SI21661A - Postopek za evaluacijo deleža hibridnih celic in celičnih izdelkov s konfokalno mikroskopijo in avtoklavabilna elektrofuzijska kamrica - Google Patents

Abstract

Predmet izuma, ki sodi v področje biomedicinske tehnologije, je postopek za evalvacijo deleža hibridnih celic in celičnih izdelkov - hibridomov v celični vakcini, ki obsega meritve površine kolokaliziranih pikslov v sliki, posneti z večkanalnim konfokalnim mikroskopom in avtoklavabilna elektrofuzijska kamrica, namenjena za večkratno uporabo pri pripravi hibridomskih celic. Postopek za kvantifikacijo deleža hibridnih celic omogoča ocenjevanje deleža hibridnih celic z meritvami površin kolokaliziranih pikslov in omogoča hkratno vizualizacijo in dokumentiranje postopka. Uporabnost postopka je široka tudi za primere, kjerkoli se določa delež enega ali več tipov celic ali struktur v sliki. Predmet izuma je tudi pripadajoča avtoklavabilna elektrofuzijska kamrica, bolj natančno, kamrica za fuzijo bioloških celic v električnem polju. Izum se nanaša na konstrukcijo elektrofuzijske kamrice, ki je namenjena za večkratno uporabo. Kamrica je sestavljena iz zgornjega dela (1), spodnjega dela (2), steklene plošče (4) z elektrodami, O-ringa, pokrova in matice, in jih je mogoče avtoklavirati ločeno in jih v brezprašni sterilni komori zelo enostavno sestaviti v sterilno elektrofuzijsko kamrico. Poleg tega je mogoče z menjavo enega od delov elektrofuzijske kamrice spreminjati velikost elektrofuzijske površine in tako v kamrici fuzirati različne volumne suspenzije celic. Elektrofuzijska kamrica je izdelana iz biokompatibilnih materialov in je primerna za pripravo hibridnih celic za humane vakcine.ŕ

Description

POSTOPEK ZA EVALVACIJO DELEŽA HIBRIDNIH CELIC IN CELIČNIH IZDELKOV S KONFOKALNO MIKROSKOPIJO IN

AVTOKLAVABILNA ELEKTROFUZIJSKA KAMRICA

Predmet izuma, ki sodi v področje biomedicinske tehnologije, je postopek za evalvacijo deleža hibridnih celic in celičnih izdelkov hibridomov v celični vakcini, ki obsega meritve površine kolokaliziranih pikslov v sliki, posneti z večkanalnim konfokalnim mikroskopom in avtoklavabilna elektrofuzijska kamrica, namenjena za večkratno uporabo pri pripravi hibridomskih celic. Izum sodi v razred C12N13/00 mednarodne patentne klasifikacije.

Tehnični problem, ki ga predložen izum uspešno rešuje je postopek za zanesljivo in hitro določitev deleža hibridnih celic pri fuziji med dvema vzorcema fluorescenčno označenih celic in konstrukcija ustrezne fuzijske kamrice iz biokompatibilnih materialov za večkratno uporabo v humani medicini.

Na področju biomedicinske tehnologije je v zadnjem času veliko zanimanje za fuzijo dendritskih in tumorskih celic za pripravo vakcin za antitumorsko imunoterapijo. Dendritske celice so imunoaktivne celice, ki imajo sposobnost, da na svoji površini prezentirajo antigene. Tumorske celice pa so donorji antigenov. S fuzijo dendritskih in tumorskih celic dobimo hibridne celice, ki izražajo specifične tumorske antigene in delujejo imunostimulatorno (Gong et al., PNAS, 97 (6), 2000; Kugler et al., Nature Medicine, 6 (3), 2000; Orentas et al., Cellular lmmunology 213, 4-13 (2001); Zhang et al., World J Gastroenterol., 9(3)2003).

io Na tem področju sta odprta dva velika sklopa problemov: izdelava naprave za reproducibilno pripravo hibridnih celic z elektrofuzijo in v tej zvezi določanje učinkovitosti fuzije celic.

Ocena učinkovitosti fuzije in nastajanja hibridnih celic je odločilna za uporabo hibridnih celic pri raziskavah in pri uporabi v terapevtske namene, is Postopek po izumu omogoča hitro in natančno določitev učinkovitosti fuzije. Natančnost metode določa raba mikroskopije, hitrost postopka pa je taka, kot je pri rabi postopkov pretočne citometrije, metode, ki je bila do sedaj pogosto uporabljana metoda za določevanje deleža fuziranih celic v celičnih vakcinah. Temeljni problem postopka znane pretočne citometrije je neobčutljivost, kar prispeva k razmeroma velikemu deležu tako imenovanih lažno pozitivnih rezultatov. Postopek po predloženem izumu, ki uspešno odpravlja to pomanjkljivost, smo uvedli s pomočjo konfokalne mikroskopije in ni uporaben le za reševanje specifičnega problema, to je za določevanje deleža hibridomov v celični vakcini, pač pa je njegova uporabnost širša. Uporabimo ga lahko v vseh primerih, kjer merimo bodisi deleže celic ali drugih struktur v nekem preparatu, ki so označeni z različnimi fluorescenčno označenimi sondami.

Elektrofuzija je proces, pri katerem pride zaradi delovanja električnega polja na celice v suspenziji do združitve dveh ali več celic v novo celico (hibridna celica). Hibridna celica ima fiziološke lastnosti obeh fuzijskih partnerjev. Za pripravo celičnih hibridomov se v zgoraj omenjenih študijah uporabljata dve metodi: fuzija z uporabo polietilen glikola in elektrofuzijo.

Elektrofuzija daje signifikantno večji odstotek fuziranih celic kot metoda fuzije s polietilen glikolom (Orientas et al., 2001).

