SK11296A3 - Dna fragment, derived from coryneform bacteria and manufacturing process of l-amino acid or nucleic acid - Google Patents

Dna fragment, derived from coryneform bacteria and manufacturing process of l-amino acid or nucleic acid Download PDF

Info

Publication number
SK11296A3
SK11296A3 SK112-96A SK11296A SK11296A3 SK 11296 A3 SK11296 A3 SK 11296A3 SK 11296 A SK11296 A SK 11296A SK 11296 A3 SK11296 A3 SK 11296A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
sucrose
gene
ferm
coryneform bacteria
atcc
Prior art date
Application number
SK112-96A
Other languages
English (en)
Inventor
Masakazu Sugimoto
Seiko Otsuna
Tsuyoshi Nakamatsu
Kazuo Nagase
Makoto Tsuchiya
Hiroshi Matsui
Yasuhiko Yoshihara
Original Assignee
Ajinomoto Kk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Kk filed Critical Ajinomoto Kk
Publication of SK11296A3 publication Critical patent/SK11296A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01048—Sucrose alpha-glucosidase (3.2.1.48), i.e. sucrase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/0101—Oligo-1,6-glucosidase (3.2.1.10), i.e. sucrase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Oblasť techniky
Vynález sa vzťahuje na sacharázový gén, odvodený od koryneformných baktérií. Podrobnejšie sa vynález vzťahuje na fragment DNA, odvodený z koryneformných baktérií, ktorý obsahuje gén kódujúci pre proteín, ktorý má sacharázovú účinnosť, ďalej na rekombinantnú DNA, získanú vložením uvedeného DNA fragmentu do vektora, schopného rastu v koryneformných baktériách, ďalej sa týka mikroorganizmov, ktoré patria ku koryneformným baktériám, uchovávajúcim uvedenú rekombinantnú DNA, a ktoré sú schopné produkovať Laminokyselinu alebo nukleovú kyselinu, a vzťahuje sa na spôsob prípravy L-aminokyseliny alebo nukleovej kyseliny kultiváciou uvedeného mikroorganizmu.
Doterajší stav techniky
Mnohé doterajšie štúdie sa týkajú prípravy mikroorganizmov, ktoré produkujú L-aminokyselinu využitím technológie génového inžinierstva. Pozri Biotechnology Letters, Vol. 2, strany 525 až 530 (1980); Appl. Environ. Microbiol., Vol. 144, strany 181 až 190 (1979), a Preprint of Discussions and Lectures in: The Agricultural and Chemical Society of Japan (1981), strana 8; všetky tieto zdroje sú tu zahrnuté týmto odkazom. Všetky uvedené štúdie sa týkajú rozmnožovania génov na biosyntézu L-aminokyselín so zámerom zvyšovania produktivity jednotlivej bunky, vzhľadom na produkciu vyžadovaných L-aminokyselín. Uvedené rozmnožovanie nezvyšuje účinnosť prípravy L-aminokyselín zvyšovaním asimilácie sacharidov (ako fermentovanej suroviny) mikroorganizmami.
Sú známe niektoré príklady, ktoré využívajú technológiu génového inžinierstva na zvýšenie asimilácie sacharidov mikroorganizmami, produkujúcimi L-aminokyseliny. Pozri prihlás ku japonského patentu pod číslami 61-119185 a 2-171178, ktoré sú tu zahrnuté týmto odkazom. Podľa týchto prác sa génovou manipuláciou u Escherichia coli dosiahla schopnosť asimilovať cukry. Bližšie, kmeň Escherichia coli sa vybavil schopnosťou prijímať sacharózu, neskoršie schopnosťou hydrolyzovať sacharózu na glukózu a fruktózu a výsledkom bolo, že uvedený kmeň bol schopný využívať sacharózu ako zdroj uhlíka, teda schopnosťou, ktorou nie je tento kmeň inherentne vybavený. Nikto však doteraz neuvádza, že sa podobný úspech dosiahol aj s koryneformnými baktériami a nie je známa nijaká publikácia, ktorá by sa týkala využitia technológie génového inžinierstva na zvýšenie schopnosti koryneformných baktérií asimilovať sacharidy, ako je sacharóza a ďalšie.
Podstata vynálezu
Pomocou technológie génového inžinierstva zlepšiť schopnosť baktérií skupiny koryneformných baktérií asimilovať sacharózu a tým zvýšiť rýchlosť fermentácie pozmenenými baktériami a tak zlepšiť výťažnosť L-aminokyselin a nukleových kyselín zo suroviny, obsahujúcej sacharózu, je jedným z cieľov tohto vynálezu. Podrobnejšie predmety tohto vynálezu zahrňujú získanie DNA fragmentu, odvodeného od korynef ormných baktérií a obsahujúceho gén, kódujúci pre protein so sacharázovou aktivitou; ďalej zahrňujú rekombinantnú DNA, obsahujúcu uvedený DNA fragment; vektor, ktorý je schopný génového množenia v koryneformných baktériách, obsahujúcich uvedený fragment; mikroorganizmus, osobitne koryneformnú baktériu, ktorá viaže uvedený vektor a spôsob zlepšenia účinnosti prípravy L-aminokyselín alebo nukleových kyselín pri fermentácii transformovanými mikroorganizmami, najmä transformovanými koryneformnými baktériami, za prítomnosti suroviny, obsahujúcej sacharózu.
Podrobný opis vynálezu
Autori tohto vynálezu s úspechom dosiahli uvedené ciele zistením DNA fragmentov, odvodených od koryneformných baktérií, ktoré obsahujú gén, kódujúci pre proteín so sacharázovou účinnosťou. Naviac opísali spôsob výroby L-aminokyselín a nukleových kyselín s vysokým výťažkom a/alebo v kratšom čase ako bežné spôsoby, využitím kultivácie koryneformných baktérií, do ktorých boli zavedené rekombinantné DNA, obsahujúce vyššie opísaný fragment DNA.
Podrobne tento vynález sa vyznačuje fragmentom DNA, odvodeným od korynef ormných baktérií a obsahuj lícim gén, ktorý kóduje pre proteín so sacharázovou účinnosťou; vektorom, schopným génového množenia v koryneformných baktériách a obsahujúci uvedený DNA fragment; vynález ďalej zahrňuje mikroorganizmus, ktorý prislúcha k koryneformným baktériám, ktoré viažu uvedený vektor, a ktorý je schopný produkovať L-aminokyselinu alebo nukleovú kyselinu; rekombinantnú DNA, získanú vložením uvedeného DNA fragmentu do vektora, schopného génového množenia v koryneformných baktériách; a spôsob prípravy L-aminokyseliny alebo nukleovej kyseliny, zahrňujúci kultiváciu uvedeného mikroorganizmu. Výraz proteín so sacharázovou účinnosťou” sa tu používa vo význame sacharolytického proteínu, schopného hydrolyzovať sacharózu za vzniku glukózy a fruktózy. Proteín má výhodne sacharázovú účinnosť najmenej 1 jednotku/mg proteínu, výhodne účinnosť 2, 3, 4 alebo 5, alebo ešte viac jednotiek/mg proteínu.
Výraz koryneformná baktéria” sa tu používa na označenie aeróbnych gram-pozitívnych tyčiniek, ktoré patria k rodu Microbacterium, Brevibacterium alebo Corynebacterium, ako sa opisujú v príručke Bergey s Manua'l of Determinative Bacteriology, 8 th ed., str. 599 (1974), v texte tohto vynálezu zahrnutá týmto odkazom. Uvedený výraz zahrňuje nasledujúce divé kmene, ktoré majú schopnosť produkovať
L-glutamovú ky
Corynebactéri um Corynebactér i um Corynebact erium Corynebactéri um Corynebact e r i um selinu a z nich acetoacidophi L um ace tog Lutamicum caLlunae glutamicum g Lu tamicum odvodené mutantné kmene
ATCC 13870
ATCC 15806
ATCC 15991
ATCC 13032
ATCC 13060
Brevibacteri um d ivaricatum ATCC 14020
Brevibacterium lactofermentun ATCC 13869
Corynebacteri um : Hli um ATCC 15990
Corynebacteri um : melás secola ATCC 17965
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacteri um roseum ATCC 13825
Brevibacterium flavum ATCC 13826
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
Brevibacterium ammnoniagenes ATCC 6872
Corynebacteri um ·. equi ATCC 21280
Gén, kóduj úci pre proteín so sacharázovou účinnosťou
tu používa na označenie génu, ktorý kóduje proteín, ktorý má opísanú účinnosť na hydrolýzu sacharózy za vzniku glukózy a fruktózy. Sacharolytická účinnosť je dôležitá u mikroorganizmov, ak využívajú sacharózu ako zdroj uhlíka. Gén nie je inak obmedzený. Určité, v texte výhodné sekvencie zásad neurčujú rozsah tohto vynálezu. Do vynálezu sa zahrňujú výhodné sekvencie zásad, ďalej ich funkčné ekvivalenty, najmä také, ktoré majú v porovnaní s výhodnými sekvenciami do ± 300 naviac alebo menej zásad, 3 alebo 5 alebo obidvoch druhov, ako aj schopnosť kódovať pre proteín, ktorý má najmenej 75 % sacharázovej účinnosti ako má proteín, kódovaný pre výhodnú sekvenciu a ďalej sa do vynálezu zahrňuje akýkoľvek iný gén, ktorý spĺňa uvedené funkčné požiadavky.
