SE537424C2 - Förfarande för reglering av insekter med användning av en insektpatogen och en mikroorganism som är naturligt associeradmed insektens larver - Google Patents

Abstract

537 424 Sammandrag Foreliggande uppfinning hanfor sig till en komposition for kontroll av en skadeinsekt, sasom Lepidoptera, varvid kompositionen innefattar en insektpatogen och en nnikroorganism sonn är naturligt associerad nned 5 skadeinsektens larv.

Description

Tekniskt onnrade och uppfinningens bakgrund Samrore mellan jast och insektsvaxtatare är vanligt forkommande, och dessa interspecifika interaktioner har avgOrande betydelse fOr evolutionen bade av jast och insekter (Janson et al. 2008, Klepzig et al. 2009, Guzman et 5 al. 2013). Mikrobiell insektsekologi är ett valetablerat forskningsomrade, men hittills har fokus legat pa vissa grupper sasom barkborrar, fruktflugor och sociala insekter (Starmer and Fogleman 1986, Farrell et al. 2001, Mueller et al. 2005, Schoenian et al. 2011). Emellertid har dessa kunskaper inte kommit till praktisk nytta.

Parallellt med den hastigt expanderande forskningen kring det nnanskliga nnikrobionnet, har aven insekt-vaxt-nnikrob-interaktioner rant storre uppmarksamhet. Vi har bidragit genom var forskning som visar att bananflugan, Drosophila melanogaster, lockas till jast och inte frukt (Becher et al. 2012) samt att applevecklaren Cydia pomonella, en typisk vaxtatare, lever i 15 mutualism med jast (Witzgall et al. 2012).

Biologisk insektsbekampning omfattar tre sektorer: nyttoinsekter, patogener och "semiokemikalier". Omrade (1): nyttoinsekter, eller naturliga fiender som slapps ut for att bekampa skadeinsekter framforallt i vaxthusmiljoer. Omrade (2): insektpatogena virus, bakterier eller svampar anvands 20 vid sprutbehandling av faltgrodor och fruktodlingar for att &Ida insektslarver. Omrade (3): sk "semiokemikalier" (feromoner eller kairomoner, kemiska amnen som paverkar inskternas beteenden) anvands mot fullvuxna insekter for att forhinda parning eller f6r att fanga insekter i fallor (Witzgall et al. 2008, 2010).

F6rs6k att kombinera patogener med semiokemikalier har hittills inte varit sa framgangsrika som fOrvantat. Det finns tva anledningar till detta: 1 537 424 fullvuxna insekter, som kan bekannpas med senniokennikalier, är inte tillrackligt mottagliga for insektspatogener for att mojliggora effektiv kontroll. Insektslarver daremot är mer kansliga f6r insektspatogener, men kan inte bekampas med semiokemikalier pa ett enkelt sail nar de redan befinner sig pa sin 5 vardvaxt.

Kemosensoriska stimuli styr larvemas beteenden Hos bananflugan D. melanogaster (Fishilevich et al. 2005, Kreher et al. 2005) och formodligen ocksa hos andra insekter, uttrycks en viss del av de 10 olfaktoriska receptorgenerna i larvernas olfaktoriska sensoriska neuroner. Larver och vuxna fjarilar av applevecklaren C. pomonella lockas till vaxtdofter (Sutherland 1972, Knight and Light 2001) och det är troligt att bade larver och agglaggande honor dessutom reagerar pa dofter som avges av associerade mikroorganismer. Kemosensorisk attraktion hos S. frugiperda larver har inte 15 studerats, men det är troligt att de ocksa attraheras av doftsignaler.

Applevecklarens granulovirus Cydia pomonella granulovirus (CpGV) har erhallit avsevard uppmarksamhet som mikrobiell insekticid pa grund av den specificitet for appleveck20 laren och dess sakerhet mot icke-malorganismer. CpGV har registrerats i manga lander och anvands arligen pa mer an 150.000 ha (Cross et al. 1999, Lacey and Shapiro 2008, Lacey et al. 2008, Chandler et al. 2011) Applevecklarhonor lagger agg direkt pa, eller i narheten av frukt men de nyklackta larverna borjar inte aktivt att ata forran de forst gnagt sig igenom 25 fruktskalet. Nar larven val kommit in i frukten är fysiskt isolerad fran efterfoljande bekampningsmetoder.

