SE536936C2 - Humant karboanhydras II med ökad fysikalisk stabilitet - Google Patents

Abstract

44 SAM NÉÅN DRAG En isoâerací pcsiypeptäd som har karbøarahydrasaktävitet, vars sekvens mot-svarar rnødâfierai humant karbcsanhydras ii är beskriven. Ber; šsoierade pow-peptâden innæfattar' mutatâorrerrra AZBC, Såäíl, LZOQC, 62053 isch V241C ochpoivpeptâden har ökad stabiištet järrrfërt med všiütyræskarboarrhydras ii. Vidarešnrwefattar poivpreptšderw üšsuâfšdbrvggorna nweiiarw (323 och C2í32 ochíeiirermeiian CQQ och (3241.

Description

536 936 en superfamilj av homologa proteiner, dvs deras gener har utvecklats från en gemensam ursprunglig gen. Bland de mest effektiva karboanhydraserna är oi- karbonanhydraserna från vertebrater med en katalytisk omsättningskonstant (kcat) på upptill 1,4 - 106 s'1, vilket är 1O7gänger snabbare än den spontana reaktionen. Dessutom är den katalytiska effektiviteten (kcal/Km) för t ex humant karboanhydras ll 1,5 - 108 l\/l'1 s'1, vilket är i närheten av en diffusionskontrolle- rad reaktion. Eftersom den naturliga funktionen hos enzymet ärt ex att under- lätta bortförande av C02 från blodet (humant karboanhydras ll, HCA ll) har det föreslagits att karboanhydraser kan användas som biologiska katalysato- rer i bioreaktorer utformade för att fånga C02 från olika gasflöden. Vid denna tidpunkt råder enighet om att koncentrationen av koldioxid i atmosfären är den mest bidragande faktorn till den ökande globala uppvärmningen, en slutsats som även dragits av lntergovernmental Panel on Climate Change (lPCC)[3].

Sålunda harflera kemiska metoder föreslagits och provats för koldioxidavskilj- ning och lagring (CCS). De flesta av dessa arbetar emellertid vid extrema temperaturer och utnyttjar skadliga kemiska föreningar och förbrukar fort- farande stora mängder energi med låg verkningsgrad. Om istället en enzym- baserad bioreaktor, som utnyttjar karboanhydras som katalysator, kunde an- vändas skulle energi- och miljöproblemen förknippade med kemiska reaktorer kunna lösas. Åtskilliga sådana reaktorer och processer har föreslagits i t ex WO2006/089423, U.S. Pat. nr. 6,524, 842, WO2004/007058, WO 2004/028667, U.S. 2004/0029257, U.S. Pat. nr. 7,132, 090, WO 2005/114417, U.S. Pat. nr. 6,143,556, WO 2004/104160, US 2005/214936 och US 7,892,814. De ovan nämnda processerna arbetar vanligtvis genom att bringa karboanhydras, antigen fritt i lösning eller immo- biliserat, i kontakt med C02 i lösningen. Men eftersom driftförhållandena så- som temperatur, pH och lösningens kemiska sammansättning etc emellertid kan variera stort beroende på applikation, är ingen av dessa processer av något värde, om den nödvändiga karboanhydraskatalysatorn inte är stabil nog för att fungera under de använda driftsvillkoren eller inte ha tillräcklig livslängd för att vara ekonomiskt användbar. 536 936 Olyckligtvis, eftersom det inte finns några organismer som lever under de villkor som kan råda i en COg-fångande bioreaktor, har naturen inte försett oss med ett karboanhydras med den önskade stabiliteten eller effektiviteten.

Däggdjurs-, växt- och prokaryota karboanhydraser har genom naturlig evolu- tion selekteras för att vara stabila vid de fysiologiska villkoren som gäller för respektive organism. Följaktligen är vanligen öt- and ß-klasskarboanhydraser- na endast stabila vid fysiologiska villkor, dvs ungefär 37 °C eller lägre. Det enda värmestabila karboanhydraset har påträffats hos Methanosarcina thermophile, som har en optimal tillväxt vid 55 °C och som producerar ett y- karboanhydras (Cam) med en värmedenatureringstemperatur (smältpunkt, Tm) på omkring 70 °C. Detta enzym har emellertid ett katalytisk omsättning som är ungefär 10 gånger långsammare än t. ex. humant karboanhydras ll (kw, pä ungefär 1,2 - 105 s* jämfört med 1,4 - 106 si). Den kätälytiskä effektiviteten är dessutöm ungefär 20 gänger lägre (7,5 - 106 lvl” - si) jämfört med 1,5 - 108 M4 - s'1 för humant karbonanhydras ll[4' 51. Andra egenskaper hos y-karboanhydras från Methanosarcina thermophila som gör det mindre intressant som katalysator i en bioreaktor är att det är ett homotrimert protein, dvs ett enzym uppbyggt av tre identiska polypeptidkedjor. Varje polypeptid- kedja innehåller 213 aminosyror och har en molvikt på ungefär 23 kD, dvs består totalt av 639 aminosyror med en molvikt på 69,15 kD. Detta kan jäm- föras med HCA ll, som är ett monomert protein på 259 aminosyror och med en molvikt pä 29,3 kolßl. En fördel med HcA || jämfört med cäm är sälundä att det inte kommer att inaktiveras genom dissociation av polypeptiderna. Ett annat problem förknippat med användning av y-karboanhydras från Methano- sarcina thermophila är att för att erhålla den mest aktiva formen av enzymet (FeZïCam), krävs det att det produceras anaerobt och att det skyddas från luft under rening och användning. Om dessa förutsättningar inte uppfylls oxideras det naturligt förekommande Fez* i aktiva ytan till Fes* och utbyts därefter med Zn2*, vilket sänker aktiviteten ytterligare 3 gångerwl.

Omvandlingshastigheten och effektiviteten är naturligtvis av stor betydelse för den tekniska och ekenernšska realâserbafheten av ett använda karboanhydras i någen 'form av COQ-fångande process. Skuile det således 536 936 vara möjligt att använda humant karboanhydtas li, skutie en bioreaktor be- tiöva ti) - 2G gånger mindre enzym (alternativt vara tt) - 2G gånger mindre med samma mängd enzym) än en motsvarande reaktor :ned t ex y-karbo- anhydras från Methanosarcina thermophila.

Enzymer är makromolekylära proteinbiomolekyler som har förmågan att fungera som högeffektiva, högpresterande biologiska katalysatorer och är fundamentala för allt biologiskt liv. De är ämnen som accelererar livets kemiska reaktioner utan att själva förbrukas i reaktionen. isolerade enzymer är således viktiga i många industriella processer för behandling av biologiska substrat. Enzymer för industriella och miljömässiga tillämpningar har därmed ett stort och växande ekonomiskt och ekologiskt värde.

En flaskhals vid användning av enzymer i industriella processer är att enzymer och andra proteiner måste behålla en mycket ordnad och veckad struktur för att vara aktiva. Men den mycket ordnade strukturen hos proteiner upprätthålls emellertid endast om proteinerna är stabila vid de rådande för- hållandena, dvs pH, jonstyrka, temperatur etc. som måste vara inom bestämda gränser, specifika för varje typ av protein. Med avseende på den naturliga selektionen av proteiner under evolutionen, betonas det faktum att en proteinmolekyl är strukturellt meningsfull enbart om den existerar under villkor liknande dem för vilka den selekterades, i sitt s k nativa tillstånd.

Grundläggande kan proteinstabilitet indelas i kemisk stabilitet och fysikalisk stabilitet. Kemisk stabilitet hänför sig till förändringar i enzymaktivitet som respons på olika kemiska förändringar, t ex deamidinering av asparagin till aspartat och oxidation av metionin. Förändringar i aktivitet kan bero på förändringar av aminosyror involverade i den enzymatiska processen eller bero på att det kemiskt modifierade enzymet förlorar sin struktur och därmed sin aktivitet. Fysikalisk stabilitet hänför sig till den inneboende förmågan nos proteinet att hitta och bibehålia sin struktur (och fötjaktligen aktivitet). Fysika- lisk stabilitet kan mätas på åtskilliga sätt, t ex som termodynamisk stabilitet, termisk stabilitet och kinetisk stabilitet, vilka samtliga är en funktion av sum- man av interaktioner inom proteinet och mellan proteinet och dess omgivning. 536 936 i strävan att designa mer stabila proteiner är det därför viktigt att förstå skiiinaderna ech 'iördeiariizm liksom de underiiggande inekanismerria, för xfarie typ av stabiiiiet för att kunna åstadkomma proteiner med önskad ökad stabili~ tet.

Termodynarnisk stabilitet är ett mått på skiiinaden ifri energi (AG) mellan de inaktiva uppveckade tillstånden (U) och det veckade nativa tillstån- det (V), i vilket enzymet är aktivt. Termodynarnisk stabilitet kan bestärnmas Linderjämviktsviiiker, em proteinet fritt kan veckas upp och aterveckas.

Denna två-tiiiståndsmodeli kan skrivas: VíPU Således är stabiliteten i detta fall helt enkelt skillnaden i fri energy mellan U- och V-tillstånden (AG = Gnppveckat - Gveckat) och stabiliteten är definierad som AGVU, där AGVU = -RT|nK.

K representerarjämviktskonstanten mellan uppveckat och veckat tillstånd (K=[U]/[V]) vilket innebär att ju mer termodynamiskt stabilt proteinet är, desto större är skillnaden ifri energi (AG). Detta kan även grafiskt representeras genom att rita ett diagram över skillnaden i fri energi mellan uppveckat och nativt veckat tillstånd (Se Fig. 1).

Förenklat kan således den termodynamiska stabiliteten ökas antingen genom destabilisering av det uppveckade tillståndet (högre energi för U) eller genom stabilisering av det nativa tillståndet (lägre energi för V), för att maxi- mera skillnaden i fri energi (AGVU) mellan de två tillstånden. Förändringen i fri energi måste vara lägre än noll (AG < O) för att veckningsreaktionen skall vara effektiv, dvs favorisera proteinets nativa tillstånd. Eftersom skillnaden i fri energi bestäms av reaktionens entalpi (AH, interaktioner) och entropi (AS, oordning) enligt AG = AH - TAS, kan ett gynnsamt AG åstadkommas genom att stärka det veckade tillståndets interaktioner, vilket leder till minskad entalpi 536 936 (t ex vätebindningar, jonbindningar, bättre packning av det inre av proteinet etc.). Detsamma, dvs en större skillnad ifri energi mellan uppveckat och veckat tillstånd, kan åstadkommas genom destabilisering av det uppveckade tillståndet. Vidare, för det uppveckade tillståndet, vilket kan antas vara en s k random-coil, kan detsamma uppnås genom att begränsa frihetsgraderna för det uppveckade tillståndet, vilket leder till lägre entropi hos det uppveckade tillståndet och därigenom en högre nivå på det uppveckade tillståndets fria energi.

Ett proteins smältpunkt (Tm), dvs mittpunktstemperaturen för upp- veckning, är ett mått på ett proteins termiska stabilitet. I industriella processer är det ofta önskvärt att använda enzymer med hög smältpunkt, eftersom det i många fall är fördelaktigt om reaktionen kan äga rum vid en förhöjd tempera- tur (högre reaktionshastighet, lägre viskositet, mindre mikrobiologisk tillväxt, mindre förorening etc). För proteiner som har potential att användas i indus- triella enzymbaserade processer ligger därför fokus ofta på att proteinet har en hög termisk stabilitet (dvs en hög smältpunkt).