Na získanie DNA fragmentu, obsahujúceho gén, ktorý kóduje pre proteín so sacharázovou účinnosťou podľa tohto vynálezu, môže sa použiť spôsob, zahrňujúci výstavbu génovej knižnice z chromozomálnej DNA koryneformných baktérií a následné klonovanie sacharázového génu hybridizáciou. Uvedený spôsob bude opísaný ďalej.
Génová knižnica koryneformného genómu sa môže vybudovať použitím bežných techník, ako sú techniky diskutované Sambrookom et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2 nd ed., CSH Press, NY, 1989, čo sa v tomto texte zahrnuje odkazom, osobitne kapitoly 1 a 9. Stručne, z koryneformných baktérií získaná chromosomálna DNA sa čiastočne odbúra pomcou reštrikčnej endonukleázy, podrobí sa ligácii do vhodného kolonového vektora ako je plazmid a transformuje sa do vhodného hostiteľa. Uprednostnený klonový vektor na vybudovanie koryneformnej genómovej knižnice je pUC18. Uprednostnený hostiteľ je E. coli, osobitne E. coli JM109.
Sacharázové alebo invertázové gény sa klonovali s Bacillus subtillis (Gene, Vol. 45, strany 221 až 225 (1986) - zahrnuté týmto odkazom), Zymomonas mobilis (J. Bacteriol., Vol. 172, strany 6727 až 6735 (1990) - zahrnuté týmto odkazom), Streptococcus mutans (Infect. Immun., Vol. 56, strany 1956 až 1960 (1988) - zahrnuté týmto odkazom), kvasinky rodu Saccharomyces (Nucleic Acids Res., Vol. 11, strany 1943 až 1954 (1983) - zahrnuté týmto odkazom), Vžbrio alginolyticus (Gene, Vol. 80, strany 49 až 56, (1989 - zahrnuté týmto odkazom), atď., a uvedené gény sú do určitého stupňa navzájom homologické (J. Bacteriol., Vol. 172, strany 6727 až 6735 (1990) - zahrnuté týmto odkazom). Syntetické DNA sa môžu pripraviť použitím bežných spôsobov, ako je roztoková syntéza DNA, alebo syntéza DNA v tuhej fáze, najmä s využitím automatického syntetizátora DNA na základe častí, bežných v týchto mikroorganizmoch.
Na prípravu značkovaných vzoriek sa takto vytvorené n 9 syntetické DNA fosforylujú, napríklad použitím [t- P] ATP ako substrátu. S použitím uvedených značkovaných vzoriek a pomocou hybridizácie buniek sa vytvorená knižnica triedi. Z označených kolónií sa vyberú tie, ktoré majú sacharázovú účinnosť. Účinný DNA fragment sa potom z klonovaného vyberie bežnou technikou.
Expresný kódujúcim pre sa využívci v všeobecnosti vektora s génom a ktorý nie je presne vymedzený, ale vo niektorý Užitočný
Biol. Chem. , obsahuje fragment DNA má sacharázovú účinnosť vektor, ktorý proteín, ktorý tomto vynáleze môže byť baktérií. (Agric.
to z koryneformných zahrňuje pHM1519 plazmid, odvodený vektor napríklad Vol. 48, (1984), strany 2901 až 2903, zahrnuté týmto odkazom), pAM330 (Agric.
-..6
Biol. Chem., Vol. 48, (1984), strany 2901 až 2903, zahrnuté týmto odkazom), plazmidy na ich báze, odolné voči liečivám, a podobné. Vektor sa môže do chromozómov vložiť homológovou rekombináciou, alebo vložením sekvencií. Ako homológová rekombinácia je známy spôsob chromozómovej rekombinácie génov korynebaktérií s pôvodom z teplotné závislej replikácie; pozri Prihláška japonského patentu číslo 5-7491. Ako vložené sekvencie sú známe IS714, IS719, IS903 a podobné a tieto sekvencie sa využijú na hore uvedený účel; pozri VO93/Í8151.
Jednotlivé príklady koryneformných baktérií, ktoré sa v tomto vynáleze používajú ako hostiteľské baktérie, zahrňujú prírodné kmene baktérií, produkujúcich L-glutamovú kyselinu, a od nich odvodené mutantné kmene, ktoré sú schopné produkovať inú L-aminokyselinu, alebo nukleové kyseliny ako je inozín, 5 -inozinová kyselina, guanozín a 5 -guanylová kyselina. L-aminokyseliny zahrňujú také kyseliny, ktoré sú produkované koryneformnými baktériami, vrátane napríklad L-glutambvej kyseliny, L-lyzínu, L-treonínu, L-aspartovej kyseliny, L-izoleucínu, L-argionínu, L-prolínu, L-histidínu, L-valínu, L-leucínu, L-fenylalanínu, L-glutamínu a ďalšie.
Jednotlivé príklady hostiteľov, ktorí sú vhodní na produkciu rôznych L-aminokyselín a nukleových kyselín sa uvádzaj ú ďalej .
(i) Hostitelia výhodní na produkciu L-glutamovej kyseliny:
Brevibacte rium lactofermentum AJ
12745 (FERM
BP-2922); pozri Patent USA číslo 5,272,067, strana 561;
Brevibacterium lactofermentum AJ pozri Patent USA číslo 5,272,067.
Brevibacterium lactofermentum AJ pozri Patent USA číslo 5,272,067.
Brevibacterium lactofermentum AJ pozri Patent USA číslo 5,272,067.
Corynebacterium glutamicum ATCC
12746 (FERM BP-2923);
12747 (FERM BP-2924);
12748 (FERM BP-2925);
21942; pozri prihlášku japonského patentu číslo 5-3793, strana 3, tabuľka 1.
Ako hostitelia sa okrem už uvedených kmeňov môžu použiť ďalšie v prírode sa vyskytujúce kmene koryneformných baktérií:
Corynebactéri um acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebactéri um acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebactéri um callunae ATCC 15991
Corynebactéri um glutamicum ATCC 13032
Corynebactéri um glutamicum ATCC 13060
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869
Corynebactéri um Hli um ATCC 15990
Corynebacterium melás secola ATCC 17965
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium flavum ATCC 13826
Brevibacterium thiogenitali s ATCC 19240
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
íl) Výhodní hostitelia na produkciu L-lyzínu:
Brevibacterium lactofermentum AJ 12031 (FERM BP-277); pozri prihlášku japonského patentu číslo 60-62994, strana 525, ľavý spodný stĺpec.
Brevibacterium lactofermentum prihlášku japonského patentu číslo pravý spodný stĺpec.
Brevibacteri um
ATCC 39134; pozri
60-62994, strana 473
FERM P-3840); pozri
Brevibacterium lactofermentum AJ
Patent USA číslo 4 lactofermentum pozri Patent USA číslo 5,304,476.
Brevibacterium lactofermentum pozri Patent USA číslo 5,304,476.
B re vibacter i um Lactofermentum pozri Patent USA číslo 5,304,476.
Corynebac terium glutamicum AJ pozri Patent USA číslo 5,304,476.
AJ
AJ
AJ
11082 (NRRL B-11470
275,157.
12435 (FERM
BP-2294)
12592
12593
12596 (FERM (FERM (FERM
BP-3239)
BP-3240)
BP-3242)
Corynebacterium glutamicum AJ 3463 (FERM P-1987) ; pozri Publikovaný japonský patent číslo 51-34477 iii) Výhodní hostitelia na produkciu L-treonínu:
Brevibacterium lactofermentum AJ 11188 (FERM P-4190); pozri prihlášku japonského patentu číslo 60-87788, strana 473, pravý spodný stĺpec
Corynebacterium glutamicum AJ 11682 (FERM BP-118); pozri Publikovaný japonský patent číslo 2-31956, strana 230, stĺpec 8.
Brevibacterium flavum AJ 11683 (FERM BP-119); pozri Publikovaná japonský patent číslo 2-31956, strana 231, stĺpec 10.
(iv) Výhodní hostitelia na produkciu kyseliny L-aspartovej:
Brevibacterium flavum AJ 3859 (FERM P-2799); pozri Prihláška japonského patentu číslo 51-61689, strana 524, ľavý horný stĺpec.
Brevibacterium lactofermentum AJ 3860 (FERM P-2800); pozri Prihláška japonského patentu číslo 51-61689, strana 524, ľavý spodný stĺpec.
Corynebacterium acetoacidophilum AJ 3877 (FERM P-2803); pozri Prihlášku japonského patentu číslo 51-61689, strana 524, ľavý horný stĺpec.
Corynebacterium glutamicum AJ 3876 (FERM P -2802); pozri Prihláška japonského patentu číslo 51-61689, strana 524, ľavý horný stĺpec.
v) Výhodní hostitelia na produkciu L-izoleucínu:
Brevibacterium lactofermentum AJ 12404 (FERM P-10141); pozri Prihláška japonského patentu číslo 2-42988, strana 603, ľavý spodný stĺpec.
