SI24316A - Antagonisti toll-u podobnega receptorja 4 (TLR-4), odkriti z virtualnim rešetanjem - Google Patents

Abstract

Izum predstavlja proces odkrivanja in uporabo spojin, ki se vežejo na protein TLR-4, motijo tvorbo kompleksa TLR4-MD-2 in pri tem izražajo antagonistično delovanje. Slednje pomeni, da preprečijo delovanje naravnih ligandov TLR-4 kot je LPS in signalizacijo, ki jo sproži tovrstna vezava na omenjeni receptor. Omenjene spojine imajo potencialno rabo v terapevtskem smislu kot zdravila za preprečevanje bolezenskih stanj, povezanih s prekomernim delovanjem TLR-4, kot je npr. sepsa in druge vnetne bolezni.

Description

Antagonisti toll-u podobnega receptorja 4 (TLR-4), odkriti z virtualnim rešetanjem OPIS IZUMA

A. PODROČJE TEHNIKE, NA KATEREGA SE IZUM NANAŠA

Predloženi izum spada na področje farmacije in se nanaša na spojine, ki se vežejo na protein TLR4 in preprečijo vezavo molekul, ki preko kompleksa MD-2/Toll-like receptor (TLR)-4 aktivirajo elemente prirojenega imunskega odziva. Značilnost spojin je, da se s pomočjo neko val entnih, polarnih interakcij specifično vežejo na protein TLR4 in tako preprečijo tvorbo kompleksa TLR4-MD-2. Na tak način omenjene spojine preprečijo imunsko aktivacijo v kontekstu TLR-4, ki spada med poglavitne mehanizme bolezni povezanih z imunskim neravnovesjem. To velja zlasti za sistemske infekcije s po gramu-negativnimi bakterijami, kar vodi v sepso in druga imunsko-pogojena patološka stanja.

B. PRIKAZ PROBLEMA, KI GA REŠUJE IZUM

Prirojena imunost in toll-u podobni receptorji

Prirojena veja imunskega sistema predstavlja prvo obrambno vrsto pri zaščiti organizma pred patogenimi mikroorganizmi. Poglavitni receptorji, ki modulirajo odziv prirojene imunosti spadajo v družino, ki prepoznava molekulske vzorce oz. »pattem recognition receptors« ali PRRs. Navkljub dejstvu, da prirojena imunost ne deluje specifično na določen antigen, je njena prednost v hitrem in močnem imunskem odzivu, ki nastane, ko receptorji PRR prepoznajo molekulske vzorce, ki so povezani s patogeni (pathogen associated molecular pattems ali PAMPs). V tej skupini igrajo toll-u podobni receptorji (TLR) ključno vlogo in so en poglavitnih PRR. Toll-u podobni receptorji namreč prepoznavajo številne različne PAMP, ki izvirajo iz bakterij, virusov, gliv, kot tudi parazitov (Kawai, Immunity, 2011).

Toll-u podoben receptor 4 (TLR-4)

Do danes smo pri ljudeh prepoznali že več kot 10 vrst receptorjev TLR. Med temi je TLR-4 vsekakor najbolje preučen. Zelo zanimiv je tudi v kliničnem smislu, saj so mehanizme signalizacije preko TLR-4 povezali s številnimi bolezenskimi stanji, ki so povezana z imunskim sistemom. Receptor TLR-4 se nahaja na celični površini kjer prepozna številne PAMP kot je npr. lipopolisaharid (LPS) (Akira, Celi, 2006). Prepoznava LPS vodi v heterodimerizacijo TLR-4 in pomožnega proteina MD-2 (myeloid differentiation factor-2), kar rezultira v znotraj celično signalizacij sko kaskado pri čemer se aktivirata poti povezani tako s proteinom Myd88 kot s TRIF (Kawai, Nat Immunol, 2006). Slednje vodi v aktivacijo jedrnega dejavnika Nf-κΒ in aktivacijo transkripcijskega dejavnika IRF-3. Končni rezultat omenjene kaskade je prepis številnih vnetnih genov ter aktivacija celic prirojene imunosti med katere sodijo pomembni akterji kot so makrofagi ter dendritične celice.

