SK109997A3

SK109997A3 - Eukaryotic initiation factor 5a (eif-5a) mutants

Info

Publication number: SK109997A3
Application number: SK1099-97A
Authority: SK
Inventors: Joachim Hauber
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1995-02-13
Filing date: 1996-02-12
Publication date: 1998-04-08
Also published as: JPH10509327A; FI972763A0; HUP9801681A3; KR19980702160A; NO973679D0; NO973679L; IL117113A0; MX9705757A; CN1173897A; BR9606951A; EP0811060A1; FI972763A; AU4665196A; CA2210538A1; PL321239A1; WO1996025492A1; CZ255397A3; HUP9801681A2

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka mutantných proteínov, spôsobu ich prípravy, farmaceutických prostriedkov, ktoré ich obsahujú a ich použitia.

Doterajší stav techniky

Replikácia vírusu ľudskej imunodeficiencie (HIV) závisí na funkcii vírusového transaktivačného proteínu Rev. Proteín Rev je akumulovaný v, jadrovom priestore hostiteľskej bunky a viaže sa priamo a špecificky na vysoko štruktúrovanú sekvenciu RNA, nazývanú odozvový element Rev (RRE), ktorý sa vyskytuje na každej neúplne zostrihnutej vírusovej mRNA. Po naviazaní, molekuly proteínu Rev konglomerujú práve na RRE a'.spájajú sa s hostiteľským kofaktorom nutným na transaktiváciu Rev, nazývaným eukaryotický iniciačný faktor 5A (eIF-5A; starší názov: eIF-4D). Výsledkom tohto spojenia je jadrovo-cytoplazmatická translokácia neúplne zostrihnutej vírusovej mRNA, následne umožňujúce expresiu vírusových štruktúrnych proteínov (napr. Gag, Pol, Env) a ďalej replikáciu vírusu.

Mutantné proteíny Rev s transdominantnými (dominantne negatívnymi) fenotypmi, ktoré boli opísané (viď napr. WO 90/14427). Títo mutanti Rev sú ďalej schopní väzby na RRE RNA, nie sú však schopní funkčného spojenia s ich bunkovým kofaktorom, a to kvôli mutácii v aktivačnej doméne proteínu Rev.

eIF-5A je endogénny proteín, potrebný na. normálnu funkciu bunky. Už bolo pripravených niekoľko jeho rôznych variantov (napr. J. Biol. Chem. 264 (1989) 18527 - 18530; Mol. Celí. Biol. 11 (1991) 3105 - 3114) a všetky tieto varianty vykazujú nežiaduci vplyv na normálne bunkové funkcie, napr. na bunkový rast.

Podstata vynálezu teraz sa zistilo, že možno pripraviť také mutantné formy proteínu eIF-5A, ktoré neblokujú endogénnu funkciu natívneho elF5A, a normálne nevykazujú aktivitu proteínu eIF-5A, inhibujú však funkciu proteínu Rev; majú teda vzhladom na funkciu proteínu Rev inhibujúci fenotyp.

Toto zistenie je velmi prekvapivé, nakoľko sa nepredpokladalo, že faktor, ktorý je neaktívny v bunkovom prostredí prirodzenom pre jeho nemutovanú formu, by mohol vykazovať inhibičný efekt voči metabolickým pochodom začatým vonkajším mikroorganizmom, akým je vírus. Tiež sa nepredpokladalo, že takéto mutantné formy proteínu eIF-5A, vrátane génov tohto proteínu, by vôbec mohli existovať, pretože proteín eIF-5A je nevyhnutný na bunkovú reguláciu (Biofactors 4 (1993) 95 - 104; TIBS 18 (1993) 475 - 479. Predpokladalo sa, že takéto proteíny vrátane ich génov by boli toxické voči bunke, .zatiaľ čo gény a. proteíny, ktoré sú predmetom tohto vynálezu (najmä M13, M14 a Μ13Δ) sú neaktívne, netoxické a inhibujú proteín Rev, napríklad jeho funkciu v rámci vírusu HIV, a tým i replikáciu HIV.

Predmetom tohto vynálezu sú mutantné formy proteínu eIF-5A, ktorým chýba ich prirodzená bunková aktivita eIF-5A ( v texte nazývaná - endogénna funkcia eIF-5A) a zároveň inhibujú funkciu proteínu Rev, a majú teda inhibičný fenotyp vzhladom na funkciu Rev; ďalej sú predmetom tohto vynálezu im zodpovedajúce gény a príslušné sekvencie DNA a cDNA, ktoré ich kódujú.

Výhodné sú mutanty, ktoré sú podstatne zbavené endogénnej funkcie eIF-5A. Tu uvádzaným eIF-5A je výhodne ľudský eIF-5A a jeho mutácie sú výhodne založené na ľudskej natívnej forme eIF-5A. Tu uvádzaným vírusom HIV je výhodne jeho forma HIV-1.

Mutantnými proteínmi sa podlá vynálezu rozumejú polypeptidy vrátane svojich modifikovaných foriem, ako sú alelické modifikácie alebo ich fragmenty či deriváty schopné inhibovať funkciu proteinu Rev a ktoré výhodne nedisponujú žiadnou endogénnou funkciou eIF-5A. Na farmaceutické účely sa s výhodou používajú vo vysoko čistej forme, teda podstatne zbavenej extraktu z vnútrobunkového prostredia.

Mutácie zahŕňajú výhodne úsek alebo viac úsekov na polypeptidickom reťazci, začínajúce približne na úrovni zodpovedajúcej aminokyseline č. 130 v natívnom genóme eIF-5A (obr. 3, identifikačné č. sekvencie - 17), najmä v úseku približne medzi aminokyselinou č. 135 a koncom molekuly, predovšetkým však medzi č. 135 a č. 139.

Zodpovedajúce gény, alebo sekvencie DNA alebo cDNA sú ukázané napríklad v tabuľke č. 2, predovšetkým pre mutanty eIF-5AM13, elF5AM14 a eIF-5AM13A; ďalej nimi môžu byť také gény či sekvencie, ktoré za prísnych podmienok hybridizujú so sekvenciami kódujúcimi, zmienené proteiny alebo gény či sekvencie, ktoré s nimi nehybridizujú iba v dôsledku degenerácie genetického kódu a zároveň výhodne nehybridizujú s génmi a sekvenciami zodpovedajúcimi natívnym formám.