Det är emellertid viktigt att förstå att vid standardtemperatur (25 °C) är AGvU-värdena för ett termolabilt protein inte nödvändigtvis lägre än för ett termostabilt protein, dvs hög termisk stabilitet är inte detsamma som hög termodynamisk stabilitet vid alla temperaturerlsl. Det är därför inte möjligt att härleda ett proteins smältpunkt genom att bestämma dess termodynamiska stabilitet vid omgivande rumstemperatur eller vice versa. Smälttemperaturen (Tm) är den temperatur vid vilken U och V är i jämvikt och är lika populerade och bestäms av AGFU(T) - funktionen. Detta inträffar när denatureringstrycket (temperaturen) är så hög att AGFU = 0. När AGFU avsätts som funktion av temperaturen uppvisar AGFu(T)-funktionen en skev parabel, som skär x-axeln två gånger (dvs både värme- och kölddenaturering sker) (Se Fig. 2).

Figur 2 illustrerar hur ett hypotetiskt proteins termostabilitet sålunda kan ökas på andra vis än genom ökning av proteinets termodynamiska stabili- tet (AGUF) vid standardtemperatur. Således är termisk stabilitet relaterad till, men inte likvärdig med termodynamisk stabilitet. 536 936 Det vill säga, vid omgivande rumstemperatur kan ett protein ha en rela- tivt låg termodynamisk stabilitet och ändock visa sig ha en relativt hög smält- punkt.

Kinetisk stabilitet är ett mått på med vilken hastighet ett protein upp- veckas (ku). Detta är särskilt viktigt för proteiner eller villkor som denaturerar proteiner irreversibelt till uppveckade tillstånd. Ett protein kan denaturera irreversibelt om proteinet i det uppveckade tillståndet genomgår någon per- manent förändring såsom proteolytisk nedbrytning eller aggregering (vilket ofta är fallet med termiskt denaturerade proteiner). k V íu> U a lrreversibeltinaktiverad I dessa fall är det inte skillnaden i fri energi mellan det veckade och uppveckade tillståndet som är viktigt. Denna påverkar endastjämvikten, och detta är inte en sann jämviktsprocess. För kinetisk stabilitet är det istället skillnaden ifri energi mellan det veckade tillståndet (V) och övergångs- tillståndet (ts#) längs uppveckningsvägen det viktiga, vilket bestämmer aktive- ringsenergin för uppveckningen (EA_ uppveckning). Följaktligen bestämmer EA_ uppveckning hastighetskonstanten för uppveckning (ku) och därmed med vilken hastighet en irreversibel inaktivering av det uppveckade tillståndet kan äga rum (Se Fig. 3).

Sålunda är detta på inget vis relaterat till den termodynamiska stabilite- ten (AGFU) eller den termiska stabiliteten (Tm) och andra metoder är nödvän- diga för att öka den kinetiska stabiliteten ijämförelse med för AGFU och Tm.

För att förändra den fria energin för övergångstillståndet behöver veckningsl- uppveckningsmekanismen för proteinet påverkas. Förenklat uttryckt, när en ensemble av proteinmolekyler veckas kommer de huvudsakligen att följa den snabbaste vägen som bildar veckningsintermediärer och övergångstillstånd på lägsta möjliga energinivåer. ivlen om denna väg inte längre är tillgänglig, kommer de att tx-'ingas att veckas via en aiternativ vag, vilken har vecknings- intermediärer och övergångstillstånd med högre energi. Detta kommer i praktiken leda till en väg som placerar övergångstillståndet på en högre fri 536 936 energinivå. Eftersom det veckade tillståndet har samma energinivå som innan (måste fortfarande vara i sin mycket ordnade nativa veckning för att vara aktiv) kommer i detta fall höjden av EA, unfolding att ökas och ger således upp- hov till en barriär mot uppveckning, vilket leder till en långsammare hastig- hetskonstant för uppveckning (kU).

För att ett protein ska vara värdefullt för någon tillämpning krävs således att det har ett stort negativt AGFU vid dess arbetstemperatur, så att proteinet arbetar klart under sin smältpunkt (Tm). Lika viktigt är att det behöver ha en hög kinetisk stabilitet så att proteinet bibehålls i sitt nativt veckade till- stånd och inte hamnar i uppveckat tillstånd, vilket kommer att göra det irrever- sibelt inaktivt. En hög kinetisk stabilitet kommer därför att leda till långsam uppveckning och en lång livslängd för proteinet. Detta gäller för alla förhållan- den och kommer till exempel att öka hållbarhetstiden för proteinet vid olika omgivningstemperaturer, men aktiveringsenergin för uppveckning (EA, unfmding) kommer också att ge upphov till en barriär mot uppveckning även om protei- net verkar nära eller till och med över sin uppveckningspunkt (termisk eller annan) och håller således hastighetskonstanten för uppveckning (ku) låg och livslängden hög även under villkor som medför uppveckning.

Det finns många sätt att stabilisera proteiner pålgl, antingen genom att stabilisera det veckade tillståndet eller genom att destabilisera det uppvecka- de tillståndet på olika sätt. Dock förlitar sig flesta metoderna för stabilisering av det veckade tillståndet på förstärkning av lokala interaktioner som bildats bara när proteinet väl är veckat och få leder till en väsentlig påverkan av veckningsvägen och därmed den kinetiska stabiliteten. Dessutom, på grund av att det ofta är hundratals aminosyror att variera och tusentals interaktioner inom proteinet och mellan proteinet och dess omgivning, är det mycket svårt att enkelt undersöka strukturen och peka på vad som skall ändras för att öka stabiliteten. Detta är även orsaken till varför kombinatoriska metoder som riktad evolution har utvecklats. Eftersom dessa metoder "slumpmässigt" producerar tusentals varianter av proteinet, vilka sedan testas med avseende på aktivitet under olika villkor, kan kravet på detaljerad kunskap om proteinets struktur eller förståelse av proteinstabilitet kringgås. För dem som är väl för- 536 936 trogna med mekanismerna bakom proteinstabilitet och konsten att stabilisera proteiner är det emellertid möjligt att designa stabilare proteiner genom kun- skapsbaserad proteiningenjörskonst. Ett attraktivt sätt att stabilisera ett speci- fikt protein genom kunskapsbaserad proteiningenjörskonst är att överföra strukturella motiv, som är kända för att vara stabiliserande, från en protein- homolog till den proteinhomolog som skall stabiliseras. På detta finns det åt- skilliga exempel beskrivna i litteraturenÜQm. Två proteiner anses vara homo- loga om de har identiska aminosyrarester i ett signifikant antal sekvens- positioner längs polypeptidkedjan. Den tredimensionella strukturen är emellertid mycket mer konserverad än sekvensen, vilket är lärobokskunskap i proteinkemi, och man har ofta funnit att proteiner med mycket låg sekvens- identitet fortfarande har liknande funktion och liknande tredimensionell struk- turerna. Således anses även medlemmar i sådana familjer vara homologa även om polypeptidsekvensidentiteterna inte är statistiskt signifikanta, utan endast strukturellt eller funktionellt signifikanta. Vidare innehåller homologa proteiner alltid en central region (strukturellt konserverat område), där den allmänna veckningen av peptidkedjorna är mycket lika. Detta innebär att ram- verket även för avlägset besläktade homologa proteiner med låg sekvens- identitet har liknande struktur. Det är dessa släktskap som gör det möjligt att överföra stabiliserande aminosyrakombinationer eller motiv mellan strukturellt homologa proteiner, om tredimensionella strukturdata finns tillgängliga. Struk- turdata kan ha sitt ursprung från röntgenkristallografi, kärnmagnetisk reso- nansspektroskopi eller modellering. Om två sådana strukturer från homologa proteiner överlagras, den ena med de stabiliserande interaktionerna av intres- se (mallen) och den andra som skall stabiliseras (målet), kan de stabiliseran- de aminosyrornas tredimensionellt strukturellt ekvivalenta positioner identifie- ras och förändras i målstrukturen.

Ett sätt att reducera frihetsgraderna (dvs entropin) hos det uppveckade tillståndet och således placera det uppveckade tillståndet på en högre energi- nivå är att introducera kovalenta bindningar mellan olika delar av proteinet.

Detta kan göras genom förändring av de ursprungliga aminosyrorna till cysteiner, vilka kan bilda kovalenta disulfidbryggor (S-S) om tiolgrupperna hos 536 936 de tvä aminosyrasidokedjorna är korrekt placerade i rymden. Att designa sä- dana bryggor är emellertid inte trivialt, eftersom geometrin hos en spännings- fri -CHz-S-S-CHZ brygga i proteiner är begränsad inom ganska snäva kon- formationsramar och avvikelser frän de geometriska begränsningarna kom- mer att införa spänningar i den veckade strukturen. Men just på grund av de geometriska begränsningarna är emellertid identifiering av disulfidbryggor särskilt lämpade för homologimodellering för att identifiera de aminosyra- positioner som skall förändras till cysteiner, för att införa disulfidbryggor i homologa proteiner, av vilka det finns en mängd exempel i litteraturenmml. Även om denna metod har en begränsad grad av tramgang, eftersom ersättningen av vildtypsaminosyrorna och introduktionen av en disulfidbrygga ofta leder till förlust av gynnsamma interaktioner eller spänning i det veckade tillständet, kommer den att leda till en högre termodynamisk stabilitet (AGFU), om det veckade tillståndet är opåverkat (Se Fig. 4).

Vidare, om den intörda disuttidhryggan sammantör deiar av proteinet som normait är i nära kontakt under tidiga skeden av veokniitgsprooessen. kommer det inte att påverka veokningsvägen ooh kommer sàiedes endast att öka den termodynamiska stabiiiteten oon eventueiit t/eokningshastigheten (under förutsättningen att energinivan hos det veckade tiiiståndet är opåver- kad). Gm erneiiertid den införda disuitidbryggan bringar deiar av proteinet samman, viika under normai veoknihg inte interagerar tidigt i veoknings- processen, kommer detta att ieda tiit att proteinet sannoiikt behöver veckas via en aiternativ väg, som har ett övergàngstiiistand med högre tri energi.

Under förutsättning att energinivàn hos det veckade tiiistàndet är opaverkad, kommer detta att ieda tiii att aktiveringsenergin för tippveokrting (EA, unfokiing) kommer att bit högre och därmed korttmer uppveckitingsnastigheten att vara långsammare och iivsiängden hos proteinet att ökas. Gm detta kan åstad- kommas har ett ideait protein konstruerats, med både en hög termodynamisk stabiiitet (och möjiigen med en förhöjd smäittemperatur) och en hög kinetisk staoiiitet. (Se Fig. ö).

Vid sidan av att potentieiit ha förmågan att öka bade den termodyna- miska ooh kinetiska staniiitetert hos proteiner, sa ar stabiiiseringen av entro- 536 936 piskt ursprung genom att begränsa det uppveokade tiiistandets frinetsgrader genom att en kovaient bindning (disuifidbrygga) inkorporeras. Ûet viii säga, de entaipistaloiiiserande interaktionerna som ernäiis genom införande av disulfidbryggor kommer inte att uppvisa nagot starkt temperaturoeroende, viiket annars kan försvaga eiier förstärka t ex vätetnindningar, saitoryggor, iontzindningar eiier nydrofotiinteraktioner. tfifiessutom betyder detta att stabiii~ seringen kommer att bii mindre påverkad av det omgivande mediets oiika egenskaper såsom poiaritet, jonstyrka eto, så att den reiativa ökningen av staoiiiteten kontrnei* att bieenäiias även i andra media än tntaffrade vatten- iösningar.