Detta beteende hos applevecklarlarverna Or dem mycket svara att bekampa med CpGV, som maste tas in med fodan for att ha effekt (Jacques et al. 1987). Efter besprutning ar viruset bara aktivt under nagra fa dagar i 30 odlingen. Darfor har f6rs6k gjorts f6r att Oka effekten av CpGV genom att Oka virusintag genom stimulering av atbeteende och larvattraherande kemiska substanser (Lacey et al. 2008, Ballard et al. 2000a,b). 2 537 424 Exennpel pa substanser som attraherar applevecklarlarver är (E,E)-a- farnesen och paronester, ethyl (E,Z)-2,4-decadienoat (Sutherland 1972, Knight and Light 2001). Tillsats av a-farnesen okade effekten av CpGV (Ballard et al. 2000a) och paronester reducerades angrepp pa valnotter (Light 5 and Knight 2011), men inte pa apple och 'Aron (Arthurs et al. 2007, Schmidt et al. 2008). Amnen som stimulerar larvernas atbeteende, sasom sirap eller socker, visar en effekt, men orsakar aven sekundara svampinfektioner (Ballard et al. 2000a). Dessa studier visar att det är mojligt att oka effekten av CpGV genom inkorporering av attraherande substanser och/eller atstimuler10 ande medel, men den overgripande effekten var begransad.

Spodoptera frugiperda nucleopolyhedro virus Baculovirus forkommer hos manga fjarilsarter och anvands kommersiellt fOr bekampning av nattflyn Noctuidae, t ex mot Anticarsia gemmatalis pa 15 sojab6nor i Brasilien (Moscardi 1999, Cory and Myers 2003). En mikroinkapslingsmetod for storskalig, industriell produktion av Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus finns redan etablerad (Villamizar et al. 2010).

Sammanfattning av uppfinningen Vaxtatande insekter är associerade med mutualistiska mikroorganismer Vi har nyligen visat att en typisk vaxtatare, applevecklaren C. pomonella, är associerad med jast och svannpar, i synnerhet med Metschnikowia spec. (Ascomycota, Saccharomycetes), Aureobasidium spec. (Ascomycota, Sordariomycetes) och Cryptococcus spec. (Basidiomycota, 25 Tremellomycetes) (Witzgall et al. 2012).

Vi visar nu att nattflyet, Spodoptera frugiperda är associerat med jastoch svamparter, i synnerhet med Metschnikowia spec. (Ascomycota, Saccharomycetes) och Cryptococcus spec. (Basidiomycota, Tremellomycetes) (opubl. res.) 3 537 424 Kombinerad anvandning av mutualistiska mikroorganismer och insektspatogener Vi upptackte nu att dessa mutualistiska mikroorganismer som 5 forekommer tillsammans i nara anslutning till insektslarver, okar intaget av insektspatogena virus hos nyklackta larver (opubl. res.) Man ipulering av larvernas beteenden mot en okad exponering for patogener blir nu mojlig genom att kombinera patogener med mutualistiska mikroorganismer som f6rekommer tillsammans i nara association med 10 insektslarver.

Denna upptackt oppnar ett nytt perspektiv for biologisk insektsbekampning och ger mOjlighet att utveckla en ny vaxtskyddsmetod. Vi fOrvantar oss att metoden vasentligt kommer att bidra till insektsbekampning i framtiden. Saledes avser uppfinningen en ny insektsbekampningsmetod. Metoden 15 bygger pa mutualistiska mikroorganismer som forekommer tillsammans med insektslarver, som attraherar dessa insektslarver fOr intag av foda, i kombination med insektspatogener, i synnerhet patogena virus, svampar eller bakterier.

Utan attraherande mikroorganismer sasom jast eller svampar, traffar 20 larverna bara slum pvis pa insektspatogener. Att form ulera attraherande mikroorganismer, sasom jast eller svampar, tillsammans med insektspatogenet okar kraftigt det avdodande patogenets effekt, eftersonn nnikroorganismerna som är associerade med insekter attraherar larver och aven stimulerar intaget av foda.

Uppfinningen kan anvandas pa vaxtatande insektslarver for vilka associerade mikroorganismer, sasom jast och jastliknande svampar, kan kombineras med insektspatogener, sasom patogena insektsvirus, svampar eller bakterier.

