SI9012105A - Postopek za izoliranje biološko aktivnih spoji - Google Patents

Abstract

Postopek za izoliranje biološko aktivnih spojin oziroma za izoliranje faktorja Vlil v obliki kompleksa Faktor VIII:C in vWF od drugih proteinov v krvni plazmi, pri katerem je plazma izpostavljena geiskl filtraciji pri pogojih skupinske separacije z uporabo velike polnitve in velike pretočne hitrosti pri čemer je gel kemijsko in imunološko inerten za faktor Vlil med časom gelske filtracije, pri katerem dobimo frakcijo, ki vsebuje faktor Vlil v zelo visokem dobitku in vedno brez drugih proteinov

Description

Postupak za izolovanje biološki aktivnih jedinjenja

1. Oblast tehnike

Cvaj pronelazak se odnosi na postupak za izolovanje bioloških jedinjenja kao ato su proteini, -narošito koagulacionog faktora V.III, iz tečnih tela kao što jo plazma, upotrebom gel filtracije kao prve faze u filtraciji.

2. Definisan tehniški problem

Predmet ovog pronalaska je da obezbedi postupak za izolovanje Faktora VIII direktno iz plazme, uz upotrebu gel filtracije.

3* Stanje tehnike

Faktor VIII koji je poznat kao antihemofilieni faktor A ili AHF je plazma protein koji ušestvujo u unutrašnjem putu koagulacije krvi.

Faktor VIII cirkulise u krvnoj plazmi u eksterno maloj koncentraciji u obliku ne-kovalentnog kompleksa dva proteina koji imaju Faktor VIII kao aktivni koagulator (Faktor VIIIjC) i aktivni ristocetin kofaktor (von tvillebrand Faktor (vffF)), odnosno kompleks ima molekularnu težinu od 1-20 x 10^D.

Fektor VIII:C nedostaje ili je nedovoljan kod pojedinaca koji boluju od bolesti krvarenja Hemofilija Λ koja se javlja kod 5 na 100.000 ljudi.

von V/illebrand Faktor so vezuje za aktivne plateletc na takuv način da se povečava ogregacija aktivnih plateleta. Ovaj efekat se može otkriti in vitro agregacijom ristocetina indukovanih plateleta. Zajodno sa V/illebrandovom bolešču vidi so i produženo vreme krvarenja zbog nedostatka ili sraarnjenog nivoa bioloških aktivnosti Υ/illebrand Faktora.

Hemofiličari koji pate od hemofilije A i pacijenti koji pate od različitih slučajeva von Willebrandove bolesti se danas leče koncentratima koji obuhvataju Faktor VVII:C/vWF, lecenjem koje može da poboljša kvalitet života pacijcnta i uzima u obzir ekonomsku mogučnost i koje pomaže u produženju života ovih pacijenata.

Farmaceut3ki preparati koji sadrže Faktor VIII (Faktor VIII:C i/ili vWF) mogu biti proizvedeni iz krvi ili krvne plazme. Proizvodnja ovakvih preparata može se izvoditi na nekoliko poznatih načina koje karalcterise mali prinos, naročito Faktora VIII:C. Zajediničko za skoro sve postupke je početna faza purifikacije koja obuhvata kriotaloženje. Kriotalog smrznute plazme je otopljen na temperaturi od 0-4°C koja daje porast taloga koji obuhvata Faktor VIII koji može biti salcupljen npr. centrifugiranjem. Iako je kriotaloženje relativno jedinostavno, ono je osnovni nedostatak zbog toga što kad je upotrebljeno u velikom opsegu, tj. bazen sa plazmom koji sadrži više od 5 kg, daje mali prinos Faktora VIII:C (30-45$ 3adržaja plazme) što zn.-.-či da je finalni prinos mali bez obzira koja je faza purifikacije kasnije upotrebljena.

Osim ovoga, generalno, faza umrtvl javanja virusa je obuhvačena proizvodnjom preparata Faktora VIII. Faza umrtvljavanja virusa povečava bezbednost od virusa u preparatima, ali u mnogo slučajeva uzrokuje daljnjim smanjenjem prinosa Fcktora VIII:0.

Vrlo mali opšti prinos Faktora VIII dovoi do nestašice ovih preparata na nekoliko lokacija i zbog toga potrebni su novi po3tupci za purifikaciju Faktora VIII u visoki prinos radi ispunjavanja potrebe za Faktorom VIII u lečenju hemofiličara.

Novi postupci za izolovanje Faktora VIII direktno iz plazme u visokom prinosu če biti od velikog interesa pošto se Sak do 70% sadržaja Faktora VIII u plazmi izgubi prilikom ili pre kriotaloženja.

Nedavno je pokušono da se izoluje Faktor VIII direktno iz plazme upotrebom afinitet hromatografije (Thromb. Haemost., 61, (2), 234-237 (1989)) ali dobijen je samo prinos manji od 60% i specifične aktivnosti od 1 IU Faktora Vlll/mg protein izolovanog Faktora VIII koji sadrži frakcija.