Fran det ovan nämnda kan det antas att för att öka ett proteins fysika- liska staidiiitet ännu mer är det bara att införa fier distiifidoryggor. tfiietta är emeiiertid inte okompiioerat av fiera skäi. För det första är införandet tiii den tried av en enda staoiiiserande disuifidttinditiitg en utmaning, eftersom ofta vad som vinns i energidifterens genom rninskad entropi i det tippveokade tiiiständet ofta förioras av det veckade tiiiständets entaipienergi, beroende pä föriust av iokekovaienta interaktioner etter att spänningar införts i strukturen, sä att AGVU för det muterade proteinet är lika eller till och med mindre än för vildtypsproteinet (dvs termodynamiskt destabiliserad). Introduktion av två eller flera disulfidbryggor kan således öka eller minska proteinstabiliteten. För det andra, med två disulfidbryggor närvarande kan proteinets veckningsväg bli blockerad, så att proteinet inte längre ärförmöget att veckas till sin nativt aktiva form. För det tredje, när fier än tvä oysteiner införs i ett protein är det en stor risk att oysteinerna oiidar disuifidbindningar med fei partner under syntes eiier t/eokning. Detta kommer alitid att ieda tiii ett inaktivt protein eftersom det inte korttrner att kunna hitta sin veokade aktiva korttormatiott.

Detta är även särskiit viktigt vid produktion av neteroioga (t ex däggdjurs) proteiner med fiera disuifidbindningar i rekombinanta system (t ex bakterier), eftersom bildandet av korrekta etter nativa disuifidoindningar i sådana systern är inyoket ineffektix/t, viiket ofta ieder tiil ett iägt produktionsuttuyte av funktio» neiia enzymer. 11 'IO 536 936 Sammanfattninq av uDDfinninQen Eftersom det inte finns några naturiigt förekommande karooannydraser som uootytter de krav som maste uoetyttas för att kanna användas i en enzymbaserad oioreaktor för att fånga C02, toretigger det ett behov att ot~ veokta konstruerade karooanttydraser som uppfytier de förväntade kraven och som är enkta ocn ekonomiska att trarnstàtta, nar en hög katait/ttsk aktivi~ tet, nar en hög tysškaiisk staoiiitet den en tång iivsiängd under otika förnaiian- den.

Syftet med föreläggande uoriiiarining ar därför att iösa de orobtem oon nackdetar som beskrivits ovan genorn att tâiinandanatia ett karboanitydras som är enkett och ekonomiskt att tštiverka, nar en hög katatytisk aktivitet, en nog tysikatisk stabititet bestämd genom termodyitainisk, termisk och kinetisk stabitätet och en tång tät/stängd under oiika törnåttanden.

Hetta trppnàs i eniignet med töretiggande trppfiawning med njäip av en isoierad potyoeptid som nar karboannydrasaktivitet, vars sekvens motsvarar rnoditierat humant karboartnydras tt, vari polyoepttden omfattar mtitatiorterrta A235), SQQC, LEÜQC, tlâtššS och V24t C och som har ökad stabâtitet jämfdrd med vitdtypskarboannydras tt och vidare ointattar disuttidbryggor metian C23 och C202 oenietter meiian C99 och C241.

Eniigt en uttörtngstorm nar den isoierade ootypeptiden med karbo- annydrasaktivitet en termodyawarnisk statsšiitet som ökat rned 23,5 kålmoi järn- tört med vitdtypskarboanhydras tt.

Eniigt en annan uttörtngsiorrtt nar den isoterade potypeptideii med karboannydrasaktävitet en smättpunkt som ökat med “E85 ° C jämfört med vtidtypskarnoannydras ti. t ytteriigare en utforingstorm nar den isoierade potyoeottden med kartnoannydrasaktšvštet en aktiveringsenergš 'för Lippveokning som ökat med tai/mot jämfört med vitdtypskarboanhydras ti. t en utfërtngstorm nar den âsoterade potyoeptiden med karboanitydras aktivitet en trppveckningsnastignet i vatten vid 21 ”C som är cirka 22 G00 gånger iàngsamanare jämtërt sned vttdtyps humant kartsoaztnydras it. 12 536 936 Eniigt en utföringsferrn nar den iseierade poiypeptiden med Karpa- anifydrasaktivitet en nalveringslivstld på 86 dagar vid 6G °C, 8 dagar vid 65 “C den 1,5 dagar vid 7D °C.

Eniigt en annan utföringsferm bibenaiier den isolerade peiypeptiden med karboannydrasaktivitet sin ökade fysikaiisita stabilitet jämfört med vild» typskartzeannydrae ll i vatteniöeningar av etaneiarniner, innefattande rnetyi- dietanelarnin (it/EÜEA), rneneetanolantin (MBA), dietanelamilw (ÜEA) enn airlinnetexietanei.

Enligt ytterligare en utföringsferm nar den iseierade polypeptiden med karbeanfiydrasaktivitet sekvensen enligt SEKV lf) NR: S.

Syftet med föreliggande uppfinning uppnås vidare genom en rneted för att öka den fysikaliska stapiiifeten nes karpoannydraser (EC 42.23 vaida från superfainiljen med naturiigt förekommande efter medifierade (ekarna- annydraser, omfattande insättning av en knrnpirtatien av tva stabiliserande disuifidbryggoi' vid de tredimensienetit ekvivaienta eller seitventiellt nemeiega positionerna till C23, C39, L202 den X/Efl-t i SEKV ti) NR: 8, inetsvarande positionerna A23, SQQ, LZGZ den Vårt-f i humant karpoannydras il.

Föreliggande uppfinning hänför sig även till en konstruktion omfattande en peiyçfeptid enligt föreiiggande urzfpfinning, eperapeit kopplad tiii en eller fiera kpntrelisekxferteer sem styr produktionen av pelypeptiden i en expres~ siensvärd. i en utföringsferm hänför sig föreliggande uppfinning till en rekömtiinanf expressiönsvetttor omfattande konstruktionen eniigt uppfinningen.

Syftet med föreliggande uppfinning uppnås vidare med ftjaip av en rekenteinant vardpeil omfattande konstruktionen enligt uppfinningen eiler den rekernplnanta expressiensvektnrit eniigt uppfinningen.

Syftet med föreliggande uppfinning uppnås vidare genom användning av en isoierad peiypeptid med ltarbeannydrasaktivitet i eniignet med före liggande uppfinning för extraktlon av koldioxid från ett itoidiexidinnenàilande medium.

Eniigt en annan utföringsfprrrl är det keidipxidinnenàiiaiwde mediet en gas. 13 536 936 i en uttëringeterrn år gasen en räknas, biogas, ventilationsgas eller riaiurgas. i en annan utidringsfdrm är det i-:eidiexidinnenåiiande mediet en vätska. i ytteriigare en utföringeierm är det iteidiexidinnenåiiande mediet en iiertaeblandiiing.

Eniigt en niföringeierin sker extraktidn av keididxid från ett ifloidiexid- innenåiiande medium i en biereakter.

Föreiiggande uppfinning avser vidare en metod för preparation av en isoierad peiypeptid eniigt SEKV iD NR: 8, omfattande acceieratioit av biid~ ningen av disnitidbrygger genom initubering av peiypeptiden vid iörndida temneraturer från 25 tiii 80 °i3 i nårx/are av ett exidatienenwedei vid ett pH på 749. “ii/idare hänför sig itireiiggande uppfinning tiii en isdierad poiynukieoiid med en sekvens som koder för en poiyeeptid eniigt iëreiiggande uppfinning.

Eniigt en ntföringeierm nar den ieeierade eeiypeptiden âtrninetene ïö % återstående COQ-nydratiseriiigeaktivitetjårniörd med pseude-viidtyps iiCA ii. i en utföringeforni nar den isoierade poiyneetideafi en termodynarniek stabiiitet eà 54 kit/moi. i en annan uttöringeiorin har den iseierede peiypeptideit en sinaiteunkt på 727,5 °C efter ininibering i 15 min. i ytteriigare en utiöringsierni har den ieeierade peiypeetideii en åter- stående CGg-nydratieeringeaktivitet på "iGÛ % efter inkuberiifig i 15 min vid ïü °C. i en annan utiöringsrerm itar den ieoierade poiypeptiden en återetåem de COg-nydratiseringsektâviiet på åtminstone 2G % efter inkubering i 15 min vid 70-95 °C.

Eniigt en annan utföringsterm nar den iseierade peiypeptiden en åter- stående COZ-tiydratieeringeaktix/itet på iGt) % efter iiikubering i 2 tim vid 6:5 °C.

Eniigi ytteriigare en ntitiringeterm nar den isoierade pdiypeptiden en 14 536 936 aktiveringsenergi för uppveckning på 121 ktilmei. i ytteriigare en utföringsform har den isolerade poiypeptideii en upp- veckningshastignet i vatten vid Ei ”C på 4,2 x “itïg min”.

Enligt ytterligare en uttöringsforin nar den isoierade poiypeptiden åt- minstone 95 % identitet tried aminosyrasekveiwseiw eniigt SEKV ii) NR: 2 eiier SEKV ED NR: 4 eller SEKV iQ NR: 6 eiier SEKV til) NR: 8.

Eniigt en annan uttöringsfoitnt nar den isoierade polypeptiden minst QS % identitet med arninosyrasekvensen eniigt SEi-(V ED NR: 2 elier SEKV iQ NR: 4 eiier SEKV ti) NR: ES eiiei' SEKV ED NR: 8.

Kort beskrivning av figurerna Figfi är en graf som iiiustrerai' definitionen för skiiinaden i fri energi meiian det uppveckade tiilståndet (ti) och det nativt veckade tiiiståndet (V) nos ett protein (AGvui). Grafen visar vidare hur den termodynamiska stabilite- ten kan ökas genom Stabilisering av det veckade tillståndet (AGVUZ).

Fig. 2 illustrerar sambandet mellan termodynamisk och termisk stabili- tet och att kunskap om den termodynamiska stabiliteten vid en enda tempera- tur inte ger någon information om smälttemperatur (Tm) för ett protein. AGVU (T)-funktionen för ett hypotetiskt termolabilt protein (_) med dess smält- temperatur (Tm) och den möjliga ökningen av Tm genom upplyftning (-- - ), högerskiftning (- - -) och utplattning (-----) av AGFU (T) -funktionen (anpassad från ref. 8).

Fig. 3 är en graf som illustrerar definitionen för aktiveringsenergin för ett proteins uppveckning (EA_ uppveckning) bestämd genom skillnaden i fri energi mellan det veckade tillståndet (V) och övergångstillståndet (ts#) på uppveck- ningsvägen.

Fig. 4 är en graf som illustrerar hur den termodynamiska stabiliteten (AGvu) för ett protein ökas genom begränsning av det uppveckade tillståndets frihetsgrader genom införandet av en disulfidbrygga (USS), således placeran- de det uppveckade tillståndet på en högre energinivå.

Fig. 5 är en graf som illustrerar den resulterande ökningen i både termodynamisk stabilitet (AGVU, 3-3) och aktiveringsenergi för uppveckning 536 936 (Elsas), för ett protein med en disulfidbrygga insatt i positioner som påverkar både det uppveckade tillståndets frihetsgrader liksom veckningsvägen och därmed övergängstillståndet (.....). Jämförelse är gjord med ett omodifierat referensvildtypsprotein (wt). (_).