Proces elektrofuzije poteka v treh stopnjah (Zimmermann U,. Rev Physiol Biochem Pharmacol. 1986; 105:176-256). V prvi stopnji (alignment) pridejo celice, ki jih damo v elektrofuzijski postopek, med is seboj v tesen kontakt. Celice morajo biti v električno prevodnem mediju. Za vzpostavitev tesnega kontakta med celicami se večinoma uporablja postopek dielektroforeze. V tem postopku pride do gibanja, migracije in orientacije celic v nehomogenem izmeničnem električnem polju. Celice med elektrodama se postavijo v vrste (»pearl chains«) v smeri največje gostote električnega polja. V naslednji stopnji (fuzija) so celice izpostavljene kratkemu intenzivnemu električnemu pulzu (ali več pulzom), običajno je to DC pulz, ki povzroči permeabilizacijo celične membrane in nato zlitje dveh membran na mestu, kjer sta celici v tesnem kontaktu. V tretji stopnji (»post-alignment«) pride do stabilizacije fuzijskega produkta. Z uporabo dielektroforeze ostanejo celice v tesnem kontaktu. Fuzirani celici se zaokrožita v hibridno celico.

Proces elektrofuzije poteka v elektrofuzijski kamrici, ki ima v osnovi 5 prostor za suspenzijo celic in vsaj en par nasproti postavljenih elektrod, tako da je suspenzija celic med procesom elektrofuzije med elektrodama.

Elektrodi sta povezani z napajalnikom (AC oz. DC virom toka).

Elektrofuzijska kamrica, namenjena za pripravo vakcin, mora omogočati fuzijo dovolj velikega volumna celične suspenzije in omogočati mora reproducibilnost elektrofuzijskega postopka.

Kugler et al. (2000) v zgoraj omenjenem članku uporablja za pripravo vakcin Biorad-ovo elektroporacijsko kiveto. Kamrica je v osnovi konstruirana tako, da generira homogeno električno polje. Kot smo že omenili, je pogoj za uspešno elektrofuzijo, dielektroforetična ureditev celic is med dvema elektrodama. Za optimizacijo te faze elektrofuzije Kugler et al. (2000) uporablja kapljico parafinskega voska (»dielectrical wax«), ki jo nanese na eno stran elektroporacijske kivete. Taka rešitev otežuje standardizacijo in ponovljivost elektrofuzijskega postopka. Tako prirejeno kamrico je težko čistiti ali ponovno sterilizirati in zato ni primerna za ponovno uporabo.

Tipi elektrofuzijske kamrice, ki so na tržišču, so pretežno namenjeni za enkratno uporabo npr. Microslide 450 (za elektrodi ima nameščeni dve cevi iz nerjavečega jekla na stekleno površino, kar ustvarja divergentno električno polje) in Microslide 453 (dve palici nerjavečega jekla (ali zlata) sta nameščeni vzporedno in ustvarjata homogeno električno polje) ali 454 Meander Fusion Chamber (Genetronics, Inc., ΒΤΧ Instruments, San Diego, CA). Tudi pri teh tipih kamric je problem reproducibilnost fuzijskega postopka, ker fuzijski prostor ni omejen in je težko doseči vedno enako gostoto celic, glede na površino izpostavljenih elektrod.

Drugi problem, ki se pojavlja pri kamricah za enkratno uporabo, je nepreciznost pri izdelavi elektrod, kar tudi vpliva na slabšo reproducibilnost fuzijskega postopka. Ker naj bi bile sorazmerno poceni, io so kamrice za enkratno uporabo večinoma iz materialov, ki niso biokompatibilni.

Elektrofuzijska kamrica, namenjena za pripravo vakcin, mora zagotavljati tudi sterilnost fuzijskega produkta. Vsi deli kamrice, ki pridejo v kontakt s suspenzijo celic, morajo biti sterilni. Fuzija mora potekati v is zaprtem sistemu, ki preprečuje vsako možno kontaminacijo med fuzijskim postopkom. Elektrofuzijske kamrice za enkratno uporabo, ki so komercialno na voljo, so ali nesterilne ali pa pred-sterilizirane, običajno z gama žarki, in uporabne samo za raziskovalne namene.

Iz vsega navedenega je jasno, da obstaja potreba po novem tipu 20 elektrofuzijske kamrice, ki bo omogočala pridobivanje dovolj velikih količin hibridnih celic, ki so potrebne za pripravo vakcin. Konstrukcijska rešitev mora biti taka, da bo omogočala reproducibilnost elektrofuzijskega postopka, zagotavljala sterilnost elektrofuzijskega postopka in ustrezala standardom za humano uporabo (biokompatibilnost materialov), ekonomična in okolju prijazna.

Problemov, ki se pojavljajo v zvezi s pripravo hibridnih celic (hibridomov) za vakcine je torej več, predvsem pa izstopajo:

- problem fuzije večjih in različnih volumnov suspenzije celic;

- zagotavljanje dovolj velikega procenta fuziranih celic; sterilnost (in apirogenost);

biokompatibilnost materialov, ki pridejo v kontakt s suspenzijo celic;

- zmanjšanje stroškov za pripravo vakcin s konstrukcijo kamrice, namenjene za večkratno uporabo in za hitro evalvacijo deleža hibridov tudi že v sami fuzijski kamrici.

Znani postopki za določanje hibridomov so doslej ocenjevali is učinkovitost fuzije tako, da so uporabljali pretočno citometrijo, ki je hitrejša od mikroskopskih postopkov. Uporaba mikroskopa pa omogoča vizualizacijo in dokumentacijo posameznih celic. Hibridne celice se na mikroskopski ravni ločijo od nehibridnih celic. Pregledovanje celic s klasično mikroskopijo je sila zamudna metoda. Doslej so mikroskop uporabljali izključno za vizualizacijo, ocenjevanje učinkovitosti fuzije z mikroskopom pa bi bilo časovno prezahtevno in subjektivno.

Najenostavnejši tip kamrice sestoji iz mikroskopskega stekelca, na katerega sta prilepljeni dve vzporedni žici. Ta tip kamrice se uporablja za približno določanje optimalnega električnega polja, ki povzroči dielektrično ureditev in fuzijo celic. Med žici kanemo kapljico s suspenzijo celic in pod mikroskopom opazujemo posamezne stopnje fuzije. Ta tip kamrice omogoča fuzijo le majhnega volumna celic. Problem je tudi sterilnost.