Uppfinningen avser narmare bestamt en komposition for kontroll av en 30 skadeinsekt, innefattande en insektspatogen och atminstone en mikroorga- nism som forekommer naturligt tillsammans med skadeinsektens larver. Foreliggande uppfinning avser aven ett forfarande f6r bekannpning av skadeinsekter, innefattande exponering av skadeinsekten fOr en insektspato- 4 537 424 gen och atnninstone en nnikroorganisnn som forekonnnner naturligt med skadeinsektens larver.

Kort beskrivning av ritningen Fig. 1 visar resultaten av experiment dar mikroorganismerna Cryptococcus tephrensis, Aureobasidium pullulans eller Metschnikowia pulcherrima kombinerades med applevecklarens granulovirus (CpGV). Mortaliteten av nyklackta applevecklarlarver pa applen som behandlades med en blandning av CpGV (3.8 x 7 occlusion bodies/L) och 1.2 eller 3.6 g/L 10 mikroorganismer, med eller utan tillsats av socker, var signifikant hogre an pa apple som behandlades enbart med CpGV. Tre forsok genomf6rdes: virus och socker; virus och mikroorganismer; virus, socker och mikroorganismer, jamfort med enbart virus och vatten. Staplar med olika bokstaver ar signifikant skilda at med P < 0.05.

Detaljerad beskrivning av uppfinningen En mutualistisk mikroorganism, sasom jast eller svamp, som attraherar fodosokande insektslarver, i kombination med en insektspatogen, sasom virus, svamp eller bakterie, beskrivs som en ny insektsbekampningsmetod. 20 Den mutualistiska mikroorganismen stimulerar larvattraktion och fodointag och framkallar intag av insektspatogenen.

Begreppet "skadeinsekt" som anyands i den aktuella beskrivningen hanfor sig till insekter som skadar eller dodar, jordbruksgrodor, tradgardsvaxter eller naturliga vaxter in situ. Larvema av skadeinsekten som kan 25 bekampas med kompositionen eller forfarandet enligt uppfinningen, livnar sig av vaxterna.

I nagra utforingsformer ar skadeinsekten vald fran ordningen Lepidoptera.

I nagra utforingsformer ar skadeinsekten applevecklaren Cydia pomonella L. (Lepidoptera, Tortricidae) I nagra utforingsformer ar skadeinsekten nattflyet Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). 537 424 I nagra utforingsformer är skadeinsekten nattflyet Spodoptera litura (Fabricius, 1775) (Lepidoptera: Noctuidae).

I nagra utforingsformer är skadeinsekten bomullsflyet Spodoptera littoralis (Boisduval, 1833) (Lepidoptera: Noctuidae).

I nagra utforingsformer är skadeinsekten nattflyet Spodoptera exempta (Walker, 1857) (Lepidoptera: Noctuidae).

I nagra utforingsformer är skadeinsekten smalvingat lovfly Spodoptera exigua (Hubner, 1808) (Lepidoptera: Noctuidae).

I nagra utforingsformer är skadeinsekten nattflyety Spodoptera eridania 10 (Stoll, 1782) (Lepidoptera: Noctuidae).

I nagra utforingsformer är skadeinsekten nattflyet Anticarsia gemmatalis (Hubner, 1818) (Lepidoptera: Noctuidae).

I nagra utforingsformer är skadeinsekten nattflyet Heliothis virescens (Fabricius, 1777) (Lepidoptera: Noctuidae).

I nagra utforingsformer är skadeinsekten brunaktigt knolfly Helicoverpa armigera (Hubner, 1805) (Lepidoptera: Noctuidae).

I nagra utforingsformer är skadeinsekten nattflyet Helicoverpa zea (Boddie, 1850) (Lepidoptera: Noctuidae).

I nagra utforingsformer är skadeinsekten fruktskalvecklaren Adoxophyes orana (Fischer von Roslerstamm, 1834) (Lepidoptera: Noctuidae).

Det är av sarskilt intresse i enlighet nned foreliggande uppfinning att anvanda kompositionen och forfarandet for bekampning av insekter som angriper frukt och jordbruksgrodor.

Exempel pa frukt eller jordbruksgrodor som angrips av skadeinsekter som kan bekampas enligt uppfinningen är apple (Ma/us domestica Borkh.), paron (Pyrus communis L.), och/eller valnot (Juglans regia L).