Fig. 6 är en graf som illustrerar enzymvarianternas motstånd mot uppveckning i ett denatureringsmedel som fraktion av uppveckat protein som funktion av Gu-HCI koncentration för SEKV ID NR: 2 (O), 4 (I), 6 (III) och 8 inkuberat över natt (e) och SEKV ID NR: 8 inkuberat i 2-5 dagar (O).

Fig. 7 A-C illustrerar livslängderna vid 60 °C (Fig. 7A), 65 °C (Fig. 7B) och 70 °C (Fig. 7C) för SEKV ID NR:2 (O),4 (I),6 (III) och 8 (o). Observera att SEKV ID NR: 2 endast är mätt vid 60 °C eftersom den omedelbart in- aktiveras redan vid denna temperatur (Fig. 7A) och att SEKV ID NR: 4 endast är mätt vid 60 och 65 °C (Fig. 7A och 7B). Den enda variant som har en an- senligt lång livslängd vid alla temperaturer är polypeptiden SEKV ID NR: 8.

Detalierad beskrivninq av föredraqna utförinqsformer av uppfinningen En aspekt av 'föreliggande uppfinning är att tillhandahålla ett ertzym som har en tillräckligt hög fysikalisk stabilitet för att göra biereakterer, som är utformade och kapabla att extrahera C02 fran ett Cilla-innehållande nieditini, praktiskt och ekonomiskt genemförhart. lvfed föreliggande beskrivning tillhandahålls en konstruerad, högeffek- tiv, human karheanhydras li variant sem har en ökad fysikalisk stabilitet he- starnd genem terrneclynamislt, termisk och kinetisk stabilitet samt förlängd livstid.

Det stabiliserade humana karbeaithydraset il i enlighet med före» liggande uppfinning har en terniedynamisk stabilitet ökad med 23,5 ktlimol.

Föreliggande uppfinning tillhandahåller vidare ett konstruerat humant karbeanhydras ii som är värmestabiit och har förmåga att katalysera hydrati- sering av C02 vid nerrnala ech förhöjda temperaturer under lange tids~ perioder. Värrnestabiliteten enligt föreliggande uppfinning tillhandahåller ett karboanhydras som har en smältpunltt på 77,5 “C och bibehåller "ltlü % CIÜZ» 16 536 936 nydratiseringeaktivitet under minst 15 min vid 7G °C een har mer än 29% kvarvarande CGQ-ttydratiseringsaktivitet vid 95 “C i minst i5 min.

Föreiiggaitde uppfinning tiiihandaitäiier även ett kenstruerat kinetiskt staniiiserat humant kareannydras ii sem har en aktiveringsenergi för upp- veekiwiitg (EA, unfading) ökad med 25 kit/moi een en hastighet för uppveekiing (ka) vid omgivande temperatur sem är cirka 22 ÛÛÛ gånger iångsammare än for viidtvpsenzyrnet.

Föreiiggande upptäckt tiiinandaiiåiier vidare ett konstruerat humant karbeanhydras ti som eibehàiier sina reiativa staeiiiseringsegenskaper i iríirhåiiande tiii viidtypsenzymet även i andra iösningar än putirade vatten» iesningar t ex etaneianiiniösniiwgar.

Föreiiggande uppfinning tiiinandanäiiei' även en meted för att ekene- miskt oen effektivt trarnstäiia muterat humant karbeannydras ii i eniignet med “iöreiiggaitde uppfinning.

Föreliggande uppfinning tiiinandahåiier vidare peiynukieetider som kedarför viidtyps och konstruerat numant kareoanhydras ii i eitiignet med uppfinningen.

Fereiiggande uppfinning nänftjr sig tiii en gentekniskt konstruerad variant av enzymet humant karbeaiinydras ii som nar aminesyrasekvensen eniigt SE-IKV iD NR: 8, viiket har väsentiigt ëkad iysikaiisk staniiitet, definierad genom ökad termisk, termodynaniisk och kinetisk ataeiiitet ijàmtdreise med sina ursprungsenzymer, viika nar aminesyrasekveitser eniigt SEKV ti) NR: 2, 4 een ti. Nukieotidsekvenserna som motsvarar SEKV ii) NR: 2, 4, (5 een 8 visas i SEEKV ti) NR: 'i, 3, 5 respektive ?'. Den ökade fvsikaiiska stabiiiteten ger enzymet de egenskaper sem gör att enzymet kan utnyttjas, med en ökad iivsiärigd, vid tdriidjda temperaturer (dvs iiögre än 3? °C) een i andra medier än eutirade vatteniösningar tt ex i rnetyidietaneiaminiösningar).

Vidare ieder kembinationen av SEKV it) NR: 2, 4 den 6 tiii egenskapen na nes SEKV EE? NR: 8 som gör att den kan tiiiverkas pä ett ekonomiskt nar- kraitigt sätt. En aspekt av tippfinningeii är användningen av stabiia Karine- annydraser sem kataiysaterer i niereakterer för avskiiining een iagring av (Bilig från CGB-iiaitiga gaser, vätskor eiier tieriasbiaiidiiingar. Föreiiggande upp~ 17 536 936 tinning är aärskiit viktig nar en iörriangd iivsiängd önskas ocn/eiier :tar tenipe- returen nes det íštjig-innenåiiande mediet är över srnaitpunkten för naturiigt itirekonimande eiier konirnersieiit tiiigangiiga karboanitydraser. Föreiiggande uppfinning är dessutom användbar bade for upptag (nydratisering) av CÛZ och eftertöijaiide återvinning av bikarbonat (denydratisering) av det tidigare upptagna (392.

DEFiNiTiONER “Karbeannycirasfl eon törkertningen "CA" används onivàxiande för att hänvisa tiii en ooivoeptid som nar eitzyrnatisk EC 4.2.1 .i aktivitet och som kan kataiysera den reversibia enfivandiingen av keidioxid och vatten tiii oi- karbenat een en preton.

"Human karbeannydras ii" och "HCA ii" används oinväxiande för att beteckna isoforrn 2 varianten av nnrnant karbearinydras ii.

"Všidyp" eiier “naturiigt förekommande" avser den torrn av poiyoeotiden eiier peiyritrkieetidsekvensen som tinns i naturen een sein inte avsiktiigt nar motiiiierats genern rnäiwskiig ntanipuiation.

"Pseucieviidtyps niinwant karbenaniivdras ii" CHCA iimfi hänför sig tiii en variant av humant karboannvdrras ii med egenskaper sorn ernöiiigt kan särskiijas iran viidiyps ntiiriant karboannydras ii med den riaturiigt 'iöre- kernrnande oysteinen i position 205 utbytt genoni genrnaiiiptiiering tiii att istaiiet keda för aniinesyrait serin (62953). Konventioneii beteckning för iiurnana kariaeaiinvdras isofiorrnssekvenser hänvisar ibiand tiii positioner i iörnåiiande tiii oositienerna i nurnant karbearwnydras i oen nurnraring kan saiedes skiiia sig rneiian oiika piibiikatiener. Om inget annat uppges anges erneiiertid aiia positiener i denna text tiii de sekvenser och pesitiener som detinieras i SEKV ED NR: 1-8.

”Modiiieracie” poiypeptider' eniigt tipptiiiningen innetattar poiyoeptider som nar yftteriigare niiitatiener, trnnkerade varianter av poivpeptidkediorna och eoiypeetider earn nar en eiier flera aminosyror adderade tiii den N» eiier G-terrninaia delen av peiypeaticien. 18 536 936 EXEMPEL Exempel 1 Val av mutationspositioner De valda positionerna för mutation och införandet av cysteiner basera- des på upptäckten att den terrnodynamiska stabiiiteten nos tva tidigare produoerade disuitidvarianter av i-iCA iipwi ökades vid omgivningsteinperattir (23 °oi i” *i (siat-tv in rie; 4 sei e i. i dessa tva iiiaiviaueiii kensiitieraee disuitidbryggevarianter, biidar eystein i position 99 en disuifidbrygga med oystein i position 241 i en variant (SEKV iD NR: 4) och i den andra varianten (SEKV iii) NR: ti) biidar oystein i position 23 en disuitidbivgga med oystein i position 292.

Emeiiertid var de iiesta av de andra viktiga parametrarna vad gälier aktivitet den stabiiitet för dessa varianter okända. išitersom tdiiafide informa- tion inte bara kan iiariedas från kunskap av den terrnodynaniiska stabiiiteten vid omgivande temperatur, bestämdes sinäitpunkten, stabiiiteten i 30 % etanoiarniniösning, kinetisk stabiiitet, uppveokningsnastigtiet och iii/stängd vid tdrnöjda temnerattirer na bada varianterna eniigt föiiande exemnei. Från den- na information inses det att bada varianterna individueiit besitter egenskaper titöver den termodynamiska stabiiitetefi, som är värdeiuiia för karboaniiydra- ser som ska användas i en indnstrieii process designad tor att fånga C02.

Säiedes skdile en kombination av de två varianterna kunna ieda tiii en enzym- variant med fiera av de nödvändiga egenskaperna förbättrade. ivten som kan förstås från bakgrundsintorrnationen kan detta emeiiertid inte utan vidare tas för givet titan den nödvändiga designen av en kombinerad variant och karak- täriseringen av densamma.

Tiii yttermera visso kan en kombination av tva disuitidbryggor mycket väi ieda tiii att proteinet inte iangre kan veckas eiier att oysteinerna biidar disuifidbindningar med en ieiaktig partner och därigenom veckas tiii ett icke- nativt tiiistand. För en av varianterna (SEKV ID NR: 6) var det tidigare funnet att en metod utöver det vanliga krävdes för att bilda disulfidbryggan på en acceptabel tidsskala, vilket skulle hämma storskalig produktion av enzy- 19 536 936 metnßl. Den tidigare föreslagna metoden skulle för en storskalig produktion av enzymet vara svår att implementera till en ekonomiskt genomförbar industriell produktionsprocess av enzymet. Således, baserat på de experimentella resul- taten av de två enkeldisulfidvarianterna av enzymet designades en ny dubbel- disulfidvariant, vilken producerades och karaktäriserades (SEKV ID NR: 8).

Exempel 2 Riktad rnutaoenes av l-lCA lim. ššamtliga varianter framställdes genom samma metoder. Som mall för ytterligare inodifieringar användes en nukleotid (SEKV ED NR: t) som kodar for en välkänd variant av HCA ll med den enda oysteinen i polypeotid- sekvensen vid position 2% (SEKV ED NR: 2) ersatt med en serinllï. An» vändningen av denna variant förhindrar felaktiga disulfidbryggor frän att bildas mellan någon ny inlörd oystein och den annars enda naturligt färekomrriande oysteiiieii i position 2%. Benna variant av HCA ll nar dessutom egenskaper som är omöjliga att skilja från viidtfy-'ps HCA ll och identifieras därför som ett pseudovildtyps numant karnoannydras li il-lCA lime-i). Nukleotidsekvensen som kodarför l-lCIIA llpwi klonades in i plasmiden pACA, en vektor tär TïRNA» polymerasstyrd expression. Produktion av T? Riißepolvmeras är i sin tur under kontroll av en lao-promotor, den därmed kan produktion av det klonade HCA ll-proleinet aktiveras genom tillsats av laktos eller analoger, såsom iPTG. Plasmiden bibendils i en latioratorieuttryoksstam av E. coli (BLQHDES).