Patentni dokumenti, kot npr. U.S. Pat.No. 4,441,972, U.S. Pat.No. 4,578,168, U.S. Pat.No. 4.764, 473, U.S. Pat.No. 2002164776 rešujejo problem fuzije večjih volumnov suspenzije celic in problem izvedbe (konfiguracije) elektrod, ki generirajo nehomogeno električno polje.

U.S. Pat. No. 4,441,972 opisuje tip kamrice, kjer je fuzijski prostor w določen z zgornjo in spodnjo elektrodno ploščo v obliki diska. Vsaj ena od elektrod ima na površini več koncentrično razporejenih žlebov. Na vrhovih teh se ustvari nehomogeno električno polje. Konstrukcija kamrice je mehansko zapletena in zahteva natančno nastavljanje vzporednih elektrod. Prostor med vzporednima elektrodama je težko očistiti. Ni is verjetno, da bi ta sistem omogočal fuzijo večjih količin celic.

U.S. Pat.No. 4,578,168 opisuje kamrico, kjer je nameščenih več ploščatih mrežastih žičnih elektrod. Laminatna konstrukcija v kaseti omogoča namestitev zaporedja distančnikov in mrežastih žičnih elektrod. Ta izvedba omogoča fuzijo suspenzij celic v večjih volumnih za večkratno uporabo vključno za večkratno sterilizacijo. Slaba lastnost te kamrice pa je, da se celice ujamejo v mrežni strukturi in jih je zato težko odstraniti po izvršenem postopku fuzije.

U.S. Pat.No. 4,764,473 opisuje kamrico, ki ima konično cilindrično jedro, okoli katerega sta naviti žičnati elektrodi v obliki dvojne vijačnice, in posode, ki po obliki sledi cilindričnemu jedru. Ozek vmesni prostor med tema dvema deloma je prostor za suspenzijo celic. Kamrica omogoča fuzijo manjših volumnov celične suspenzije (optim. 0,3 ml) druga njena pomanjkljivost pa je, da ni avtoklavabilna.

Pri dokumentu US2002164776 oziroma njegovem ekvivalentu EP1245669 je poudarjeno, da kamrica omogoča procesiranje večjih volumnov celic. Elektrode so laminarne in kontinuirne in so konfigurirane io tako, da generirajo nehomogeno polje. Elektrode imajo površino iz električno prevodnega materiala in so oblikovane valovito. Uporabijo se lahko katerikoli el. prevodni materiali: z ogljikom obogatena plastika ali polprevodniki. Zato je ta tehnologija primerna za izdelavo kamric z brizganjem mase v kalupe, kar je idelano za pripravo kamric za enkratno is uporabo. Taka je tudi primerna za sterilizacijo z obsevanjem.

Dokument US 4804450 opisuje napravo za fuziranje celic, ki ima fuzijski prostor, v katerem je par elektrod. Ti sta nameščeni tako, da imata enake dimenzije (višino), da se minimizira nehomogenost električnega polja.

Pri dokumentu U.S. Pat.No. 4,832,814. je naprava sestavljena iz tanke plasti-filma elektrod, ki so nanešene z jedkanjem na optično prozorno spodnjo plast s kanalom, ki definira meje s fotokopolimernim materialom, ki je nanešen kot laminat med zgornjo optično prozorno in spodnjo ploščo.

Na vrhu je optična plošča, ki zapre kanal in ima odprtino prek katere lahko v kanal vnesemo celice. Napravo je lahko narediti z optičnimi orodji. Med takim postopkom nastane izdelek, kije zaradi narave dela že sterilen. Tudi volumen kamrice se lahko poljubno spreminja s spreminjanjem votlin v laminatu, kamor se namešča celice. Elektrode so iz kroma ali mešanice oksidov indija in kositra, kar pa je težko uskladiti z biokompatibilnostjo. Dobra lastnost take kamrice pa je, da omogoča določitev deleža hibridomov z mikroskopijo, kar je predmet tega izuma.

Postopek za evalvacijo deleža hibridnih celic in celičnih izdelkov s konfokalno mikroskopijo po izumu je hiter postopek za kvantifikacijo deleža hibridnih celic, ki nastanejo pri fuziji celic. Postopek temelji na uporabi konfokalnega mikroskopa. Po postopku po izumu lahko hitro in zanesljivo analiziramo veliko število celic. Vsak vzorec celic označimo s fluorescenčnim barvilom. Celice barvamo vitalno. Za različne vzorce is uporabimo barvila z različnimi emisijskimi spektri (npr. rdeč in zelen). Po označevanju celice uredimo z dielektroforezo v visokofrekvenčnem izmeničnem električnem polju tako, da se dotikajo. Nato celice zlijemo (npr. z električnim sunkom). Preiskovanje posameznih hibridnih celic pod konfokalnim mikroskopom temelji na dvojni fluorescenci hibridnih celic.

2o Delež hibridnih celic določimo na slikah posnetih s konfokalnim mikroskopom tako, da izmerimo površino, ki jo zasedajo piksli z dvojno fluorescenco. To površino primerjamo z vsemi piksli, ki označujejo le dele z enojno fluorescenco. Elektronski šum slike odstranimo z dvodimenzionalnim filtriranjem slike. Pred primerjavo intenzitet različnih kanalov slike nastavimo kontrast posameznega kanala tako, da intenzitete pikslov zasedajo vse razpoložljivo območje. Nato določimo prazno vrednost intenzitete, ki loči intenzitete ozadja slike od intenzitete signala fluorescenčno označenih celic. Pražno vrednost intenzitete uporabimo za binarizacijo slike. Pri binarizaciji se slika, ki ima intenzitete celotnega območja, pretvori v dvonivojsko sliko. Računalniški program prešteje vse piksle z nadpražno intenziteto. Razmerje med številom pikslov, ki imajo nadpražno intenziteto pri obeh kanalih in številom pikslov, ki imajo nadpražno intenziteto pri najmanj enem kanalu, predstavlja delež hibridnih celic glede na vse celice.