Exempel pa jordbruksgrodor som angrips av skadeinsekter som kan bekampas enligt uppfinningen är alfalfa (Medicago sativa L.), bomull (Gossypium spec.), ogonbona (Vigna unguiculata (L.) Walp.), limabonan (Phaseolus lunatus L.), majs (Zea mays L.), ris (Oryza sativa L.), soja (Glycine max (L.) Merr.), och/eller tomat (Solanum lycopersicum L.). 6 537 424 Begreppet "insektspatogen" som anvands i foreliggande beskrivning hanfor sig till alla kanda insektspatogener som infekterar eller clodar skadeinsekterna som bekampningen riktar sig emot.

Skadeinsekten kan infekteras eller dodas i sitt outvecklade stadie, som 5 en larv, eller som fullvuxen insekt.

I nagra utforingsformer dodar insektspatogenen skadeinsekten.

For det fall insektspatogenen, som anvands enligt uppfinningen, inte &Aar insekten, är det onskvart att den resulterar i forebyggande av fodointag eller fortplantning hos insekten.

I nagra utforingsformer är insektspatogenen ett virus.

I nagra utforingsformer är insektspatogenen en svamp.

I nagra utforingsformer är insektspatogenen en bakterie.

I nagra utforingsformer är insektspatogenen Cydia pomonella granulovirus (CpGV).

I nagra ufforingsformer är insektspatogenen Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus (SfNPV).

Uttrycket "mikroorganism som är naturligt associerad med skadeinsektslarven" innefattar alla mikroorganismer som naturligt forekommer med larver av den insekt som ska bekampas. Mikroorganismen som är naturligt 20 associerad med skadeinsektslarven kan ha en naturligt f6rekommande relation, som kan vara en mutualistisk interaktion med skadeinsektslarven. I vissa delar av denna ansokan anvands begreppet "insektsassocierad mikroorganism" vilket betyder det samma som "mikroorganism som är naturligt associerad med skadeinsektslarven". Denna mikroorganism attraherar och 25 stimulerar larven att ata. I nagra utforingsformer är mikroorganismen som är naturligt associerad med skadeinsektslarven en jast. I nagra utf6ringsformer är mikroorganismen som är naturligt associerad med skadeinsektslarven en svamp. Svampen kan vara en jast-liknande svamp. I nagra utforingsformer är mikroorganismen som är naturligt associerad med skadeinsektslarven en 30 bakterie. Det är mojligt att anvanda till exempel en enstaka jast eller en enstaka svamp, men det är aven mojligt att anvanda en kombination av flera mikroorganismer som är naturligt associerade med skadeinsektslarven, 7 537 424 sasonn tva eller flera jaster, atnninstone tva svannpar, eller atnninstone en jast och atnninstone en svamp.

I nagra utforingsformer kan en sockerart kombineras med mikro- organismen som är naturligt associerad med skadeinsektslarven. Sockret 5 fungerar da som ett substrat for mikroorganismen.

I nagra utforingsformer är mikroorganismen som är naturligt associerad med skadeinsektslarven en jast av slaktet Metschnikowia. Jasten av slaktet Metschnikowia kan vara Ascomycota. Alternativt kan jasten av slaktet Metschnikowia vara Saccharomycetes. I nagra utforingsformer anvands M. andauensis. I nagra utforingsformer anvands M. pulcherrima. I nagra utforingsformer anvands M. lopburiensis. I nagra utforingsformer anvands M. saccharicola.

I nagra utforingsformer är mikroorganismen som är naturligt associerad med skadeinsektslarven en jastliknande svamp av slaktet Aureobasidium. 15 Den jastliknande svampen av slaktet Aureobasidium kan vara Ascomycota.

Alternativt kan den jastliknande svampen av slaktet Aureobasidium vara Sordariomycetes. I nagra utforingsformer anvands A. pullulans.

I nagra utforingsformer är mikroorganismen som är naturligt associerad med skadeinsektslarven en svamp av slaktet Cryptococcus. Svampen av 20 slaktet Cryptococcus kan vara Basidiomycota. Alternativt, kan svampen av slaktet Cryptococcus vara Tremellomycetes. I nagra utforingsformer anvands C. tephrensis. I nagra utforingsformer anvands C. nemorosus.

I specifika utforingsformer, nar kompositionen eller forfarandet ska anvandas for att bekampa applevecklaren Cydia pomonella L. (Lepidoptera, 25 Tortricidae), är mikroorganismen som är naturligt associerad med skadeinsektslarven vald fran den grupp som bestar av Metschnikowia arter, sasom Ascomycota och Saccharomycetes; Aureobasidium arter, sasom Ascomycota och Sordariomycetes; och Cryptococcus arter, sasom Basidiomycota och Tremellomycetes och insektspatogenen är Cydia pomonella granulovirus 30 (CpGV).