Plasmider framställdes genom användning av Qiagens plasmidpreparations- kit i enlighet med tillverkarens instruktionen lvlutagenesoligonukleotider designades och beställdes enligt specifikation från ÜNA Technology Aå (Üanmark). HCA llpwas nukleotidsekvens, som finns i de renade olasmiderna, var daretter 'föremål för riktad mutagenes med användande av ovannämnda DNA-oligomerer och Quioktïnange ® riktade niutageiieskit fran Stratagene.

Efter rening av de oenandlade plasmiderna, sändes prover av plasmiden tor sekvensering (SATC Grnbli, Tyskland) for verifiering av korrekt önskad sek- vens oon mutationer. Eštter verifiering användes olasmlderna tor att trans formera en ny uppsättning av BLZtIDEIš celler, vilka odlades till en oelltatnet av rxa GD i vid A850 i 2G ml 2 x LB-inediuin. Cellerna överfördes i prover om 536 936 509 pL tiil Eeeeridorfrör den biandadee :ned ätit) pL 5G % giycerei een fryetee i iiytande kväve. E. ceii stammarna iagrades därefter vid - Hi °C.

Exerngei 3 Preteingreduktien Samtiiga varianter tremetaiidee med samma metoder. 2 x 15 mi över» nattekuiturei' med 5G mi. trenetermerad BLÉtIÜEB, innetiåiiande piaenwider som när det rnuterade HCA iipwi, den ediad i LB-rrieditint vid 3? ”CL överfördes den ertvärtdee fär att inokuiera 2 x 1,5 L LS-medium i ekaktiasker. Ceiierna tisk växa vid 37 °C tiii en eeiitatnet pà c:a GD (3,8 vid Avtßg den irempietteradee sedan med EPTG den ZnSO-e tiii en siutkoneentration för vardera om t mivt, varpå cetierna lämnades för att producera proteinet under itatten. Ceiierna i ediingekuituren eedimenteradee genom eentrifugering vid 39% >< g den eupernatanten kaeseradee. Ceiierne àtereuependeradee i 40 mi ti) mivi tris- HBSOtt, pH ätt. Ceiienepeneienen utsattes därefter för uitraiitidebenandiing *för att bryta sönder ceiivëggarna och frigöra ceiiinnenàiiet. Ceiietispeitsidnen centrifiigerades därefter vid “iGGÜG >< g i 3G min den eiipernatanten innenàiian de det producerade muterat HCA iipwi upeearniades. ett för edpernataawten jueteradee tiii ena ett 9 med trie bas. Stipernetanteiw tiiandedee med eze ti) mi av en aftinitetegei för HCA ii (Bietäad Civiegarde med en euitenamid keppiad tiii matrisen) den 'rick stå i St) min innan den appiieerades på en krernategrati- iteienn.

Geien tvättades med fiera bäddvniynier ti) mit/i tris-i-ig-Sålht, rat-i 9,t3 under registrering av Agge När ingen ytteriigare förändring av Am kunde detekterae eiueradee proteinet med 'id intvi trieHZSOvr, ett 7,12) och 6,5 tvi ezid.

Eiuatet uppeainiadee den öt/ertördee tiii diaiyeeiangar med en rneieiryivikte- gräns på tt) kDa (it/iiiiipere) och diaiyeeradee sedan mot 5 x ti) L diaiysbutiert (tt) mivi trie-HQSQ, pH 7,5) med minst 8 timmar meiian varje butiertbyte. De diaiyserade ereteiniësningarna uppsamiades därefter den kdneentreradee i eentrifugrör med en meiekyiviittsgräne på ti) kDa.

Kdncentratien av erdteinerovet bestämdes genom Aggg-mätning med användning av en extiitktionekeetticient em = 554% M” ernf Preteinprevet anaiyeeradee ytteriigare med avseende na renhet genom tëveriaddriing av 21 536 936 preteinprevet (fi) pg ner brunn) på en SBS-PAGE. Efter SBS-PAGE- körningen färgades preteinerna i geien rned Cernrnassie Briiiiant Både. För varje producerat proteinprev befanns att inget annat oroteinpand visueiit kunde detekteras. Saiedes, ettersem preteinerna ansags vara rena kunde de rndterade varianterna av HCA ii bii törernài för tftteriigare anaiys.

Exernpei 4 Detekterind av fria evsteiner Aiia varianter som innenöii evsteiner anaiyserades med sarnrna mete- der. Fria eysteiiter, dvs ickeproduktiva eysteiner som inte nade biidat en evstinrest med sin förväntade partner den därmed inte nade biidat en staidiii- serande disuifidbrygga, detekterades rated iflkior-ši-iiitrobenzefurazan (N85- Ci). Protein, tris-H2SO4 pi-i "Lö den guanidinnydrekierid (Gudflitïi) biandades tiii en siutkancentratien på 'iïfi pM, 9,1 iVi respektive 5 tvi. Fria cysteiner detekterades genom att observera tidsförioppet för A429 i 30 rnirt rned en spektrofoterneter (Hitachi U-Éüíit) etter tiiisats av ett tiefaidigt överskett av NBD-Ci itït UM). Sent referens kördes ett prov av HCA iipwi (som inte nar någon oystein antindsyrarest). Gm det finns tria cysteiiter kommer NBD-Ci att reagera rned tioigrtippen een biidar en eysteiii-NBD-förening; som absorberar ijus i det syniiga vagiäitgdsornradet (biir gui). tvied en extinktienskeetfipieitt på saga = 139136 tvi” ern" för system-NBD, kommer en fri eystein per protein att ge en absorbans Atea på 0,22 vid den använda koncentrationen av protein etter reaktionen, och fyra fria eysteiner kontrner saiedes att ge en absereans ßazfl på (3288. Ben enda disnifidvariant som inte visade ökning av absorean~ sen vid 426 nrn efter reaktionen var enkeidistiifidpryggevarianten SEKV ED NR: 4, viiken darnted inte nade någon fri eystein den därmed nade sin enda disuifidbindning 'tutiständigt Litbiidad. Den andra enkeidisuitidvarianteri (SEKV fi? NR: 6) var, som tidigare visats, inte förrndgen att spontant piida sin di- suifidbrygga mi. Ännu viktigare visade det sig att den nya dubbeidistiifid varianten (SEKV ED NR: 8) även nade da 599,6 fria eysteiner (2 av 4 evsteiner som inte biidar en disuifidbrygga). Bet rriest troliga är att detta indikerar att en disuifidbrygga nade pšidats spontant, medan den andra disiiifidbiryggan inte biidades under produktion av ertzyntet SEKV iD NR: 8. Saiedes behövdes en 22 536 936 rneted titveekiae, för att biida den saknade dieuifidbryggaiw.

Exerngei 5 Biidnind av dieuifidbrvdner för SEKV it) NR: 6 den 8 På grund av Eàg stabiiitet hes den reducerade terrnen (Cm) Fn på dj? tvi ea-iieiiiiti, :areas aeiiiriaeiyggah från eakv in na; e med en kantin me» ted earn tidigare har beskrivits i iitterattirenüß, den earn reeuiterai” i ett pretein rried bada eyeteinerna reagerade i en korrekt dienitidbrvgga och rned bieehai- ten nativ och aktiv kentorrnation. Dubheidisuitidbryggevarianten fran SEKV tili NR: 8 hade enieliertid endast hiidat en av de tva disaitidbryggerna. iviest tro- íigt var det disuitidbivggan från SEKV ED NR: 4 som hade biidate, rhedan di~ snitidbryggan tràn SEKV EE) NR: 6 inte hade biidats, anaiögt rned beteendet för de individueiia dieuitidbryggex/arianterna. icke desto rnindre, oberoende av viiken av de tva dieuifideryggorna som hade iaiidats, kornnwer var den en för sig individtieiit att ieda tiii en högre etatæiiitet av proteinet. Saiedee, ietäiiet för att använda den tidigare beskrivna kemiska rneteden för att öka den struktu~ reiia tiexibiiiteten tör att iinderiätta för cyeteinerna att finna varandra, kan hiidandet av den andra disuifidbryggan åstadkommas genom att tiiiata reak- tionen att äga ruin vid förhöjda tenteeraturer.

Bärtöi: utveckiadee en aiternativ rnetod tiii den kemiska rneteden eorn artvënts för att öiida dieuiíidbryggan nde SEKV ED NR: 6 för dubheidisuitid- hryggevarianten SEKV ti) NR: 8: Ešttereent sinàitpunkten för den rninet etahiii~ eerade varianten (SEKV EB NR: 4) ökas med Tf: “C :ned en hiidad disuitid- brygga och ar onaverkad av inituhering vid temperaturer < 55 “C (se exernpei å), ekuiie den dtibhia dietiitidt/arianten av SEKV ti) NR: 8 effektivt kunna in- kueerae vid åt) “(3 för att indueera eiidning av den andra dienitidbryggan dö- nerad 'från SEKV ii) NR: ö. i syfte att verifiera detta tiiivägagangssëtt utferrna~ dee en experinienteii anaiys. Två etainiösniitgar initehaiiande 85,5 UM av proteinet (SEKV ti) NR: 8 rned endast en disuifidbrygga bildad) i 50 mivi tris~ H2S04 ett 8,5, kernpietterad :ned en “iGG-taidigt högre koncentration av oxida- rad ditidtreitei (DTT), tzereddee. En iöening inkiiberadee vid rumstemperatur rnedan den andra inkuheradee i ett vërnteekan vid 5G °<3. Vid vissa tidpunkter taga prover 'från etarniöeningarrta och fria eysteiner mattes earn beskrivet i 23 536 936 exemoei 4. Det visade sig att gendm inktibering av provet vid 5G “C att denna itietod gav ”iGQ % tiiidniitg av disuiiidbrygga i SEKV itä NR: 8 inom 24 timmar.

Vid denna tid nade provet som inkiiberades vid rumstemperatur endast biidat 9:a 2G % disuifidbryggor. Proven anaiyserades vidare med SBS-PAGE, viiket visade att inga dimerer nade bildats under den termiska processen, viiket indikerar att korrekta disuitidbryggoi' nade biidats. i fraga om tiiiämpbarnet av enzymet SEKV iD NR: d är detta ett mycket viktigt resnitat, eftersom det inne- här att storskaiig produktion av varianten är genorniörbar. Deivis därför att, jamtört med den tidigare beskrivna kemiska metoden, en mindre mängd kost~ samma kernikaiier behövs, eftersom ingen tiiisats av Gud-tili ar nödvändig i processen.

Vidare behöver den färdiga enzymprodtikten inte nedströms bearbet- ning för rengöring från denattireringsnwediet íšu-Híli. Ytteriigare är reaktions~ itastigiieteri med SEKV ED NR: 8 den den beskrivna “termiska" metoden snabbare (24 ii för *iÜO % disuifidbryggebiiditing) än den keiniska metoden, ettersoni den äger runt vid förhöjda ternoeratiirer. Detta kan jämföras med hastigheten för disutfidbrvggebiidning i SÉKV ti) NR: 6 med användning av den tidigare beskrivna kemiska metoden (ttlitli timmar för “iütli % disuitid- bryggebiiditing).