Predmetom vynálezu sú ďalej prokaryotické a eukaryotické hostiteľské bunky, do ktorých sú transformované alebo transfekované gény alebo sekvencie DNA alebo cDNA definované vyššie, a to tak, že hostiteľská bunka je schopná uskutočniť expresiu týchto génov alebo sekvencii DNA alebo cDNA. Ďalej sú predmetom vynálezu biologicky funkčné plazmidové alebo vírusové vektory DNA, obsahujúce gén alebo sekvenciu DNA alebo cDNA definované vyššie. Predmetom vynálezu sú tiež prokaryotické a eukaryotické hostiteľské bunky, ktoré sú stabilne transformované alebo transfekované vektormi DNA vyššie uvedenými.

Predmetom tohto vynálezu je ďalej spôsob prípravy génov alebo sekvencií DNA alebo cDNA definovaných vyššie, a to vrátane izolácie príslušného natívneho génu zo zodpovedajúceho expresného systému, jeho naklonovania do príslušného systému, uskutočnenie požadovanej genetickej mutácie a izolácia výsledného mutanta z klonu z požadovanou mutáciou.

Vynález ďalej zahŕňa spôsob produkcie vyššie definovaných proteínov, ktorý zahŕňa kultiváciu prokaryotických alebo eukaryotických hostiteľských buniek za prítomnosti vhodných živín a za vhodných kultivačných podmienok, transformovaných alebo transfekovaných génmi alebo sekvenciami DNA alebo cDNA definovanými vyššie, a to takým spôsobom, ktorý umožňuje hostiteľským bunkám produkciu proteínu a poprípade izoláciu výsledného polypeptidického produktu expresie.

Vynález rovnako zahŕňa farmaceutické prostriedky obsahujúce vyššie definované proteíny, spoločne aspoň s jedným farmaceutický vhodným nosičom, s pomocnou -látkou alebo iba s riedidlom.Nosičom môžu byť rovnako bunky izolované z pacientovho tela a upravené in vitro pred ich aplikáciou. Vynález ďalej zahŕňa použitie vyššie definovaných proteínov alebo génov či sekvencií DNA alebo cDNA kódujúcich tieto proteíny pri liečení ochorení vyvolaných retrovirusmi, u ktorých funkcia ich proteínu Rev závisí od funkcie eIF-5A, akými sú vírusy HIV, HTLV-I a HTLV-II. Predmetom vynálezu je tiež ich použitie ako liečiva a ich použitie na prípravu liečiva na liečenie ochorení spôsobených retrovirusmi, u ktorých funkcia ich proteínu Rev závisí od funkcie _; eIF-5A, akými sú vírusy HIV, HTLV-I a HTLV-II.

Postupy a metódy nutné na uskutočnenie tu uvedeného vynálezu sú v odbore známe. Hoci ich príprava tu nie je konkrétne uvedená, zlúčeniny, reakčné činidlá, vektory, bunkové línie a pod., ktoré sú potrebné na uskutočnenie tohto vynálezu, sú všeobecne známe a bežne dostupné alebo ich možno získať už konvenčnými metódami zo známych a bežne dostupných zdrojov alebo im podobné zdroje môžu byť pripravené konvenčnými metódami z iných všeobecne známych a bežne dostupných zdrojov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

a) Príprava mutantov eIF-5A

Ľudská cDNA kódujúca eIF-5A (J. Celí Biol. 123/6, 1309 - 1320 /(1993)) bola vložená ako HindlII fragment do jediného reštrikčného miesta HindlII vektora M13mpl8 (Pharmacia, Švédsko). Zodpovedajúca j ednoreťazcová DNA bola použitá na mutagenézu metódou „oligonukleotidom riadenej mutagenézy in vitro, verzia 2 (Amersham, UK).

Sekvencie všetkých mutantov boli určené sekvenovanim DNA za použitia Sequenase

2.0 z United States

Biochemicals. Ďalej bola v bunkách cos všetkých mutovaných, génov kódujúcich eIF-5A ktorej nasledovala imunoprecipitačná analýza uskutočnená expresia (viď Tabuľka č. 1), po špecifická pre eIF-5A, ktorou bola potvrdená prítomnosť požadovaného produktu expresie.

Tabuľka 1

Mutanti eIF-5A

Mutant

Pozícia

Mutácia väzba Rev kômplamentácia (ak) (ak) in vitro v kvasinkách

peIF-5AMl	4,5,6	D,L,D-4EJD,L	nz.
peIF-5AM2	9,10	T.G-^DX	nz.
peIF-5AM3	15,16,17	S, A,T—> AJ) L	nz.
peIF-5AM4	22,23,24	C,S,A->GJDX	-
peIF-5AM5	43,44,45	M.S,T->U)L
peIF-5AM6	46,47,48	S,K,T->UDX
peIF-5AM7	64,65	F.T-4DL
peIF-5AM8	69,70
peIF-5AM9	75,76	S,T-»DL
peIF-5AM10	98,99,100	,YL,S-»LDX
peIF-5AMl 1	104,105,106	D,S,G'->QJ)L	nz.
peIF-5AM12	126,127	K,Y->DX	nz.
peIF-5AM13	135,136	I,T-+DJL	+
peIF-5AM14	138,139	L,S,—>DJ.	+
peIF-5AM15	141,142,143	M,T^-»LDX	nz.
peIF-5AM16	149,150	LK-»D,L
peIF-5AM13A* 135	DLCCLP-STOP	+

áno áno áno nie nie nie nie nie nie nie áno áno nie nie áno nie nie *peIF-5A13A je protein so 140 aminokyselinami (ak) po delécii Cterminálnej časti proteínu peIF-5A. Jeho sekvencia je: natívny od aminokyseliny č. 1 až po č. 134 a ďalej aminokyseliny: DLCCLP. Všetky ostatné mutanty vznikli substitúciou aminokyselín.

+ označuje aktivitu natívnu, - označuje žiadnu aktivitu, nz.

označuje nestanovované.