Brevibacterium flavum AJ 13405 (FERM P-10142); pozri Prihláška japonského patentu číslo 2-42988, strana 524 ľavý spodný stĺpec.
vi) Výhodní hostitelia na produkciu L-arginínu:
Brevibacterium flavum AJ 12144 (FERM P-7642); pozri Prihláška japonského patentu číslo 5-27388, strana 174, stĺpec 4.
Corynebacterium glutamicum AJ 12145 (FERM P-7643) ; pozri publikovaný japonský patent číslo 5-27388, strana 174, stĺpec 4.
Brevibacterium flavum ATCC 21493; pozri Prihláška japonského patentu číslo 5-3793, strana 3, tabuľka 1.
Corynebacterium glutamicum ATCC 21659; pozri Prihláška japonského patentu číslo 5-3793, strana 3, tabuľka 1.
vii) Výhodní hostitelia na produkciu L-prolínu:
Brevibacterium lactofermentum AJ 11225 (FERM P-4370); pozri Prihláška japonského patentu číslo 60-87788, strana 473, ľavý horný stĺpec.
Brevibacterium flavum AJ 11512 (FERM P-5332); pozri Publikovaný japonský patent číslo 62-36679, strana 185, stĺpec 2.
Brevibacterium flavum AJ 11513 (FERM P-5333); pozri
Publikovaný japonský patent číslo 62-36679, strana 185, stĺpec 2.
Brevibacterium flavum AJ 11514 (FERM P-5334); pozri Publikovaný japonský patent číslo 62-36679, strana 185, stĺpec 2.
Corynebactéri um glutamicum AJ11522 (FERM P-5342) ; pozri
Publikovaný japonský patent číslo stĺpec 2.
Corynebacterium glutamicum AJ pozri Publikovaný japonský patent 185, stĺpec 2.
62-36679, strana 185,
11523 (FERM P-5343);
číslo 62-36679, strana vili) Výhodní hostitelia na produkciu L-histidinu:
Brevibacterium flavum AJ 3420 (FERM P-2316) ; pozri
Patent USA číslo 5,294,547.
Brevibacterium flavum AJ 12425 (FERM BP-2212); pozri
Patent USA číslo 5,294,547.
Corynebacterium glutamicum pozri Patent USA číslo 5,294,547 AJ 12092 (FERM P-7273);
Corynebacterium glutamicum pozri Patent USA číslo 5,294,547 AJ 12426 (FERM BP-2213);
ix) Výhodní hostitelia na prípravu L-valínu:
Brevibacterium lactofermentum AJ 3434 (FERM P-1845) ; pozri Patent USA číslo 5,188,948.
Brevibacterium lactofermentum AJ 12341 (FERM BP-1763) ; pozri Patent USA číslo 5,188,948.
Corynebacterium glutamicum AJ 3776 (FERM P-2601); pozri Patent USA číslo 5,188,948.
Corynebacterium glutamicum AJ 12342 (FERM BP-1746) ; pozri Patent USA číslo 5,188,948.
x) Výhodní hostitelia na produkciu L-leucínu:
Brevibacterium lactofermentum AJ 3452 (FERM P-1965) ; pozri Patent USA číslo 3,970,519.
Brevibacterium lactofermentum AJ 3719 (FERM P-2517); pozri Patent USA číslo 3,970,519.
Corynebacterium glutamicum AJ 3453 (FERM P-1966); pozri Patent USA číslo 3,970,519.
Corynebacterium glutamicum AJ 3455 (FERM P-1968); pozri Patent USA číslo 3,970,519.
xi) Výhodní hostitelia na produkciu L-.f enylalanínu :
Brevibacterium lactofermentum AJ 12637 (FERM BP-4160) ; pozri Prihláška japonského patentu číslo 5-49489.
Corynebacterium acetoacidoph.il um AJ 11761 (FERM P-6286); pozri Publikovaný japonský patent číslo 2-11235.
Corynebacte ri um acetoacidophi'Lum AJ 12638 (FERM
P-12382); pozri Publikovaný japonský patent číslo 2-11235.
xii) Výhodní hostitelia na produkciu L-glutamínu:
Brevibacterium flavum AJ 12418 (FERM BP-2205); pozri Patent USA číslo 5,294,547.
Corynebacterium acetoacidophilum AJ 12419 (FERM BP-2206); pozri Patent USA číslo 5,294,547.
xiii) Výhodní hostitelia na prípravu kyseliny 5-inozínovej:
Brevibacterium ammoniagen.es AJ 12192 (FERM P-7949) ; pozri Publikovaný japonský patent číslo 5-998.
Corynebacierium equi AJ 11347 (FERM P-4968) ; pozri
Publikovaný japonský patent číslo 57-22558.
Corynebacierium equi AJ 11350 (FERM P-4971) ; pozri
Publikovaný japonský patent číslo 57-22558.
Corynebacierium equi AJ 11352 (FERM P-4973) ; pozri
Publikovaný japonský patent číslo 57-22558.
Všetky uvedené publikované japonské patenty, prihlášky japonských patentov a patenty USA sú tu zahrnuté týmito odkazmi .
Na vloženie vektora alebo rekombinantnej DNA, obsahujúcich gén, ktorý kóduje pre proteín, ktorý má sacharázovú účinnosť , do uvedených koryneformných baktérií sa môžu použiť dobre známe spôsoby, ako je protoplastový spôsob (Gene, Vol . 39, strany 281 až 286 (1985), zahrnuté tu týmto odkazom), elektroporačný spôsob (Bio/Technology, Vol. 7 (1989); Prihláška japonského patentu číslo 2-207791, zahrnuté tu týmito odkazmi) a podobné spôsoby.
Spôsob kultivácie uvedených hostiteľov, kotviacich uvedený vektor alebo rekombinantnú DNA, sa nemusí odlišovať od bežných spôsobov kultivácie mikroorganizmov, všeobecne produkujúcich L-aminokyseliny. Na kultiváciu sa napríklad môže použiť akékoľvek bežné prostredie s obsahom zdrojov uhlíka, zdrojov dusíka, anorganických iónov a, ak sa to vyžaduje, aj organických minoritných výživných látok ako sú aminokyseliny, vitamíny a podobne.
Typické zdroje uhlíka zahrňujú glukózu, sacharózu a podobné zdroje, ako aj tekuté hydrolyzáty škrobu, melasy a podobné, obsahujúce uvedené cukry. Výhody tohto vynálezu sú však zrejmé najmä vtedy, ak sa kultivácia vykonáva v prostredí obsahujúcom ako zdroj uhlíka sacharózu. V tom prípade sa rýchlosť vzniku L-aminokyselín a nukleových kyselín významne zväčší v porovnaní s doteraz používanými spôsobmi, pri ktorých sa fermentuje východiskový materiál, obsahujúci sacharózu, ako je napríklad trstinová alebo repná melasa. Ako zdroj dusíka sa môže použiť plynný amoniak, vodný roztok amoniaku, amónne soli a podobné látky. Ak sa ako hostitelia použijú mutantné kmene, ktoré vyžadujú aminokyseliny a podobné látky, potom je nevyhnutné tieto vyžadované látky pridávať do kultivačného prostredia.
Kultivácia sa výhodne vedie aeróbne, pričom sa pH kultúry udržuje medzi hodnotami 6,0 až 8,0 a fermentačná teplota sa udržiava medzi 25°C a 40 °C až sa produkcia vyžadovanej L-aminokyseliny alebo nukleovej kyseliny v podstate zastaví a nezvyšuje sa jej množstvo. Na oddelenie L-aminokyseliny alebo nukleovej kyseliny od kultúry sa môže použiť akýkoľvek bežný spôsob ako je kryštalizácia, spôsoby iónovej výmeny a podobne.
Vynález sa bližšie objasňuje ďalej uvedenými príkladmi. Vynález sa týmito príkladmi však neobmedzuje.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Výstavba génovej knižnice
Z Brevibacteriun lactofermentum ATCC 13869 sa pripravila chromozomálna DNA spôsobom podľa Saito-Miura (Biochem. Biophs. Acte., Voľ. 8278, strany 619 až 629 (1963), zahrnuté tu týmto odkazom). Asi 100 gg takto pripravenej DNA sa čiastočne digerovalo s Sau3Al; zmes sa preniesla do roztoku sacharózy s gradientom hustoty od 10 % do 40 % sacharózy a ponechala sa odstreďovať na ultracentrifúge pri 22 000 otáčkach za minútu počas 22 hodín pri 20 “C . Z dna trubice sa potom injekčnou ihlou odobrali jednomililitrové alikvotné, časti, čím sa získal podiel, ktorý obsahoval približne 1500 až 6000 bp (base pairs - párov zásad). Táto frakcia sa dialyzovala proti TE pufru (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) a podrobila sa ligácii vektorom pUC18, ktorý sa štepil pomocou BamHl za použitia T4 DNA ligázy. Výslednou DNA sa transformoval kmeň Escherichia coli JM 109. Výsledkom prípravy bola génová knižnica, obsahujúca asi 10 000 klonov.