Exerngei ß Staoiiitet mot denatureriiidsinedei i vatteniösnind och i 36% metvidietanoi- amia Proviösniitigar aa 0,85 pM av var och en av de beskrivna HCA it vanan» terna av SEKV EB NR: 2, 4, 6 den 8 inkuberades i ruinsternperatur över natten (cca 18 timmar) i ökande mängder av denatiireringsmediet Gdd-iíïi (t) - 6 tvi) i btrtirade iöeningar (0,1 tvi tris-HZSCA pH 25). För metyidietanoiarttintivtßšßty mätningarna innenöii iösningen även MDEA i en siutiig koncentration av 3G Wii. Fiuorescensspektra registrerades för varje variant vid aiia vaida GUHCL konoentrationer i en sbektrotiuorirneter (dobinYvon Fiuoromax 4). Excite- tionsvagtängden var 295 rim den tre aektiinuierade emissionssbektra registre» rades för varje drev meiian 31 tš-rtdd rim. Fran spektnirnen bestämdes vag» iangdsskittet. Data ndrmaiiserades den brakdeistörandringen som en 'funktion 24 536 936 av Gu-HCi-konoentratioiweifi bestämdes. Därifrån bestämdes vid viiken Gu- HGi-koneentration inittpoitkten för uppveeknirtg (Cnrvfu) inträffade för varje variant i bada medierna. För prov inkuberade i huffrad vatteniosniitg upp~ nådde HCA iipwi (SEKV it) NR: 2) och de två enkeidistaifidvarianterna (SEEKV it) NR: 4 een 6) tidigare funna värden (Cave pa fi), 1,40 respektive 1,85 fvt Gu-Híli). Oväntat nådde den nya varianten SEKV 5D NR: 8 en syntaariigt niyoket hög Crave na 2,6 tvi Gu-HCE, viiket är högre än summan av varje en- skiid disuifidtiryggas stabiiisering (1,0 + QA + 0,85 = 2,25 tvi GtiHCi). Detta kunde betyda en av tvä saker. Antingen att det är nagon svnergistisk effekt i den termodynanfisa staoiiiteten, viiken gör det donnie disuifidoryggeenztfrnet SENV EU NR: 8 i sjäiva verket terrnodyiiainiskt stabiiare än summan av stabi- tiseriitgen frän de tvä bidragande enkeivarianternas disuifidhryggor. Aiterna- tivt, att den kinetiska stabiiiteten hos SEKV ED NR: d var ökad, sä att det» veekningsttastigheten var iangsammare och därmed inte proteinprovet SEKV til* NR: 8 nådde jäntviktaiäget på 18 timmar. Üarfdr inkuberades exakt samma prover under ytteriigare 24 timmar (totait 42 timinar) innan data inaarniades igen. För Sfštív ti) NR: 8 noterades att kurvan nade skiftat tiii iagre korioeiwt- ratiener ooh stannade vid en Cart/U pä 2,25 tvi Gu-HCi. Ešaionda, fastän SEKV til* NR: 8 inte var fika motständskraftig mot denattireringsmedei som de in« tedande resuttaten antydde, är detta en avsevärd ökning av stabiiiteteit tre- stärnd genom Cm, »friden iiäintdreise med SEKV if) NR: 2, 4 och 6. Dessutom visar detta även att det är uopnåeiigt att gora en kombinationen av disuifid- Idrvggevarianterna SEKV til) NR: »fi een 6, eftersom proteinet fortfarande itan veckas den stabiiiteten uppnår summan av varje enskiid statniiiserande di» suifidtirygga (225 tvi Guitßi) och att därmed inga statditiserande effekter vad gäiier motståndskraft mot denattirerirtgsmedei nar gått 'iäriorade genom att konioiitera de tva.

Den iängsamnta ekviiibrerirtgen av SESKV tili NR: 8 är ett beteende som eniigt var kännedom inte tidigare har visats for nägra tidigare HCA ii- varianter. Beteendet impiioerar att dotïiheidäsuifidx/arianten SEKV EB NR: 8 har en hög kinetisk barriär rnot uppveokning. ilietta skuiie dä ieda tiii att upp- veokriingshastšgheten för SEKV HD NR: 8 är iängsamrrrare än för var ooh en 536 936 av de individueiia disuifidbryggevarianterna SEKV ID NR: 4 och 8, eeh att säiecies jämvikten mellan det veckade ech uppveckade tiltetändet tar längre tid att nä än för varje enskild disuifidbryggevaräant (SEKV ID NR: 4 och 8).

Tabell 1 Mittpunktskoncentrationer för uppveckning i ökande koncentration av Gu-HCI SEKV ID SEKV ID SEKV ID SEKV ID NR 8 SEKV ID NR 8 NR 2 NR 4 NR 6 (INKUBERING 3- (INKUBERING DAGAR) ÖVER NATT) ggflw) 1.0 1.4 1.85 2.25 2.8 IM Gu-HCI) ggflfw 0.3 0.75 1.2 1.4 MDEA (M Gu-HCI) Stabiliteten mot denatureringsmedel i 30 % MDEA följer samma trend, dvs SEKV ID NR: 2 har lägst CmA/U följd av SEKV ID NR: 4, 6 respektive 8 (se tabell 1). Således bekräftar resultaten att fastän MDEA allmänt destabiliserar proteinerna, så är den relativa ökningen i stabilitet frän de införda disulfid- bryggorna nästan opäverkad av de omgivande mediernas egenskaper, sä- som tidigare beskrivits. Därför har protein SEKV ID NR: 8 även i 30 % MDEA en avsevärt högre stabilitet än vad HCA lim-varianten (SEKV ID NR: 2) har.

Således är proteinvarianterna SEKV ID NR: 6 och 8 stabilare också i 30 % MDEA än vad SEKV ID NR: 2 är även i buffrad vattenlösning.

Exempel 7 Termedvnamisk stabilitet i vattenlösnine tiämviktekorfetanteeia (ti) I övergängsemràdet 'för varje enzymvariant, som erhållits i exempei 6, användes för att med den linjära extrapolerings» metodenfig i beräkna den termedyiaainâska stabiliteten av respektive enzym- variant i ren buffrad vatteniösning enligt sambandet AG LRTIn (K).

Tabeli 2 26 536 936 Terrnedvnarniek etabiiitet i butirad vatteniöening vid erngivningeteinperatur (21 “Ci Termodynamisk SEKV ID NR 2 SEKV ID NR 4 SEKV ID NR 6 SEKV ID NR 8 stabilitet (inkl 3-5 dagar) AG (H20) (kJ/mol) 30,5 39 46 54 AAG (H20) (kJ/mol) 8,5 12,5 23,5 relativt SEKV ID NR 2 Ubpenbariigen är den ökade inetstanciskratten nes SEKV ED NR: 8 mot Gut-iíïi-denaturering, eaeorn bedömt genern Cm vwvarden, en etfekt av en signifikant ökad ternfiodynarnisk stabiiitet. Vidare är den ökade terntodyiwainis- ka stabiiiteten nes SEKV ED NR: 8 nagot större än summan av den ökade stabiiiteten noe SEKV EB NR: 4 een 6 (8,5 + “i2,5 < 23,5), viiket indikerar en iiten synergistisk effekt.

Exerngei 8 Aktivitetaanaiveer av karbeaiwnvdraaer Aktivitetsanaivser användes för att rnäta förändringen i enzyrnaktivitet som respons på förändringar i viiiker (denatureringernedei och tenieeratiir) för att bestämma ernäitternberaturer (im), uppveckningsnastigiieter, kinetisk stabiiitet och iiveiängd vid förhöjda teinperaturer. Aktiviteteanaiyeer är även viktiga för att fastetäiia den abeoiuta aktiviteten nes nroteinvarianterna SEKV 5D NR: 4, e den 8, i törnaiiaride tiii beeudeviidtynsenzyinet, eftersom vad sörn önskas är högsta rnöiiiga kataiytieka aktivitet een effektivitet även nes de konstruerade varianterna.

Ett tiertai varianter på koieriinetriska anaiyser av CQQ-bydratieeringe- 1929' m, viika aiia är baserade aktiviteten har tidigare beskrivits i iitterattireni på den enzyinatiska reaktionen sem ieder tiii produktionen av bikarbonat een protoner från koidiexid een vatten. Saiedee kommer enzyrriaktiviteten nes karböanbydrae att ge en snabbare sänkning av pii än den spontana reaktie~ nen ger een kan registreras en: reaktionen äger ruin i en buffert innenaiiande piiinciikaibrn brerntymbibiatt (STB). 27 536 936 En etantiëeitiitg E vatten mättad med CCD; frametäiidee genom att E iskyit avjenieerat vatten butubia (302 genem ett gaeditiusionefitier under nninst t timme iöre användning. För att töiia Cügfnydratiseringeaktiviteten per mg enzyrn iaiandades 2 mi 25 mit/t veronai-Hgåüvi, pH 8,2, inneitaiiande 2G rng/L BTB med t mi avieitieerat vatten een 30 iiL protein (8,5 nivi) i en iiten bägare piaeerad i ett ieiaad ovanpå en magnetenwrërare. Aila iëenirigai' iiöiis på Es fëre ant/andning. Reaktienen startades genern tiiieate av 2 mi av den (Silk-mättade iöeningeii tiii den ornrörda buitertiëeningert. Samtidigt med tiiieats av den OCZ-mättade töeningen startades ett etapper een tiden för att na pi-i nä bestämdes generri jëmtöreise med färgen av ett refereneprev innenåiiande 2 mi 0,2 tvi Na-festatbutiert, ett 6,5, 2 mi 25 mivi verenati-igâtlïia, ett 8,2, inne» naiiande 20 mgii. BTß een 'i rni avjenieerat vatten. Tiden för att na pii 6,5 mättes för den kataiyeerade reaktienen (ta) een för den ekataiyserade taianit» reaktionen (th) och 'itiiiande ekvation användes för att tveetäinma aktivitets~ enheter (Ali) per mg eitzym: i etta Cíšg-nydratieeringsexperiment var mängden enzym i aktiviteten analysen 'E25 Ang. Cíöynydratiseringsaktiviteten hes de tre ciisuiiidvarianterita (SEKV iii) NR: 4, 6 een 8) visade sig vid mätviiikoreiw (ti “Ci vara m5, 82 reepektit/e "itä procent av HCA iiavi-variaritene aktivitet _ Såiedee är aiia di- euitiditiryggevarianter fortsatt mycket aktiva när det gaiier (IÜQ-tivdratieering.

Exemgei å 'termisk etabiiiteteaitaitfe För varje enzynivariant (SEKV iD NR: 2, 4, 6 och 8) beredciee etern iöeniiwgar av 8,5 luivt enzyiri i 'EG mit/i trie-H2SO4 ett 7,0 Prever om 'ïü at. enzyrniöeitingar niaeeraciee i tunnvaggiga PCRwör. För att förhindra ökning av eitzyrrikerieentratiorteit i enzyrniösnirigariwa etter inkutiering, pà grund av avdunetning och kerideneatien av vätska i PCR-röret, användes en PCR~ terrnoeyirier tried uppvärmt ieck (GeneAmp PCR-systern täßtit), Appiied 28 536 936 Biosystems). För varje enzymvariant den maitemperatur ptacerades ett prev i PCR utrustningen, vilken pregrarnrnerats för konstant ternperaturäkrting över tiden tiii den instäiida temperaturen (55 titt 95 °C) den inkunerades under iö minuter etter 2 timmar. Etter inkuberingen iäts proverna svaina titt rums- temperatur under ti) min innan mätningar av den kvarvarande enzvmatiska aktiviteten titfördes entigt exempet 8. Aiia experiment utfördes i dupiikat.