Gel filtracija, nazvana i hromatografija zasičenja gela ili hromatografija ogranieene veličine je široko kontrolisan postupak koji se upotrebljava za separaciju rastvora prema njihovoj veličini. Rastvori su prošli kroz stub napunjcn česticama inertnog po rožno g gela koji ima pore veličine koje isključuju veče molekule, dok se manji molekuli šire u stacionarno j fazi unutar cestica gela. Na ovaj način, veči molekuli koji biva ju potpuno isključeni iz 'čestica gela su elutovani prvo sa praznom zapreminora, dok manji molekuli provode duže vreme prolazeči stub i elutovani su u skladu sa smanjenjera veličine sa povečanjem elutovone zapremine.

Gel filtracija može biti izvedena na dva različitn nač ina:

T.Iod grupne separacije

U modu grupne separacije rastvori su separatisani u » dve grupe koje imaju velike razlike u njihovim molekularnim veličinama, jedna grupa je elutovana sa praznom zapreminom, a druga je zatira elutovana sa mnogo večom elutovanom zapreminom, cesto blizu ukupne natalozene zapremine? ovaj postupak je primarno upotrebljen za separaciju proteina iz rastvorenih soli, ili za promenu $ufera i odnosi se na desalinizaciju.

Za desalinizaci ju jo upotrebljen čvrsti gel koji ima pore male veličine i postupak moče biti izveden upotrebom velike količine materijala (uzorak zaprcmine se sastoji od 20-30/ natalozene aapremine) i upotrebom veliko protočne brzine (oko jedne natalozene zaprcmine pufera na sat); na ovaj način kapacitet stuba če biti veei.

Mod deljenja na frakcije

U ovom modu, rastvori koji imaju slične molekularne veličine su separatisani; ovaj postupak se često upotrebljava za separatisonje proteina. Za ovu svrhu ppotrebljene su čestice gela sa večim porama i sredina gel filtracije je odabrana tako da osigura da se proteini elutuju izmedju prazne zapreraine i elutovane zapremine koja odgovara ukupno natalozenoj zapremini. Supstance su elutovane mnogo gusče nogo kada se upotrebljava ju uslovi grupne separacije i mogu se preklapati. Velike brzine protoka nisu poželjne jer ne dozvo1javaju efikasnu separaci ju proteina, i punjenje stuba aura da se drži niško da bi se dobila prihvatljiva separacija pojedinih proteina. Na ovaj način, gol filtracija upotrcbljena u modu deljenja na frakcije može biti preporučena samo za scparaciju proteina kao poslednja faza poliranja gde je mala zapremina koju treba frakcionisati (Jagschies, Ullmanns Encyclopedia ofl Industrial Cheraistry, vol B3(10), 1988 i . Bio/Technol., 4, 954-58 (Ι98β)·

Ονο su bili pokužaji izolovanja Paktora VIII iz plazme upotrebon gel filtracije (J.Lab. Ciin. Med., 72,(6), 1968, 1007-1008 i J.Clin.Inveot., 48, 1969, 957-962). Velika purifikacija je pronadjena za vreme eksperimenata, ali su prino3i samo oko 40-50%. Pronadjeno je da čistoča dobijenog Faktora VIII koji sadrži frakcije zavisi od početne plazme, kako veliki sadržaj lipida i hilomikrona podižc zamučenont frakcije Faktora VIII koja ima nižu specifičnu aktivnost.

Zabeleženo je da tehnika gel filtracije koja je upotrebljena ne dozvoljava rokovanje velikim količinama plazme, iako uvodni eksperimenti pokazuju da gel filtraoija mnogo koncentrovanijc Cohn frakcije I izgleda moguča.

Osim ovoga, Paulssen et. ali (Thromb. Diathes.Haemorr. 22, 1969, 577-583) je nasao da Faktor VIII može biti separaI * tisan iz drugih proteina plazme upotrebom gel sredine Sefaro«. I · ze 6B, ali hromatografija upotrebom gel filtracije, samo izgle· da moguča u večem obirnu, kada je upotrebljen rastvoren kriotalog, kao početni matcrijal.

US patent br. 3,63?» 489 otkriva postupak za separaciju komponenti krvi koji koristi gel filtraciju i koristi porozne staklenc kuglice. Postupak je specijalno .odredjen za separaciju imunološki aktivnih materija iz drugih sastojaka, u serumu ili plazmi.

Od tada jo izvedeno nekoliko pokušaja da se gel filtracija upotrebi za purifikaciju Paktora VIII, ali su pokuša ji koncentrisani na gel filtraciju delimično purifikovane frakcije plazme (rastvoren kriotalog i njegove purifikovane frakcije). Svi pokušaji su izvedeni upotrebom raalog punjenja stubova i/ili malih protočnih brzina ili i jednog i drugog zajedno.