Označenie vzoriek
Základné sekvencie génov sacharázy, levanázy a invertázy, uvedené ďalej, boli už určené. Tieto zahrňujú levenázu (Mol. Genet., Vol. 208, strany 177 až 184 (1987), zahrnuté tu týmto odkazom) a sacharázu (Gene, Vol. 45, strany 221 až 225 (1996), zahrnuté tu týmto odkazom), obidve odvodené od Baci'llus subtilis; sacharázu, odvodenú od Streptococcus mutans (Infect. Immun. , Vol. 56, strany 1956 až 1960 (1988) , zahrnuté tu týmto odkazom); invertázu, odvodenú od Saccharomyces cerevisias (Nucl. Acids. Res., Vol. 11, strany 1943 až 1954 (1983), zahrnuté tu týmto odkazom); sacharázu, odvodenú od Zymomonas mobilis (J. Bacteriol. , Vol. 172 (1990) , strany 6727 až 6735, zahrnuté tu týmto odkazom); a sacharázu, odvodenú od Vibrio alginolyticus (Gene, Vol. 80, strany 49 až 56 (1989) , zahrnuté tu týmto odkazom) . Tieto sekvencie uvedených génov sú vzájomne čiastočne homológne (J. Bacteriol., Vol. 172, strany 6727 až 6735 (1990), zahrnuté tu týmto odkazom) . Na základe tejto informácie sa ako vzorkové sondy navrhli a syntetizovali DNA za použitia syntetizátora DNA, ktoré mali základnú sekvenciu vybranú z SEQ ID NOs: 1, 2 a 3 (pozri Zoznam sekvencií na konci textu).
Hybridizácia
Vytvorená, vyššie uvedená, knižnica sa použila na hybridizáciu na vytriedenie kolónií, hybridizovaných so značkovými vzorkami (sondami) spôsobom podľa Dereka (FOCUS, Vol, 6, strany 1 až 4 (1984), zahrnuté tu týmto odkazom). Teplota pri hybridizácii bola 50 °C a teplota pri premývaní filtra bola 48 °C. Kloň, vždy hybridizovaný s každou vzorkou (sondou) sa kultivoval v 100 ml prostredia M9 (Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press (1989); Maniatis, et al., A.3 in Appendixes, zahrnuté tu týmto odkazom). Oddelené bunky sa premyli 0,9%-ným fyziologickým roztokom soli, potom sa suspendovali v 5 ml 0,1 M roztoku fosfátového pufra (pH 7,3) a potom sa rozbili pôsobením ultrazvuku. Suspenzia sa potom odstredila pri 33 000 otáčkach za minútu počas jednej hodiny, s cieľom oddeliť výsledný supernatant a získať tak surový extrakt. 150 pg surového extraktu sa zmiešalo s 50 μΐ 0,5 M sacharózy a nechalo reagovať pri 30 °C počas jednej hodiny. Zmes sa potom zahrievala 3 minúty pri 100 °C na inaktiváciu enzýmov. Na stanovenie sacharázovej účinnosti sa určovala vytvorená glukóza pomocou skúšky Glucose C Test Vako (vyrobenej Vako Pure Chemicals Co.). Kmeň jedného klonu, ktorý mal podľa detekcie so sondou sekvenciu SEQ ID NO:2, vykázal silnú sacharázovú účinnosť (tabuľka 1). Tabuľka 1 ukazuje sacharázovú účinnosť (ako pomernú účinnosť) na 1 mg proteínu. Jedna jednotka je definovaná ako účinnosť, ktorá je nevyhnutná na vytvorenie 1 mg glukózy za 1 hodinu pri 30 'C. Plazmid kmeňa, ktorý vykázal sacharázovú účinnosť sa označuje ako pBS3-43.
Tabuľka 1
Plazmid/Hostiteľ Sacharázovú (j ednotky/mg účinnosť proteínu)
pUC18/ JM109 0
pBS3-43/JM109 3,1
Analýza klonu
Z vloženej DNA sa odštiepil fragment Smal s veľkosťou asi 6 kb a vložil sa na miesto Smal plazmidu pSAC4, čo je bifunkčný vektor pre Escherichia coli a koryneformné baktérie, ktorý spôsobuje odolnosť hostiteľa voči chloramfenikolu. Výsledný plazmid sa označil ako pSSM30 a vyvolával sacharázovú účinnosť u Escherichia coli (údaje sa tu neuvádzajú).
Escherichia coli JM109, ktoré majú plazmid pSSM30 sa označili ako AJ13047 a uložili sa podľa Budapeštianskej dohody v Národnom ústave biologických vied a humánnych technológií, v Agentúre pre priemyselné vedy a technológie, 1 až 3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibarakiken 305, Japonsko a bolo mu pridelené zbierkové číslo FERM BP-4800.
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 sa transformovali s pSSM30 pomocou elektropulzného spôsobu (japonský patent číslo 2-207791). Tranformant s pSSM30 sa označil ako ATCC13869/pSSM30. Tento sa kultivoval v 100 ml prostredia
Q
CM2G (kvasničný extrakt 10 g v 1 dm , polypeptón 10 g v 1 dm^, glukóza 5 g v 1 dm^, NaCl 5 g v 1 dm^, pH 7,0). Oddelené bunky sa premyli 0,9%-ným fyziologickým roztokom soli, potom sa suspendovaní! v 5 ml 0,1 M fosfátového pufra (pH 7,3) a potom sa rozbili účinkom ultrazvuku. Suspenzia sa potom odstred’ovala pri 100 000 x g na oddelenie zvyšného supernatantu a získal sa tak surový extrakt. 150 μΐ supernatanta sa zmiešalo s 50 μΐ 0,5 M sacharózy a nechalo sa reagovať pri 30 °C počas 1 hodiny, potom sa zahrievalo 3 minúty pri 100 °C na inaktiváciu enzýmu. Na určenie sacharázovej účinnosti sa stanovila glukóza použitím skúšky Glucose C Test Vako ( vyrobenej Vako Pure Chemicals Co.) Pretože Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 mali pôvodnú sacharázovú účinnosť v ich bunečnom tele, ako porovnávacia vzorka sa použil transformant, v ktorom hostiteľom bolo Brevibacterium lactofermentum ATCC13689 a ako plazmid sa použil pSAC4. Výsledok sa uvádza v tabuľke 2. V tabuľke 2 sa uvádza sacharázová účinnosť (ako pomerná účinnosť) na jeden mg pro ternu. Jedna jednotka je definovaná ako účinnosť, potrebná na vytvorenie 1 mg glukózy za jednu hodinu pri 30 °C . Ako je zrejmé z tabuľky 2, kmeň s pSSM30 má zvýšenú sacharázovú účinnosť.
Tabuľka 2
Hostiteľ/Plazmid Sacharázová účinnosť (jednotiek / mg proteínu)
ATCC13869/pSSM30 ATCC13869/pSAC4 5,7 0,72
Stanovenie sekvencie
Na stanovenie sekvencie báz sa fluorescenčným značkovacím postupom sekvenovali DNA fragmenty s veľkosťou asi 7 kb, vrátane hore uvedeného fragmentu Smal, ktorý bol vložený do pSSM30. Sekvencia je vyjadrená SEQ ID No: 4 (pozri Zoznam sekvencií na konci textu). V sekvencii sa nachádzajú štyri genetické kódy (ORF-F1: od 342. po 1505., ORF-F2: od 2338. po 3609., ORF-F3: od 4438. po 5358., ORF-F4 od 5570. po 6577.). Podľa homológie medzi génom a známym sacharázovým génom, považuje sa štruktúrny gén sacharázy za ORF-F2, kódujúci pre 424 aminokyselinových zvyškov. Ostatné predpokladané genetické kódy sa hodnotili podľa homológie s použitím banky údajov bielkovín NBRF a získané výsledky sa uvádzajú v tabuľke 3. Zistilo sa, že ORF-F3 a 0RF-F4 majú vysoký stupeň vzájomnej homológie a preto bude medzi nimi existovať nejaká závislosť.
Tabuľka 3
ORF číslo Počet aminokyselín Názov (homológna bielkovina iného druhu) Stupeň homológie (%)
F1 388 N-acetylglukozoamino-6-fosfát deacetyláza E. coli (382a.a) 24
F3 307 UDP-N-acetylmuramoylalanyl-Dglutamyl-meso-6-diaminopimelát syntetáza B.sub. (494a.a) 36
F4 336 Fosfo-N-acetylmuramoylpentapeptid transferáza B.sub. (324a.a) 39
Príklad 2
Vloženie plazmidu sacharázového génu do baktérií, produkujúcich L-lyzín
Z Escherichia coli AJ13047 plazmid sacharázového génu Brevibacterium lactofermentum (FERM BP-4800) sa pripravil pSSM30 a vložil sa do
AJ11082 (NRRL B-11470), baktérií, produkujúcich L-lyzín. Pri príprave sa využil elektropulzný spôsob (pozri prihláška japonského patentu číslo 2-207791, zahrnutá týmto odkazom). Bunky sa pestovali na platniach M-CM2G (pozostávajúcich z 5 g glukózy, 10 g polypeptónu, 10 g kvasničného extraktu, 5 g chloridu sodného, 0,2 g DL-metionmu a 15 g agaru v 1 dm destilovanej vody, pH prostredia bolo 7,2), obsahujúcich 5 gg chloramfenikolu na selekciu vyžadovaného transformanta. Takto získaný transformant sa označil ako AJ 11802/pSSM30.