Den resuiterande restaktiviteten etter termisk nenandting i 15 minuter den 2 timmar presenteras i taneii 3 respektive 4. Uppenpariigen har aiia iiiuterade varianter nögre ternmstaniiitet än pseudeviidtypsenzymet (SEKV it) NR: 2).

Dessutom är varianten :ned högsta termestabiiitet den dubpia disuitidbrygge varianten (SEKV it) NR: 8). För att beräkna ungetäriigt Tm (dvs den tempera- tur vid viiken 5G% restsaktix/itet återstår) för varje variant, passades data frän minuters inkuberiiwgen titt en sigmeidai funktion (Tania (Iurve, Jandet Seientitie) een presenteras i tanett 5.

Bet är erneiiertid viktigt att notera att de ernäiiiia Tm~värdena endast är apparenta sinäitpunkter. icke deste mindre representerar ökningen av "im (ATm) nos de nteditierade varianterna (StštíV ED NR: 4, 6 een 8), ijämtöreise med t-iCA tipwi (SEKV ED NR: 2), precisa värden. Antedningen titt detta är att termisk denaturering av enzymerna inte är en iärriviktsproeess utan är ett exempei pä irreversipei inaktivering, där enzymerna aggregerar efter upp- veekning vid temperaturer nära etter över deras respektive sniäitpunkter.

Sàiedes, vad som taktiskt registreras vid aktivitetsanaiysen är nur ster popu- iatien av enzymmeiekyierita sem ännu inte när uppveekats een aggregerat vid respektive temperatur. Föijakttigeiv, i detta tai! av termisk stabiiitet, är den kinetiska stabiliteten tika viktig sern den termedynarniska staniiiteten när det gätier att avgöra beteendet vid törnöjda temperaturer. Saiedes, iiämtöretse med de andra varianterna, nar SEKV it) NR: 8 tvä stående egenskaper. För det första nar den en exeeptieneiit nög srnäitpunkt på ungefär ?7,5 °C, viiket är en ökning med 18,5 °C jämfört med pseudeviidtvpsvarianten, een är ännu högre än da ïti “C tär y-kartueannydrae tran it/ietnanesarciria titerrriepniia.

För det andra nar enzymet SEKV tD NR: 3 en apparent restaktivitet på mer än 2G “š/ii vid temperaturer tängt över dess srnäitpunkt pä 715 °C. Detta är 29 ttëget eertnetikt ett resultat ev en ertmärknšngsvärt hög kinetâek etebšäâtet, vilket resuâterer i ett inte ens inkubering under 15 min vie 85 “(3 är tâtiräektig för att tuttetàrretgt inaktivera etta enzymmetettyâer. Dtvivetektägt är detta en vàrctetutt egenskap om enzymet skett användas ä t ex en process med etternerantïe temperaturer, där temperaturen terttöpeatde förändras meåten tåge och höga temperaturer, eftersom hög kânetisk stebštštet i SEKV' ti) NR: 8 tšttåter enzymet ett överteve korta perioder mee temperaturer âàngt över tïeee ernätttenweere- 536 936 tur.

Tabe||3 Procent återstående COz-hydratiseringsaktivitet efter 15 min inkubering TEMPERATUR (°C) ENZYMVARIANT 55 60 65 70 75 80 85 90 95 SEKVIDNR2 100 22 2 0 0 ND ND ND ND SEKVIDNR4 100 100 77 4 0 0 ND ND ND SEKVIDNR6 100 100 100 80 2 1 ND ND ND SEKVIDNR8 100 100 100 100 76 26 24 23 22 Tabe||4 Procent återstående COg-hydratiseringsaktivitet efter 2 tim inkubering TEMPERATUR (°C) ENZYMVARIANT 55 60 65 70 75 80 85 90 95 SEKV ID NR2 100 2 1 0 0 ND ND ND ND SEKV ID NR 4 100 95 50 1 0 0 ND ND ND SEKV ID NR 6 100 100 100 39 0 0 ND ND ND SEKV ID NR 8 100 100 100 92 38 7 7 ND ND 536 936 Tabell 5 Smältpunkter och ökning i enzymvarianternas smält unkter Tm ATm Enzymvariant SEKV ID NR: 2 59 - SEKV ID NR: 4 66,5 7,5 SEKV ID NR: 6 71,5 12,5 SEKV ID NR: 8 77,5 18,5 Exemggei 16 Kinetisk stabiiitet av kenetruerade HCA ii varianter För att bestämma uppveckitingsitastignetert (ku) den aktiveringsenergin för dppverzkiing (EA, unfßiding) nes respektive enzymvariant användes kentiek denattirering. För tippveckningernätitingen utsattes varje eitzymvariant för ökande itdrwcentratiener av Gd-HCL :ned start från en koncentratidrw på 6,2 » 6,3 tvi över deras respektive rnittpunktekdncentratien får uppveekning (Cm, VU, se tabeli 1, exempei 6) i steg din 6,1 ivt, Exempeivis HCA iipivt, med en Cm, VU på 1,6 ivi Gti-Htfiši, denattirerades i Gieiiíïi-kdneentratieiter på 1,2, 1,3, 1,4 och 1,5 tvi Gu-HCi. Stamiösitingar av Gu-HCE för att na den siutiiga anaiye- kdneeittratien preparerades den preteinstamiösningar pa 6,5 mg/'rni prepare- radee för varie eitzvrnvariant, 2,5 itä av enzymet iaiandades med 47,5 ttt Gu~ Htlt fdr att na den avsedda Gu-HCi-keneentratâenen den en protein- koncentration på 6,625 rngfmi (8,5 ttivi). “ii/arje prdteinvariantt den <3u-ti(3i~ kencentrationsprev bereddes vid rumstemperatur (21 °C) från stamiösningar, för att registrera återstående aktivitet efter 16 och 36 sekunder, samt t, 2, 5, 36, 45, den 66 min. Aittivitetsmätawtitgar gjordes sàedrn beskrivits i exempei 8 (med 36 ai prev), med den eidiinaden att den leufirade BTB-iöeningeit komp» tetteradee med 6,5 rnM av metaiikeiatbiidaren EDTA för att förhindra åter- veckrting av enzymerna under mätningen. Återveekniitg kan annars ske, då både protein och denattireririgsrttedei (Gu~HCi) spade vid aktiviteisanaiysen.

EDTA binder Znz* som siàppt från dppvecitade enzym, een som är nödvändig för aktiviteten noe HCA ii. Tiiieats av EDTA tiii anaiysiösningen "fryser" så» 31 536 936 lades tiiistandet i prevet, så att kvarvarande Gíšgßnydratiseringsaktivitet kan rnätas.

När den återstående aktiviteten ar avsatt som en funktion av tiden för varje (šu-Htli-keneentration kan uppveekningsnastigtteten (kJ) vid den Gu- HCi-keneentratien beräknas genom anpassning av data tiii en enda expenen» tieii term entigt y = a e-kx. För att beräkna tiastignetskenstariten får uppveek- ning i vatteniösning avsätts den naturiiga iegaritrnen av de iipprriätta hastig- netskoristanterna fär respektive erizyrnvariant mot Cšu-Htïkkortcentrationen och de iiniariserade datavardena extrapoieras tiii O ivi Gu-i-ttflt (viiket ger in kr vid 0 tvi GuiiCi). Den fria aktivaringsenergin (AG#), det viii säga i detta fait den fria aktiveringsenergin för uppveckning (EA Henning) kan beräknas med niäip av Arrtteniiis ekvation, AG#= RT [in (kg/n) - in (ku !T)], där R är gas- kansiai-iien, satt J-mort-K-t, kB/h är itensiania-i znsasei rim, r ar den absaiuta temperaturen i Keivirt een kr. är nastignetskanstanrten för Uppveck- ning. Resuâtaten från mätningarna av den kinetiska stabiiiteten presenteras i tabeii 6.

Tabell 6 Uppveckningskinetikdata för enzymvarianter vid 21 °C sEKv |D NR 2 sEKv |D NR 4 SEKV |D NR 6 SEKV |D NR s InkU, H20 -9,30 -14,1 -12,2 -19,3 ku Hzounirft) 9,1*1o'5 7,5*1o” 5,1*1o'6 4,2*1o'9 GÅNGER 122 18 22000 LÅNGSAMMARE UPPvECKN|NG .JÄMFÖRD MED SEKV |D NR 2 EA ue-ivecratina 96 kJ/mol 108 kJ/mol 103 kJ/mol 121 kJ/mol AEA, uppveciming 12 kJ/mo| 7 KJ/moI 25 kJ/mo| (ÖKNING JÄMFÖRD MED SEKV |D NR 2) 32 536 936 För eiia etabiiieerade dieuitidbryggeverienter (SEKV ti) NR: 4, 6 den ö) år det en tydiig rninskniiig i dppveekiiirigsiiestighet (ketngofi, sem kdirninerari den eynneriigen iångsemma uppveekningen för SEKV ti) NR: 8, viiken upp~ veckas 22 (lidt) gånger iångsamrnare än i-iCA time-varianten (SEKV EB NR: 2) i vattenrnedier vid 21 ”il Ved som år viktigt år att enzymet SEKV ED NR: 8 tippför sig eern en neit ny variant av RCA it. SENV 5D NR: 4 nar en stör ök- ning i kinetiek etabiiitet (AEA, Unifüging på 12 kiiirnei) den en inindre ökning i termödyneittiek etebiiitet (AAGFU på 8,5 kdiniei), een beter sig eåiedee som ett enzynt med en konstruerad disuitiderygga med en förändrad veckningsvag den därmed ett övergångstiiistånd på en högre energinivå. i meteete tiii SEKV iQ NR: 4 nar enzymet SEKV ti) NR: ö en iågre ökning av den kinetieka staisiii- teten (AEA, unfoidifig på 7 ktiirnöi) den en nögre termödyneiniek etapiiieering (AAGFU på 12.5 ktšlrnei). Såiuitda ner denna variant ett uppveeket tiiietånd som är piaeerat på en annu nögre nivå av iri energi. Å andra siden nar den en veekningevåg, viiken ertdast år i iite grad iörandrad och nar däriör ett över- gångstiiistånd med endast en någdt högre energinivå ån enzymet SENV til) NR: 2. Enzyrnet SEKV EE) NR: 8 nar emeiiertid både en inyeket hög kinetiek etapiiieering (AEAMnieding på 25 kJ/möi) een en mycket nög ökning ev den terrnödynerniek etabiiiteten (AAGFU på 23,5 ktilmöi). För den terrnedynarniekt steöiiiteteri år ökningen nära, desk inte identisk, med summan av den ökade statiiiiteten för SEKV til) NR: 4 den ö. Den mycket störa ökningen av kinetisk etepiiitet år emeiiertid en öiörutsågber effekt söm nar sin grund i det tram- gångsrika införandet av två dieuiiiderygger i enzymet, i pöeitiener som tvingar proteinet att veckas vie en dutterekad bana, som ekiijer sig från den nes en« zymerna SEEKV it) NR: 2, 4 den ö, medan veekningeiörntågan den enzym- aktiviteten på samme gång är öibenåiien.