Nadalje ima avtoklavabilna kamrica za elektrofuzijo po izumu naslednje značilnosti:

elektrode so naparjene na steklo prek maske z optičnim postopkom s tem, da je debelina kovinskega biokompatibilnega nanosa, dimenzij do polovice premera celic. Rob elektrod, ki so med sabo oddaljeni od 50 do 350 mikrometrov, ustvarja nehomogeno polkrožno polje, ki je ključno za dielektroforezo med dvema ali več pasov, na

2o ravnino položenih trakov elektrod. Trakovi elektrod so naparjeni tako, da so paralelni ali pa so nanešeni pod koti, da ustvarjajo gradient električnega polja, tako, da omogočajo določitev optimalnih parametrov fuzije v enem poskusu v eni suspenziji. Gradient električnega polja je zaradi nanosa elektrod pod koti, in tako kodiran v x, y koordinatah. To omogoča analizo optimalnih pogojev fuzije tako, da se analizira deleže fuzijskih celic v različnih regijah ravnine, ki ima površino nanešeno z elektrodami;

konstrukcija kamrice je izvedena tako, da omogoča preprosto (sterilno) razstavljanje in sestavljanje, avtoklaviranje in omogoča uporabo biokompatibilnih materialov. Način sterilizacije z avtoklaviranjem (ali suhe sterilizacije) v primerjavi s sterilizacijo z žarki gama ali etilen oksidom ima več prednosti;

z menjavo delov fuzijske kamrice, dela z oznako EL.B, ki imajo različno velike centralne odprtine, omogočajo fuzijo različno velikih volumnov suspenzij celic. Celice pa se lahko is hitro in preprosto oddvojijo, kar je prednost v primerjavi s patentom USP4832814;

posebna rešitev konektorjev omogoča hitro sestavljanje in razstavljanje fuzijske kamrice.

Izum bomo podrobneje obrazložili na osnovi izvedbenega primera in slik, od katerih kaže:

slika 1	dva vzorca različnih celic, označenih z dvema različnima fluorescenčnima barviloma, posneta s konfokalnim mikroskopom;
slika 2	hibridna dvojnofluorescenčna celica, z diagramom intenzitet
5	zelene in rdeče fluorescence za tri sosednje celice;
slika 3	graf korelacije med štetjem celic z dvojno fluorescenco in meritvijo površine, ki jo zasedajo piksli z dvojno fluorescenco;
slika 4	primerjava rezultatov analize vzorcev s pretočnim citometrom z rezultati pridobljenimi po postopku po izumu s
10	konfokalnim mikroskopom;
slika 5	shema elektrofuzijske kamrice - pogled od zgoraj - brez pokrova (»top plan view«);
slika 6	skica vzdolžnega prereza elektrofuzijske kamrice, skozi os A-A;
15 slika 7	skica steklene plošče z elektrodami- pogled od zgoraj (ni v merilu);
slika 8	skica izvedbe priključka na vir napajanja (AC oziroma DC)- pogled na kamrico od strani (slika 8A) ali od zgoraj (slika 8B);
20 slika 9	vodila za vijake in matico;
slika 10	risba vseh delov kamrice.

Postopek za evalvacijo deleža hibridnih celic in celičnih izdelkov s konfokalno mikroskopijo po predloženem izumu bo podrobneje obrazložen v nadaljevanju.

Celične vakcine, pripravljene s fuzijo dentritskih (antigen 5 prezentirajočih) celic in tumorskih celic, so vedno bolj v ospredju, saj vzbudijo imunsko zavrnitev tumorjev pri skoraj vseh raziskanih živalih (Scott-Taylor et al., 2000, Biochemica et Biophysica Acta, 1500, 265-279). Pri razvoju postopkov za elektrofuzijo je pomembna kvantifikacija deleža hibridnih celic. V ta namen so doslej raziskovalci uporabljali pretočno io citometrijo (Jaroszeski et al., 1994, Analytical biochemistry, 216, 271-275). Za vizualizacijo in dokumentacijo pa so uporabljali različne mikroskopske tehnike, ki so bile zamudne in zaradi subjektivnosti neprimerne za natančno kvantifikacijo (Gottfried et al., 2002, Cancer lmmunity, 2, 15266).

is Razviti postopek po izumu omogoča ocenjevanje deleža hibridnih celic z analizo površine na slikah, posnetih s konfokalnim mikroskopom. S tem postopkom lahko analiziramo veliko število celic po elektrofuziji. Dva vzorca različnih celic smo označili z dvema različnima fluorescenčnima barviloma. Sliki 1 in 2 posneti s konfokalnim mikroskopom smo analizirali na dva načina:

i) prešteli smo celice z dvojno fluorescenco in izračunali odstotek teh celic glede na vse označene celice;

ii) izmerili smo površino, ki jo zasedajo piksli z dvojno fluorescenco.

Drug način je bil veliko hitrejši od štetja celic. Rezultati obeh postopkov imajo veliko stopnjo korelacije, kar je razvidno iz slike 3. Iste vzorce smo analizirali tudi s pretočnim citometrom. Tudi ti rezultati korelirajo z rezultati pridobljenimi po novi metodi s konfokalnim mikroskopom (slika 4), vendar je korelacijski koeficient nizek.

Povprečni odstotek hibridnih celic, določenih s konfokalnim mikroskopom, je bil dvakrat manjši od povprečnega odstotka hibridnih celic, ki smo ga določili s pretočno citometrijo. Ta razlika je verjetno zaradi večje selektivnosti novega postopka s konfokalnim mikroskopom. Pretočni io citometer namreč lahko zazna tudi agregate nezlitih, zlepljenih celic in jih opredeli kot hibridne celice.

Za fluorescenčno označevanje celic smo uporabljali fluorescenčni barvili: zelen 5-chloromethyl fluorescein diacetate (CMFDA, 7 μΜ) in rdeč 6-chloromethyl benzoyl amino tetramethylrhodamine (CMTMR, 5 μΜ).

Uporabljali smo elektroporator z vijačno kamrico Eppendorf Multiporator®. Volumen kamrice je bil 250 pl. Uporabljali smo tudi lastno planarno kamrico predmet izuma, z volumnom 5 ml (slika 10). Stike med celicami smo dosegli z dielektroforezo. Za 30 sekund smo dovedli izmenično električno polje (280 V/cm, 2 MHz). Elektrofuzijo smo povzročili s sunkom visoke napetosti (1600-2800 V/cm) za 30 ps, nato smo ponovno dovedli izmenično električno polje (280 V/cm, 2 MHz) za 30 sekund. Suspenzijo celic smo analizirali s konfokalnim mikroskopom in pretočno citometrijo.