Príprava L-lyzínu zo sacharózy použitím baktérií, vypestovaných so sacharázovým génom
AJ 11802 a AJ 11802/pSSM30 sa oddelene kultivovali v prostredí obsahujúcom sacharózu s cielom fermentáciou pripraviť L-lyzin. Bunky sa naočkovali do fermentačnej nádoby s obsahom 1 dm^, ktorá obsahovala 300 ml prostredia na prípravu lyzínu. Prostredie obsahovalo sacharózu ako zdroj uhlíka (to znamená, že obsahovalo 100 g sacharózy, 55 g (NH4)2SO4, 1 g KH2PO4, 1 g MgS04.7H20, 50 ml hydrolyzátu sójových bielkovín, 10 mg FeSO4.7H2O, 10 mg MnSO4.4H20 a 5 a mg amidu kyseliny nikotínovej v jednom dm destilovanej vody) a obsah nádoby sa kultivoval pri 31,5 °C a pri pH 7,0 (nastavené plynným amoniakom), za miešania a prevzdušňovania. Po úplnom spotrebovaní pôvodne pridanej sacharózy bunkami sa postupne pridala výživná zmes, obsahujúca 60 g/100 ml sacharózy a 8 g/100 ml síranu amónneho (ktoré boli oddelene sterilizované). Zmes sa pridávala tak, aby sa koncentrácia sacharózy v kultúre udržiavala v rozmedzí od 1 g/100 ml do 3 g/100 ml. Kultivácia pokračovala, kým sa nespotrebovalo 150 ml pridávaného výživného roztoku. V tabuľke 4 sa uvádza doba kultivácie a množstvo vytvoreného L-lyzínu. Dôsledkom prítomnosti rozmnoženého sacharázového génu sa významne zvýšila rýchlosť fermentácie, pri ktorej sa zo sacharózy vytváral L-lyzín. Z buniek sa po kultivácii extrahoval surový enzým pomocou známych spôsobov a merala sa jeho sacharázová účinnosť.
Výsledky sú tiež uvedené v tabuľke 4.
Tabuľka 4
Kmeň Kultivačná doba (hodiny) Množstvo vytvoreného L-lyzínu (g/100 ml) Sacharázová účinnosť (j ednotky/mg proteínu)
AJ 11082 65 9,5 0,35
AJ11082/pSSM30 34 9,4 3,54
Príklad 3
Vloženie plazmidu sacharázového génu do divokého kmeňa Brevibacterium lactofermentum
Plazmid sacharázového génu pSSM30 sa vložil do divokého kmeňa Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 použitím elektropulzného spôsobu (pozri prihlášku japonského patentu číslo 2-207791, zahrnutá týmto odkazom). Bunky sa pestovali na platni M-CM2G (pozostávala z 5 g glukózy, 10 g polypeptónu, 10 g kvasinkového extraktu, 5 g chloridu sodného, 0,2 a g DL-metionínu a 15 g agaru v 1 dm destilovanej vody, pH prostredia bolo 7,2), ktorá obasahovala 5 gg chloramfenikolu na selekciu vyžadovaného transformanta. Tajto získaný transformant sa označil ako ATCC13869/pSSM30.
Príprava L-glutamovej kyseliny zo sacharózy použitím baktérií , vypestovaných so sacharázovým génom
ATCC 13869 a ATCC 13869/pSSM30 sa oddelene kultivovali v prostredí obsahujúcom sacharózu s cielom fermentáciou pripraviť L-glutamovú kyselinu. Bunky sa naočkovali do fer□ mentačnej nádoby s obsahom 1 dm , ktorá obsahovala 300 ml prostredia na prípravu L-glutamovej kyseliny. Prostredie obsahovalo sacharózu ako zdroj uhlíka (to znamená, že obsahovalo 100 g sacharózy, 15 g (N^^SC^, 2,5 g KH2PO4, 0,4 g MgSO4.7H2O, 50 ml hydrolyzátu sójových bielkovín, 10 mg FeSO4-7H2O, 10 mg MnSO4-4H2O, 350 gg hydrochloridu tiamínu a 3,5 gg biotínu v jednom dm destilovanej vody) a obsah nádoby sa kultivoval pri 31,5 C a pri pH 6,5 (nastavené plynným amoniakom), za miešania a prevzdušňovania. Po úplnom spotrebovaní pôvodne pridanej sacharózy bunkami sa postupne pridala výživná zmes, obsahujúca 60 g/100 ml sacharózy a 8 g/100 ml síranu amónneho (ktoré boli oddelene sterilizované) . Zmes sa pridávala tak, aby sa koncentrácia sacharózy v kultúre udržiavala v rozmedzí od 1 g/100 ml do 3 g/100 ml. Kultivácia pokračovala kým sa nespotrebovalo 150 ml pridáva neho výživného roztoku. V tabuľke 5 sa uvádza doba kultivácie a množstvo vytvorenej L-glutamovej kyseliny. Dôsledkom prítomnosti rozmnoženého sacharázového génu sa významne zvýšila rýchlosť fermentácie, pri ktorej sa zo sacharózy vytvárala L-glutamová kyselina.
Tabuľka 5
Kmeň Kultivačná doba (hodiny) Množstvo vytvorenej kyseliny L-glutamovej (g/ 100 ml)
ATCC13869 45 10,7
ATCC13869/pSSM30 29 10,9
Príklad 4
Zmenšenie fragmentu sacharázového génu
Fragment DNA sa zmenšil s cieľom bližšie určiť oblasť v pSSM30, ktorá zvyšuje sacharózový metabolizmus. K tomu sa z pSSM30 extrahoval fragment génu s veľkosťou asi 1,5 kb, obsahujúci od SacíI miesta, začínajúceho od 2155. bázy po Bani miesto, začínajúce od 3722. bázy v sekvencii báz SEQ ID No: 4, ktorá obsahuje ORF-F4, predpokladaný ako kódujúci pre sacharázovú účinnosť. Konce fragmentu sa otupili použitím T4 DNA polymerázy. Tento fragment sa vložil do Smal miesta p’lazmidu pHSG399 - vektora pre Eschertchia coli. Aby sa naviac plazmid pripravil ako replikovateľný v bunkách koryneformných baktérií, vložil sa tam tiež replikačný základ baktérií Corynebacterium glutamicum. Bližšie DNA .fragment s veľkosťou asi 3 kb, obsahujúci replikačný základ sa extrahoval z plazmidu pHC4 (pozri prihlášku japonského patentu číslo 5-7491, zahrnutú týmto odkazom) z Corynebacterium glutamicum. Obidva konce sa otupili použitím T4 DNA po lymerázy a nasledovala modifikácia polôh reštrikčného enzýmu linkermi do polohy BamHI. Fragment sa vložil do polohy BamHI plazmidu pHSG399, spojeného so sacharázovým génom s veľkosťou asi 1,5 kb. Takto skonštruovaný plazmid sa označuje ako pSSM30BS.
Príklad 5
Vloženie zmenšeného plazmidu sacharázového génu do baktérií, produkujúcich L-lyzín
Zmenšený plazmid pSSM30BS sacharázového génu sa vložil do kmeňa Brevibacterium lactofermentum AJ 11082 (NRRL B-11470) , produkujúceho L-lyzín, použitím elektropulzného spôsobu (pozri prihlášku japonského patentu číslo 2-207791). Bunky sa pestovali na platni M-CM2G (ktorá obsahovala 5 g glukózy, 10 g polypeptónu, 10 g kvasničného extraktu, 5 g chloridu sodného, 0,2 g DL-metionínu a 15
Q g agaru v 1 dmJ destilovanej vody, pH prostredia bolo 7,2), obsahujúcich 5 pg chloramfenikolu na selekciu vyžadovaného transformanta. Takto získaný transformant sa označil ako AJ 11802/pSSM30BS.
Príprava L-lyzínu zo sacharózy použitím baktérií, vypestovaných so zmenšeným sacharázovým génom
AJ 11802 a AJ 11802/pSSM30BS sa oddelene kultivovali v prostredí obsahujúcom sacharózu s cieľom fermentáciou pripraviť L-lyzín. Bunky sa naočkovali do fermentačnej nádoby s obsahom 1 dm , ktorá obsahovala 300 ml prostredia na prípravu lyzínu. Prostredie obsahovalo sacharózu ako zdroj uhlíka (to znamená, že obsahovalo 100 g sacharózy, 55 g (NH4)2S04, 1 g KH2P04, 1 g MgS04.7H20, 50 ml hydrolyzátu sójových bielkovín, 10 mg FeSO4.7H2O, 10 mg MnS04.4H20 a 5 mg amidu kyseliny nikotínovej v jednom dm^ destilovanej vody) a obsah nádoby sa kultivoval pri 31,5 °C a pri pH 7,0 (nastavené plynným amoniakom), za miešania a prevzdušňova22 nia. Po úplnom spotrebovaní pôvodne pridanej sacharózy bunkami sa postupne pridala výživná zmes, obsahujúca 60 g/100 ml sacharózy a 8 g/100 ml síranu amónneho (ktoré boli oddelene sterilizované). Zmes sa pridávala tak, aby sa koncentrácia sacharózy v kultúre udržiavala v rozmedzí od 1 g/100 ml do 3 g/100 ml. Kultivácia pokračovala, kým sa nespotrebovalo 150 ml pridávaného výživného roztoku. V tabuľke 6 sa uvádza doba kultivácie a množstvo vytvoreného L-lyzínu. Dôsledkom prítomnosti rozmnoženého sacharázového génu sa významne zvýšila rýchlosť fermentácie, pri ktorej sa zo sacharózy vytváral L-lyzín. Z buniek sa po kultivácii extrahoval surový enzým pomocou známych spôsobov a merala sa jeho sacharázová účinnosť.
