrazuje porovnanie aktivít cyklických peptidov. Na Obr. 3 (A) sa bunky THP-1 zmiešali s peptidom, ktorý obsahuje buď disulfid C (1-8;3-9) alebo C(1-9;3-8) pri vzniku suspenzie. Konečná koncentrácia peptidov je označená. Bunky sa potom inkubovali počas 60 minút pri teplote 37 °C v mikrotitračných priehlbinách potiahnutých LLG-C4-GST. Po premytí priehlbín sa stanovilo množstvo naviazaných buniek fosfatázovým testom. Výsledky sú vyjadrené ako priemerné hodnoty z troch priehlbín ± SD. Podobné výsledky sa získali v dvoch ďalších experimentoch vždy v trojnásobnom uskutočnení.

Na Obr. 3 (B) sa testovali bunky THP-1 viažuce sa na LLGC4. GST za prítomnosti peptidov C(1-8;3-9), CLLGC alebo CAAGC. Syntetické peptidy sa použili v uvedených koncentráciách. Po 60 minútach inkubácie sa priehlbiny premyli a viazané bunky sa stanovili fosfatázovým testom. Údaje zobrazujú priemerné hodnoty z troch priehlbín ± SD. Podobné výsledky sa získali v dvoch ďalších experimentoch.

Obr. 4 zobrazuje leukocytovú bunkovú adhéziu na ICAM-1 peptidom LLG-C4 . Na Obr. 4 (A) sa Jurkatove bunky nechali zachytiť na imobilizovanom ICAM-l-Fc v mikrotitračných priehlbinách za neprítomnosti alebo za prítomnosti peptidov LLG-C4. Po 45 minútach inkubácie sa odstránili neviazané bunky ponorením mikrotitračných doštičiek dnom nahor do dekantéru, ktorý obsahuje PBS a zachytené bunky sa zafarbili kryštalickou violetou. Výsledky vykazujú % bunkovej adhézie ± SD z dvoch experimentov, pričom každý sa uskutočnil v trojnásobnom alebo štvornásobnom počte priehlbín.

Na Obr. 4 (B) sa bunky T nechali viazať na monovrstvy endoteliálnych buniek Eahy stimulovaných TNFa, ktoré sa nechali

Zahrnuté boli LÍ.G-C4 μΜ. Po 45 minútach odstránili ponorením rásť v mikrotitračných priehlbinách alebo RGD-4C pri koncentrácii 50 inkubácie sa neviazané bunky mikrotitračnej doštičky do roztoku PBS a viazané bunky T sa určili f osf oatázovým testom. Dáta sú priemerné hodnoty z troch priehlbín ± SD.

Obr. 5 zobrazuje, ako adhézia buniek THP-1 na von Willebrandovom faktore a kolagéne typu IV je blokovaná peptidom LLG-C4. Na Obr. 5 (A) sa testovalo naviazanie bunky THP-1 na von Willebrandov faktor za prítomnosti protilátok proti integrínom β₂ (7E4), α_νβ₃ (LM609) alebo α_ΪΛβ3 (P2) . Po 60 minútovej inkubácii v priehlbinách potiahnutých von Willenbrandovým faktorom sa stanovili viazané bunky. Dáta sú priemerné hodnoty z troch priehlbín ± SD. Experiment sa opakoval tri razy.

Na Obr. 5 (B) sa bunky THP-1 nechali viazať na mikrotitračné doštičky potiahnuté von Willebrandovým faktorom, kolagénom typu IV alebo fibronektínom. Peptid C(1-8;3-9) sa použil ako kompetítor v uvedenej koncentrácii. Viazané bunky sa potom stanovili fosfatázovým testom. Dáta sú priemerné hodnoty z troch priehlbín ± SD. Podobné výsledky sa získali v štyroch ďalších experimentoch.

Obr. 6 znázorňuje, že syntetický peptid LLG-C4 bráni adhézii a migrácii buniek THP-1 na substráte tvorenom fibrinogénom. Na Obr. 6 (A) sa bunky THP-1 aplikovali spolu s C(l-8;3-9) alebo C (1—9;3—8) alebo pri neprítomnosti peptidov, do mikrotitračných priehlbín potiahnutých fibrinogénom. Po 60 minútach inkubácie sa viazané bunky určili fosfatázovým testom. Dáta sú priemerné hodnoty z troch priehlbín ± SD. Podobné výsledky sa získali v dvoch ďalších experimentoch.

Na Obr. 6(B) v prípade aktívnych integrínov sa bunky THP1 stimulovali s esterom forbolu (v koncentrácii 50 nM) a peptidy RGD-4C a C(1-8;3-9) (každý v koncentrácii 2,5 μΜ) po dobu 1 hodiny. Po premytí sa bunky nechali viazať na priehlbiny potiahnuté fibrinogénom za prítomnosti peptidu RGD-4C alebo C(1-8;3-9) alebo obidvoch peptidov pri uvedenej koncentrácii. Po 30 minútach inkubácie sa stanovili viazané bunky. Výsledky sú vyjadrené priemernými hodnotami z troch priehlbín ± SD. V niektorých bodoch sú hodnoty SD príliš malé.

Na Obr. 6(C) sa filtre Transwell potiahli na obidvoch stranách fibrinogénom alebo ľavý ostal bez potiahnutia a potom sa saturovali BSA. Bunky THP-1 (v množstve 5xl0⁴ buniek na jeden filter) sa naniesli na horný povrch filtra v kultivačnom médiu, ktoré obsahuje 10 % séra. Koncentrácia C(l8;3-9) a C(l-9;3-8) bola 200 μΜ. Po 18 hodinách kultivácie sa stanovili bunky migrované na spodnú plochu filtra. Bunky sa fixovali, farbili a mikroskopom sa určil ich počet. Výsledky sú vyjadrené priemernými hodnotami aspoň troch experimentov ± SD.

Na Obr. 6 (D) sa obe strany filtra Transwell potiahli

LLG-C4-GST, GST, fibrinogénom alebo BSA. Na filter sa celkovo nanieslo 5xl0⁴ buniek THP-1 v kultivačnom médiu obsahujúcom 10% séra. Bunky sa kultivovali po dobu 18 hodín a mikroskopicky sa stanovil počet buniek, ktorý migroval na spodný povrch filtra. Výsledky sú vyjadrené priemernými hodnotami z troch experimentov ± SD.