Nukleotidové sekvencie špecifických oligonukleotidov použitých na prípravu uvedených 17 mutantov sú uvedené v Tabuľke 2 (identifikačné č. sekvencie 1 až 16) . Posledný mutant, Μ13Δ, bol pripravený za použitia rovnakého oligonukleotidu ako M13; chyba v postupe mutagenézy však spôsobila vznik mutanta Μ13Δ.

Je nutné vziať na zreteľ, že uvedené sekvencie nukleotidov sú iba reprezentatívnymi ukážkami pre 17 pripravených mutantov, a že je možné pripraviť identické mutanty z celého radu iných sekvencii, ak vezmeme do úvahy napríklad odchýlky od štandardného genetického kódu.

Tabuľka 2

Oligonukleotidy použité na prípravu mutantov eIF-5A

Ml :	5 ' -	GGC	AGA	TGA	AGA	TCT	CTT	CGA	GAC	AGG	-3 '
M2 :	5 ' -	CTT	GGA	CTT	CGA	AGA	TCT	AGA	TGC	AGG	-3 '
M3 :	5 ' -	GCA	GGG	GCC	GCA	GAT	CTC	TTC	CCA	ATG	C -3 ’
M4 :	5 ' -	CCC	AAT	GCA	GGG	AGA	TCT	ATT	ACG	TAA	G -3 ’
M5 :	5 ' -	CGT	CGA	GAT	AGA	TCT	TTC	GAA	GAC	TGG	-3 '
M6 :	5 ' -	CGA	GAT	GTC	TAC	ΊΤΤ	AGA	TCT	TGG	CAA	GCA CG -3'
M7 :	5 ’ -	GGT	ATT	GAC	ATA	GAT	CTT	GGG	AAG	AAA	TAT G -3 *
M8 :	5 ' -	GGG	AAG	AAA	GAT	CTA	GAT	ATC	TGC	CCG	-3 ¹
M9 :	5 ' -	GAT	ATC	TGC	CCA	GAT	CTT	CAT	AAT	ATG	G -3 '
M10 :	5 ' -	GGC	ATC	CAG	GAT	GGG	TTA	GAT	CTA	CTG	CTC CAG GAC
		AGC	G -ľ	5 '
Mll :	5 ' -	CTG	CTC	CAG	GAA	GAT	CTG	GAG	GTA	CGA	G -3 ¹
M12 :	5 ¹ -	GAG	ATT	GAG	CAA	GAT	CTC	GAC	TGT	GGA	G -3 '
M13 :	5 ’ -	GAA	GAG	ATC	CTA	GAT	CTG	GTG	CTG	TCT	GCC -3’
M14 :	5 ' -	CCT	GAT	CAC	GGT	AGA	TCT	TGC	CAT	GAC	AGA GG -3'
M15 :	5 ' -	GCT	GTC	TGC	CAT	AGA	TCT	GGA	GGC	AGC	TG -3 ’
M16 :	5 ¹ -	GCA	GCT	GTT	GCA	GAT	CTG	GCC	ATG	GC	-3 ¹

b) Testovanie bunkovej aktivity eIF-5A mutantov eIF-5A v kvasinkách Saccharomyces cerevisiae

Sekvencie kódujúce eIF-5A boli vložené do reštrikčných miest BamHI a Xbal kvasinkového shuttle-vektora pRSGAL s použitím technológie polymerázovej reťazovej reakcie (PCR). Na účely testovania komplementačnej kapacity rôznych mutantov eIF-5A v kvasinkovom kmeni Saccharomyces cerevisiae neobsahujúcom eIF-5A bola použitá plazmidová technológia publikovaná v Mol. Gen. Genet. 244, 646 - 652 (1994) . Výsledky sú zhrnuté v Tabuľke 1; niekoľko mutantov eIF-5A, najmä od peIF-5AM4 až po peIF-5AM10 a ďalej peľF5AM13, peIF-5AM16 a peIF-5AM13Ä bolo identifikovaných ako nefunkčné mutanty proteinu eIF-5A.

c) Väzba in vitro nefunkčných mutovaných proteinov eIF-5A k tránsaktivačnému proteinu Rev vírusu HIV ‘za použitia testu zmeny pohyblivosti na géli

Gény natívnej a všetkých nefunkčných foriem proteinu eIF-5A boli vložené medzi reštrikčné miesta BamHI a EcoRI prokaryotického expresného vektora pGEX-3X (Pharmacia) za použitia polymerázovej reťazovej reakcie a ďalej bola uskutočnená ich expresia vo forme rôznych fúznych proteinov obsahujúcich glutation-S-transferázu (GST) v Escherichia coli, po ktorej nasledovala purifikácia. Rôzne fúzne proteíny GST-eIF-5A boli ďalej použité v testoch zmeny pohyblivosti na géli spolu s RRE RNA označenou izotopom ³²P a s rekombinantným proteínom Rev (Náture 342, 816-819 (1989)), podľa postupu opísaného v časopise Biochemistry 32, 10497-10505 (1993).

Ako prvý bol testovaný vplyv natívneho proteinu GST-eIF-5A na komplex RRE:Rev. Ako je ukázané na obrázku IA, prídavok proteinu

GST-eIF-5A do reakčnej zmesi RRE RNA obsahujúcej Rev umožnil detekciu komplexu s vyššou molekulovou hmotnosťou a s jednoznačne zníženou pohyblivosťou (Obr. IA, pruhy 5 a 4) . Tento nebol detekovateľný počas inkubácie RRE RNA spolu s GST alebo so samotným GST-eIF-5A (Obr. IA, pruhy 2 a 3) .

Ďalej sa testovalo, či odpoveď špecifická pre tento proteín eIF-5A závisí od prítomnosti aktivačnej domény v transaktivačnom proteíne Rev. Za účelom tohto zistenia boli použité už skôr opísané mutantné proteíny Rev9A14 a RevllA14 (Biochemistry 32, 8945-8954 (1993)) . Oba tieto proteíny obsahujú vnútornú deléciu v blízkosti C-terminálneho konca a vykazujú voči RRE RNA špecifickú väzbovú afinitu a špecificitu, ktorá je porovnateľná s natívnou formou Rev. Dôležité je, že z proteínu Rev9A14 bola celkom odstránená aktivačná doména, ktorá však v proteíne RevllA14 bola zachovaná. Nižšia molekulová hmotnosť oboch proteínov spôsobila posun prúžkov komplexu RRE:proteín, ktorý bolo ťažko určiť pri teste zmeny pohyblivosti na géli. Výsledky však jednoznačne ukazujú, že mutant s odstránenou áktivačnou doménou Re'v9AÍ4 nie _t je schopný interakcie s GST-eIF-5A (Obr. IA, pruhy 6 a 7). Oproti tomu pridanie GST-elF5A k reakčnej zmesi RRE:RevllA14 spôsobil nový výsledok (Obr. IA, pruhy 8 a 9; pomalšie sa pohybujúci bod v pruhu 9), ktorý indikuje interakciu eIF-5A s aktivačnou doménou Rev.