Výsledky sú tiež uvedené v tabuľke 6.
Tabuľka 6
Kmeň Kultivačná doba (hodiny) Množstvo vytvoreného L-lyzínu (g/100 ml) Sacharázová účinnosť (j ednotky/mg proteínu)
AJ 11082 67 9,9 0,39
AJ11082/pSSM30I 3S 35 9,5 4,10
Príklad 6
Vloženie zmenšeného plazmidu sacharázového génu do divokého kmeňa Brevibacterium lactofermentum
Zmenšený plazmid pSSM30BS sacharázového génu sa vložil do divokého kmeňa Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 pomocú elektropulzného spôsobu (pozri prihlášku japonského patentu číslo 2-207791). Bunky sa pestovali na platni M-CM2G (ktorá obsahovala 5 g glukózy, 10 g polypeptónu, 10 g kvasničného extraktu, 5 g chloridu sodného, 0,2 g DL-mea tioninu a 15 g agaru v 1 dmJ destilovanej vody, pH prostredia bolo 7,2), obsahujúcich 5 gg chloramfenikolu na selekciu vyžadovaného transformanta. Takto získaný transformant sa označil ako ATCC 13869/pSSM30BS.
Príprava L-glutamovej rií, vypestovaných so kyseliny zo sacharózy využitím baktézmenšeným sacharázovým génom
ATCC 13869 a kultivovali v fermentáciou naočkovali do sacharózu kyselinu.
obsahom prípravu oddelene s cieľom
Bunky sa a dm , ktorá
L-glutamovej zdroj uhlíka
ATCC 13869/pSSM30BS sa prostredí obsahujúcom pripraviť L-glutamovú fermentačnej nádoby s obsahovala 300 ml prostredia na kyseliny. Prostredie obsahovalo sacharózu ako (to znamená, že obsahovalo 100 g sacharózy, 15 g (NH4)2SO 2,5 g KH2PO4, 0,4 g MgSO4.7H2O, bielkovín, 10 mg FeSO4.7H2O, hydrochloridu tiamínu a 3,5 destilovanej vody) a obsah nádoby a pri pH 6,5 a prevzdušňovania. Po sacharózy bunkami sa obsahujúca 60 g/100 amónneho (ktoré boli tak, aby sa v rozmedzí pridávala udržiavala
Kultivácia pridávaného kultivácie
Pg ’ ml hydrolyzátu sójových mg MnSC^.4H20 a 350 gg biotínu v sa kultivoval a
jednom dm pri 31,5 °C za miešania (nastavené plynným amoniakom), úplnom spotrebovaní pôvodne pridanej postupne a pridala výživná ml sacharózy a 8 g/100 oddelene sterilizované).
koncentrácia sacharózy g/100 ml do 3 sa nespotrebovalo V tabuľke 7 sa uvádza doba L-glutamovej kyseliny, sacharázového génu sa pri ktorej sa zo zmes , ml síranu
Zmes sa v kultúre od 1 kým roztoku.
g/100 ml.
> 150 ml pokračovala, výživného a množstvo vytvorenej
Dôsledkom prítomnosti rozmnoženého významne zvýšila rýchlosť fermentácie, sacharózy vytvárala L-glutamová kyselina.
Tabuľka 7
Kmeň Kultivačná (hodiny) doba Množstvo vytvorenej kyseliny L-glutamovej (g/ 100 ml)
ATCC13869 43 10,2
ATCC13869/pSSM30BS 30 10,3
Výhody vynálezu
Podľa tohto vynálezu sa získal fragment DNA, odvodený od koryneformných baktérií a obsahujúci gén, kódujúci pre proteín, ktorý má sacharázovú účinnosť; ďalej sa získala rekombinantná DNA, obsahujúca uvedený fragment DNA, schopná množenia v koryneformných baktériách. Vložením uvedenej rekombinantnej DNA do koryneformných baktérií sa zvýši ich účinnosť asimilovať sacharózu a tak sa dosiahol spôsob hospodárnej výroby L-aminokyselín a nukleových kyselín, ktorý vyžaduje kratší čas, ako doterajšie spôsoby.
Táto prihláška je založená na prihláške japonského patentu číslo 046836/1992, podaná 4. marca 1992, ako celok je tu zahrnutá týmto odkazom.
Je zrejmé, že vzhľadom na hore uvedené sú možné rôzne úpravy a obmeny tohto vynálezu. Preto je pochopiteľné, že v rámci priložených nárokov sa môže vynález využívať aj inak, ako sa opisuje v jednotlivých príkladoch tohto vynálezu .
Zoznam sekvencii (2) Informácia pre SEQ ID No:l:
(i) Sekvenčná charakteristika:
(A) Dĺžka: 24 párov báz
GGGCTGTTAA ATGACCCAAA TGGG (3) Informácia pre SEQ ID No:2:
(i) Sekvenčná charakteristika:
(A) Dĺžka: 24 párov báz
TACATGTGGG AATGCCCTGA TTTG (4) Informácia pre SEQ ID No:3:
(A) Dĺžka: 33 párov báz
GATCAAGGTT TTGATTTTTA CGCGCCGCAA ACA
(5) Inf (i AGTCCGTCGA ormácia pre ) Sekvenčná CGCCACCATT SEQ ID No:4: charakteristika: 6 911 párov báz
GATGTGGTGG TCACCGAGCT TGCGGAGGCT TTCTACATCT
ACGCTCCCGT CGGCGTGGAG TGGGGTCATT ACGGGTGGGA TCACGCCGGT GAAAGTTGCG
GAACCCATGG TGTTCCTTGT GGGTTGAGGG AACGAGTGCG GGTGAGAAGT TTTTCAAGTG
TCTGCAGTTT TTAAGTTATG CATCATCAGC TTGGAAGGCT GAGGTAATTC AGTAGACCTG
CAACAGCAGG CCTCAAGTCC GAAGATAATT AAC C T AG AT C CGTAGACATA AGACATCATA
CGTCCTATGC TTGCTGGAAG GAACCAAATA ACCTCAGAAA GATGGCAGAA GTGGTGCATT
ATCAAGAAAA TGCAGGTCAA GCAGTTAAAA AAATTGAGGG AAGAATTGTT CCCCCCCTCG
GGGTGATTGA TGGCTTTCTC CAACTCGAAA ACGGCATCAT CACGGAACTC TCTGGAGAAC
CAGCACCTAA AAACGCAGGA TTCCACCCCG AACTCCCCAC GATTGTTCCC GGTTTTATTG
ATCTTCATAA TCACGGTGGA AACGGTGGCG CGTTTCCTAC GGGAACGCAG GACCAGGCGA
GGAACACCGC GCAGTATCAC CGCGAACATG GCACGACCGT GATGTTGCCA AGCATGGTTT
CGGCGCCGGC TGACGCACTG GCAGCGCAGG TGGAAAACCT TATTCCCTTG TGTGAAGAGG
TCCTGCTGTG CGGCATTCAC CTCGAGGGCC CTTTCATCAA CGCATGCCGT TGTGGTGCTC
AAAACCCGGA TTTCATTTTT CCCGGCAACC CAACAGATCT TGCCCGGGTG ATCCATGCGG
GAAAAGGTTG GATCAAATCG ATCACAGTAG CGCCGGAAAC TGACAATCTT TCTGAGCTTC
TCGATCTCTG CGCAGCGCAC CACATCATTG CTTCCTTCGG GCACACTGAT GCAGATTTTG
ATACCACTAC CAGCGCAATT GCCTTGGCTA AAGAGAAAAA TGTGACGGTC ACGGCTACGC
ATTTGTTCAA TGCGATGCCT CCGCTGCATC ATAGGGCTCC CGGCAGCGTG GGCGCTTTGC
TTGCTGCGGC ACGTGCCGGG GACGCATATG TTGAGTTGAT CGCCGACGGC GTGCATTTGG
CCGATGGAAC GGTCGATCTA GCTCGTTCCA ACAACGCCTT TTTCATCACG GACGCCATGG
AAGCCGCCGG AATGCCAGAC GGTGAGTACA TTTTGGGCGT TTTGAACGTC ACCGTCACCG
ATGGAGTCGC CCGTCTGCGC GATGGCGGCG CCATCGCCGG GGGCACCAGC ACACTAGCGA
GTCAGTTCGT GCACCACGTG CGCAGGGGTA TGACGCTTAT CGACGCGACC CTCCACACCT
CAACCGTCGC CGCTAAAATT CTCGGTCTTG GCGATCACGA AATCGCTAAA TCCAACCCTG
CAAATTTTGT GGTCTTTGAC TCAAACGGCC AGGTGCAAAA GGTCCATTTA GGTCATCAAG