Odstotek hibridnih celic smo določili s štetjem rumenih - dvojno fluorescenčnih celic. Odstotek smo izračunali glede na vse preštete celice v suspenziji.

Odstotek hibridnih celic smo določili tudi z analizo konfokalne slike v 5 smislu meritve površine, ki jo zasedajo piksli s kolokalizirano rdečo in zeleno fluorescenco. Odstotek smo izračunali glede na vse fluorescenčne piksle. Določili smo prazno vrednost, ki je ločevala intenzitete ozadja od intenzitet signala zelenih in rdečih celic. Prazna vrednost je bila 41 od vseh 255 nivojev intenzitet, kar ustreza 16 % maksimalne intenzitete. Isto io prazno vrednost smo uporabili za določanje dvojnofluorescenčnih hibridnih celic. Elektronski šum, ki bi povzročil precenitev kolokaliziranih pikslov, smo odstranili z Gaussovim filtriranjem.

Po zaključenem postopku zlivanja celic smo suspenzijo celic analizirali s konfokalnim mikroskopom. Uporabili smo konfokalni mikroskop Zeiss is 510 z objektivom Plan-Neofluoar (20x, NA = 0,5). Fluorescenco CMFDA smo vzbujali z argonskim laserjem pri 488 nm, CMTMR pa s He/Ne laserjem pri 543 nm. Fluorescenci CMFDA in CMTMR smo ločili z BP 505530 nm in LP 560 nm emisijskimi filtri. Odstotek zlitih celic smo najprej določili s štetjem celic na posneti sliki. Slika 2 kaže sliko s hibridno celico.

Za potrditev, da gre za hibridno dvojnofluorescenčno celico, smo narisali linijski diagram intenzitet zelene in rdeče fluorescence za tri sosednje celice (profil, ki je narisan v diagramu, v sliki pokriva puščica). Črtkana črta označuje zeleno fluorescenco, polna črta pa rdečo fluorescenco. Leva in desna celica sta enojnofluorescenčni, sredinska, hibridna celica pa je dvojnofluorescenčna. Merilce predstavlja 100 gm. Povprečen delež hibridnih celic, določen s štetjem pri vseh poskusih je bil 4,1 ± 0,3%, (n= 47), značilno več kot delež navideznih hibridnih celic pri kontrolnem poskusu brez elektrofuzije (0,2 + 0,1 %, n= 12).

Iste slike smo analizirali tudi po opisanem hitrejšem postopku z meritvijo površin kolokaliziranih pikslov. Slika 3 kaže rezultate ocenjevanja deleža hibridnih celic na oba načina s konfokalnim mikroskopom. Rezultati so statistično značilno korelirani (R=0,9; P < 0,001, n=59). Delež površine io kolokaliziranih pikslov torej predstavlja delež hibridnih celic v suspenziji. Z meritvami površine kolokaliziranih pikslov smo izračunali povprečen delež hibridnih celic 4,3 ± 0,3 % (n = 47), ki se ni značilno razlikoval od deleža hibridnih celic določenega s štetjem (4,1 ± 0,3%, n= 47).

Delež hibridnih celic, določen s konfokalnim mikroskopom smo tudi is primerjali z deležem, ki smo ga določili po klasični metodi s pretočnim citometrom. Diagram na sliki 4 kaže, da sta deleža hibridnih celic določena z meritvami površine kolokaliziranih pikslov na konfokalnih slikah (abscisa) in s pretočnim citometrom (ordinata), korelirana (črni krogci: fuzija celic PC-12 in celic DC; beli krogci: enake celice brez fuzije).

Razmeroma majhen koeficient korelacije (R = 0,3; P < 0,05) je verjetno posledica večje selektivnosti konfokalnega mikroskopa in neselektivnosti metode pretočne citometrije. Povprečen delež hibridnih celic, določen s konfokalnim mikroskopom (meritve površine: 4,3 ± 0,3; štetje hibridnih celic: 4,1 ± 0,3, n=47) je manjši od deleža, ki smo ga določili s pretočno citometrijo (9,1 ± 0,8, n=47), saj pretočni citometer lahko celične agregate zazna kot hibridne celice. Deleži hibridnih celic, določeni po vseh uporabljenih metodah, so značilno (P<0,001) večji od deležev, določenih pri kontrolnih celicah, kjer nismo uporabili elektrofuzije.

Za odpravo pomanjkljivosti obstoječih elektrofuzijskih kamric, smo razvili nov tip elektrofuzijske kamrice. Predložena kamrica je namenjena za večkratno uporabo, tj. kamrica, ki je kompaktna, vendar lahka, trpežna, enostavna za čiščenje in vzdrževanje in tudi omogoča določitev optimalnih io fuzijskih pogojev in deleža fuzije kar s konfokalnim mikroksopom. Kamrico je mogoče sterilizirati (ne da bi pri tem materiali izgubljali na kvaliteti) z avtoklaviranjem. Sterilizacija z avtoklaviranjem ima več prednosti v primerjavi z ostalimi načini sterilizacije, predvsem je to najenostavnejši in najcenejši način sterilizacije. Stroški avtoklaviranja so minimalni. Tudi is nakup enote za avtoklaviranje je neprimerljivo cenejši kot instalacija enote za sterilizacijo z etilen oksidom, ali gama žarki (Co-60 ,Cs-137, radioizotopi, accel. elektroni). Etilen oksid je toksičen in potencialno karcinogen. Elektrofuzijska kamrica za večkratno uporabo po izumu ima šest ločenih delov, ki jih je mogoče avtoklavirati ločeno in jih v brezprašni sterilni komori zelo enostavno sestaviti v sterilno elektrofuzijsko kamrico.