Obr. 7 zobrazuje porovnanie štruktúr konformérov cyklických peptidov LLG-C4 pomocou NMR. Na Obr. 7 (A) sú zobrazené rodiny 40 konformácií C (1-8;3-9) (lavá strana) a C(1-9;3-8) (pravá strana). Ťažké atómy hlavného reťazca uzatvorené disulfidom sa vrství v každej rodine a potom sa dve rodiny prekladajú bez ohľadu na pohľad.

Na obr. 7 (B) sú zobrazené stereo pohľady reprezentatívnych štruktúr roztoku C(1-8;3-9) (navrchu) a C(l9;3-8) (dolu). V prípade tohto zobrazenia boli zo začiatku dve štruktúry vrstvené na atómy F4, L5 a L6 hlavného reťazca a potom sa prekladali nezávisle na pohľade. V prípade peptidu C(l-8;3-9) sa Cl páruje s C8 nad cyklickou štruktúrou a C3 s C9 pod cyklickou štruktúrou. Podobne v prípade peptidu

C(1-9;3-8) sa Cl páruje s C9 nad kruhom a C3 sa páruje s C8 pod kruhom.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1: Vyjadrenie fágom

0Γ_Μβ₂ integrín sa čistil protilátkovou afinitnou chromatografiou z krvných zrazenín získaných z inštitúcie „Finnish Red Cross Blood Transfusion Service, ako sa to popisuje vyššie v texte (popisuje sa v publikácii Li, R., Xie, J., Kantor, C., Koistinen, V., Altieri, D. C., Nortamo, P., and Gahmberg, C. G. (1995) . A peptide derived from the intercellular adhesion molecule-2 regulates the avidity of the leukocyte integrins CDllb/CD18 and CDllc/CD18. J. Celí. Biol. 129, 1143-1153). Mikrotitračné priehlbiny sa potiahli integrínom riedeným fyziologickým roztokom upraveným Trispufrom (TBS)/1 mM MnCl₂ cez noc pri teplote 4 °C. Pri prvom vyhľadávaní sa použil 1 pg do jednej priehlbiny a pri následnom vyhľadávaní sa pridalo 100, 10 a 1 ng integrínu do jednej priehlbiny. Priehlbiny sa blokovali 5 % BSA v TBS po dobu 1 hodiny pri teplote 22 °C a potom sa päťkrát premyli TBS. Biologické vyhľadávanie sa uskutočnilo použitím knižníc fágových peptidov CX₂C a CXgC v podstate spôsobom opísaným v publikácii Koivunen, E., Wang, B., and Ruoslathi, E. (1994). Isolation of a highly specific ligand for the α₅β_χ integrín from a phage display library. J. Celí. Biol. 124, 373380. Konštrukcia knižníc sa upravila tak, že j ednoreťazcová DNA kódujúca degenerované sekvencie sa previedla na dvojreťazcovú DNA použitím 5 cyklov PCR len z reverzným primérom a potom 11 cyklov reverzným a priamym primérom. Celkové množstvo 6 pg dvo j r e ť a z co vého oligonukleotidu sa čistilo použitím PCR čistiaceho tmelu QIAGEN a ligovalo sa 42 pg fágového vektora Fuse5. Počet rekombinantov v knižnici bol vyšší než 10⁹. Naviazanie fága, elúcia a následná amplifikácia v baktériách E. coli sa opakovalo päťkrát a po každom vyhľadávaní sa izolovali bakteriálne kolónie a uchovávali sa v 10 μΐ TBS v mikrotitračných priehlbinách pri teplote -20 °C. V prípade priameho sekvenovania v kolóniách sa alikvóty roztavenej vzorky objemu 1 μΐ vystavili PCR použitím 10 pmol každého priameho priméru 5 ' TAATACGACTCACTATAGGGCAAGCTGATAAACCGATACAATT 3 ' a reverzného priméru 5' CCCTCATAGTTAGCGTAACGATCT 3' .

Podmienky reakcie PCR sú teplota 92 °C počas 30 sekúnd, teplota 60 °C počas 30 sekúnd a teplota 72 °C počas 60 sekúnd a počet cyklov je 35. Pre sekvenovanie sa použil alikvót produktu reakcie PCR objemu 1 μΐ použitím 15 pmol jedného z primerov a vzoriek sa analyzovali pomocou prístroja ABI 310 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) . Po päťkolovej selekcii, knižnica CX₇C vykázala 600-násobné obohatenie a CX₉C 1000 násobné obohatenie fága viazaného na integrín pri porovnaní s pozadím. Sekvenovanie viazaného fága preukázalo 7 odlišných sekvencii, čo indikuje selekciu peptidov integrínom (Tabuľka č. 1). Štyri sekvencie z uvedených siedmich obsahovali tripeptidový motív LLG. Najsilnejšie obohatené sekvencie boli CPCFLLGCC (LLG-C4) a CWKLLGSEEEC, pričom každá bola v náhodne vybraných klonoch pozorovaná 15 razy. Pričom išlo len o klony, ktoré zostali po izolácii klonov, ktoré sa viažu s vysokou afinitou, ktorá sa uskutočnila použitím nízkych koncentrácií integrínov pri poťahovaní. Je zaujímavé, že LLG-C4 vyzerá ako konvenčná väzobná sekvencia, pretože všetky peptidy preukázali podobnosť s touto sekvenciou s ohľadom na celkom len špecifických konzerváciu leucínových, glycínových alebo cysteínových prolínových, zvyškov.

Tabuľka č. θί_Μβ₂ integrín obsahujúcimi proteínoch

1: Sedem fágových sekvencii viazaných na (Mac-1) a ich usporiadanie so sekvenciami LLG prítomných v bunkových adhezívnych

CPCFLLGCC (15) CWKLLGSEEEC (15) CWHKDLLGC (4)

CWSMELLGC CPPDLFWYC (4) CPEDLYEFC (3) CPEDFIFFC

ICAM-1 von Willebrandov faktor A2 von Willebrandov faktor D3 kolagén oí2 typ I kolagén «4 typ IV osteopontín

CDQPKLLGIETPL

TVGPGLLGVSTLG

GRYIILLGKALSV

PGPQGLLGAPGIL

PGPPGLLGRPGEA

VICFCLLGITCAI

Aminokyseliny, ktoré sú zhodné s fágovými peptidmi sú vyznačený tučným písmom. Sekvencia ICAM-1 je z prvej domény Ig. Sekvencie von Willebrandovho faktora sú z domén A2 a D3 a sekvencie kolagénu typu I a IV sú z a reťazcov. Sekvencie osteopontínu zahrnujú zvyšky č. 5 až 17. Počet izolovaných nukleotidových sekvencií kódujúcich každý peptid je označený číslom v zátvorke.