TACTTTAAGT ACGAGTAAAA CTATCCTGAT TTTAAAGGAG TCCCACCATG GAAATCACTA
TCTGCAAAGA CGAGCAAGAA GTCGGCAAAG CAGTTGCAGT CCTAATCGCA CCCTTCGCCA
ACAAGGGTGG AACCTTGGGG CTTGCAACAG GATCCTCACC ACTGAGTACC TACCAAGAGC
TCATTCGCAT GTATGAAGCT GGGGAAGTGT CATTCAAGAA CTGCAAGGCA TTCTTGTTGG
ATGAATACGT GGGACTAACC CGTGACGATG AAAACAGCTA CTTTAAAACC ATTCGCAAAG
AGTTCACTGA CCACATCGAC ATCGTTGATG AAGAGGTCTA CAGCCCAGAT GGTGCAAACC
CTGATCCATA CGAAGCAGCT GCAGAGTATG AGGCAAAGAT CGCTGCAGAA TCCGTTGAAG
TTCAAATCCT TGGCATCGGC GGAAACGGCA CATCGCTTTC ATTGAACCAT CATCTTCTCT
GTCAGGACTG ACAAAGGTCC AGGCGCTGCA CCCTAAAACT GTGGAGGACA ACGCTCGATT
CTTCAACACC ATCGAAGAGG TCCCAACCCA CGCCGTCACC CAGGGTTTGG GCACTTTGTC
CCGCGCGCAA AACATCGTGT TGGTGGCAAC TGGTGAAGGA AAAGCCGACG CCATCCGCGG
AACTGTGGAA GGCCCAGTGA CTGCTTCTTG CCCAGGTTCC ATCCTGTAGA TGCACAACAT
GCCACCATCA TCGTTGGATG AAGCAGCAGT ATCCAAGCTG GAAAACGCTG ATCACTACCG
TCTCATGGAG CAATTAAAGC TGCGCTAGAA ACAAAAAG GA AAGTACTGTG TGGGGCTATG
CACACAGAAC TTTCCAGTTT GCGCCCTGCG TACCATGTGA CTCCTCCGCA GGGCAGGCTC
AATGATCCCA ACGGAATGTA CGTCGATGGA GATACCCTCC ACGTCTACTA CCAGCACGAT
CCAGGTTTCC CCTTCGCACC AAAGCGCACC GGCTGGGCTC ACACCACCAC GCCGTTGACC
GGACCGCAGC GATTGCAGTG GACGCACCTG CCCGACGCTC TTTACCCGGA TGCATCCTAT
GACCTGGATG GATGCTATTC CGGTGGAGCC GTATTTACTG ACGGCACACT TAAACTTTTC
TACACCGGCA ACCTAAAAAT TGACGGAAAG CGCCGCGCCA CCCAAAACCT TGTCGAAGTC
GAGGACCCAA CTGGGCTGAT GGGCGGCATT CATCGCCGTT CGCCTAAAAA TCCGCTTATC
GACGGACCCG CCAGCGGTTT CACACCCCAT TACCGCGATC CCATGATCAG CCCTGATGGT
GATGGTTGGA ACATGGTTCT TGGGGCCCAA CGCGAAAACC TCACCGGTGC AGCGGTTCTA
TACCGCTCGA CAGATCTTGA AAACTGGGÄA TTCTCCGGTG AAATCACCTT TGACCTCAGT
GATGCACAAC CTGGTTCTGC TCCTGATCTC GTTCCCGATG GCTACATGTG GGAATGCCCC
AACCTTTTTA CGCTTCGCGA TGAAGAAACT GGCGAAGATC TCGACGTGCT GATTTTCTGT
CCACAAGGAT TGGACCGAAT CCACGATGAG GTTACTCACT ACGCAAGCTC TGACCAGTGC
GGATATGTCG TCGACAAGCT TGAAGGAACG ACCTTCCGCG TCTTGCGAGG ATTCAGCGAG
CTGGATTTCG GCCATGAATT CTACGCACCG CAGGTTGCAG TAAACGGTTC TGATGCCTGG
CTCGTGGGCT GGATGGGGCT GCCCGCGCAG GATGATCACC CAACAGTTGC ACAGGAAGGA
TGGGTGCACT GCCTGACTGT GCCCCGCAAG CTTCATTTGC GCAACCACGC GATCTACCAA
GAGCTCCTTC TCCCAGAGGG GGAGTCGGGG GTAATCAGAT CTGTATTAGG TTCTGAACCT
GTCCGAGTAG ACATCCGAGG CAATATTTCC CTCGAGTGGG ATGGTGTCCG TTTGTCTGTG
GATCGTGATG GTGATCGTCG CGTAGCTGAG GTAAAACCTG GCGAATTAGT GATCGCGGAC
GATAATACAG CCATTGAGAT AACTGCAGGT GATGGACAGG TTTCATTCGC TTTTCCGGGC
CTTCAAAGGT GACACTATTG AGAGATAAGT CATATAAAAG GGTCTTTTGT GGCGAATTGT
acaaatactt CGCAAAATCC CTTGATCTAG TTATTGTCAC TGATGACAAC CCTCGTTCAG
AGGTGCCTGC CACGATTCGC GCAGCAGTCA CTGCAGGAGC ACAGCAGGGT GCTTCAGAGT
CCGAACGACC GGTGGAAGTC CTAGAAATTG GTGACCGTGC AGAAGCAATT CGCGTTTTGG
TCGAGTGGGC ACAGCCTGGA GATGGCATTG TAGTAGCTGG 71AAAGGCCAT GAAGTTGGAC
AACTAGTTGC TGGTGTCACC CACCATTTTG ATGACCGCGA AG7XAGTTCGC GCTGCTTTGA
CAGAAAAGCT CAACAATAAA CTTCCCCTTA CTACGGAAGA AGGATAGGCC ACAGTCATGA
TCACAATGAC CCTTGGGGAA ATCGCTGACA TCGTTGGAGG CAGGCTTACT GGCGGTGCTC
AAGAAGATAC GCTTGTGAGC TCCAGCGTGG AATTTGATTC TCGATCCCTC ACACCGGGTG
GCTTGTTTTT AGCACTTCCG GGTGCTCGTG TAGACGGGCA TGATTTTGCT GCAACTGCAA
TTGAGAAAGG TGCGGTCGCA GTATTGGCAG CCCGTGAGGT TGACGTACCT GCGATCGTCG
TGCCTCCAGT AAAAATCCAG GAATCCAATG CTGACATTTA TGCTCATGAT CCAGATGGGC
ATGGCGCGGC GGTAGTGGAG GCGTTGGTCT CGGTTGGCTC GCCACGTGGT GGATATCTGC
GTGGATGGCC ATCAATTGAA CGTTGTGGCT ATTACTGGTT CTGTGGGAAA GACTTCTATG
AAGGATTTCA TCGCGACGGT TCTTGGCCAA GATGGGCCAA CTGTGGCTCC TCCGGGCTCG
TTTAACAATG AGCTTGGTTT GCCACACACC GCGCTCCGCT GCACAACCGA TACTAAGTAT
TTGGTGGCTG AGATGTCCGC GCGTGGCATT GGACATATTA AGCACCTGAC AGAGATTGCT
CCGCCACGGA TTGCAGCTGT GCTCAACGTC GGCCATGCGC ACCTGGGTGA ATTTGGATCC
CGCGAGAATA TCGCGCAGGC AAAAGGCGAG ATCATTGAAG CGCTGCCCTC GAAGAAAACG
GGTGGGGTAG CAGTCCTTAA CGCTGACGAT CCTTTTGTCG CCCGGATGGC TCCACGCACT
AAGGCGCGCG TGGTGTGGTT taccaccgat' GCAGGTCAAG CAAAAAAGTC TGATTATTGG
GCAACGAGTA TTTCACTGGA CGCTGTTGCG CGGGCAAGCT TTACGCTGAA CACGAAGGAC
GGGTCTTGGC CGGTCGCCCT GCAGGTTTTT GGTGAGCACC AGGTTGCT7XA TGCACTTGCT
GCTGCTGCCA TTGCCATGGA AGCTGGCGTC GCCCCAGAAT TGGTGGTTGC TGGATTGGAA
GCACATTCAG CGGCTTCCGC GCACCGCATG GATGTAAAGA CCCGCGCCGA CGGCGTGACC
ATCATCAACG ATTCTTACAA CGCGAATCCT GATTCTATGC GTGCAGGTAT CGCGGCTCTT
GCGTACACAG CTAGTGGTCG TTCTCTGAAG CAACAAGCTG GGCAGTGCTT GGTCAAATGG
GTGAGCTTGG CGATGACGCC TCGGAAGCCC ATGCCGAACT TGGTGCTGAG CTGCCTAAAT
ACAATGTTCA AGAACTTGTC GCAGTGGGGG AGAACCCTAC CTGTGCAGCA CTTGCAGAGT
CCGCAGCGAG CCTGGGTGTG AGTACTCACG TAGTTTCAGA CGTTGATGCA GCGCTCGAGT
TGCTCGCAGC •CCATATTAAG CGGGATGATG TAGTGCTGGT TAAGGCTTCA AATGCTGATC
GCCTGTGGAG GGTCGCAGAA GCACTACATG GCATGGTGCC GGCCTCAAAA ACACAGGTGG
CTCGGTCAAC GACGATTCTC GTCGGAACGT GGAAGGACAG TAGAAAACAA TGCAACAGAT
TATGGTCAGT GGAACGGTTG CGTTCCTCGT CTCAATCTTT CTCACCCCGG TGTTGATCCG
TTATTTCACT AACCGCCAGT TGGGCCAGGA AATCCGTGAA GAAGGCCTGC AGTCTCACTT
GCGTAAGCGT GGCACTCCAA CCATGGGTGG CATTGCGATT ATCGCGGGCA TTGTTGTGGC
CTATGTGTTT ACCAATATCT TGGCCATGAT CCAAGGCGTT GGTGGATTCA CAGTCTCCGG
CTTGCTCGTG TTGGGTCTGA CCTTGGGCCT TGGTGCCACT GGCTTCGCCG ATGACTTCAT
CAAGCTGTAC ATGAACCGAA ACCTTGGTTT GAACAAGACC GCTAAGCTGG TGTCTCAGCT
GGCCATTGCG TTGATCTTTG GTTTTTTGGT ACTGCAGTTT CCCGATGAAA ACGGTCTGAC
CCCAGCATCA ACCCACCTGT CATTCATTCG CGATATCGAC ACCATTGACC TTGGCTTCGG
GGACAGCGTT TTTGGCATCA TCGTGTTCCT CATTTTTATC TACGTTGTGG TCAGCGCGTG
GTCGAATGCC GTGAACATCA CTGATGGTTT GGATGGTTTG GCTGCAGGTA CCACAGCATT
TGTCATGGGT GCTTACACCT TGATCACGTT CTGGCAGTTC CGAAACTCCT GCGATACTGC
AGTGGAAGCG GGTTGCAATA CGGTGCGTGA TCCACTGGAT TTGTCTGTGT TGTGCGCTGC
TGGTCTGGCG CCACCTTGGG CTTTCTGTGG TGGAATGCGG CACCGACAAA GATCTTCATG