Adaptabilna elektrofuzijska kamrica po izumu je prilagojena za fuzijo različnih volumnov suspenzije celic. Kamrica je konstruirana tako, da z menjavo enega dela elektrofuzijske kamrice, ki ima različno velike centralne odprtine, spreminjamo velikost elektrofuzijske površine tj. efektivno dolžino elektrod, ki je v kontaktu s suspenzijo celic. Rešuje problem nabave kamric za različne volumne celic. Večkratna uporaba kamrice je ne le ekonomična, ampak je tudi skladna z zmanjšanjem obremenitve okolja pri njenem uničenju, kar je tudi problem kamric za enkratno uporabo.

Izum se nanaša tudi na dimenzije in obliko elektrod za uniformno tretiranje celic po vsej fuzijski površini. Debelina elektrod in razdalja med elektrodami je definirana s toleranco ± 0,9 nm. Globina elektrod je manjša io od polmera celic, ki so v suspenziji med elektrodami, tako da se generira nehomogeno električno polje za dielektroforetično ureditev celic v območju največje gostote električnega polja, kar je pogoj za uspešno fuzijo. Poleg tega je predmet izuma tudi nameščanje trakov elektrod, ki so bodisi razporejeni vzporedno ali pa pod kotom, da ustvarijo gradient električnega polja, ki je različen v različnih poljih z x, y koordinatami steklene podlage dna elektrofuzijske kamrice.

Priključek na elektrode se da odklopiti od elektrod, za razliko od nekaterih izvedb, kjer so konektorji fiksirani na elektrode. Problem je rešen z vzmetnimi kontakti, ki se vzpostavijo ob sestavljanju kamrice. Rešitev

2o omogoča lažje čiščenje in vzdrževanje sterilnosti kamrice.

Zaradi predložene konstrukcije fuzijske kamrice je omogočeno avtoklaviranje posameznih delov, ki so obenem iz biokompatibilnih materialov, da ustreza pogojem za humano uporabo.

Sliki 5 in 6 prikazujeta konstrukcijsko rešitev elektrofuzijske kamrice po izumu, pri čemer je le-ta sestavljena iz naslednjih delov: spodnjega dela 1 kamrice s fiksno odprtino, zgornjega dela 2 z odprtino, katere premeri so lahko različni, med obema deloma nameščene steklene plošče 4 z elektrodami (prikazani na sliki 7), O-ringa nameščenega v ugrez 3, ki je izveden v spodnji strani zgornjega dela 2 kamrice. Spodnji del 1 in zgornji del 2 ohišja kamrice povezujejo štirje vijaki (izvedba obrob lukenj za vijake, ki so fiksirani v spodnjem delu 2 kamrice je prikazana na slikah 9A in 9B). Slika 9C prikazuje prečni prerez matice. Kontaktna plošča 5 (slika 8A, 8B) io se pritrdi na zgornji del 1 kamrice z istimi vijaki, ki pričvrstijo vse dele kamrice. Kamrico se sestavi tako, da se na podlago položi spodnji del 2 kamrice, v posebno ležišče z utorom 3 se namesti stekleno ploščo 4 z elektrodami, nato se na štiri vijake nasadi zgornji del 1 kamrice, na enem delu pa še kontaktno ploščo 5 na dva vijaka. S tremi do štirimi zavoji matic is se vse sestavne dele kamrice pričvrsti.

Zgornji del 1 kamrice služi kot nosilec steklene plošče 4 z elektrodami (slika 10). Za enostavnejšo namestitev steklene plošče 4 z elektrodami ima zgornji del 1 na zgornji strani ležišče-utor (slika 10) za stekleno ploščo 4 z elektrodami, ki sega po vsej dolžini zgornjega dela 1, mora pa biti toliko ožja od zgornjega dela 1, da je na vogalih zgornjega dela 1 prostor za namestitev vijakov. Velikost steklene plošče 4 z elektrodami dimenzijsko ustreza velikosti utora 3 na zgornjem delu 1.

Spodnji del 2 nalega na stekleno ploščo 4 z elektrodami in je enakih zunanjih dimenzij kot zgornji del 1A. Oba dela 1 in 2 služita kot dva dela enotnega ohišja. Spodnji del 2 ima centralno okroglo odprtino. V naši izvedbi je odprtina okrogla, lahko pa je tudi drugačne oblike. Spodnji del 2 ima na ploskvi, ki nalega na stekleno ploščo 4 z elektrodami ugrez 3. V ugrez 3 je nameščen O-ring, ki služi za tesnenje prostora za suspenzijo celic. Popolno tesnenje prostora za suspenzijo celic dosežemo s pomočjo štirih vijakov, ki so nameščeni asimetrično na vogalih zgornjega dela 1 in segajo aksialno skozi štiri odprtine na vogalih spodnjega dela 2 tako, da io lahko s pomočjo matic tesno stisnemo stekleno ploščo 4 z elektrodami med zgornjim delom 1 in spodnjim delom 2. Vijaki so postavljeni asimetrično zato, da omogočajo vedno pravilno orientacijo spodnjega dela 2. Vijaki imajo na vrhovih odstružene navoje za hitro vdevanje matice. Velikost prostora za suspenzijo celic je določena z velikostjo centralne is okrogle odprtine v spodnjem delu 2, pri čemer dno prostora za suspenzijo celic tvori steklena plošča 4 z elektrodami, stransko steno pa predstavlja obod centralne okrogle odprtine. Velikost centralne okrogle odprtine je poljubna, odvisno od volumna suspenzije, ki jo želimo imeti v elektrofuzijskem postopku. V ta namen je praktično izdelati več spodnjih delov 2 z različnimi velikostmi centralne okrogle odprtine in jih menjati, glede na volumen suspenzije celic, ki ga želimo pripraviti.

Elektrofuzijska kamrica po izumu ima pokrov z držalom (slika 10). Pokrov ima raven, vsaj 2 mm debel rob, ki dimenzijsko ustreza obodu centralne okrogle odprtine v spodnjem delu 2. Skozi dno pokrova segajo kot kapilare tanke luknjice za izenačevanje tlaka in izpust zraka. Dno pokrova je ravno in naleže na suspenzijo s celicami in skozi kapilare iztisne eventualne zračne mehurčke, kar prispeva k večji reproducibilnosti fuzijskega postopka.