I specifika utforingsformer, nar kompositionen eller forfarandet ska anvandas f6r att bekampa nattflyet Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae), valjs mikroorganismen som är naturligt associerad 8 537 424 med skadeinsektslarven ut fran den grupp som bestar av Metschnikowia arter, sasom Ascomycota och Saccharomycetes; och Cryptococcus arter, sasom Basidiomycota och Tremellomycetes och insektspatogenen är Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus (SfNPV).

Enligt forfarandet enlig foreliggande uppfinning appliceras insekts- patogenet och mikroorganismen som är naturligt associerad med skadeinsektslarven, pa en vaxt till exempel genom besprutning.

Insektspatogen och mikroorganismen som är naturligt associerad med skadeinsektslarven, appliceras pa vaxten antingen samtidigt eller var och en 10 for sig. I manga utforingsformer appliceras patogenet och mikroorganismen samtidigt. For det fall att patogenet och mikroorganismen som är naturligt associerad med skadeinsektslarven inte appliceras samtidigt, ska de -bretradesvis appliceras morn en relativt kort tidsperiod.

Exempel De insektassocierade mikroorganismerna Cryptococcus tephrensis, Aureobasidium pullulans eller Metschnikowia pulcherrima kombinerades med applevecklarens granulosvirus (CpGV), ett virus som är ett patogen f6r C. pomonella. Mortaliteten hos nyklackta applevecklarlarver C. pomonella pa 20 apple behandlade med CpGV (3.8 x 7 partiklar/L) och 1.2 eller 3.6 g/L insektassocierade mikroorganismer, med eller utan tillsats av socker, var signifikant hogre an med enbart CpGV (dvs. patogent virus).

Tre experiment genomfordes: patogent virus plus socker; patogent virus plus insektassocierad mikroorganism; patogent virus plus socker plus 25 insektassocierad mikroorganism, jam-fort med patogent virus och enbart vatten. Staplar markerade med olika bokstaver är signifikant skilda at (P < 0.05).

Applevecklaren Cydia pomonella 30 Applevecklarlarver är associerade med insektassocierade mikroorganismer av slakten Metschnikowia, Aureobasidium and Cryptococcus, som okar larvernas tillvaxt och overlevnad (Witzgall et al. 2012). Inledande laboratoriefOrsOk visar nu att en blandning av dessa insektassocierade 9 537 424 nnikroorganisnner och applevecklar granulovirus (CpGV) avsevart okar larvernas mortalitet, jamfort med enbart CpGV (se Fig. 1).

Var slutsats är att dessa insektassocierade mikroorganismer okar larvernas attraktion och fodointag, med intag av det patogena viruset som 5 foljd. Kombinationen av insektassocierade mikroorganismer och patogena insektsvirus är foljaktligen en ny och mer effektiv bekampningsteknik an enbart patogent virus.

Ett replikerat faltforsok bekraftade effekten av insektassocierade mikroorganismer i kombination med CpGV. Signifikanta skillnader fanns 10 bland behandlingar med avseende pa andelen doda och levande larver. Besprutningar med CpGV (3 x 13 partiklar/L) med och utan M. pulcherrima och rOrsocker applicerades vid 1.2 L/appletrad (623 L/ha). Andelen dOda larver var hogst efter behandling med CpGV plus insektsassocierade mikroorganismer och socker. Andel levande larver i frukten var lagst vid 15 tillsats av insektassocierade mikroorganismer och socker till CpGV. Andelen frukt med larver som fullbordade sin utveckling var hogst i obehandlade kontrollforsok och efter behandling med enbart CpGV.

Fall arm yworm Spodoptera frugiperda Insektassocierade mikroorganismer av slaktet Metschnikowia och Cryptococcus har aven hittats i association med nattflylarver av arten Spodoptera frugiperda. Inledande laboratorieforsok visar att larverna av S. frugiperda attraheras till dessa insektassocierade jaster och vi antar baserat pa dessa experiment att de kan anvandas i kombination med S. frugiperda 25 nucleopolyhedrovirus (SfNPV) for bekampning av S. frugiperda. 537 424 Referenser Arthurs SP, Hilton R, Knight AL, Lacey LA. 2007. Evaluation of the pear ester kairomone as a formulation additive for the granulovirus of codling moth (Lepidoptera: Tortricidae) in pome fruit. J econ Entomol 100:702-709.