Testovanie databáz ukazuje, že tripeptidová sekvencia sa nachádza v prvej doméne Ig ICAM-1 práve pred zvyškom Glu-34, ktorý je dôležitý pri naviazaní ICAM-1 na OmPz integrín (popisuje sa v publikácii Staunton, D. E., Dustin, M. L., Erickson, H. P., and Springer, T. A. (1990). The arrangement of the immunoglobulin like domains of ICAM-1 and the binding sites for LFA-1 and rhinovirus. celí 61, 243-254, Stanley, P., and Hogg, N. (199) . The I domain of integrin LFA-1 interacts with ICAM-1 domain 1 at residue Glu-34 but not Gln-73. J. Biol. Chem. 273, 3358-3362). Peptid CWKLLGSEEEC vykazoval najväčšiu podobnosť, pričom päť zo šiestich konzekutívnych zvyškov je zhodných s ľudskou sekvenciou ICAM-1 (tabuľka č. 1) . Tripeptidová sekvencia LLG je tiež obsiahnutá v doméne A2 a D3 von Willebrandovho faktora, v a reťazci kolagénu typu I a IV a v osteoponíne. Žiadna zo sekvencií obsahujúcich LLG, okrem sekvencie ICAM-1, nebola predtým popísaná, že obsahuje potencionálne väzobné miesto pre bunky. Von Willebrandov faktor (popisuje sa v publikácii Savage, B., Saldivar, E., and Ruggeri, Z. M. (1996). Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor. Celí. 8 4 , 28 92 97) a osteopontin (popisuje sa v publikácii Helluin, O., Chán, C., Vilaire, G., Mousa, S., DeGrado, W.F., and Benett, J.S. (2000). The activation state of α_Μβ3 regulates platelet and lymphocyte adhesion to intact and thrombincleaved osteopontin. J. Biol. Chem. 275, 18337-18343) je proteínový ligand β₃ integrínov riadených RGD, ale či sa môže ďalej viazať na β₂ integríny, nie je známe. Je zaujímavé, že kolagén typu I je ligand α_χβ₂ integrínu (popisuje sa v publikácii Garnotel,

R.

Rittié,

Monboisse, J.-C., Nguyen, P., Potron

L . , Poitevin, S ., G., Maquart, F.-X.,

Randoux, A. and Gillery, P. (2000). Human blood monocytes interact with type I collagen through α_χβ₂ integrin (CDllcCD18, gpl50-95) . J. Immunol. 164, 5928-5934) .

Príklad 2: Väzobné testy integrínov

Príprava GST a Fc fúznych proteínov

Nukleotidová sekvencia kódujúca LLG-C4 sa amplifikovala pomocou PCR z fágovej DNA použitím primérov obsahujúcich miesto BamH I (5' AGGCTCGAGGATCCTCGGCCGACGGGGCT 3') a EcoR I (5’AGGTCTAGAATTCGCCCCAGCGGCCCC 3'). Produkt PCR sa izoloval na agarózovom géle, štiepil sa reštrikčnými enzýmami a ligoval sa do vektora PGEX-2TK (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Švédsko) . Rekombinanti exprimujúci LLG-C4-GST sa overili sekvenovaním DNA. LLG-C4-GST sa produkovali v baktériách E. coli kmeň BL 21 a čistili sa afinitnou chromatografiou použitím glutatiónu a následnou dialýzou. Fúzny proteín Fc ICAM-1 obsahujúci päť domén ICAM-1 Ig sa produkoval v bunkách CHO a čistil sa afinitnou chromatografiou s proteínom A. Produkovalo sa približne 20 mg LLG-C4-GST, s čistotou vyššou ako 95 %, ako sa analyzovalo pomocou SDS gélovej elektroforézy na prístroji PhastSystem (Amersham Pharmacia) .

Monoklonálne protilátky

Protilátky proti podjednotke intergínu β₂ boli 7E4, 11D3,

3F9, 1D10 a 2E7, ako sa to opisuje vyššie v texte (uvádza sa v publikácii Nortamo, P., Patarroyo, M., Kantor, C., Suopanki, J., and Gahmberg, C. G. (1988). Immunological mapping of the human leukocyte adhesion glycoprotein gp90 (CD18) ba monoclonal antibodies. Scand. J. Immunol. 28, 537-546). Protilátky proti podjednotke oí_l boli TS2/4 a ME-83 (Monosan, Holandsko). Protilátky 0KM1, OKMIO a MEM-170 sú proti podjednotke a_M a protilátky 3.9 sú proti podjednotke a_x (popisuje sa v publikácii Li, R., Nortamo, P., Valmu., L., Tolvanen, M., Huuskonen, J., Kantor, C., and Gahmberg, C. G. (1993) . A peptide from ICAM-2 binds to the leukocyte integrin CDlla/CD18 and inhibits endothelial celí adhesion. J. Biol. Chem. 268, 17513-17518, Li, R., Xie, J., Kantor, C.,

Koistinen, V., Altieri, D. C., Nortamo, P., and Gahmberg, C. G. (1995). A peptide derived from the intercellular adhesion molecule-2 regulates the avidity of the leukocyte integrins CDllb/CD18 and CDllc/CD18. J. Celí. Biol. 129, 1143-1153). Protilátky P2 proti 0ίιη>β3 integrínu sa získali od firmy Immunotech (Marseille, Francúzsko) a protilátky LM609 proti οί_νβ₃ integrínu a protilátky 6S6 proti podjednotke βι sú od firmy Chemicon (Temecula, CA) .