Gel filtracija kao postupak jša proteinsko deljenje na frakcije je poznata još od 1959.g. i bila je u širokoj upotrebi u biohemijskim laboratorijskim istraživanjima kao postupak za karakteriz^ciju proteina i za purifikaciju proteina iz uzoraka sa malim zaprerainama, npr. raonjim od 1 litar. Gel filtracija, do ovog pronalaska, nije bila u veliko j upotrebi u deljenju plazme na frakcije za separaciju proteina, jedina upotreba.je bila denalinacija etanola i soli iz albumin rastvo ra. Tako, kao što se može nači u referentnim knjigama!»Glavnfi razlog sašto gel filtracija nije postala glavnom tehnikom u deljenju na frakcije plazme je protok proteina po zapremini

3tuba . (J.II.Berglbf: Fractionation by Gel Filtration,

3tr. 163-173 u J.M.Curling (Ed.): tfethods of Plasma Protein Fractionation”, Acaderaic Press, London 1930) i Nažalost, proteinske mase kojima se nože rukovati sa razumnim veličinama stubova su male, i razblaživenje uzorka ne može biti za,nemareno. Zbog toga, postupak ni je mnogo u upotrebi u deljenju plazme na frakcije” (J. J.Morgenthaler ct al.:Preservation of struoture and function during isolation of human plasma proteina, str. 127-13θ u Šmit Sibinga et al.(Eds.): Plasma Fractionation end Blood Transfusion, Martinus Nijhoff Publiohers, Boston, 1985).

US patent br. 4,675» 385 otkriva postupak za izolaciju Faktora VIII prokoagulacionog protein_a iz preparata plazme koji obuhvataju Faktor VIII, saotojke visoke modularne težinc i sastojke male molekularne težine nizom hromatograf!je ograničene veličine vispke performance pripremanjem, u prvo j fazi, puferovanog vodnog sastava preparata plazme i separacijom sastojaka male molekularne težine unoženjem sastava hromatografskog 3tuba porozne tečne hromatografije slojeva visoke performance koji ima veličine od oko 13 mikrona do oko 35 mikrona i elutuje stub puferovanim vodnim eluaton. Da bi smo imali dobru separaciju US patent br. 4,675,385 uči upotrebi stubova koji imaju jedan aspekt odnosa ne monji od iaaedju 10 i 40 koji smanjuje kapacitet, ali ne osigurava dob*u separaciju proteina koji pokazuju aktivnost Faktora VIII:C iz drugih sastojaka preparata plazme iz preparata plazme koji se dobija izvodjenjem druge HPLC.

Tako je sve do ovog pronalaska generalno prihvačena činjenica da gel filtracija ni je pogodan postupak za separaciju proteina u deljenju na frakcije plazme, kada se ruku je večim zaprerainama, npr. iznad 5 litara.

Iznenadjujuce je soznanje da je kada je odabrani materi jal za gel filtraciju predvidjen za velike protoiSne brzine, moguče izolovati Faktor VIII u obliku čiste frakcijo i volikog prinosa direktno iz plazme vrlo pažljivom raehaničkoa eoparacijon, bez oolanjanja na normalno početno kriotoloženjo.

4. Opis rešenja. tehničkog problema

Predmet ovog pronalaska je’postupak za izolovanje Faktora VIII u oblil m. kompleksa Faktora VIII: C i vWF iz drugih proteina u krvnoj plazmiu upotrebom gel filtracije.

Postupak prema ovom pronalasku je karakteristikan po torno što jo izolovana plazma ili otopljena sveže srarznuta plazma podvrgnuta gel filtraciji pod uslovima grupne separacije upotrebom visokog punjenja i velike protočne brzine, sredina gel filtracije postaje konstituisana od čestica koje su inertne za Faktor VIII i imaju opseg deljenja na frakcije u intervalu od 1 x 10do 1 χ 10θ, ili još poželjnije od 1 x 10^ γ do 8 x 10 . Opseg deljenja na frakcije može biti npr. u intervalu od 5 x 10^ do 4 x 10⁷.

U poželjnom ostvaronju zapremina plazme koja je dodata je najmanje 5% od nataložene zapremine. Količina plazme koja je dodata je požel jno 15-40^ od nataložene zapremine.

Postupak prema pronalasku je poželjno izveden upotrebom protočne brzine od najmanje 0,3 nataložene zapremine na sat, najpoželjnije 0,5-2 nataložene zapremine na sat.

Za potrebe ovog pronalaska upotrebljena je sredina gel filtracije koja ima čvrstoču koja dozvoljava brzu eluta. ciju. Osim ovoga, gel mora biti hemijski i imunološki inertan za Faktor VIII za vreme gel filtracije. Eksperimenti če pokazati da postupak prema ovom pronalasku može biti izveden upotrebom komcrcijalnih gela kao što su: Sefaroza CL-4B, Sefaroza CL-6B, Sefaroza 4FF, Sefaroza 6FF, Sefakril S-400, Sefakril S-500, Fraktogel TSK IW-65(F) i Matreks Celufin CGL 2000 koji su odredjeni za svrhu ovog pronalaska. Ovi gelovi su generalno veličino cestice u intervalu od. oko 32um do ofto 200/nn

Prema jednom od ostvarenja postupka prema ovora pronalasku, smrznuta plazma je otopljena i to osigurava da su svi JPaktori VIII rastvoreni, nakon Sega se požoljno dodaje otopljena plasma stubu odmnh nakon Sto su svi Fdtfcori VIII rastvoreni. Temperatura ne sme da·raste previse da bi se izbegla ekstenzivna degradacija Paktora.VIII. Plazmi može biti prethodno dodat npr. heparin, citrat, saharoza, amino kiseline, soli ili drugi 3tabilizatori i poželjno može biti isfiItritsna, centrifugirana, koncentrovana uitrafiltracijom prethodno nataložena upotrebom uobičajenih sredstava za taloženje, ili može biti pripremljena na neki drugi način pre svog dodavanja stubu i to onoliko dugo da ne bi doSlo do uticaja na sadržaj Paktora VIII iz plazme.