Klinični pomen TLR-4

Pravilno delovanje TLR-4 ter odziv na vezavo endotoksinov (LPS) je ključnega pomena za zaščito organizma pred po gramu-negativnimi patogeni. Imunski procesi, ki se inducirajo ob akti vacij i TLR-4 (sproščanje vnetnih citokinov in aktivacija imunskih celic) so namreč ključni za obrambo pred infekcijami in poškodbami, ki so s tem povzročene. Vsekakor pa lahko nepravilno oz. prekomerno delovanje TLR-4 povzroči pretiran odgovor imunskega sistema, kar so že v več primerih povezali s številnimi bolezenskimi stanji pri ljudeh, kot sta sepsa in nevropatska bolečina (Wittebole, Mediators Inflamm, 2010; Guo, Cellular and Molecular Life Sciences, 2007). Pri slednjih je zlasti pogostost sepse v svetu ključen razlog, ki postavlja zahteve po razvoju novih pristopov v zdravljenju. Število smrtnih primerov, ki so povezani s sepso je v Ameriki prb. 250 000 letno ter 200 000 letno v Evropi. Smrtnost pri ljudeh, ki razvijejo septični šok je več kot 50-odstotna (Angus, Crit Čare Med, 2001). Omenjeni razlogi predstavljajo TLR-4 kot idealno terapevtsko tarčo za nove imunomodulatome učinkovine.

Tehnični problem

Najpomembnejši cilj izuma je bilo odkritje novih učinkovin, ki bi se specifično vezale na protein TLR4 in bi nanj delovale antagonistično.

C. PODATKI O STANJU TEHIKE

Stanje tehnike na področju sinteznih zaviralcev MD-2/TLR4 opisujejo naslednji primeri:

Hedayat et al., Medicinal Research Reviews, 2012. 32: 294-325

Henessy et al., Nat Rev Drug Disc, 2010. 9: 293-307

O'Neill et al., Pharmacol Rev, 2009. 61: 177-197

Kondo et al., Trends Immunol, 2012. 33: 449-458

Connoly et al., Curr Op Pharmacol, 2012. 12: 510-518

Kang et al., Annu Rev Biochem, 2011. 80: 917-941

Makkouk et al., Immunopharmacol & Immunotoxicol, 2009. 31: 331-338

Bowen et al., Sci Signal, 2012. 5

Keogh et al., Trends Pharmacol Sci, 2011. 32: 435-442

Jin et al., Immunity, 2008. 29: 182-191

Horscroft et al., J Antimicrobial Chemotherapy, 2012. 67: 789-801

Chavez et al., J Med Chem, 2011. 54: 4659M669.

Matsunaga et al., Mol Pharmacol 2011. 79: 34-41.

• · · • ·

E. PODROBEN OPIS IZUMA Z IZVEDBENIMI PRIMERI IN SKICAMI

Izum opisujejo naslednje slike/grafi:

Slika 1. Mesta vezave na proteinu TLR4 za spojino 1 (A), spojino 2 (B) in spojino 3 (C) kakor jih je predvidel LeadIT. Predvidene polarne interakcije (A in B) so prikazane s temno prekinjeno črto.

Slika 2. Inhibicija z LPS izzvane sekrecije TNF-α iz PBMC-jev s 100 μΜ koncentracijo spojin, ki so predmet patenta. Statistično signifikantno razliko med posamezni pari (tretirane celice glede na LPS kontrolo) smo določili z neparnim Študentovim t testom. (*** - p<0.001) Slika 3. Preliminarni test vezave spojin na imobiliziran TLR4. Vsako spojino smo uporabili v dveh različnih koncentracijah (20 μΜ (črno) in 200 μΜ (rdeče)). Prikazani so senzorgrami za spojino 1 (A), spojino 2 (B) in spojino 3 (C). Vidna je vezava vseh treh spojin pri 20 μΜ koncentraciji. Pri višji koncentraciji spojini 2 in 3 tvorita agregate zaradi slabše topnosti.

Predmet predstavljenega izuma so spojine, ki se vežejo na protein TLR-4 in pri tem izražajo antagonistično delovanje. Slednje pomeni, da preprečijo delovanje naravnih ligandov TLR-4 kot je LPS in signalizacijo, ki jo sproži tovrstna vezava na omenjeni receptor. Natančneje, predmet predstavljenega izuma opisuje odkritje novih antagonistov receptorja TLR-4, ki imajo potencialno rabo v terapevtskem smislu kot zdravila za preprečevanje bolezenskih stanj, povezanih s prekomernim delovanjem TLR-4, kot je npr. sepsa in druge vnetne bolezni. Nove spojine, ki so predmet izuma, so predstavljene s formulo in imenom 1UPAC:

o

NH;

spojina 1

spojina 3

Spojina 1: l-(4-fluorofenil)-2-(5-(2-hidroksi-5-metoksibenzoil)pirimidin-2-il)gvanidin Spojina 2: 6-((2-(benzo[djtiazo 1 -2-il)pirolidin-1 -il)metil)-/V2-(o-tolil)-1,3,5-triazin-2,4-diamin

Spojina 3: 2-(metil((4-okso-6-fenil-3,4-dihidrotieno[2,3-d]pirimidin-2-il)metil)amino)-A^r-(4morfolinofenil)acetamid

Predloženi izum temelji na podlagi intezivnih interdisciplinarnih študij razvoja in kvantifikacije novih ligandov TLR-4 in je ponazorjen z naslednjimi neomejujočimi primeri:

Primer 1:

Postopek odkrivanja novih antagonistov TLR4

Dosedanji pristopi reševanja tehničnega problema se niso ciljano lotevali inhibicije interakcije med TLR4 in MD-2, oziroma so uporabljali spojine, ki se vežejo bodisi v področje MD-2 bodisi v intracelulamo domeno na proteinu TLR4. V literaturi so sicer objavljene spojine, ki se domnevno vežejo v področje stika med TLR4 in MD-2, vendar spojine izkazujejo citotoksičnost na celični liniji HEK-293. Iz kristalne strukture kompleksa TLR4-MD-2 je razvidno, daje površina TLR4, kije v stiku s proteinom MD-2, dolgo in ozko področje z dimenzijami 40 * 20 A. Povezava med proteinoma poteka preko številnih polarnih interakcij, med katerimi sta najpomembnejši vodikovi vezi arginina 106 na proteinu MD-2 s serinom 183 in asparaginsko kislino 209 na proteinu TLR4. Razrešena kristalna struktura kompleksa in znanje o ključnih aminokislinah pomembnih za interakcijo je omogočila struktumo-podprto načrtovanje novih antagonistov receptorja TLR4. Spojine, definirane v tem izumu, smo odkrili s pomočjo struktumo-podprtega virtualnega rešetanja knjižnic? ZINC, ki vsebuje 11,3 milijona zdravilom-podobnih spojin. Uporabili smo programsko opremo LeadIT, ki je vsako izmed spojin iz virtualne knjižnice umestila v področje stika TLR4-MD-2 in ocenila njihovo interakcijo. Pri različnih proizvajalcih smo pridobili spojine, za katere je program LeadIT predvidel močno interakcijo s proteinom TLR4. Predvidene ocene vezave za spojine, ki so predmet tega patenta, so prikazane v tabeli 1. Mesto vezave, kakor gaje predvidel program LealTje razvidno na sliki 1.

*

Primer 2:

Biološko oceno delovanja vseh 3 spojin v smislu antagonizma LPS na TLR-4, smo določili z uporabo komercialne celične linije HEK-Blue ™ hTLR-4 podjetja Invivogen. Gre za HEK 293 celično linijo, ki je ko-transficirana s humanimi proteini TLR-4, MD-2, CD14 ter inducibilno fosfatazo SEAP (secreted embryonic alkaline phosphatase). Gen za SEAP je vezan na vezavna mesta za transkripcij ska dejavnika Nf-κΒ ter AP-1. Aktivacija TLR-4 tako vodi v prepis in ekspresijo SEAP, katere stopnjo v supematantu celičnih kultur lahko določimo s kolorimetričnimi metodami (Quanti-Blue ™, Invivogen). Antagonizem spojin smo v tem smislu določali na način, da smo HEK-Blue ™ hTLR-4 celice predhodno tretirali z različnimi koncentracijami raziskovanih spojin. Po 2 urah predinkubacije pri 37 °C , smo v celične kulture dodali LPS in celice gojili nadaljnih 20 ur. Inhibicijo vezave LPS na TLR-4 smo posledično določili s kvantifikacijo SEAP v supematantu kultur po 20-ih urah. Inhibicijske konstante (IC)₅₀ spojin smo izračunali na podlagi njihove sposobnosti, da inhibirajo izločanje SEAP v supematante celičnih kultur, kar se je pokazalo kot zmanjšana vrednost absorbance. Za izračun smo uporabili funkcijo analize rezultatov z nelinearno regresijo. Vse postopke v testu smo opravili po navodilih proizvajalca (Invivogen). Kot pozitivno kontrolo antagonizma smo izbrali komercialno dostopen TLR-4 inhibitor TAK-242 (Invivogen). Vrednosti (IC)₅₀za spojine, ki so predmet tega patenta, so prikazane v tabeli L

Primer 3:

Za nadaljno biološko oceno antagonistične aktivnosti spojin smo uporabili test določanja citokinov v supematantih kultur levkocitov izoliranih iz periferne krvi (PBMC - peripheral blood mononuclear celiš). Celice PBMC smo izolirali iz krvi prostovoljnih darovalcev na Zavodu RS za transfuzijsko medicino, v soglasju s pravili zavoda. Celice smo nato predinkubirali s spojinami 1, 2 in 3 pri koncentraciji ΙΟΟμΜ za 2 uri in jih nato izpostavili LPS v obdobju 48 ur. Za pozitivno kontrolo antagonizma smo uporabili komercialno dostopen inhibitor signalizacije TLR-4, spojino TAK-242 (Invivogen). Po 2 dneh smo odvzeli celičr j supematante ter jih analizirali za prisotnost vnetnega citokina tumorje nekrotizirajočega dejavnika (tumor necrosis factor - TNF)-a (slika 2). Nivo citokina smo določili z metodo ELISA (Biolegend). Odstotki inhibicije sekrecije TNF-α za spojine, ki so predmet tega patenta, so prikazani v tabeli 1.