Slika 7 prikazuje skico tlorisa steklene ploščo z elektrodami. Elektrode so izvedene tako, da je električno prevodna snov naparjena na steklo s foto postopkom. Debelina elektrod je manjša ali enaka polovici premera celice (0,5 do 4,5 pm). Stopnja tolerance je ± 0,9 nm. Razdalja med io elektrodami je od 50 do 350 pm. Elektrode so lahko razporejene kot krožno fuzijsko polje z interkalarnimi trakovi vzporednih elektrod. Lahko pa so elektrode nameščene pod kotom, da z njimi ustvarimo gradient električnega polja na različnih področjih na površini na x,y koordinatah steklene plošče.

Iz slik 5, 8 in 10 je razvidna izvedba priključka elektrod na vir AC oz.DC. Spodnji del 2 ima asimetrično na strani, ki pokriva mesto kontaktov na stekleni plošči z elektrodami, vzmetne kontakte, ki se vzpostavijo ob sestavljanju elektrofuzijske kamrice po izumu.

Zunanje dimenzije kamrice so take, da jo je mogoče namestiti v okvir mikroskopske mizice. Odprtina v zgornjem delu 1 in steklena plošča 4 omogočata opazovanje procesa fuzije, brez nevarnosti, da bi se fuzijski material kontaminiral.

Elektrofuzijska kamrica za pripravo hibridomov za humano uporabo mora biti sterilna in apirogena. Vsi deli ekektrofuzijske kamrice so iz biokompatibilnih materialov, ki so avtoklavabilni tj. prenesejo temperaturo avtoklaviranja (od 120-130°C) in niso občutljivi na vlago.

Elektrofuzijska kamrica, namenjena za pripravo vakcin, mora biti tudi obstojna na depirogenizacijo. Postopek depirogenizacije posameznih delov kamrice poteka (pred parno sterilizacijo) v suhem sterilizatirju 1 uro pri 200°C ali 30 min pri 250°C, oziroma z inkubacijo čez noč v 0,1 M raztopini NaOH.

io Na elektrofuzijski kamrici se lahko izvede postopek za evalvacijo deleža hibridnih celic in tudi optimizacijo pogojev elektrofuzije (trakovi elektrod izvedeni pod kotom).

Postopek za evalvacijo deleža hibridnih celic in celičnih izdelkov s konfokalno mikroskopijo po izumu uspešno rešuje zastavljene tehnične probleme.

Doslej so raziskovalci poročali o uspešnih fuzijah celic z relativno visokim deležem hibridnih celic (do 30%). Za kvantifikacijo deleža hibridnih celic so običajno uporabljali pretočni citometer (Hayashi et al., 2002, Clinical lmmunology, 104, 14-20; Gong et al., 2000, Proč Natl Acad

Sci USA, 97, 5011; Gong et al., 2000, Journal lmmunology, 165, 170511; Akasaki et al., 2001, Journal lmmunotherapy, 24, 106-113). Poročali so tudi, da ugotavljanje deleža hibridnih celic s pretočnim citometrom ne zadošča, saj lahko agregati celic prispevajo k previsokemu izmerjenemu deležu hibridnih celic (Hayashi et al., 2002). Postopek po izumu to težavo uspešno rešuje. Ocenjevanje deleža hibridnih celic z meritvami površin kolokaliziranih pikslov je hitro, specifično za hibridne celice in omogoča hkratno vizualizacijo in dokumentiranje postopka.

V primerjavi z običajno konfokalno mikroskopijo je ocenjevanje deleža hibridnih celic hitro. Čas, potreben za analizo posameznega vzorca, je enak času, ki je potreben za analizo s pretočno citometrijo. Analiziramo lahko enako število celic v posameznem vzorcu kot pri pretočni citometriji. Za vizualizacijo in dokumentacijo analize ne potrebujemo dodatne metode.

Postopek s konfokalnim mikroskopom je bolj selektiven od pretočne citometrije, saj lahko pretočna citometrija napačno zazna agregate nezlitih, zlepljenih celic kot hibridne celice. Postopek za ocenjevanje deleža hibridnih celic z analizo površine na slikah, posnetih s konfokalnim mikroskopom, je občutljiv in hiter, zato je primeren za ocenjevanje vzorcev z veliko celicami.

Tudi nova konstrukcija avtoklavabilne elektrofuzijske kamrice za izvedbo postopka po izumu omogoča njeno večkratno uporabo, kamrica sama pa je kompaktna, vendar lahka, trpežna, enostavna za čiščenje in vzdrževanje. Kamrico je mogoče tudi zelo enostavno sterilizirati.

Claims (22)

1. PATENTNI ZAHTEVKI

   1. Postopek za evalvacijo deleža hibridnih celic in celičnih izdelkov s konfokalno mikroskopijo,

   5 označen s tem da vsak vzorec celic označimo s fluorescenčnim barvilom, po označevanju celice uredimo z dielektroforezo v visokofrekvenčnem izmeničnem električnem polju tako, da se dotikajo, nakar sledi preiskovanje posameznih hibridnih celic pod konfokalnim mikroskopom, io ki temelji na dvojni fluorescenci hibridnih celic, pri čemer delež hibridnih celic določimo na slikah posnetih s konfokalnim mikroskopom tako, da izmerimo površino, ki jo zasedajo tisti piksli, ki imajo dvojno fluorescenco; da to površino primerjamo z vsemi piksli, ki označujejo le dele z enojno fluorescenco, pri čemer pred primerjavo intenzitet is različnih kanalov slike nastavimo kontrast posameznega kanala tako, da intenzitete pikslov zasedajo vse razpoložljivo območje, nakar določimo pražno vrednost intenzitete, ki loči intenzitete ozadja slike od intenzitete signala fluorescenčno označenih celic; da pražno vrednost intenzitete uporabimo za binarizacijo slike, pri čemer se pri binarizaciji