Postupak prema ovom pronalasku pokazuje da daje visok prinos Paktora VIII. Tipično, iznad 70$ sadržaja iz Paktora VIII iz plazme jo nadoknadjeno u proizvodu, i postupak dajo porast do vrlo čistih proizvoda koji inaju specifičnu aktivnost od 1 do 4 IU Faktor VIII:C/mg proteina. Ovo se može deliraično pripisati činjenici da je upotrebom postupka prema ovom pronalasku Faktor VIII takodje separatisen iz proteolitičkih enzima, koji normalno mogu usrokovati propast Paktora VIII:C vrlo rano u postupku izolacije.

Postupak prema ovom pronalasku omogučava trotmnn velikih količina plazme pod uslovima gde je plazma primenjena upotrebom visokih punjenja i velikih protočnih brzina u gel filtraciji, dajuči porast do vrlo visokih, nadolcnada Faktora VIII visoka čistoče. Na ovaj način je ponudjen vrlo efikasan postupak za industrijsku primenu.

Faktor VIII koji -sadrži frakcije iz gel filtracije ili kombinovane frakcije iz više gel filtracija može biti koncentrovan i zatim purifikovan upotrebom tehnika poznatih per se, kao što su ultrafiltracija, taloženje, izmena jona, hromatof grafija afiniteta ili slične.

Preostali plazma proteini, kao sto ou albumin, imunoglobulini, protrombin kompleks, antitrombin III i drugi mogu takodje biti izolovani iz kasnijih. frakcija gel filtracije upotrebom tehnika poznatih per oe, kao ato su tnloženje sa alkoholom, FECZ-t&loženje, hromatograf i ja ili slične.

Odrodjivonje aktivnosti Paktora VIII može biti izvedeno upotrebom jediie od dvofazne ili jednofazne analize. Utvrdjeno je da jednofazna i dvofazna analiza mogu dati različitc rezultate u odredjivanju aktivnosti Paktora VIII:C u uzorku. Osim ovo ga, po znat o je da ponovljena o dre djivan j a upotrebom iste analize na istom uzorku može dati porast vari jaci ja u odredjivanju aktivnosti Paktora VIII:C.

Kako je ovde upotrcbljen izraz ^plazma” on predstavlja krv iz koje su sve krvne korpuskulč i platelete uklonjene npr. centrifugiranjem.

Paktor VIII:Ag οζηαδανα Paktor VIII u vezi 3a antigenom, i vWF-Ag von Willcbrend Paktor u vezi sa antigenom.

Nataložena zapremina je definisana kao napunjenn gel 3fcdina i intermedijama tečnost. Prazna zapremina je definisana kao zapremina pufera izmedju gel cestica, i elutovana zapremina je zapremina pufera koji je upotrcbljena za elutovanje specificnog materijala. Izraz napunjen stub je upotrebljen da označi zapreminu materijala dodatu sloju kalkulisanu kao procenat nataložene zapremine. Izraz opseg deljenja na frakcije označava opseg molekularnih težina (granula) proteina ili večih molekula za koje je preporučen gel materijal.

Postupak prema ovora pronalasku je, nadalje, objaenjen odgovarajučim črtečima i primerima objasnjenih ostvarenja ovog pronalaska. Primeri su samo za ilustraciju i ne mogu biti shvačeni kp.o ograaičavajuči prikaz pronalaska koji je definisan priloženim zahtevima.

Ovaj pronalazak je ilustrovan odgovarajučim priloženim crtežima u ko jima:

Crt, 1 prikazuje graficki prikaz elutovanja Faktora VIII gel filtracijom u skladu sa ovim pronalaskom odredjenim različitim analizama, i

Crt. 2 ilustruje poredak elutovanja različitih plazma proteina gel filtracijom u skladu sa ovim pronalaskora.

Primer 1

Gel filtracija plazme radi izolovanja Paktora VIII. Stub od 0 2,6 cm je napunjen Sefarozom CL-4B do konačne višine od 60 cm.

Smrznuta plazma iz danske banke krvi je otopljena na

25°C u vodenom kupatilu. Nakon dodavanja Ϊ IH, hcparina/ml ml (16$ nataložene zapremine) plazme je dodato stubu upotre bom protoka od 100 ml/hr, nakon čega je stub elutovan koristeci pojačani protok od 200 ml/h±r pufera, što odgonra brzini· od 0,63 nataložene zapremine na sat. Uravnoteženje stuba i elutovanje je izvedeno upotrebom pufera, 0,02 H citrata,

0,15 M NaCl, pH 7,4. Puferu je zatim dodato 2,55 ml IM CaCl?