Integrínové väzobné testy

Intergín sa imunologický zachytil na mikrotitračných priehlbinách, ktoré sa potiahli protilátkami 0KM1 alebo MEM170 proti podjednotke cx_M, protilátkami TS2/4 proti podjednotke a_x alebo nešpecifickým IgG (Dáko, Carpinteria, CA) . Protilátky sa potiahli v koncentrácii 10 pg/ml v TBS cez noc pri teplote 4 °C. Po saturácii priehlbín 5 % BSA, sa nechalo inkubovať 200 μΐ alikvótu lyzátu krvnej zrazeniny v 1 % oktylglukozide/1 mM MnCl₂/TBS počas 2 hodín pri teplote 4 °C. Priehlbiny sa potom päťkrát premyli pufrom, ktorý obsahuje oktylglukozid. LLG-C4-GST alebo kontrolný GST sa inkubovali pri koncentrácii 10 pg/ml v 25 mM oktylglukozide/TBS/1 mM MnCl₂ počas jednej hodiny. Po premytí priehlbín sa stanovil viazaný GST pomocou protilátok proti GST (Amersham Pharmacia) , ktoré sa značili Eu³⁺chelátom podľa inštrukcií výrobcu (Wallac, Turku, Fínsko). Fluorescencia spôsobená Eu³⁺ sa merala fluorometrom Arcus 1230 (Wallac). Pri testovaní naviazania I domény sa použila a_M I-domény exprimovaná v baktériách E. coli ako fúzny proteín GST (popisuje sa v publikácii Ueda, T., Rieu, P., Brayer, J., and Arnaout, M. A. (1994). Identification of the complement iC3b binding site in the β₂ integrín CR3 (CDllb/CD18) . Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91, 10680-10684) . Fúzny proteín sa čistil afinitnou chromatografiou pomocou častíc spojených s glutatiónom a štiepil sa pomocou trombínu, aby sa uvoľnila rekombinantná Idoména s molekulovou hmotnosťou približne 23 000. I-doména sa potiahla na mirkotitračné doštičky v koncentrácii 20 pg/ml a zisťovalo sa naviazanie LLG-C4-GST a GST.

Zistilo sa, že fúzny proteín LLG-C4-GST, ale nie samotný GST, vykazuje značnú aktivitu a viaže sa na oímPž integrín spôsobom citlivým na dvojmocný katión ako typický integrínový ligand. Katiónový chelátor EDTA inhiboval naviazanie LLG-C4GST na integrín, ktorý sa imunologický zachytil v mikrotitračných priehlbinách s protilátkami MEM170 alebo OKMl proti podjednotke a_M (Obr. IA) . Podobné naviazanie LLG-C4-GST inhibovatelné pomocou EDTA sa detekovalo na oílPž integríne, ktorý sa zachytil s protilátkami TS2/4. Naviazanie LLG-C4-GST sa nelíši od kontroly GST a nie je inhibovatelné pomocou EDTA, keď sa pre imunologické zachytenie použilo nešpecifické IgG (nie je zobrazené) .

Skúmalo sa tiež, či peptid môže priamo reagovať s Idoménou α_Μβ₂ integrínu so známym miestom viažuci ligand. LLG-C4GST testovaný pri koncentráciách 0,01 až 100 pg/ml vykazoval naviazanie závislé na koncentrácii s izolovanou I-doménou podjednotky a_M (Obr. IB) . GST sa pri rovnakej koncentrácii neviaže.

Schopnosť I-domény viazať sa na LLG-C4-GST je závislá na katiónoch Mn2+ pridaných do väzobného média, pričom Mn2+ s chelatačným účinkom spolu s EDTA blokuje naviazanie (Obr. IC) . Aby sa preukázalo, že I-doména sa môže tiež viazať na nonapeptid LLG-C4 a nie len na fúzny proteín, syntetizovali sme biscyklický peptid LLG-C4. Bolo obtiažne pripraviť aktívny a vo vode rozpustný peptid, zjavne preto, že počas oxidácie na vzduchu sa jednoducho tvoria zmiešané disulfidy. Jeden prípravok LLG-C4 (1) bol vysoko aktívny a blokoval schopnosť I-domény viazať sa na LLG-C4-GST (Obr. IC) . Rovnaký peptid bol tiež aktívny pri experimentoch s bunkovými kultúrami. Iný prípravok LLG-C4 (2) nebol aktívny, čo je zjavne spôsobené nevýhodnou disulfidovou väzbou a neinhibuje naviazanie LLG-C4-GST na I-doménu.

Príklad 3: Bunková kultúra a adherencia bunkových línií na nonapeptidový ligand

Bunkové línie leukémie Jurkatových T buniek (ATCC č. TIB152), U-937 histiocytický erytroleukémie (č. 45507)

RPMI 1640 doplnenom 2 mM lymfóm (č. CRL-1593.2) a K562 sa udržovali v kultivačnom médiu glutamínom, 10 mM HEPES, 1 mM pyruvátom sodným, penicilínom. (koncentrácie 100 U/ml), streptomycínom (koncentrácie 100 pg/ml) a 10 % fetálnym teľacím sérom (FCS) . Bunky monocytickej leukémie THP-1 (ATCC TIB-202) sa kultivovali v rovnakom kultivačnom médiu, ktoré navyše obsahuje 0,05 mM 2-merkaptoetanol. Bunkové línie

Eahy926, HT1080, KS6717 a SKOV-3, ktoré nie sú bunkové línie leukocytu, sa udržovali spôsobom opísaným vyššie v texte (popisuje sa v publikácii Koivunen, E., Arap, W., Valtanen, A., Medina, O. P., Heikkila, P., Kantor, C. G., Salo, T., Kontinen, Y.T., Sorsa,

E., Rainisalo, C., Gahmberg,

Ruoslathi, E., and Pasqualini, R. (1999). Tumor targeting with a selective gelatinase inhibítor 768-774). T bunky sa izolovali

Náture Biotechnol. 17, z krvných zrazenín centrifugáciou Ficoll-Hipaque, po ktorej nasleduje pasáž cez kolónu s nylonovou vlnou (popisuje sa v publikácii Valmu, L., and Gehmberg, C. G. (1995). Treatment with ocadaic acid reveals strong threoninephosphorylation of CD18 after activation of CD11/CD18 leukocyte integrins with phorbol esters or CD3 antibodies. J. Immunol. 155, 1175-1183) . Bunky L92 9 myší divého druhu a bunková línia L transfekovaná α_χβ₂ integrínom sa získala od Dr. Y. van Kooyk (Univerzitná nemocnica, Nijmegen, Holandsko).

Bunková adhézia

Fibrinogén, fibronektín, von Willebrandov faktor, kolagén typu IV, fúzne proteíny GST, fúzne proteíny Fc alebo syntetické peptidy sa potiahli na mikrotitračné doštičky pri koncentrácii 2 pg v 50 pl TBS, pokiaľ sa neuvádza inak. Ďalej sa použil rekombinantný von Willebrandov faktor a na ňom zachytené protilátky, ktoré poskytol Dr. J. J. Sixma a PhDr. G. de Groot (z inštitúcie University Medical Centre Utrecht, Holandsko) . S cieľom pripraviť polymerizované peptidy, sa pridal glutaraldehyd pri konečnej koncentrácii 0,25 %.