Ballard J, Ellis DJ, Payne CC. 2000a. Uptake of granulovirus from the surface of apples and leaves by first instar larvae of the codling moth Cydia pomonella L. (Lepidoptera: Olethreutidae). Biocontr Sci Technol 10:617-625.

Ballard J, Ellis DJ, Payne CC. 2000b. The role of formulation additives in increasing the potency of Cydia pomonella granulovirus for codling moth 10 larvae, in laboratory and field experiments. Biocontr Sci Technol 10:627-640. Becher PG, Flick G, Rozpedowska E, Schmidt A, Hagman A, Lebreton S, Larsson MC, Hansson BS, Piskur J, Witzgall P, Bengtsson M. 2012. Yeast, not fruit volatiles mediate attraction and development of the fruit fly Drosophila melanogaster. Funct Ecol 26:822-828.

Chandler D, Bailey AS, Tatchell GM, Davidson G, Greaves J, Grant WP. 2011. The development, regulation and use of biopesticides for integrated pest management. Phil Trans R Soc B 366:1987-1998.

Cory JS, Myers JH. 2003. The ecology and evolution of insect baculoviruses. Annu Rev Ecol Evol Syst 34:239-272.

Cross JV, Solomon MG, Chandler D, Jarrett P, Richardson PN, Winstanley D, Bathon H, Huber J, Keller B, Langenbruch GA, Zimmerman G. 1999. Biocontrol of pests of apples and pears in northern and central Europe: 1. Microbial agents and nematodes. Bioctrl Sc Techn 9:125-149.

Farrell BD, Sequeira AS, O'Meara BC, Norrnark BB, Chung JH, Jordal 25 BH. 2001. The evolution of agriculture in beetles (Curculionidae: Scolytinae and Platypodinae). Evolution 55:2011-2027 .

Fishilevich E, Domingos Al, Asahina K, Naef F, Vosshall LB, Louis M. 2005. Chemotaxis behavior mediated by single larval olfactory neurons in Drosophila. Curr Biol 15:2086-2096.

Guzman B, Lachance M-A, Herrera CM. 2013. Phylogenetic analysis of the angiosperm-floricolous insect-yeast association: have yeast and angiosperm lineages co-diversified? Mol Phylog Evol 68:161-175. 11 537 424 Jacques RP, Laing JE, Laing DR, Yu DSK. 1987. Effectiveness and persistence of the granulosis virus of the codling moth Cydia pomonella (L.) (Lepidoptera: Olethreutidae) on apple. Can Entomol 119:1063-1067.

Janson EM, Stireman JO, Singer MS, Abbot P. 2008. Phytophagous 5 insect-microbe mutualisms and adaptive evolutionary diversification. Evolution 62:997-1012.

Klepzig, K. D., Adams, A. S., Handelsman, J. & Raffa, K. F. 2009. Symbioses: a key driver of insect physiological processes, ecological interactions, evolutionary diversification, and impacts on humans. Environm 10 Entomol 38,67-77.

Knight AL, Light DM. 2001. Attractants from Bartlett pear for codling moth, Cydia pomonella (L.), larvae. Naturwissenschaften 88:339-342.

Kreher SA, Kwon JY, Carlson JR. 2005. The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva. Neuron 46:445-456.

Lacey LA, Shapiro-Ilan DI. 2008. Microbial control of insect pests in temperate orchard systems: potential for incorporation into IPM. Annu. Rev. Entomol. 53:121-144.

Lacey, L. A., Thomson, D., Vincent, C. and Arthurs, S. P. 2008. Codling moth granulovirus: a comprehensive review. Biocontr. Sci. Technol. 20 18:639-663.

Light DM, Knight AL. 2011. Microencapsulated pear ester enhances insecticide efficacy in walnut for codling moth (Lepidoptera; Tortricidae) and navel orangeworm (Lepidoptera: Pyralidae). J econ Entomol 104:1309-1315.

Moscardi F. 1999. Assessment of the application of baculoviruses for 25 control of Lepidoptera. Annu Rev Entomol 44:257-289.

Mueller UG, Gerardo NM, Aanen DK, Six DL, Schultz TR. 2005. The evolution of agriculture in insects. Annu Rev Entomol 36:563-595.