   20 slika, ki ima intenzitete celotnega območja, pretvori v dvonivojsko sliko, nakar z računalniškim programom preštejemo vse piksle z nadpražno intenziteto.
2. 2. Postopek za evalvacijo deleža hibridnih celic in celičnih izdelkov s konfokalno mikroskopijo po zahtevku 1, označen s tem, da celice barvamo vitalno.
3. 3. Postopek za evalvacijo deleža hibridnih celic in celičnih izdelkov s konfokalno mikroskopijo po zahtevku 1 in 2, označen s tem, da za različne vzorce uporabimo barvila z različnimi emisijskimi spektri io (n. pr. rdeč in zelen).
4. 4. Postopek za evalvacijo deleža hibridnih celic in celičnih izdelkov s konfokalno mikroskopijo po zahtevkih od 1 do 3, označen s tem, is da za eliminacijo elektronskega šuma slike, ki bi povzročil precenjenje kolokaliziranih pikslov, uporabimo dvodimenzionalno filtriranje slike.
5. 5. Postopek za evalvacijo deleža hibridnih celic in celičnih izdelkov s konfokalno mikroskopijo po zahtevkih od 1 do 4,

   20 označen s tem, da lahko iste metode rabimo za evalvacijo deležov populacij v suspenziji celic tudi za druge namene v biomedicinski biotehnologiji.
6. 6. Avtoklavabilna elektrofuzijska kamrica, po zahtevkih od 1 do 5, označena s tem, da je sestavljena iz zgornjega dela (1), spodnjega dela (2), steklene plošče (4) z elektrodami in priključkoma na vir AC oziroma DC signala,

   5 O-ringa, pokrova in matice.
7. 7. Avtoklavabilna elektrofuzijska kamrica, po zahtevku 6, označena s tem, da sta zgornji del (1) in spodnji del (2) enakih zunanjih dimenzij in imata io centralno krožni odprtini, delujeta kot polovici skupnega ohišja in se povezujeta na štirih mestih asimetrično, za vselej pravilno sestavljanje.
8. 8. Avtoklavabilna elektrofuzijska kamrica, po zahtevkih 6 in 7, označena s tem, is da ima utor (3) enake dimenzije kot steklena plošča (4), tako, da steklena plošča nalega v utor (3) in ima spodnji del (2) na spodnji strani nameščen utor (3) za O-ring, dimenzij, ki ustrezajo različnim dimenzijam v osrednji odprtini spodnjega dela (2), utor (3) pa obliko dimenzije O-ringa.
9. 9. Avtoklavabilna elektrofuzijska kamrica, po zahtevkih od 6 do 8, označena s tem, da velikost centralne krožne odprtine v spodnjem delu (2), določa velikost elektrofuzijske površine.
10. 10. Avtoklavabilna elektrofuzijska kamrica, po zahtevku 9,

    5 označena s tem, daje velikost centralne krožne odprtine v spodnjem delu (2) poljubna, in se z njo določi volumen elektrofuzata in s tem število celic v fuziji.
11. 11. Avtoklavabilna elektrofuzijska kamrica, po zahtevkih od 6 do 10, io označena s tem, da ima zgornji del (1) štiri vijake in da imajo vijaki na vrhu odstružene vijačnice za hitro vdevanje matice in da ima spodnjem delu (2) v isti osi štiri odprtine skozi katere sežejo vijaki.

    is
12. 12. Avtoklavabilna elektrofuzijska kamrica, po zahtevkih od 6 do 11, označena s tem, da so deli iz avtoklavabilnih biokompatibilnih materialov.
13. 13. Avtoklavabilna elektrofuzijska kamrica, po zahtevku 12,

    20 označena s tem, da so deli iz biokompatibilnih materialov po standardih ASTM.
14. 14. Avtoklavabilna elektrofuzijska kamrica, po zahtevkih od 6 do 13, označena s tem, da ima več parov vzporednih elektrod, pri čemer so razdalje med elektrodami in njihove globine definirane s toleranco ± 0,9 nm.
15. 15. Avtoklavabilna elektrofuzijska kamrica, po zahtevku 14, označena s tem, da je globina elektrod v primerjavi s premerom celic v suspenziji med elektrodami taka, da generira nehomogeno polje.
16. 16. Avtoklavabilna elektrofuzijska kamrica, po zahtevku 14, označena s tem, da je globina elektrod < polmeru celic.

    is
17. 17. Avtoklavabilna elektrofuzijska kamrica, po zahtevku 14, označena s tem, da je globina elektrod največ 0,5 do 4,5 pm.
18. 18. Avtoklavabilna elektrofuzijska kamrica, po zahtevkih od 6 do 17,
19. 20 označena s tem, da ima spodnji del (2) asimetrično na strani, ki pokriva mesto kontaktov na stekleni plošči z elektrodami, vzmetne električne kontakte, ki se vzpostavijo ob sestavljanju elektrofuzijske kamrice.

    25 19. Avtoklavabilna elektrofuzijska kamrica, po zahtevkih od 6 do 18, označena s tem, da ima pokrov raven, vsaj 2 mm širok rob, ki dimenzijsko ustreza obodu centralne odprtine spodnjega dela (2) in da ima ravno dno, ki nalega na suspenzijo celic, skozi katerega segajo luknjice (kapilare), skozi (v)

    5 katere je mogoče iztisniti zračne mehurčke, in da ima držalo.

    20. Avtoklavabilna elektrofuzijska kamrica, po zahtevkih od 6 do 19, označena s tem, da je njene dele zelo enostavno sestaviti v funkcionalno elektrofuzijsko io kamrico in da je elektrofuzijsko kamrico zelo enostavno razstaviti v sestavne dele elektrofuzijske kamrice.
20. 21. Avtoklavabilna elektrofuzijska kamrica, po zahtevku od 6 do 20, označena s tem,

    15 da jo je mogoče namestiti v okvir mikroskopske mizice.
21. 22. Avtoklavabilna elektrofuzijska kamrica, po zahtevkih od 14 do 18, označena s tem, da so elektrode nameščene pod kotom, da z njimi ustvarimo gradient 20 električnega polja na različnih področjih površine steklene plošče.
22. 23. Avtoklavabilna elektrofuzijska kamrica, po zahtevkih od 6 do 22, označena s tem, da omogoča analizo optimalnih pogojev fuzije tako, da se analizira deleže fuzijskih celic v različnih regijah ravnine, ki ima elektrode nanesene na stekleni površini.