Priehlbiny sa saturovali 5 % BSA a potom sa päťkrát premyli PBS. Skôr než sa uskutočnili adhézne testy, sa bunky ošetrili 50 nM 4 β-f orbol-12 , 1 3-dibu t y r á t om alebo 200 pM peptidom Pl (popisuje sa v publikácii Kotovuroi, A., Pessa-Morikawa, T., Kotovuori, P., Nortamo, P., and Gahmberg, C. G. (1999) . ICAM-2 and peptide form its binding domain are efficient activators of leukocyte adhesion and integrin affinity. J. Immunol. 162, 6613-6620) v kultivačnom médiu bez séra počas 30 minút pri teplote miestnosti, aby nastala aktivácia integrínov. V inom prípade sa bunky stimulovali počas 60 minút pri teplote 37 °C esterom forbolu (50 nM) a peptidmi C(1-8;3-9) a RGD-4C, pričom každý má koncentráciu 2,5 pM. Potom sa peptidy odstránili premytím s PBS/2,5 mM EDTA. Bunky sa inkubovali v mikrotitračných priehlbinách (100 000 buniek v jednej priehlbine) počas 60 minút pri teplote 37 °C za neprítomnosti alebo za prítomnosti konkurenčných peptidov, protilátok alebo EDTA. Neviazané bunky sa odstránili jemným premytím pomocou PBS a zatlačením doštičky na papierové utierky. Viazané bunky sa určili testom, ktorý meria bunkovú fosfatázovú aktivitu. Do jednej priehlbiny sa pridalo 100 μΐ pufra 50 mM acetátu sodného, pH 5,0, ktorý obsahuje 1 % Triton X-100 a 6 mg/ml pnitrofenylfosforečnanu a všetko sa inkubovalo počas jednej hodiny pri teplote 37 °C. Reakcia sa zastavila 50 μΐ 1 M

NaOH. Absorbancia pri vlnovej dĺžke 405 nm sa odčítala na zariadení vhodnom pre mikrotitračné doštičky. V inom prípade sa zachytené bunky zafarbili kryštálovou violetou, ako sa popisuje v dokumente Mould, A. P., Akiyama, S. K., and Humphries, M. J. (1995). Regulation of integrin aspifibronectin interactions by divalnet cations. Evidance for distinct classes of binding sites for Mn²⁺, Mg²⁺, and Ca²⁺. J. Biol. Chem. 270, 26270-26277).

Aby bolo možné sledovať naviazanie T buniek na endotelíálnu bunkovú monovrstvu, endoteliálne bunky Eahy926 sa naniesli na mikrotitračné doštičky v hustote 5xl0⁴ a nechali sa rásť tri dni. Aby sa stimulovala produkcia ICAM-1, bunky sa ďalej nechali rásť počas 16 hodín za prítomnosti TNF-a pri koncentrácii 10 ng/ml. T bunky (v množstve 1, 5 x 10⁵ buniek v jednej priehlbine) sa nechali viazať na bunky Eahy926 najskôr počas 30 minút pri teplote 4 °C a potom 15 minút pri teplote 37 °C. Nenaviazané bunky sa potom odstránili ponorením mikrotitračné j doštičky dnom nahor do PBS. Viazané bunky sa stanovili fosfotázovým testom.

Bunky monocytickej leukémie THP-1 aktivované esterom forbolu dostatočne viazané na LLG-C4-GST, ale nie na GST alebo peptid-GST (CLRSGRGC-CST, CPPWWSQC-GST) sa vložili do mikrotitračných priehlbín (Obr. 2A) . EDTA koncentrácie ‘2,5 mM úplne zablokovalo naviazanie na LLG-C4-GST. Testovanie s celým radom protilátok proti integrínom indikovalo, že adhézia buniek na LLG-C4-GST bola celkom inhibovaná blokovaním protilátkami 7E4 voči reťazcu β₂ (Obr. 2B) . Protilátky proti intergínom βι (6S6) a β3 (LM609, P2) nevykazovali žiadny účinok. Čiastočná inhibícia sa dosiahla protilátkami proti β₂ reťazcu 11D3 a 3F9. Poradie účinku protilátok troch protilátok proti β₂ je rovnaké ako sa predtým získalo v agregačnom teste granulocytov. Najaktívnejším inhibítorom bunkovej agregácie je protilátka 7E4, potom nasleduje 11D3 a 3F9 (popisuje sa v publikácii Nortamo, P., Patarroyo, M., Kantor, C., Suopanki, J., and Gahmberg, C. G. (1988). Immunological mapping of the human leukocyte adhesion glycoprotein gp90 (CD18) ba monoclonal antibodies. Scand. J. Immunol. 28, 537-546) . Tiež sa sledovali protilátky 1D10, 2F3 a 2E7 proti reťazcu β₂, ktoré môžu aktivovať bunkovú adhéziu sprostredkovanou β₂ integrínom. Tri protilátky stimulovali adhéziu THP-1 na LLGC4-GST (dáta nie sú uvedené).

Štúdia s protilátkami proti podjednotke a leukocytového integrínu ukázala, že zvlášť intenzívna inhibícia adhézie sa získala protilátkou 3.9 proti podjednotke oí_x. Protilátky OKMIO, MEM170 a 60.1 proti podjednotke a_M boli slabými inhibítormi, pokým protilátky TS1/22 a TS2/4 proti reťazcu oí_m mali ľubovoľný účinok. Bunky THP-1 exprimujú oí_x a Oť_M, ale len malé množstvo a_L a protilátkový inhibičný profil je podobný profilu získanému v prípade inhibície naviazania buniek THP-1 stimulovaných peptidom Pl na fibrinogén (popisuje sa v publikácii Li, R., Xie, J., Kantor, C., Koistinen, V., Altieri, D. C., Nortamo, P., and Gahmberg, C. G. (1995) . A peptide derived from the intercellular adhesion molecule-2 regulates the avidity of the leukocyte integrins CDllb/CD18 and CDllc/CDIS. J. Celí. Biol. 129, 1143-1153) .

Ďalej sa zistilo, že protilátky 3.9 proti a_x a protilátky OKMIO proti a_M majú synergický účinok, keď sa pridajú spolu, čo spôsobuje celkovú inhibíciu bunkovej adhézie.