Tabela 1. Biološki rezultati in ocena vezave programa LeadIT.

Spojina	IC50 (μΜ) ± SEM	% inhibicije sekrecije TNF-α pri koncentraciji 100μΜ	LeadIT (kcal/mol)	ocena
1	16.6 ± 1.2	87.4	-31.70
2	64.1 ± 1.4	80.8	-30.83
3	167.5 ±1.4	93.3	-25.42

Primer 4:

Spojine, z zgoraj opisanimi lastnostmi, se specifično vežejo na protein TLR4. Poskus vezave smo izvedli s pomočjo površinske plazmonske resonance (SPR). Uporabili smo instrument Biacore T100 (GE Healthcare) opremljen s čipom Series S Sensor chip CM5 (GE Healthcare). Za imobilizacijo proteina smo uporabili HBS-EP pufer (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0.005% P20, pH 7.4). TLR4 smo na čip vezali kovalentno preko aminskih skupinah p j navodilih proizvajalca čipov. Površino čipa CM5 (pretočni celici 1 in 2) smo aktivirali z 12minutnim pulzom mešanice 0.4 M l-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimida in 0.1 M Nhidroksisukcinimida po navodilih proizvajalca. Rekombinantni človeški TLR4 (R&D Systems) smo raztopili v 10 mM acetatnem pufru (pH 5.0), do končne koncentracije 200 pg/ml in injicirali dvakrat po 600 s preko druge pretočne celice. Obe celici smo blokirali z 7 minutnim pulzom 1.0 M etanolamina. Končni nivo vezave po deaktivaciji obeh celic je bil približno 8000 RU. Presejalni test smo izvedli pri 25 °C z uporabo PBS (10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 2 mM KC1,, pH 7.4) in dodanim 2% DMSO (Merck) kot nosilnim pufrom. Vse 3 aktivne spojine iz celičnih testov smo preizkusili pri 2 različnih koncentracijah, pri 20 μΜ in 200 μΜ. Vsako spojino smo vbrizgavali 1 minuto pri pretoku 30 μΐ/min in disociacijo spremljali 30 sekund. Površine nismo regenerirali, smo pa po vsakem injiciranju pustili pretok pufra 30 sekund, da se je površina stabilizirala. Primerjali smo odzive spojin z odzivom pufra in ugotovili, da vse 3 spojine izkazujejo afiniteto do proteina TLR4 (slika 3). Spojina 1 je bila topna tudi pri koncentraciji 200 μΜ, medtem ko sta spojini 2 in 3 pri višji koncentraciji tvorili agregate.

NAČIN INDUSTRIJSKE ALI DRUGE UPORABE IZUMA

Spojine, ki so predmet tega patenta, se uporabljajo za pripravo zdravil, ki delujejo antagonistično na receptor TLR4. Zdravila s farmakološko učinkovito vsebnostjo spojin, ki so predmet tega patenta, se uporabljajo za zdravljenje bolezni, za katere je značilen prekomeren imunski odziv preko receptorja TLR4, kot sta sepsa in nevropatska bolečina.

Claims (5)

1. Spojine, označene s strukturno formulo, spojina 3 in imenom IUPAC:

Spojina 1: l-(4-fluorofenil)-2-(5-(2-hidroksi-5-metoksibenzoil)pirimidin-2-il)gvanidin Spojina 2: 6-((2-(benzo[d]tiazol-2-il)pirolidin-l-il)metil)-A₂-(o-tolil)-l,3,5-triazin2,4-diamin

Spojina 3: 2-(metil((4-okso-6-fenil-3,4-dihidrotieno[2,3-d]pirimidin-2il)metil)amino)-A-(4-morfolinofenil)acetamid, z antagonističnim delovanjem na receptor TLR4.

2. Spojine s strukturo in imenom IUPAC po zahtevku 1, označene s tem, da se uporabljajo kot terapevtsko učinkovite snovi.

3. Uporaba spojin s strukturo in imenom IUPAC po zahtevku 1 za pripravo zdravil, ki delujejo antagnonistično na receptor TLR4.

4. Uporaba spojin s strukturo in imenom IUPAC po zahtevku 1 za pripravo zdravil, ki se uporabljajo za za zdravljenje bolezni, za katere je značilen prekomeren imunski odziv preko receptorja TLR4, kot sta sepsa in nevropatska bolečina.

5. Farmacevtski pripravki označeni s tem, da vsebujejo terapevtsko učinkovito množino spojin s strukturo in imenom IUPAC po zahtevku 1 in farmacevtsko sprejemljive pomožne snovi.