GGCGATACTG GTTCTTTGGC ACTGGGCGGT TTGGTTGCAG gtatttctgt GGTTAGCCGC
ACCGAGCTGC
ATCCAGATCG CACCACTTCG ACGATCATGA GAGGTATAAA
CTTGTGGCCG
TGCGATGTTG
GACGTTGCAG
GTCACCTCCC
TCATGGTTAT CATCGGCGCG CTGTTTGTCA TTGAGGTCGC GCGTGTTTAA GACCCGCGGT AAGCGTGTGT TCAAAATGGC AGGCCCTTGG GTGGACTGAA ACTACCGTGA CCATCCGTTT CTGTGTTGGC GGGTGTCGGT GTGTTTAACA GCGACTGGCT TAATTATGGT TTCTCTGTCC CATTTACCTC AGGCGCTGCA GCGCTGGTGT TTCCGGCCTG TCCATAGCAA AGATGCTCAG •TGGTCACCGA CGAGAACGAA ACTGCACGTC ACATGCTCAT ATATCAGCAC CGCCCAGGCT CAGGAACAGC TGGATTCTTT C
TTCTGTTGCG TCCGATCCAC CTGGCTGATC CCACTTAGCG GGGCCGTATT TGAGTTGCAT TGAAGTAGTA CTCCATTGTG fl/

Claims (7)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. DNA fragment, odvodený od koryneformných baktérií a obsahujúci gén, kódujúci pre bielkovinu, ktorá má sacharázovú účinnosť.
  2. 2. DNA fragment podľa nároku 1, v ktorom gén obsahuje sekvenciu od bázy 2 338 po bázu 3 609 sekvencie báz ID No:4.
  3. 3. Vektor, obsahujúci DNA fragment podľa nárokov 1 ale- t · bo 2, schopný génového množenia v koryneformných baktériách.
  4. 4. Koryneformné baktérie, obsahujúce vektor, podľa nároku 3, schopné produkovať L-aminokyselinu alebo nukleovú kyselinu.
  5. 5. Spôsob prípravy L-aminokyseliny alebo nukleovej kyseliny, vyznačujúci sa tým, že koryneformné * baktérie, podľa nároku 4, sa kultivujú v tekutom prostredí, obsahujúcom sacharózu, aby produkovali a v kultúre uchováva» li L-aminokyselinu alebo nukleovú kyselinu.
  6. 6. Spôsob prípravy podľa nároku 5, vyznačuj ú c i sa t ý m, že L-aminokyselina je L-lyzín.
  7. 7. Spôsob prípravy podľa nároku 5, vyznačujúci sa t ý m, že L-aminokyselina je L-glutamová kyselina.
SK112-96A 1995-01-30 1996-01-26 Dna fragment, derived from coryneform bacteria and manufacturing process of l-amino acid or nucleic acid SK11296A3 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP7012361A JPH08196280A (ja) 1995-01-30 1995-01-30 コリネホルム細菌由来のシュクラーゼ遺伝子とその利用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK11296A3 true SK11296A3 (en) 1996-08-07

Family

ID=11803142

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK112-96A SK11296A3 (en) 1995-01-30 1996-01-26 Dna fragment, derived from coryneform bacteria and manufacturing process of l-amino acid or nucleic acid

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP0724017A3 (sk)
JP (1) JPH08196280A (sk)
BR (1) BR9600268A (sk)
FR (1) FR2729970B1 (sk)
SK (1) SK11296A3 (sk)
ZA (1) ZA96656B (sk)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1298854C (zh) * 1999-07-02 2007-02-07 味之素株式会社 编码蔗糖pts酶ⅱ的dna
TW200734459A (en) 1999-10-04 2007-09-16 Ajinomoto Kk Genes for heat resistant enzymes of amino acid biosynthetic pathway derived from thermophilic coryneform bacteria
KR101058894B1 (ko) * 2009-03-03 2011-08-23 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산 생산 미생물 및 이를 이용한 ｌ-아미노산 생산방법

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3298135B2 (ja) * 1992-03-04 2002-07-02 味の素株式会社 コリネホルム細菌由来のシュークラーゼ遺伝子

Also Published As

Publication number Publication date
EP0724017A2 (en) 1996-07-31
BR9600268A (pt) 1997-12-23
FR2729970A1 (fr) 1996-08-02
FR2729970B1 (fr) 1998-10-09
EP0724017A3 (en) 1997-09-17
ZA96656B (en) 1996-08-07
JPH08196280A (ja) 1996-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2333247C2 (ru) Коринеформная бактерия, продуцент l-аминокислоты и способ получения l-аминокислоты
EP0643135B1 (en) Dna encoding aspartokinase iii mutants and their use for the production of l-threonine by fermentation
KR100630604B1 (ko) 아미노산 생산균의 작제 방법 및 작제된 아미노산생산균을 사용하는 발효법에 의한 아미노산의 제조 방법
EP1149911B1 (en) Amino acid producing strains belonging to the genus Escherichia and method for producing an amino acid
EP0723011B1 (en) Variant phosphoenolpyruvate carboxylase, gene thereof, and process for producing amino acid
KR101592140B1 (ko) 자일로즈 이용능이 부여된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산방법
US20050255567A1 (en) Mutant glutamine synthetase and method for producing amino acids
US20100028957A1 (en) Microorganism Of Corynebacterium Genus Having Enhanced L-Lysine Productivity And A Method Of Producing L-Lysine Using The Same
EP0358940A1 (en) DNA fragment coding for phosphoenolpyruvat corboxylase, recombinant DNA carrying said fragment, strains carrying the recombinant DNA and method for producing L-aminino acids using said strains
EP0336452A1 (en) Process for preparing L-phenylalanine
SK139297A3 (en) Dna coding for the aspartokinase iii, microorganism and method for producing l-amino acid
US5236831A (en) Amino acid synthesis in corynebacteria using E. coli genes
US5498532A (en) Process for producing amino acids
JPS63119688A (ja) Ｌ−グルタミン酸およびｌ−プロリンの製造法
JPH02186995A (ja) 発酵法によるｌ‐アルギニンの製造法
KR900004425B1 (ko) L-아르기닌의 제조방법
US5447857A (en) Process for producing L-tryptophan
EP0338474B1 (en) Process for producing L-tryptophan
JP3151075B2 (ja) アラニンの製造法
US20100323409A1 (en) Process for producing (2s,3r,4s)-4-hydroxy-l-isoleucine
EP0259858B1 (en) Process for producing amino acids
US5556776A (en) Sucrase gene derived from coryneform bacteria
SK11296A3 (en) Dna fragment, derived from coryneform bacteria and manufacturing process of l-amino acid or nucleic acid
JPS62186795A (ja) アミノ酸の製造法
US11028384B2 (en) Pyruvate carboxylase and pyruvate carboxylase-encoding DNA, plasmid containing said DNA and microorganism for the production thereof, and methods for the production of products the biosynthesis of which includes oxaloacetate as precursor, and chromosome