Príklad 4: Vplyv organizácie cysteínových väzieb na aktivitu

LLG-C4 rôznym

Fmoc na

Štyri cysteíny prítomné v LLG-C4 sa môžu teoreticky párovať rôznymi spôsobmi. Zisťovalo sa, ako ovplyvňuje usporiadanie cysteínových väzieb aktivitu LLG-C4. Na tieto účely sa pripravili syntetické peptidy s usporiadaním disulfidov.

Peptidy sa syntetizovali použitím chémie zariadení Appled Biosystems modelu 433A (Foster City, CA) . Disulfidy sa vytvorili oxidáciou v pufri 10 mM hydrogénuhličitanu amónneho (pH 9) cez noc. Peptidy sa potom čistili pomocou HPLC na acetonitrilovom gradiente. Vytvorenie disulfidov sa potvrdilo analýzou hmotnostnej spektroskopie. Peptidy C(l-8;3-9) a C(l-9;3-8) s riadenými disulfidovými mostíkmi sa pripravili vo firme Anaspec (San Jose, Ca) Peptid ACDCRGDCFCG (RGD-4C) (popisuje sa v publikácii Koivunen, E., Wang, B., and Ruoslahti, E. (1995). Phage Libraries displaying cyclic peptides with different ring sizes: ligand specificitíes of the RGD-directed integrins.

Bio/Technology 13, 265-270) sa získal od Dr. E. Ruoslahti (Burnhamov inštitút, San Diego, CA).

Najviac aktívny peptid C(1-8;3-9) priamym vytvorením jednej disulfidovej cysteínami Cl a C8 a druhej disulfidovej väzby medzi cysteínami C3 a C9. Peptid C (1-9; 3-8) mal disulfidové mostíky medzi cysteínami CA a C9 a medzi cysteínami C3 a C8. Bunky sa viazali na peptid obsahujúci C (1-9;3-8) ale neviazali sa na konfomér s C (1-9;3-8) (Obr.2). Reťazenie peptidu C(l-8;3-9) s glutaraldehydom ďalej zosilňuje naviazanie buniek, čo zjavne spôsobuje lepšie potiahnutie multimérneho peptidu, zatial čo rovnaké ošetrenie peptidu C(1-9;3-8) neviedlo k naviazaniu buniek. Vo všeobecnom prípade peptid C(1-8;3-9) špecificky podporuje naviazanie bunkových línií exprimujúcich β₂ integríny, ako sú bunky L transfekované β₂ integrínami a leukocytické bunkové línie THP-1, U937 a Jurkatove bunky. Naviazanie buniek transfekovaných α_χβ₂ na LLG-C4-GST sa inhibovalo pomocou EDTA a blokujúcimi protilátkami 7E4 sa získal väzby medzi disulfidy, disulfidami proti p₂integrínu (Obr. 2D) . Bunkové línie L929, K562, SKOV-3,

KS6717 a Eahy96, ktoré nie sú leukocyty a neexprimujú β₂ integríny nevykazujú žiadne naviazania na peptid alebo GGL-C4GCT, či boli bunky vopred upravené esterom forbolu alebo nie (dáta nie sú uvedené).

Príklad 5: Blokovanie adhézie bunkových línií leukocytov sprostredkované β₂ integrínom pomocou nonapeptidu LLG-C4.

Testovala sa schopnosť peptidov obsahujúcich LLG blokovať naviazania leukocytov na adhezívne proteíny alebo neprítomnosť tripeptidovej sekvencie LLG. Adhézia buniek THP-1 na LLG-C4-GST sa inhibovala peptidom C(1-8;3-9) s hodnotou IC₅₀ 20 μΜ (Obr. 3). Druhý konfomér C(l-9;3-8) bol 20 krát menej aktívny pri porovnaní s C (1-8; 3-9) . Aby bolo možné skúmať, či tripeptidová sekvencia LLG je dostatočná pre rozoznávanie β₂ integrínu, pripravil sa minimálny peptid CLLGC obsahujúci na svojich koncoch cysteíny, aby sa vyvolala štruktúra vynútená disulfidmi. V kontrolnom peptide sa leucíny nahradili alanínmi. Experimenty adhézie buniek THP-1 použitím substrátu LLG-C4-GST indikovali, že CAAGC je slabý kompetítor bunkovej adhézie, zatiaľ čo CLLGC ľahko inhiboval bunkovú adhéziu pri koncentráciách 1 mM alebo vyšší, čo indikuje špecifické rozoznávanie motívu LLG β₂ integrínu (Obr. 3).

Testovala sa tiež schopnosť peptidov obsahujúcich LLG inhibovať naviazania Jurkatových buniek na rekombinantný proteín ICAM-l-Fc, ktoré zahrnuje prvú Ig doménu so sekvenciou LLG, sprostredkovanej α_Εβ₂ integrínami. ICAM-l-Fc sa priamo naniesol alebo sa viazal prostredníctvom proteínu A na mikrotitračné priehlbiny. V oboch prípadoch sa zistilo, že inhibícia adhézie Jurkatových buniek spôsobená proteínom C(l— 8;3—9) je závislá na koncentrácii a hodnota IC₅₀ je približne 80 μΜ (Obr. 4).

Konformér C(1-9;3-8) bol niekoľkokrát menej aktívny a nevykazoval skoro žiadny účinok. Peptid C(1-8;3-9) podobne inhiboval naviazanie čerstvo izolovaných T buniek na kultivované endoteliálne bunky, ktoré sa stimulovali s cieľom expresie ICAM-1 ošetrením TNF-α (Obr. 4B) . Bunky sa neviazali na nestimulované endoteliálne bunky. Peptid RGD-C4 obsahujúci RGD nevykazoval žiadny účinok na naviazanie T buniek na endoteliálny ICAM-1.