Nakoniec boli podľa rovnakého postupu testované väzbové schopnosti rôznych nefunkčných mutantných proteínov eIF-5A. Ako vyplýva z obrázka 1B, väčšina mutantných proteínov GST-eIF-5A stratila schopnosť rozlišovať komplex RRE:Rev (pruhy 4 až 10 a pruh 13) . Tri nefunkčné mutantné proteíny : GST-eIF-5AM13, GST-eIF-5AM14 a GST-eIF-5AM13A, však dokazujú väzbu, ktorá je porovnateľná s väzbou natívneho proteínu eIF-5A (Obr. 1B, pruh 3 a 11, 12 a 14).

Výsledky teda ukazujú, že mutanty eIF-5AM13, GST-eIF-5AM14 a GST-eIF-5AM13A vyhovujú požiadavkám na inhibítory funkcie HIV-1 Rev, a to vzhľadom:

(1) k strate endogénnej funkcie proteínu eIF-5A (viď komplementáciu v kvasinkách, Tabuľka I), a (2) k väzbovej aktivite voči proteínu HIV-1 Rev (viď väzba Rev in vitro; Tabuľka I a Obrázok 1B) .

d) Konštitutívna inhibicia replikácie HIV-1 v ľudských T-bunkách retrovírusom sprostredkovaným génovým transferom transdominantných mutantov eIF-5A.

Na účely testovania inhibičných fenotypov proteínov eIF-5AM13, eIF-5AM14 a eIF-5AM13A boli príslušné sekvencie kódujúce eIF-5A vložené do reštrikčného miesta Xhol retrovírusového vektora pBC140, zbalené in vitro za použitia bunkovej línie Aml2 a prenesené do ľudských T-buniek CEM na konštitutívnu expresiu, ako je opísané v Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 9870-9874 (1992). Expresia natívneho génu eIF-5A, génu kódujúceho eIF-5AM9 a samotného retrovírusového vektora sa využila na ¹ 'referenčné porovnávanie v týchto experimentoch. Rovnako boli uskutočnené experimenty s HIV-1, a to s použitím TCID s hodnotou 2000/ml kmeňa HIV-1 SF2. Desiaty deň po infekcii SF2 boli odobraté vzorky z kultivačného média na test replikácie HIV-1 pomocou stanovenia proteínu p24 Gag s použitím testu ELISA. Ako je ukázané na Obrázku 2, replikácia HIV-1 bola podstatne znížená v každej z troch nezávisle klonovaných bunkových línií CEM (označenej ako A, B, C) produkujúcich eIF-5AM13, elF5AM14 alebo eIF-5AM13Á (Obrázky 2C, 2D a 2E; vľavo) , a to v porovnaní s bunkami CEM, produkujúcimi mutantný proteín eIF-5AM9 (CEM-eIF-5AM9; Obr. 2B) . Maximálna vírusová replikácia bola zistená v bunkách CEM produkujúcich parentálny vektor pBC140 (vektor CEM; Obr. 2A) alebo natívny proteín eIF-5A, (CEM-eIF-5Awt; Obr. 2A) . Pozorované inhibujúce vlastnosti neboli spôsobené všeobecnou inhibíciou bunkovej proliferácie, čo dokladujú porovnateľné počty buniek v experimentoch (Obr. 2; vpravo). Záverom tieto experimenty dokazujú, že (1) konštitutívna expresia proteinov eIF-5AM13, eIF-5AM14 alebo eIF-5AM13A nemá v ľudských T-bunkách CEM toxické účinky a (2) že eIF-5AM13, elF5AM14 a eIF-5AM13A sú inhibítormi replikácie HIV-1.

HIV je predominantným etiologickým pôvodcom AIDS (syndrómu získanej imunodeficiencie); HTLV-I spôsobuje okrem iného ATL (leukémiu T-buniek dospelých); HTLV-II súvisí etiologicky s niektorými prípadmi variantnej leukémie hairy T-buniek. Bolo zistené, že transaktivátory HIV Rev a HTLV-I Rex sú dôležité na replikáciu vírusu v médiu. Ďalej bolo dokázané, že HTLV-I Rex je schopný funkčne nahradiť proteín Rev v HIV. Navyše, Rev a Rex sú preto možnými cieľmi pre terapeutickú intervenciu u postihnutých pacientov. Mutantné formy eIF-5A podľa vynálezu účinkujú ako efektívne kompetitívne inhibitory natívnej formy Rev alebo/a funkcie natívneho Rex v dôsledku schopnosti Rex funkčne nahradiť rev v Hiv. Vzhľadom ' na to, ' tieto mutantné formy eIF-5A môžu byť tiež efektívnymi inhibítormi replikácie HIV alebo/a HTLV-I alebo/a HTLV-II. Môžu byť teda použité na ochranu lymfoidných alebo/a myeloidných buniek pacientov vystavených infekcii a preto môžu byť použité na liečenie ochorení spôsobených HTLV-I a HTLV-II alebo HIV, a to vrátane AIDS a ARS alebo ARC (syndrómu alebo komplexu súvisiaceho s AIDS). Tiež môžu byť použité na liečenie ochorení spôsobených AIDS, pretože sú schopné inhibovať činnosť proteinov HTLV-I Rex a HIV Rev. Táto vlastnosť môže byť obzvlášť prospešná u pacientov infikovaných viac než jedným vírusovým patogénom a ďalej u tých, u ktorých nie je zistené, ktorým z týchto dvoch pôvodcov sú infikovaní.