2+ ' ^ά po litri dajuci Slobodan kalcijum jon (Ca ) konccntraciju -5 na oko 7 x 10 M. Koncentracija slobodnog kalcijum jona je proverena upotrebom kalcijum selektivne elektrode od Ingold GmbH (Frankfurt/Main, FUG). Frakcije su sakupljene, i za svaku frakciju ΟΡ₂θθ su odredjeni Faktor VIII:C (upotrebom i.jednofazne koagulacione analize i dvofazne hromogeničke analize) Faktor VIII:Ag, Albumin, IgG, fibrinogen, IgH, Alfa-2-makroglobulinglobulin, Faktor IX, Faktor X, protein C i antitrombin III. Kao što je protein izmeren sa elutoven sa molim maksimumom na prazno j zapremini (frakcijo 10-18) pračen veoma širokim maksimumom (frakcije 19-50 cf crt. 1). 82$ aktivnosti Faktora VIII :C koje je odredjeno dvofaznom i 91$ aktivnosti fakotra VII:C koje je odredjeno jednofaznom koagulacionom analižom je elutovano u jednom maksimumu agregata sa praznom zapreminom (Faktor VHI-glavna frakcija) zajedho sa rani j im malim protein maksimumom. Ostatak Faktora V.III je elutovan u manje vatnom sledečem maksimumu odmah do Falctora VHI-glavne. frakcije (frakcije 19-26). Faktor VIII:Ag i vWF:Ag su elutovani zajedno sa Fakt.orom VIII: C, ali ima ju nešto malo širi sledeči maksimum.

Svi drugi odredjeni plazma prateini.su elutovani u frakciju nakon Faktora VHI-glavne frakcije zajedno sa velikom širinom protein maksimuma (vidi crt. 2). Pitana proteini separatisani iz Faktora VIII:C su sledečih molekularnih težina:

Antitrombin III:	65,000 D
Protein C:	62,000 D
Faktor X:	59,000 D
Faktor IX:	57,000 D
Alf a-2-nakro globulin:	718,000 D
IgM:	900,000 D
Fibrinogen:	340,000 D
IgG:	150,000 D
Albumin:	67,000 I)

Odredjivanje aktivnosti Faktora VIII:C upotrebom dvofazne hronogeničke onalize je izvedeno koriščenjem hromogene substrat metode (KABI Coatcst Faktor Vlil), originalni metod koji koristi test cevi na 37°C je nodifikovon da se izvodi koriščenjem mikrolitarskih ploča sa smanjenos upotrebora reagenasa. 50 mikrolitarski uzorak ili standardni je upotrebljen, i on se nakon mešanja sa 75 raikrolitarskim rastvorom fosfol.ipida, Faktora ΙΧα, Faktora X i CaCl^ inkubira na 37°0 za 15 minuta, nakon čega je dodato 50 mikroli.ter_a substrata. Nakon dodatnih 20 minuta inkubacije na 37°C> reakcija je. ohladiena sa 50 mikrolitara 1 M limunske kiseline.

Razvoj boje se Sita na 405 nm referentna je na 492 nra.

Odredjivanje aktivnosti Faktora VIIIjC upotrebora jednofazne analize je izvedeno upotrebom APTT-postupka (Activntod Partinl Thromboplastin Tine). 100 raikrolitara uzorka ili etandardnog je pipotovono w kuvete, nakon Sega je dodato 100 raikrolitara nepotpune* plazme (Faktor VIII nepotpuno plazme, generalno dijagnostiški), i rastvor je držan na 37°C za 5 minuta. Nakon dodavanja 100 raikrolitara 0,03 M CaClg, odredjeno je vreme koagulacije rastvora.

Za brojna odredjivnnja napravljene su knlibricnnc kri ve koje su kalibrisano na bazi serije razblaživanja prema V?HO standardu (3rd Int. Standard FVIII, ljudska plazma, 3,9 KJ/ral). Dvofazna analiza ovde opisana, ima nižu (oko 10 puta) granicu detekcije od jednofazne analize. Dodavanjera hcpi.rina unapredjujo se upotreba dvofazne analize, kao sto se raoguci uticaj heparina na cnalizu može ukloniti jednostavnim razblaži vonj era.

Faktor VIII:Ag je odredjen upotreboa ELISA koji koristi antitela iz Faktora VIII inhibitor pacijenta koji upotrcbljava raatorijal za presvlacenje raikrotiter ploce(Nunc, Karastrup, 4000 Roskilde, Denska) i upotrebljava peroksidazu obeleženih F(AB’)₂ fragmenata iz istog inhibitor pacijenta za odredjivrnjo veze faktora VIII (Thromb. Ilaemost., 53(3)» 1985, 346-350). Standardne krive su proizvedene upotrebora normalne plazme knlibrisane prema MIO standardu (1. IRP, osnovan 1932).

vWF:Ag ja takodje odredjen koriščenjem ELISA, ali upotrebora zečijeg anti-čovečijeg vWF (DAKO, Danska) kao materijal za presvlacenje i peroksidaze obeleženog zošjeg antiSovcSijeg vV? (DAKO, Danska) za odrodjivanje veze vMF. Standardne krive su proizvedene upotrebora iste normalne plazme kao kod Faktora VIII:Ag ELISA.