Von Willebrandov faktor a kolagén typu IV sú nové potencionálne ligandy β₂ integrínu, pokial obsahujú peptidové motívy podobné LLG. Zistilo sa, že bunky THP-1 aktivované esterom forbolu sa pevne viažu na obidva proteíny. Protilátky 7E4 proti β₂ integrínu blokujú naviazanie buniek THP-1 na von Willebrandov faktor (Obr. 5A) a bol takmer rovnako účinný inhibítor ako katión-chelatačné činidlo EDTA (dáta nie sú uvedené). Protilátky LM609 a P2 proti β₂ integrínu nevykazovali žiadny účinok. Peptid C(l-8;3-9) je silný inhibítor naviazania buniek THP-1 na von Willebrandov faktor. Peptid inhiboval s hodnotou IC50 približne 20 μΜ (Obr. 5B) Navyše peptid CLLGC, ale nie peptid CAAGC, inhiboval pri koncentrácii 500 μΜ (dáta nie sú uvedené) . Podobná inhibícia sprostredkovaná peptidom C(l-8;3-9) sa pozorovala pri naviazaní Jurkatových buniek na von Willebrandov faktor (dáta nie sú zobrazené). Adhézia THP-1 na kolagén typu IV je čiastočne inhibovaný peptidom C(l-8;3-9). Hodnota IC50 je približne 200 μΜ. S cieľom ďalšieho štúdia špecifickosti peptidov LLG sa testovala adhézia THP-1 na fibronektín, čo je známy ligand niekoľkých βι a β₃ integrínov. Peptid C(l8;3-9) vykazoval nepodstatnú inhibíciu naviazania fibronektínu na bunky THP-1. Peptid C(1-8;3-9) nevykazoval žiadny účinok na naviazanie buniek fibrosarkómu HT1080 na fibronektín alebo fibrinogén sprostredkovane βι a β₃ integrínom (dáta nie sú zobrazené).

Peptid C(1-8;3-9) je schopný inhibovať adhéziu buniek

THP-1 na fibrinogén, ktorý neobsahuje sekvenciu LLG (Obr. 6A).

Slabší konformér C(l-9;3-8) nemal žiadny účinok na naviazanie na fibrinogén. Podľa experimentov protilátkovej inhibície adherencie buniek THP-1 stimulovaných esterom forbolu na fibrinogén je prevažne sprostredkovaná α_Μβ₂ a α_χβ₂ integrínami, ako sa popisuje vyššie v texte (popisuje sa v publikácii Li, R., Xie, J., Kantor, C., Koistinen, V., Aitieri, D. C., Nortamo, P., and Gahmberg, C. G. (1995) . A peptide derived from the intercellular adhesion molecule-2 regulates the avidity of the leukocyte integrins CDllb/CD18 and CDllc/CD18. J. Celí. Biol. 129, 1143-1153). Peptid C(l8;3-9) podobne inhiboval naviazania fibrinogénu sprostredkovane β₂ integrínom na bunky monocytoidnej leukémie U937, ktoré exprimujú α_Μβ₂ a α_χβ₂ integríny (dáta nie sú uvedené). Pokial integríny závislé na RGD môžu tiež sprostredkovať zachytenie buniek na fibrinogéne, je možné porovnať aktivitu C(l-8;3-9) s aktivitou RGD-4C, čo je silný ligand niekoľkých βι a β₃ integrínov. Bunky THP-1 s nízkou koncentráciou peptidov C(l8;3-9) a RGD-4C sa vopred stimulovali na plne aktívne β₂ integríny a integríny závislými na RGD. Po predošlej stimulácii peptidmi je adhézia buniek THP-1 na fibrinogén účinnejšia pri porovnaní's peptidom C(1-8;3-9) (Obr. 6B) . Aby bolo možné skúmať, či peptid C(1-8;3-9) a RGD-4C cieli na rôzne integríny, pridali sa oba peptidy k bunkám spoločne. Účinok peptidov C(1-8;3-9) a RGD-4C bol aditívny a kombinácia peptidov blokovala adhéziu buniek účinnejšie.

Príklad 6: Test migrácie buniek

Migrácia buniek THP-1 in vitro sa sledovala v podmienkach blízkych fyziologickým podmienkam, v prostredí, ktoré obsahuje 10 % séra, aby neinterferovalo s adhezívnymi vlastnosťami buniek. Vrchný a spodný povrch filtra Transwell s velkostou pórov 8 mikrometrov sa potiahol fibrinogénom, LLG-C4-GST alebo GST koncentrácie 40 pg/ml cez noc pri teplote 4 °C. Voľné väzobné miesta sa blokovali inkubáciou s 5 % BSA/TBS. Bunky THP-1 (5 a 10⁴ v 100 μ 1) sa naniesli do vrchnej časti do kultivačného média obsahujúceho 10% FCS.

Peptid C(1-8;3-9) alebo C(1-9;3-8) sa pridal v koncentrácii 200 μΜ. Spodná časť sa naplnila 750 μΐ 10 % kultivačného média obsahujúceho 10% FCS. Po kultivácii počas 18 hodín pri teplote 37 °C sa filtre ponorili do metanolu na 15 minút, ďalej do vody na dobu 10 sekúnd a do 0,1 % toluidínovej modrej na dobu 5 minút. Filtre sa potom premyli 3 až 5 krát vo vode až sa bunky odfarbili. Bunky sa odstránili z vrchnej časti filtra bavlneným tampónom a pod mikroskopom sa zrátali bunky migrované na spodnú stranu filtra. Na štatistickú analýzu sa používal Študentov test.

Bunky účinne migrovali za prítomnosti 10% séra. Peptid C (1-8;3-9) pri koncentrácii 200 μΜ úplne blokoval schopnosť buniek traverzovať filtrom a viazať sa na spodný povrch (Obr. 6C) (p=0,005, n=6). Konformér C(l-9;3-8) je menej aktívny pri porovnaní s peptidom C(1-8;3-9) a inhibícia bola len čiastočná (p=0,01, n=6). Rozdiel aktivít medzi peptidami C(l8;3-9) a C(l-9;3-8) je podstatný (p=0,003). Bunky neprepadávali samovoine do spodnej časti pórami filtra veľkosti 8 pm. Väčšina buniek po jednodňovej kultivácii ostala v hornej časti. V prípade opačnej stratégie, kedy sa filtre potiahli LLG-C4, sa značne zintenzívnila migrácia buniek. Migrácia buniek bola v prípade substrátu LLG-C4-GST približne desaťkrát vyššia než v prípade kontrolného GST (Obr. 6D) . Migrácia buniek na LLG-C4-GST bola tiež účinnejšia než na fibrinogéne alebo fibronektíne. Peptid C(1 až 8,3 až 9) pri koncentrácii 200 μΜ úplne potlačil migráciu buniek na LLG-C4GST (p=0,0026, n=6) (dáta nie sú uvedené).