Tento vynález je teda určený na profylaxiu a terapiu vírusových a obzvlášť retrovírusových ochorení, ako sú ATL, AIDS, ARS (alebo ARC), infekcie spôsobené vírusmi ako sú SIV (opičí vírus deficitu imunity), ako je SIV_mac, FIV (mačací vírus deficitu imunity), EIAV (konský vírus infekčnej anémie), vírus visna, vírus deficitu imunity hovädzieho dobytka a najmä ľudské retrovírusové ochorenia, najmä ľudské retrovírusové ochorenia spôsobené patogénni regulovanými génmi Rex alebo Rev alebo ich ekvivalentami, ako je ATL, AIDS a ARS (alebo ARC). Zvláštnu pozornosť si zasluhuje multivalentné využitie represorového efektu, nakoľko toto využitie je výhodné pri liečení násobných, obzvlášť podvojných vírusových infekcií, ako možno často pozorovať napríklad u osôb užívajúcich intravenózne drogy a infikovaných súčasne HIV a HTLV-I alebo pri liečení infekcií spôsobených jedným patogénom za zvýšeného rizika ďalšej infekcie, ako je infekcia HIV či v prípade profylaxie za takýchto situácií, keď je potrebná ochrana proti infekcii spôsobenej spektrom rôznych vírusových kmeňov.

Terapeutické možnosti tohto vynálezu sú celkom zrejmé, lebo potlačenie napríklad funkcie Rex u HTLV-I a funkcie Rev i HIV blokuje .vírusovú •replikáciu, a tak zabránením tvorby infekčných vírusových častíc znižuje vírusovú záťaž a predpokladá sa teda, že predlžuje latentné obdobie infekcie. Bunky osôb infikovaných vírusom HIV, majúce vo svojom genórae zaintegrovaný gén kódujúci mutantný represor eIF-5A, zostanú funkčné a tieto osoby budú neobmedzene dlho uchránené pred prejavom symptómov ochorenia bez potreby ďalšej dlhodobej terapie.

Z tohto pohľadu sú gény podľa vynálezu sami o sebe liečivami určenými na jednorázové alebo viacrazové dávkovanie buďto priamo in vivo alebo nepriamo in vitro, výhodne ako súčasť vektora, napríklad retrovirálneho alebo plazmidového, a to vo forme vhodnej na dosiahnutie prenosu vo funkčnej forme do cieľových cicavčích buniek. Napríklad inzercia génov kódujúcich tieto inhibítory vírusovej replikácie môže byť uskutočnená in vitro do buniek pacientov priamou implantáciou do genómu lymfoidných alebo/a myeloidných buniek odobratých z týchto pacientov a tieto bunky môžu byť pacientovi dodané na uskutočnenie inzercie. Vzhľadom na to, že HTLV-I a HTLV-II, rovnako tak, ako aj HIV, sa replikujú v rôznych typoch T-buniek, potom ochorenia, ktoré spôsobujú, budú vhodne liečené. T-bunky sú preto požadovanými cieľovými bunkami na genetickú modifikáciu využívajúcu gény podľa vynálezu. Ďalej monocytárne a makrofágové bunky, ktoré sú cieľovými bunkami na infekciu HIV, sú tiež vhodnými cieľovými bunkami na túto modifikáciu. Výhodne sa uskutočňuje modifikácia hematopoetických kmeňových buniek, čím sa zaistí dlhodobá ochrana bunkového potomstva násobného hematopoetického rodu.

Jedno využitie uvedeného súvisí s konceptom génovej terapie uverejneným T. Friedmanom v Science, 244, (1989), 1275 alebo P. M.

Lehnom v Bone Marrow Transplant 1 (1987) 243. Hematopoetické kmeňové bunky sú izolované napríklad z pacientov postihnutých AIDS/ATL, kultivované in vitro a mutantné gény podľa vynálezu, kódujúce inhibítor funkcie, ktorá má byť 'potlačená, menovite funkcie Rev/Rex, sú implantované so týchto buniek s použitím retrovírusových vektorov. Tieto bunky, teraz už rezistentné voči vírusom, sú vrátené do imunitného systému pôvodného pacienta, kde sa očakáva ich proliferácia vzhľadom na ich získanú imunitnú výhodu v porovnaní s ostatnými kmeňovými bunkami. V požadovanom čase sa bude populácia hematopoetických buniek skladať výhradne z buniek produkujúcich represný faktor a bude rezistentný voči vírusom.

Postupy na dosiahnutie uvedeného sú už v odbore známe, viď napríklad USP 4,868,116. Vektory, napríklad retrovirusové alebo plazmidové vektory, na prenos mutovaných génov podľa vynálezu do cieľových cicavčích buniek, ako sú bunky kostnej drene, sú uverejnené alebo k nim existujú odkazy, napríklad v Science 244 (1989) 1275. Napríklad rôzne transdominantné gény kódujúce Rev alebo/a rex už boli vložené do retrovírusových vektorových systémov. Po prenose génu prostredníctvom retrovirusov do ľudských bunkových línii infikovaných napríklad HIV je inhibičný efekt mutantov zrejmý na inhibíciu produkcie vírusov. Zmienený terapeutický koncept je príkladom intracelulárnej imunizácie vysvetlenej v práci D. Baltimora v Náture, 335, (1988), 395. Súhrnne povedané, tento koncept zahŕňa inzerciu génu, ktorý kóduje represor niektorej životne dôležitej funkcie zvoleného vírusu, do príslušných cieľových buniek, ktoré tento vírus infikuje (napr. určité T-bunky a monocytárne a makrofágové bunky v prípade vírusu vyvolávajúceho AIDS). Použitie tohto konceptu pri terapii represorom ktoréhokoľvek vírusu je viazané na podmienku, že použité vektory pre gény kódujúce tieto mutantné proteíny a použité metódy na inzerciu týchto vektorov do príslušných buniek, identifikované ako modely, budú predstavovať efektívny a bezpečný intrabunkový systém prenos na využitie u ľudí aj u zvierat. Pred experimentálnym overením tohto konceptu teda stoja iba etické prekážky, ktoré v súčasnej zabraňujú génovej terapii. Prvý takéto experimenty na osobách už však boli začaté, a to so zameraním na bezpečnosť a vlastnú terapiu (viď G.T,Nabel, Human Gene Therapy, 5, (1994), 7982) . Očakáva sa, že vo veľmi krátkej dobe po overení neškodnosti tohto postupu budú tieto priekopnícke experimenty nasledované podobnými experimentmi s terapeutickými cieľmi, a to predovšetkým za stavov ohrozujúcich život, ako je ochorenie AIDS a že tento vynález sa ukáže ako veľmi vhodný na využitie počas týchto experimentov (viď napr. T. Friedman, Science 244, (1989), 1279, druhý stĺpec: „Infekčné ochorenia).