Faktor IX je. odredjen jednofaznom koagulacionon analizom, na. analogni način kao Faktor VIII:C samo koristeči Faktor IX nepotpune plazme. IgG je odredjen upotrebom radijalne imunodifuzije. (Imunochemistry, 2, 1965» 235-254) i· albumin, fibrinogen, elfa-2-makroglobulin, Faktor X, protein C i anti-trombin III su odredjeni .upotrebom imunoelektroforeze (Anal.Biochem., 15, 1966, 45-52). ΟΒ^θθ °člredjen upotrebom spektrofotometra (Spectronic 601 od Milton Roy Company), i protein, upotrebom Kjeldahl, je odredjen prema Ph. Eur. 2. Ed., I, V.3«5.2 bez talozenja s_a TCA. Specifična aktivnost purifikovonih frakcija jc izračunata kao odnos koncentracije Faktora VIII:C prema Οϋ^θθ P^rcmn koncentraciji proteina odredjenog upotrebom Kjeldahl. Kada koristimo 0D₂y₀ za računanje specifične aktivnosti, rezultati različitih eksperinenata nisu direktno upoiedivi, osim kada upotrebljavamo istu početnu pln.zmu, pošto je frakcija koja sadrži Faktor VIII često nutna, vidi rezultate Ratnoff et al.

(J.Clin.Invest., 48, 1969, 957-962).

Različita sredstva gel filtracije upotrebljena u eksperimcntima su od sledečih izvora:

Sefaroza CL-6B, Sefaroza CL-4B, Sefaroza CL-2B, Sefaroza 6FF, Sefaroza 4FF, Sefakril S-400, i Sefakril S-500 koji su iz farmacije (Hillcrjžfd, Danska), Biogel A-5m, Fine je iz BioRad (Bie i Bemtsen, R/dovre, Donska), Fraktogel TSK HW-65(F) jo iz Merck (Struers, R/dovre, Danska) i Matreks Celufin GCL 2000 je iz Emicon (Helsingborg, Švedska).

Primer 2

Gel filtracija plazme do izolovanog faktora VIII upotrebom različitih. sredstava gel filtracije.

Stub 0 2,6 cm je napunjen različitim sredstvima gel filtracije koji imaju različit opseg deljenja na frakcije i različite strukture. U svim slučajevima finalna višina napunjenog taloga je 60 cm. Plazma je otopljena kao što je opisano u Primeru 1 i dodat je 1 IU heparina na ml. Za svako sredstvo gel filtracije stub> je napunjen sa 50 ml plazme (16$ nataložene zapremine). Punjenje stuba i elutovanje sa puferom je izvedeno kako je opisano u Primeru 1. ^rotočna brzina je usvim slučajevima ista kao u Primeru 1ψ osim za eksperiment koji koristi Biogel A-5m, gde je protočna brzina niža od 50 ml/sat zbog porasta povrstnog pritiska. Frakcije su sakupljene i za svaku frakci juOD^ i Faktor VIII:0, upotrebom koatesta, su odredjene. Specifična aktivnost Faktora VIIIglavne frakcije je izračunata kao odnos Faktora VIII:C/ml sa 0^280’ ^^sP^er^^men^i ³¹¹ ponovljeni n puta upotrebom različitih; plazmi za Svako punjenje i izračunate su: srednje vrednosti prinosa i specifične aktivnosti. Faktor VHI-glavne frakcije je odabran na isti način kao u Primeru 1, i prinna je sadržaj Faktora VIII:C u Faktoru VHI-glavne frakcije kao procentualni sadržaj faktora VIII:C dodate plazme.

Opseg deljenja na frakcije i veličine čestica za različita sredstva i izračunate srednje vrednosti se nalaze u

Tabeli I

Tabela 1

— Gel fil. . sredstvo	Opseg deljenje na' frakcije MW	Kroj $ksp_er. n	J----- Prinos u %	Spec. aktivn.	Veličina. ‘čestica ·. .'u. μπι
A i	1X10* - 4XlO6	3	95	0.16	40-165
B	6x10* - 2xl07	4	82	0.88	40-165
C	7Χ105 - 4Χ107	3	68	9* 0.24	60-200
D	1x10* - 4XlO6	3	96	0.71	40-165
E	6X10* - 2xl07	3	86	1.35	40-165
F	6x10* - '8xl07	3	91	0.28	40-105
G	1x10* - 5xl06	1	71	0.12	40-80
H	5x10* - 5xl06	2	84	0.18	32-63
I	1x10* - 3x106	Z	92	0.18	45-105
1 J	1x10* - 8Χ106	3 J	101 J	0.75 J	40-105 1 1

A: Sefaroza CL-6B; B: Sefaroza CL-4B; C: Sefaroza CL-2B; D: Sefaroza 6FF; B: Sefaroza 4FFj F: Sefakril S-500; G: Biogel A-5m Fine;H: Fraktogel TSK HW-65 (F);

I: Hatreks Celufin GOL 2000; J: Sefakril S-400

Primer 3

Gel filtracija plazme do izolacije Faktora VIII upotrebom raziičitih punjenja otuba.