Príklad 7: Analýza peptidov pomocou NMR

Peptidy C(l-8;3-9) a C(1—9;:3-8) sa analyzovali NMR spektroskopiou s cielom stanoviť, či existujú rozdiely v usporiadaní peptidov spôsobenými priamym usporiadaním disulfidových väzieb. Peptid C(1-8;3-9) sa rozpustil v DMSO/H2O (90/10) a peptid C(l-9;3-8) sa rozpustil vo vode v koncentrácii 1 až 3 mM. Rôzne rozpúšťadlá vykazujú rôznu rozpustnosť oboch peptidov. Dvojrozmerné spektrá získané pomocou spektrometrov, ktoré pracujú pri ¹H-frekvencii 600 a 800 Mhz, umožňujú definovať 114 nukleárnych Overhauserových zosilňovačov (nOes) v prípade peptidu C(1-8;3-9) a 85 v prípade peptidu c (1-9;3-8). Z rodiny 200 štruktúr vytvorených simulovanou hybridizáciou (program DYANA) sa vybralo 40 štruktúr s neobmedzenými stupňami voľnosti (0,2 Ä).

Určenie štruktúry každého nonapeptidu viedlo ku vzniku vhodne definovaného usporiadania základného reťazca. RMSD hlavných atómov reťazca je 0,4±0,2 Ä v prípade peptidu C(1 až 8, 3 až 9) a 0,3±0,2 Ä v prípade peptidu C(l-9;3-8) vyrátaného z komplexu 40 štruktúr. V prípade obidvoch peptidov všetky diedrály hlavného reťazca φ a ψ sú vo výhodných a povolených oblastiach Ramanchandranovho grafu. Existuje tu len niekoľko nukleárnych Overhauserových zosilňovačov (nOes), s cielom definície orientácie bočného reťazca a preto diedrály F4, L5 a L6 bočného reťazca sú zvlášť diferencované (Obr. 7A).

Párovanie disulfidov dvomi spôsobmi ovplyvňuje štruktúru nonapeptidov. „Skrížené usporiadanie disulfidov peptidu C(l8;3-9) si vynucuje celkovo pevnejšiu štruktúru pri porovnaní s „paralelným usporiadaním disulfidov peptidu C(1-9;3-8) . To odráža veľký počet nOes pozorovaný v prípade peptidu C(l8;3-9) (114) pri porovnaní s peptidom C(l-9;3-8) (85). Neexistuje tu sklon ku kratšej vzdialenosti vynútený v peptide C(l-8;3-9) pri porovnaní s peptidom C(l-9;3-8). Výsledkom dvoch spôsobov párovania disulfidov je vnútorný zvyšok nOes zistený len v jednej štruktúre. 37 sa ich vyskytuje v peptide C(l—8;3—9) a 20 v peptide C(l-9;3-8).

Skrížené usporiadanie disulfidov v peptide C(l-8;3-9) je topologicky komplikovanejšie, než pri paralelnom premostení, ktoré sa objavuje v peptide C(1-9;3-8). V krátkom nonapeptide priľahlé disulfidy s veľkými van der Walsovými polomermi atómov síry tvorí rad priestorových obmedzení. Zvyšok P2 tiež obmedzuje voľnosť usporiadania, pokým G7 sa ho zúčastňuje.

Dopad topológie na priestorové obmedzenie je zjavné z reprezentačných štruktúr (Obr. 7). Peptid C(l—8;3—9) je kompaktnejší pri porovnaní s peptidom C(l-9;3-8). V peptide C (1-8;3-9) ďalej existuje spojitá hydrofóbna povrchová oblasť obsahujúca alifatické skupiny P2, F4 a L5. Disulfidové mostíky a reťazec F4-L6 je v peptide C(l-8;39) zlomený, zatiaľ čo v peptide C(l-9;3-8) sú vysunuté. Táto štruktúra je pravdepodobne príčinou zlej rozpustnosti peptidu C (1-8; 3-9) vo vode a môže sa podieľať na jeho vyššej aktivite.

Zoznam sekvencii <210>

<211>

<212>

<213>

<400>

proteín neznámy organizmus 1

Leu Leu Gly <210> 2 <211> 9 <212> proteín <213> neznámy organizmus <220>

<221> doména <222> (2) <223> variabilné aa, Xaa aminokyselina <220>

<221> doména <222> (4) <223> variabilné aa, Xaa aminokyselina v polohe v polohe môže byť môže byť

Ľubovoľná ľubovoľná <400> 2

Cys Xaa Cys Xaa Leu Leu Gly Cys Cys 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> proteín <213> neznámy organizmus <400> 3

Pro Cys Phe Leu Leu Gly Cys Cys 5

Cys

Claims (12)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Peptid obsahujúci štruktúru

   LLG (SEQ ID NO: 1) alebo jeho štrukturálny alebo chemický analóg.
2. 2. Peptid obsahujúci štruktúru

   CXCXLLGCC (SEQ ID NO: 2) kde symbol X je ľubovoľný aminokyselinový zvyšok, alebo jeho štrukturálny alebo chemický analóg.
3. 3. Peptid obsahujúci štruktúru

   CPCFLLGCC (SEQ ID NO: 3) alebo jeho štrukturálni alebo chemický analóg.
4. 4. Peptid podľa nároku 2 alebo 3, ktorého štruktúra je vynútená dvomi disulfidovými väzbami.
5. 5. Peptid podľa nároku 4, ktorý obsahuje jednu disulfidovú väzbu medzi cysteínami Cl a C8 a druhú disulfidovú väzbu medzi cysteínami C3 a C9.
6. 6. Peptid podľa nároku 4, ktorý obsahuje jednu disulfidovú väzbu medzi cysteínami Cll a C9 a druhú disulfidovú väzbu medzi cysteínami C3 a C8.
7. 7. Peptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6 na použitie ako farmaceutický prostriedok.
8. 8. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje peptid pódia ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6 v spojení s farmaceutický prijateľným nosičom.
9. 9. Použitie peptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6 pri výrobe farmaceutického prostriedku na liečbu zápalových ochorení a ľudských leukémii.
10. 10. Použitie peptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6 ako antagonistov β₂ integrínov pri biochemickej izolácii a čistení rôznych druhov integrínov a rôznych typov buniek leukocytov in vitro.
11. 11.Spôsob terapeutickej a profylaktickej liečby zápalového ochorenia a ľudských leukémii, vyznačuj úci sa t ý m, že zahrnuje aplikáciu terapeuticky alebo profylaktický účinného množstva peptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6 subjektu, ktorý potrebuje uvedenú liečbu.
12. 12.Použitie peptidu obsahujúceho tripeptidový motív LLG alebo jeho štrukturálneho alebo chemického analógu pri výrobe farmaceutických prostriedkov pre inhibíciu adhézie a migrácie leukocytových buniek.