Ďalším spôsobom využitia tohto vynálezu je inzercia nie génu, ale priamo represného proteínu podľa vynálezu do cieľových buniek. Orálne alebo parenterálne podanie sa uskutočňuje bežným spôsobom umožňujúcim intracelulárnu penetráciu, a to napríklad prostredníctvom lipozómov. V prípadoch takéhoto využitia bude presná dávka samozrejme závisieť na použitej zlúčenine, spôsobe podania a požadovanom liečení; určenie najvhodnejšej dávky v danej situácii je v možnostiach kvalifikovaného odborníka.

Je treba vziať na zreteľ, že v predchádzajúcom texte uvedený vynález môže podliehať rôznym kombináciám alebo zmenám jeho formy, či jednotlivých detailov bez toho, aby došlo k odklonu od rozsahu tohto vynálezu. Tiež je nutné vziať na zreteľ, že do rozsahu tohto vynálezu spadajú tiež ďalšie mutanty okrem tu uvedených, a to vrátane mutantov patriacich medzi mutanty tu uvedené, ktoré však zatiaľ neboli charakterizované, ale môžu byť charakterizované po detailnejšom skúmaní ako inhibujúce alebo/a multivalentné, a ďalej ďalšie mutanty, ktoré zodpovedajú vyššie uvedeným princípom, ale nie sú tu špecificky uvedené.

Prehľad obrázkov na výkresoch:

Obrázok 1:

Obrázok 2:

Obrázok 3:

In vitro experiment posunu RNA na géli.

FP = voľná sonda;' eIF-5A (-) = bez eIF-5A.

Experimenty s HIV-1. Hodnoty p24Gag sú ukázané vľavo. Počty buniek v príslušných experimentoch sú ukázané napravo:

A:	CEM-vektor / eIF-5A wt
B:	CEM-eIF-5AM9
C:	CEM-eIF-5AM13
D:	CEM-eIF-5AM14

E: CEM-eIF-5AM13Á (Sekvencia č. 17): Sekvencia cDNA a aminokyselín natívneho ľudského eIF-5A (J. Biol. Chem. 264, (1989), 1581) (Sekvencia č. 17); aminokyselina lyzín znázornená na pozícií č. 50 je posttranslačne zmodifikovaná na hypusín. Aminokyseliny natívneho eIF-5A, ktoré boli zmutované podlá prehľadu v Tabuľke 1 sú uvedené kurzívou. Špecifické použité oligonukleotidy (Tabuľka 2, Sekvencia č. 1 až č. 16) zodpovedajú nasledovným pozíciám nukleotidov na Obrázku 3 (Sekvencia č. 17):

Ml:	3-29	(27 nukleotidov)
M2:	12-38	(27 nukleotidov)
M3:	34-61	(28 nukleotidov)
M4 :	54-81	(28 nukleotidov)
M5:	120-146	(27 nukleotidov)
M6:	123-154	(32 nukleotidov)
M7 :	178-208	(31 nukleotidov)
M8 :	196-222	(27 nukleotidov)
M9:	211-238	(28 nukleotidov)
M10	: 277 -316	(40 nukleotidov)
Mll	: 301 - 328	(28 nukleotidov)
M12	: 364 - 391	(28 nukleotidov)
Ml 3	: 391 - 420	(30 nukleotidov)
Ml 4	: 399 - 430	(32 nukleotidov)
Ml 5	: 411 - 439	(29 nukleotidov)
Ml 6	: 433 - 458	(26 nukleotidov)
Μ13Δ: 391 -421	(30 nukleotidov, pozícia č. 409
je :	bez translácie,	a je nasledovaná STOP kodónom na

pozíciách 422-424), výsledkom sú zmeny aminokyselín uvedené v Tabuľke 1 v sekvencii natívneho proteinu.

Zoznam sekvencii

Informácie o sekvencii č. 1 (Ml):

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 27 párov báz (B) Typ:

(C) Reťazec: dvojitý (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: cDNA (iii) Hypotetický: nie (iii) Antisense: nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: syntetický (x) Informácie o zverejnení:

(H) Číslo dokumentu: - (I) Dátum podania: - (J) Dátum 'zverejnenia: - , .

(xi) Opis sekvencie: Sekvencia č. 1:

GGC AGA TGA AGA TCT CTT CGA GAC AGG

Informácie o sekvencii č. 2 (M2):

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 27 párov báz (B) Typ:

(A) Organizmus: syntetický (x) Informácie o zverejnení:

(H) Číslo dokumentu: - (I) Dátum podania: - (J) Dátum zverejnenia: - (xi) Opis sekvencie: Sekvencia č. 2:

CTT GGA CTT CGA AGA TCT AGA TGC

Informácie o sekvencii č. 3 (M3):

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	Dĺžka: 28	párov báz
(B)	Typ:
(C)	Reťazec:	dvoj itý
(D)	Topológia	: lineárna
Druh	molekuly:	cDNA , ·

(iii) Hypotetický: nie (iii) Antisense: nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: syntetický (x) Informácie o zverejnení:

(H) Číslo dokumentu: - (I) Dátum podania: - (J) Dátum zverejnenia: - (xi) Opis sekvencie: Sekvencia č. 3:

GCA GGG GCC GCA GAT CTC TTC CCA

Informácie o sekvencii č. 4 (M4):

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 28 párov báz

AGG

ATG C (B) Typ:

(A) Organizmus: syntetický (x) Informácie o zverejnení:

(H) Číslo dokumentu: - (I) Dátum podania: - (J) Dátum zverejnenia: - (xi) Opis sekvencie: Sekvencia č. 4:

CCC AAT GCA GGG AGA TCT ATT ACG

Informácie o sekvencii č., 5 (M5) (i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 27 párov báz (B) Typ:

(A) Organizmus: syntetický (x) Informácie o zverejnení:

(H) Číslo dokumentu: - (I) Dátum podania: - (J) Dátum zverejnenia: - (xi) Opis sekvencie: Sekvencia č. 5:

TAA G

CGT CGA GAT AGA TCT TTC GAA GAC TGG

Informácie o sekvencii č. 6 (M6) :

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 32 párov báz (B) Typ:

(A) Organizmus: syntetický (x) Informácie o zverejnení:

(H) Číslo dokumentu: - (I) Dátum podania: - ' , (J) Dátum zverejnenia: - (xi) Opis sekvencie: Sekvencia č. 6:

CGA GAT GTC TAC TTT AGA TCT TGG CAA GCA CG

Informácie o sekvencii č. 7 (M7) :

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 31 párov báz (B) Typ:

(A) Organizmus: syntetický (x) Informácie o zverejnení:

(H) Číslo dokumentu: - (I) Dátum podania: - (J) Dátum zverejnenia: -

(xi)	Opis	sekvencie	: Sekvencia č. 7:
GGT	AT T	GAC ATA	GAT CTT GGG AAG
Informácie o sekvencii č. 8 (M8) : (i) Charakteristika sekvencie: (A) Dĺžka: 27 párov báz (B) Typ: (C) Reťazec: dvojitý (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: cDNA

_;(ϋί) Hypotetický: nie ‘ (iii) Antisense: nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: syntetický (x) Informácie o zverejnení:

(H) Číslo dokumentu: - (I) Dátum podania: - (J) Dátum zverejnenia: - (xi) Opis sekvencie: Sekvencia č. 8:

GGG AAG AAA GAT CTA GAT ATC TGC CCG

Informácie o sekvencii č. 9 (M9) :

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 28 párov báz (B) Typ:

(A) Organizmus: syntetický (x) Informácie o zverejnení:

(H) Číslo dokumentu: - (I) Dátum podania: - (J) Dátum zverejnenia: - (xi) Opis sekvencie: Sekvencia č. 9:

GAT ATC TGC CCA GAT CTT CAT AAT

Informácie o sekvencii č. 10 (M10):

(i) Charakteristika, sekvencie:

ATG G

(A)	Dĺžka: 40	párov báz
(B)	Typ:
(C)	Reťazec:	dvoj itý
(D)	Topológia	: lineárna
Druh	molekuly:	cDNA

(iii) Hypotetický: nie (iii) Antisense: nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: syntetický (x) Informácie o zverejnení:

(H) Číslo dokumentu: - (I) Dátum podania: - (J) Dátum zverejnenia: - (xi) Opis sekvencie: Sekvencia č. 10:

GGC ATC CAG GAT GGG TTA GAT CTA CTG CTC CAG GAC AGC G

Informácie o sekvencii č. 11 (Mll):

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 28 párov báz (B) Typ:

(A) Organizmus: syntetický (x) Informácie o zverejnení:

(H) Číslo dokumentu: - (I) Dátum podania: - (J) Dátum zve'rejnenia: - , .

(xi) Opis sekvencie: Sekvencia č. 11:

CTG CTC CAG GAA GAT CTG GAG GTA CGA G

Informácie o sekvencii č. 12 (M12):

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 28 párov báz (B) Typ:

(A) Organizmus: syntetický (x) Informácie o zverejnení:

(H) Čislo dokumentu: - (I) Dátum podania: - (J) Dátum zverejnenia: - (xi) Opis sekvencie: Sekvencia č. 12:

GAG ATT GAG CAA GAT CTC GAC TGT GGA G

Informácie o sekvencii č. 13 (M13):

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 30 párov báz (B) Typ:

(C) Reťazec: dvojitý (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: cDNA (iii) Hypotetický: nie . > ‘ (iii) Antisense: nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: syntetický (x) Informácie o zverejnení:

(H) Číslo dokumentu: - (I) Dátum podania: - (J) Dátum zverejnenia: - (xi) Opis sekvencie: Sekvencia č. 13;

GAA GAG ATC CTA GAT CTG GTG CTG TCT GCC

Informácie o sekvencii č. 14 (M14):

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 32 párov báz (B) Typ:

(A) Organizmus: syntetický (x) Informácie o zverejnení:

(H) Číslo dokumentu: - (I) Dátum podania: - (J) Dátum zverejnenia: - (xi) Opis sekvencie: Sekvencia č. 14:

CCT GAT CAC GGT AGA TCT TGC CAT GAC AGA GG

Informácie o sekvencii č. 15 (M15):

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	Dĺžka: 29 párov báz
(B)	Typ:	' 1
(C)	Reťazec:	dvojitý
(D)	Topológia	: lineárna
(ii) Druh	molekuly:	CDNA

(iii) Hypotetický: nie (iii) Antisense: nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: syntetický (x) Informácie o zverejnení:

(H) Číslo dokumentu: - (I) Dátum podania: - (J) Dátum zverejnenia: - (xi) Opis sekvencie: Sekvencia č. 15:

GCT GTC TGC CAT AGA TCT GGA GGC AGC TG

Informácie o sekvencii č. 16 (M16):

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 26 párov báz (B) Typ:

(A) Organizmus: syntetický (x) Informácie o zverejnení:

(H) Číslo dokumentu: - (I) Dátum podania: - (J) Dátum zverejnenia: - (xi) Opis sekvencie.: Sekvencia č. 16: ' · ¹

GCA GCT GTT GCA GAT CTG GCC ATG GC

Informácie o sekvencii č. 17 (wt) :

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 4 65 párov báz ( a 154 aminokyselinových zvyškov) (B) Typ: cDNA (C) Reťazec: dvojitý (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: cDNA (iii) Hypotetický: nie (iii) Antisense: nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Homo sapiens (x) Informácie o zverejnení:

(H) Číslo dokumentu: J. Biol. Chem. 264 (1989) 1578-1583 (I) Dátum podania: - (J) Dátum zverejnenia: 1989 (xi) Opis sekvencie: Sekvencia č. 17:

10

TTC GAG

ACA Thr

30 GGA GAT GCA GGG GCC

TCA Ser

GCC Ala

50 ACC Thr

ATG GCA GAT Met Ala Asp 1

GAC Asp

TTG GAC

Leu

Asp

Phe

Glu

Gly Asp 10

Ala

Gly

Ala

70

90

TTC CCA ATG

CAG

TGC

TCA

GCA

TTA

CGT

AAG AAT

GGC

TTT

GTG

CTC

AAA

Phe Pro Met

Gin

Cys

Ser

Ala

Leu

Arg

Lys Asn

Gly

Phe

Val

Leu

Lys

20

110

130

150

GGC CGG CCA

TGT

AAG

ATC

GTC

GAG

ATG

TCT ACT

TCG

AAG

ACT

GGC

AAG

CAC

Gly Arg Pro

Cys

Lys

íle

Val

Glu

Met

Ser Thr

Ser

Lys

Thr

Gly

Lys

His

40

50

170

190

GGC CAC GCC

AAG

GTC

CAT

CTG

GTT

GGT

ATT GAC

ATC

TTT

ACT

GGG

AAG

AAA

Gly His Ala

Lys

Val

His

Leu

Val

Gly

íle Asp

íle

Phe

Thr

Gly

Lys

60

210

230

250

’TAT gaa ,GAŤ

ATC

TGC

CCG

TCA

ACT

CAT

AAT ATG

GAT

GTC

ccc

AAC

ATC

AAA

Tyr Glu Asp

íle

Cys

Pro

Ser

Thr

His

Asn Met

Asp

Val

Pro

Asn

íle

Lys

70

80

270

290

AGG AAT 'GAC

TTC

CAG

CTG

ATT

GGC

ATC

CAG GAT

GGG

TAC

CTA

TCA

CTG

CTC

Arg Asn Asp

Phe

Gin

Leu

íle

Gly

íle

Gin Asp

Gly

Tyr

Leu

Ser

Leu

90

100

310

330

350

CAG GAC AGC

GGG

GAG

GTA

CGA

GAG

GAC

CTT CGT

CTC

CCT

GAG

GGA

GAC

CTT

Gin Asp Ser

Gly

Glu

Val

Arg

Glu

Asp

Leu Arg

Leu

Pro

Glu

Gly

Asp

Leu

110

370

390

4

GGC AAG GAG

ATT

GAG

CAG

AAG

TAC

GAC

TGT GGA

GAA

GAG

ATC

CTG

ATC

ACG

Gly Lys Glu

íle

Glu

Gin

Lys

Tyr

Asp

Cys Gly

Glu

íle

Leu

íle

Thr

120

130

10

430

450

GTG CTG TCT

GCC

ATG

ACA

GAG

GCA

GCT GTT

GCA

ATC

AAG

GCC

ATG

GCA

Val Leu Ser

Ala

Met

Thr

Glu

Ala

Ala Val

Ala

íle

Lys

Ala

Met

Ala

140

150

AAA TAA Lys End

Claims

1. Mutantný proteín eIF-5A, ktorý inhibuje funkciu Rev, a tým vykazuje inhibičný fenotyp vzhľadom na funkciu Rev alebo gén alebo sekvencia DNA alebo sekvencia cDNA kódujúca tento proteín.

2. Proteín podľa nároku 1, ktorý nedisponuje podstatnou endogénnou funkciou eIF-5A alebo gén alebo sekvencia DNA alebo sekvencia cDNA kódujúca tento proteín.

3. Proteín podľa nároku 1 alebo 2, ktorým je proteín eIF-5AM13, eIF-5AM14 alebo eIF-5AM13A alebo gén alebo sekvencia DNA alebo sekvencia cDNA kódujúca tento proteín.

i

4. Prokaryotická alebo eukaryotická hostiteľská bunka, v .y z n ačujúca sa tým, že je transformovaná alebo transfekovaná génom alebo sekvenciou DNA alebo sekvenciou cDNA podľa nároku 1 alebo 2, a to takým spôsobom, ktorý hostiteľskej bunke umožňuje expresiu tohto génu alebo sekvencie alebo sekvencie cDNA.

5. Biologicky funkčný plazmid alebo vírusový vektor DNA, vyznačujúca sa tým, že obsahuje gén alebo sekvenciu DNA alebo sekvenciu cDNA podľa nároku 1 alebo 2.

6. Prokaryotická alebo eukaryotická hostiteľská bunka, vyznačujúca sa tým, že je stabilne transformovaná alebo transfekovaná biologicky funkčným plazmidom alebo vírusovým vektorom DNA obsahujúcim gén alebo sekvenciu cDNA podľa nároku 1 alebo 2.

7. Spôsob prípravy génu alebo sekvencie DNA alebo sekvencie cDNA podlá nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa izoláciu zodpovedajúceho natívneho génu z príslušného expresného systému, inzerciu tohto génu do príslušného klonovacieho systému, uskutočnenie požadovanej genetickej mutácie a získanie výsledného mutanta z klonov obsahujúcich požadovanú mutáciu.

8. Spôsob produkcie proteínu podlá nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kultiváciu prokaryotických alebo eukaryotických buniek transformovaných alebo transfekovaných génom alebo sekvenciou DNA alebo sekvenciou cDNA podľa nároku 1 alebo 2 za vhodných kultivačných podmienok, a to tak, že hostiteľskej bunke je umožnená expresia proteínu a poprípade tiež izolácia požadovaného polypeptidického produktu expresie.

9. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa proteín podľa nároku Ί alebo 2 spolu s , aspoň, jedným ·. farmaceutický prijateľným nosičom, s pomocnou látkou alebo s riedidlom alebo vo forme buniek odobratých z pacientovho tela a spracovaných in vitro pred ich navrátením do tela.

10. Použitie proteínu podlá nároku 1 alebo 2 alebo génu alebo sekvencie DNA alebo sekvencie cDNA kódujúcej tento proteín pri liečení ochorení spôsobených retrovírusmi, ktorých funkcia Rev závisí na eIF-5A.

11. Použitie proteínu podlá nároku 1 alebo 2 alebo génu alebo sekvencie DNA alebo sekvencie cDNA kódujúcej tento proteín pri liečení ochorení spôsobených HIV, HTLV-I alebo/a HTLV-II.

12. Protein podlá nároku 1 alebo 2 alebo gén alebo sekvencia DNA alebo sekvencia cDNA kódujúca tento protein na použitie ako liečivo.

13. Použitie proteinu podlá nároku 1 alebo 2 na prípravu liečiva na liečenie ochorení spôsobených retrovírusmi, ktorých funkcia Rev závisí od eIF-5A.