Stub 0 2,6 je napunjen Sefarozom 4FF do finalne višine od 60 cm. Plazma je- otopljena fiao u Primeru 1. Nakon otapanja, pil plazme je podeseno do 7»0 upotrebom 0,5 M HC1, 1 IU heparina po ml je dodato i plazma je isfiltrirana kroz 10 mikrometarski najlonski filter. Stubu je dodato 30 ral, 40 ml, 50 ml, 60 ral i 70 ml plazme. Dodatak, protok i elutovanje upo trebom pufera jo izvedeno kao sto je opi3anQ u Primeru 1, iako je pufer podeaen na 7»0. Frakcije su sakupljene, i za svaku frakciju ^{i Falcfcor VIIIsC} upotrebom koatesta su odredjeni. Specifična aktivnost Fnktora VHI-glavne frakcije je izračunata kao odnos Faktora VIII:C/ml sa θθ₂θθ. Eksperimenti su ponovljeni tri puta upotrebom tri razliČite plazme za svako punjenje i srednje vrednosti (x) su izračunate. Zapremina Faktora VHI-glavne frakcije (ml) je zapremina frakcije koja sadrži faktor VIII, koji može biti sakupljcn pre širokog proteinskog maksimuma (θ^Βο^ elutovan i odabran na isti način kao što je opisano u Primeru 1. Prinos je sadržaj Faktora VIII:C u Fektoru VHI-glavne frakcije kao procentualni sadržaj Faktora VIII:C dodate plazme.

Dobljeni rezultati se nalaze u Tabeli II

J. ο

Table II

Dodata količina	Factor VIII glavne· frake, tt ml	ar-iho s -u * %	Specific aktivnost
ul . 1 ml i j	dela * » ·· * . latalož. saprem:	* · br.
		1	70	88	0.81
		2	70	95	0.18
30	9.4	3	70	90	0.63
		X	70	91	0.54
		1	70	76	0.68
		2	70	85	0.17
40	12.6	3	70	93	0.61
		X	70	85	0.49
		1	80	91	0.57
		2	80	90 '	0.20
50	15.7	3	80	85	0.53
		X	80	89	0.43
		1	80	79	0.81
		2	80	85	0.16
60	18.8	3	90	95	0.61
		X	83	86	0.53
		1	80	85	0.82
		2	100	90	0.21
70	22.0	3	100	93	0.53
		X	93	89	0.52

Primer 4

Gel filtracija plazme do izolacije Faktora VIII upotrebom razliČitih vrednosti elutovanja.

Istom stubu koji je upotrebljen u Primeru 3 je dodato 50 ml plazme otopljene kao sto je prethodno opisano. Nakon otapanja, pff plazme je podešeno na 7,0 upotrebom 0,5 M HC1, 1 IU heparin/ml je dodat, i plazma je isfiltrirana kroz 10 mikrometarski najlonski filter. Upotrebom tri različita dela plazme protočne brzine od 100, 200 i 300.ml/sat su isprane. Isti protok je koriščen za vreme dodavanja plazme i pratečeg elutovanja. Elutovanje je izvedeno upotrebom istog pufera kao što je opisano u Primeru 3· Frakcije su sakupljene i za svaku f rakci ju OD^ i Faktor VIII :0 upotrebom koatesta su odredjeni. Specifična aktivnost i prinos u Faktoru VIIIglavne frakcije su izračunate kao u Primeru’ 3· -Srednje vrednosti (x) zapremine Faktora VHI-glavne frakcije, prinos i specifična aktivnost su izračunate. Rezultati se nalaze ur Tabeli III.

Tabela III

Protok ml/. natžiložT sat zaprem.	Plasma ideo . No.	Factor VIII glav.: frake. ml	Prinos te. %	Specifič aktivnost
	na sat
		1	80	89	0.75
		2	80	88	0.17
100	0.31	3	80	80	0.65
		X	80	86	0.52
L '	*' i	1	80	84	0.99
		2	80	88	0.18
200	0.63	3	80	89	0.79
		X	80	87	0.65
		1	70	, 85	0.72
		2	80	96	0.18
300	0.94	3	80	83	0.44
		X	77	88	0.45

Primer 5

Gel filtracija plazme do izolovanja Paktora VIII upotrebom· različitib punjenja stuba.

Stub jžf 10 cm je napunjen Sefarozom 4PP do finalne višine od 60 cm. Smrznuta plazma iz danske banke krvi je otoplje na na 30°C u vodenom kupatilu. 925 grama, odnosno 1497 grama i 2000 grama je dodato stubu. Protok se drži na oko 4200 ml/ sat za vreme dodavanja i elutovanja plazme upotrebom Masterfleks pumpe (Bucli i Holm, Herlev, Danska) što je odgovarajuče za 0,89 nataložene zapremine na sat. Z2a elutovanje je upotrebljen isti pufer kao što je opisano u Primera 1. je pracen kontinualno upotrebom Farmacija monitor UV-1. Kada ^0D280 da raste na praznu zapreminu^ sakupljanje

Paktora VIH-glavne frakcij« poč in je i to pre staje kad_a θ·°28θ pokazuje da veliki proteinski maksimum; poč in je da se elutuje.