Schmidt S, Tomasi C, Pasqualini E, loriatti C. 2008. The biological efficacy of pear ester on the activity of granulosis virus for codling moth. J 30 Pest Sci 81:29-34.

Schoenian I, SpiteIler M, Ghaste M, Wirth R, Herz H, SpiteIler D. 2011. Chemical basis of the synergism and antagonism in microbial communities in the nests of leaf-cutting ants. Proc Natl Acad Sci 108:1955-1960. 12 537 424 Starrner WT, Fogleman JC. 1986. Coadaptation of Drosophila and yeasts in their natural habitat. J chem Ecol 12:1037-1055.

Sutherland RW. 1972. The attraction of newly-hatched codling moth (Laspeyresia pomonella) larvae to apple. Entomol exp appl. 15:481-487.

Villamizar L, Barrera G, Cotes AM, Martinez F. 2010. Eudragit S100 microparticles containing Spodoptera frugiperda nucleopolyehedrovirus: physicochemical characterization, photostability and in vitro virus release. J Microencapsulation 27:314-324.

Witzgall P, Stelinski L, Gut L, Thomson D. 2008. Codling moth 10 management and chemical ecology. Annu Rev Entomol 53:503-522.

Witzgall P, Kirsch P, Cork A. 2010. Sex pheromones and their impact on pest management. J chem Ecol 36:80-100.

Witzgall P, Proffit M, Rozpedowska E, Becher PG, Andreadis S, Coracini M, Lindblom TUT, Ream LJ, Hagman A, Bengtsson M, Kurtzman 15 CP, Piskur J, Knight A. 2012. "This is not an apple" - yeast mutualism in codling moth. J chem Ecol 38:949-957. 13

Claims (10)

537 424 PATENTKRAV 1. Komposition for kontroll av en skadeinsekt, innefattande en insektpatogen och atminstone en mikroorganism som är naturligt associerad 5 med skadeinsektens larver. 2. Komposition enligt krav 1, varvid skadeinsekten är vald Than ordningen Lepidoptera. 3. Komposition enligt krav 1 eller 2, varvid insektpatogen är Cydia pomonella granulovirus (CpGV) eller Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus (SfNPV). 4. Komposition enligt nagot av kraven 1-3, varvid namnda atminstone en mikroorganism som är naturligt associerad med skadeinsektslarven är vald Than gruppen bestaende av Metschnikowia arter, sasom Ascomycota och Saccharomycetes; Aureobasidium arter, sasom Ascomycota och Sordarionnycetes; och Cryptococcus arter, sasonn Basidionnycota och Tremellomycetes. 5. Komposition enligt nagot av kraven 1-4, varvid skadeinsekten är applevecklare och/eller nattflyet Spodoptera frugiperda. 6. Forfarande for kontrollering av skadeinsekter, innefattande att 20 exponera skadeinsekten for en insektpatogen och atminstone en mikroorganism som är naturligt assicierad med skadeinsektslarven. 7. Forfarande enligt krav 6, varvid skadeinsekten är vald fran ordningen Lepidoptera. 8. Forfarande enligt krav 6 eller 7, varvid insektpatogenet är Cydia pomonella granulovirus (CpGV) eller Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus (SfNPV). 9. Forfarande enligt nagot av kraven 6-8, varvid namnda atnninstone en mikroorganism som är naturligt associerad med skadeinsektslarven är vald fran gruppen bestaende av Metschnikowia arter, sasom Ascomycota och Saccharomycetes; Aureobasidium arter, sasom Ascomycota och Sordariomycetes; och Cryptococcus arter, sasonn Basidiomycota och Tremellomycetes. 14 537 424 10. Forfarande enligt nagot av kraven 6-9, varvid skadeinsekten är applevecklaren eller nattflyet Spodoptera frugiperda. 537 424 Applevecklaren - larvdodlighet 100 60 - a -- a ri bc Cryptococcus (g/L) 1 . 23 . 6 3. 6 Aureobasidium (g/L) . 1 . 2 3. 6 3. 6 Metschnikowia (g/L) 1. 2 3. 6 . 3. 6 . Socker (g/L) . 1. 2 3. 6 1. 2 1. 2

1. 2 CpGV (3.8 * 7/L) + + + + + + + + + + + + -I- + Vatten + + + + + + + + + + + + + + ±