U Paktoru VIH-glavne frakci je sadržaj Paktora VIII s 0 je odredjen upotrebom jednofažne koagulacione analize?, i proteini je odredjen upotrebom Kjeldahl. Specifična aktivnost je izračunata kao odnos ukupnog broja jedinica Paktora VIII:C u Paktoru VIH-glavne frakcije sa ukupnim brojem miligrama proteina u Paktoru VIH-glavne frakcije. Prinos Paktora VIII:0 je izračunat kao sadržaj Paktora VIII:0 u Paktoru; VIH-glavne frakcije u procentima sadržaja Paktora VIII:C u dodatoj plazmi

Rezultati se nalaze u Tabeli IV.

Tabela IV

Dodata količina.plazme	Factor VIII glavne frake, u gramima	Prinos u %	Specific aktivnost IU/mg
u gramima	% nataloži, zauremine
925	19.6	1192	74	2.50
1497	31.8	1860	73	2.24
2000	42.4	2200	81	1.08

Primer 6

Gel filtracija plazme do izolovanja Faktora VIII upotrebom stuba industrijskih razmera.

Stub 0 29 cm je napunjen Sefarozom 4PP. Nakon uravnoteženja upotrebom istog pufera kao Sto je u Primeru 1 višina gela je 53 cm. 10 kilograma smrznute plazme iz danske banice krvi je otopljeno i zagrejano do 3G°C, nakon cega je dodato stubu. Dodata količina se sastoji od 28,8% nataložene zapreminc. Upotrebom Masterfleks pumpe, protok od 30 litara na sat, što odgovara za 0,86 nataložene zapremine na sat, se o država za vreme dodavanja i elutovanja upotrebom ravnotežnog pufera. θ·°28θ *^^e P°^snKrtran kontinualno upotrebom farmacija monitor UV-l, i u vreme prve indikacije porasta u Οϋ^θθ na praznu zapreminu, Palctor VHI-glavne frakcije je sakupljen. Ukupno 11,73 kilograma Paktora VHI-glavne frakcije je sakupljeno. Zatim je sadržaj Paktora VIII:C odredjen upotrebom jednofazne koagulacione analize i protein je odredjen upotrebom Kjeldahl. Ukupno 8798 IU Faktora VIII:C i man je od 2346 miligrama proteina je nadjeno u Paktom VHI-glavne frakcije dajuči prinos Paktora VIII:C od 880 IU/kilogram plazme što odgovara za .88% prinosa u obliku proizvoda koji ima specifičnu aktivnost više od 3»75 IU/kilogram proteina.

t

Faktor VHI-glavne frakcije dobi j en u skladu sa postupkom prema pronalasku može zatim biti očiščen na način aralogan konvencionalno j purifikaciji rastvorenog kriotaloga koji obuhvata npr. hromatografoku purifikaciju i liofilizaci ju, upotrebom uobičajenog vezivnog sredstva, radi stvarahja stabilnog preparata. Preparat je rekonstruisan pre upotrebe, koriščenjem pogodnog konvencionalnog prenosioca.

Claims (8)

1. PATENTNI ZAHTEVKI

   1. Postopek za izoliranje faktorja VIII od drugih proteinov v krvni plazmi z uporabo sredstva za gelsko filtracijo, označen s tem, da krvno plazmo izpostavimo gelski filtraciji pri pogojih skupinske separacije, kjer uporabimo veliko polnjenje in veliko pretočno hitrost, pri čemer je sredstvo za gelsko filtracijo sestavljeno iz delcev, ki so inertni za faktor VIII in imajo območje frakcioniranja v intervalu od 1 χ 10³ do 1 xl0⁸.
2. 2. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da je sredstvo za gelsko filtracijo sestavljeno iz gelnega materiala, ki ima območje frakcioniranja v intervalu od 1 χ 10⁴ do 8 χ 10⁷.
3. 3. Postopek po zahtevku 2, označen s tem, da je sredstvo za gelsko filtracijo sestavljeno iz gelnega materiala, ki ima območje frakcioniranja v intervalu od 5 χ 10⁴ do 4 χ 10⁷.
4. 4. Postopek po enem od zahtevkov 1-3, označen s tem, da je volumen dodane plazme vsaj 5% volumna blazine.
5. 5. Postopek po zahtevku 4, označen s tem, da je volumen dodane plazme vsaj 15-40% volumna blazine.
6. 6. Postopek po enem od zahtevkov 1-5, označen s tem, da je pretočna hitrost vsaj 0,3 volumna blazine na uro.
7. 7. Postopek po zahtevk 6, označen s tem, da je pretočna hitrost vsaj 0,5-2 volumna blazine na uro.
8. 8. Farmacevtski pripravek, ki vsebuje faktor VIII, ki je izoliran v skladu s postopkom po enem od predhodnih zahtevkov 1-7.