Exenigei “it Livsiåndd vid törnöida temperaturer anaivserad med esterasektivitete» mätningar Ben ökade terrniska, terrnedynarnieke den kinetieke etepiiiteteifi nes den ddtitaie diedifidöryggeverieiriten SEKV iQ NR: 8 kan förväntas ge den en tång iivsiångd vid :förhöjda temperaturer. Av praktiska sket studerades denna 33 536 936 genom mätning av enzymete eeterasaktivitet. Starniöeitiifgar på 2,5 rng/mi av varje enzymvariant öereddee i ft) rntvi trie-tigßíh pH KO i rör ined skruviöck den tätning för att förhindra avddnstning. Üeesa piaeerades i ett varmeskap vid den önskade temperaturen (66, 65 eiier 7G °Cfi den prover uttoge vid öiika tidpunkter för mätning av kvarvarande eeteraaaktivitet. Ešeteraeaktiviteteif anaiyeeradee genom tiiieate av ö at. pröteinpröv tiii 1,44 mi reaktienebuffeit (59 iniivi trie-Hgâílëti, ett 8,5 med en ianetyrka pä Ûji tvi jueterad med Nagßtli) i en kyvett. Provet kempietteradee med reegene, 6G pL 30 mit/i paramiitröfenyi- aeetat (pNPA) i iekaii acetöit, den öiandae under kört tid innan esterasaktivite- ten mattes vid 348 nm i en seektröfötemeter. Ökningen i aideörtzians nes den kataiyserade reaktionen registrerades under di) sekunder den ökningen av absörbanaen noe en tiiankreaktiön (inget enzym tiiieatt) sutitraneradee därefter. Ben attparenta andra ordningens nastignetekenstaitt (k) beräkna- des eniigt tidigare beskriven metödikfgzi.

Serri nöiitidereferene bestämdes esterasaktiviteten för varje enzym starniösning före varmebenandiingeit. Esterasaktiviteten för de tre distiifid~ varianterna (SEKV tili NR: 4, ö den 8) befanns under mätviiiköreiw (ena 21 “(3) vara 99, 85 respektive 78 present, iärnförd med HCA iipWi-variantene aktivitet.

Såiedee är aifa dieuifidbryggevariantei' fortsatt mycket aktiva även när det gäiier esterasaktiviteten een iigger på Lingefär eaitima nivå sem COE-nydrati- seringsaktiviteten (exempei 8). Den kvarvarande aktiviteten för varje variant vid varje temperatur avsattes met tid een anpaeeadee tiii en enda expönentieii terrn (y = arekx) för att erhäiia haetignetskenstaiften för uppveckning för varje enzyrnvariant vid de tre ternperaturerna. Eftersom inaktiveringen är en företa ordningens haetignetpröeeee, kan naiveringatiden (t för varje enzymvariant vid varje temperatur beräknas genom t«/2=|n2/k. Resuitaten av iivetidaexperi- menten presenteras i tabeii 'ï-Q dett tig. Y. 34 536 936 Tabell 7.

Procent återstående esterasaktivitet efter 15 min inkubering TEMPERATUR (°C) ENZYMVARIANT 60 65 70 SEKV ID NR 2 1 0 0 SEKV |D NR 4 102 61 1 SEKV ID NR 6 104 83 82 SEKV |D NR 6 99 96 91 Tabell 8 Procent återstående esterasaktivitet efter 2 tim inkubering TEMPERATUR (°C) ENZYMVARIANT 60 65 70 SEKV |D NR 2 0 ND ND SEKV |D NR 4 103 50 ND SEKV |D NR 6 104 72 39 SEKV ID NR 8 106 89 80 Tabell 9.

Inaktiveringshastighetskonstanter (ku), inaktiveringshalvtid (tyz) och tmo för enzymvarianterna vid 60 - 70 °C.

TEIVIPERATUR ENZYM- VÅRIÅNT 60 °C 65 °C 70 °C KH tVz t1l10 kU(h-1) tI/z t1/10 kU(h-1) tVz t1/10 (h ) (h) (h) (h) (h) SEKV ID NR 2 SEKV ID 0,0205 35 112 0,346 2 6,6 NR 4 SEKV ID 0,00255 272 903 0,0475 15 48 0,434 2 5,3 NR 6 SEKV ID 0,000337 2057 6832 0,00381 182 604 0,0180 38 127 NR 8 (86 (285 (8 (25 (1,6 (5,3 dagar) dagar) dagar) dagar) dagar) dagar) 536 936 Ben råkade tysikaiiska staieiiiteten, konstruerad in i dubheidisuitid- bryggevarianten SEKV iii) NR: 8, resiiiterar i en mycket iangsarnrnare inaktiveringsnastignet den saiedes en ntycket iangre iivsiangd vid ökade temperaturer än för de andra varianterna. vid 6G “C är naiveringstiden för aktivitetsiitaktivering 86 dagar för dubbeidisuitidbryggevarianten SEKV ED NR: 8, viiket kan jämföras med HCA iipwi (SEKV EÜ NR: 2), vilken eniedeiisart uppveekas een inaktiveras vid sarnrna temperatur. Qessutern är tiden för att aktiviteten taiier ned tiii 'i/t O för SEKV ED NR: 8 tingetär 285 dagar vid F59 “(1 Det viii saga, om tva eiika reaktorer anvander sarnrna rnangd av det rnuterade HCA ii SEKV it) NR: 8 respektive ett enzyrn med ”i/“itiïs aktivitet (såsom exentpeivis (Sant), skuiie reaktorn rned SEKV ID NR: 8 behöva 285 dagartöi' att ens sjunka tiii det taga startvärdet nes Gant-reaktorn. Sàiunda är det inte endast den fysikaiiska stabiiiteten i sig siäiv sern är viktig för ett enzyrne praktiska användbarhet, utan aven aktiviteten een eitekrtiviteteit hes proteinet. Även vid 70 °C, där aiia andra varianter snabbt uppveckas een inaktiveras, har enzymet SEKV ED NR: 8 en signifikant iàngsani inaktivering eeh ökad iivs~ iangd med en naiveringstid på 1,6 dagar, Förmågan att metsta temperaturer i entradet av 6G - ït) “C med iang iivsiängd är en synneriigen viktig egenskap hes SEKV it) NR: 8. Vid tiii exerneei rnederna törbranningsaniäggningar består rökgasreriirigen av sa rnartga steg att rökgasen kyis ned tiii c:a 6G - frå) “C innan den når skorstenenizsi. Saiiinda bör varje enzyrn sent skaii användas i en COg-tangande iaiereakter vid en törbränningsaitiäggning aiira neist även vara stabiit den aktivt i temneraturintervaiiet 60 » YO “(1 viiket saiedes är upp» tyiit av enzymet SEKV it) NR: 8. Vidare har kernbiitatienen av disuitidbrvgger eniigt SEKV iifi) NR: 8 konstaterats in i ett enzyrn (HCAiipWi) sern här tiii den strukiureiit konserverade sueeriantiiieri efkarbeaniiydraser. För att hitta struk- tureiit eesiaktade proteiner, utfördes en databassökning av HCA ii:s tredimen» sieneiia struktur (PDB EU Enea) rnet Censerved Domain Oataiøase (CÜD)[243, viiken innefattar anpassningar av konserverade preteindentäner tiii kända tre» dirnensieneiia preteinstrtiktureri itfieieciiiai* iviedeiing tšatatzase (Mit/WB). Sök- ningen resuiterade i 4%? ereteinsekvenser rned besiäktade konserverade derrianer och 438 eesiaktade testa strukturer 'iran ct-kartneannydrassiiper- 36 536 936 tamitjen. Qàtedes kan kombinationen av struktureita :notäv av dšsuitšdbryggon na mattan positionerna 1223-6202 och 123943241 i SEKV ED NR: S-varšartten av HCA Eipwt identifieras och eannotâkt också överföras tiil andra ntedtemmar av a-karooennydrassupertemâtjen genom nomoiogšmodetteršng som tädigare beskrivits. Faktum är att den signifikant ökade staoitäteten hos SEKV ED NR: 6 ttrsçvrungtigen uopnåctdes genom nornošogšznodeileršng mattan HCA E! ooh det avtägset oestäktacte hornoioga ct-karooenttydraset från Neisseria gonorr» hoeae (NGCA, 38,5% sekvensiderttitet), viiket har en naturtâgt tërekomrnande dšsuttâdorygga. Genom ttomoâogtmooeåteräng konstaterades att positionerna tor dästaitädoryggata i NGCA teekvensposâtšoner' C28 och C181) nade såna tre~ dimensâonettt strukturetit ekvšvateswta positioner ä HCA Ei i posëtâonerna A23 och LEOB. Sàtedee kunde genom nonwošogšrnodetteršzwg mot ett aviägset be siäktat homologt enzym en geornetršskt korrekt dšsttttâdbrygga transpâanteres från Nasa tm korrekta posættorer a trea tatttt. 37 536 936 REFERENSER 1) 2) 3) 4) ) ) 7) 8) 9) ) Zimmerman, S.A. and Ferry, J.G. (2008). The ß- and y-classes of carbonic anhydrase. Current pharmaceutical design 14, 716-721.

Alber, B.E., Ferry, J.G. (1994). A carbonic anhydrase from the archaeon Methanosarcina thermophila. Proceedings of the National Academy of Science 91, 6909-6913.

IPCC, 2007: Climate Change 2007: Synthesis Report. Contribution of Working Groups l, ll and lll to the Fourth Assessment Report of the lntergovernmental Panel on Climate Change [Core Writing Team, Pachauri, R.K and Reisinger, A. (eds.)]. IPCC, Geneva, Switzerland.

Zimmerman, S.A., Tomb, J.-F., Ferry, J.G. (2010). Characterization of CamH from Methanosarcina thermophila, founding member of a subciass of the y class of carbonic anhydrases. Journal of Bacteriology, 192, 1353-1360.

Silverman, D.N. and Lindskog, S. (1988). The cataiytic mechanism of carbonic anhydrase: implications of a rate-limiting protolysis of water.

Accounts of chemical research, 21, 30 - 36.

Ferry, J.G. (2010). The y class of carbonic anhydrase. Biochimica et Biophysica Acta, 1804, 374-381 .

MacAuley, S. R., Zimmerman, S. A., Apolinario, E. E., Eyilia, C., Hou, Y.-M., Ferry, J. G. and Sowers, K. R. (2009). The archetype y-class carbonic anhydrase (Cam) contains iron when synthesized in vivo.

Biochemistry, 48, 817-819.

Sterner, R. and Liebl, W. (2001). Thermophilic adaptation of proteins.

Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 36, 39 -106.

Eijsink, V.G.H., Bjørk, A., Gåseidnes, S., Sirevåg, R., Synstad, B, van den Burg, B. and Vriend, G. (2004). Rational engineering of enzyme stability. Journal of Biotechno/ogy 113, 105-120.

Wang, T.W., Zhu, H., Ma, X.Y., Ma, Y.S., Wei, D.Z. (2006). Structure- based stabilization of an enzyme: The case of penicillin acylase from Alcaligenes faecalis. Protein and Peptide Letters 13, 177-183. 38 11) 12) 13) 14) ) 16) 17) 18) 19) ) 536 936 Qi, X., Guo, Q., Wei, Y., Xu, H. Huang, R. (2012). Enhancement of pH stability and activity of glycerol dehydratase from Klebsiella pneumoniae by rational design. Biotechnology Letters 34, 339-346.

Brändén, C. and Tooze, J. ln Introduction to Protein Structure. 2"d Ed.

ISBN 0-8153-2305-0. Garland publishing, NY.

Lin, C., Chao, Y., Xiangshan, Z., Yuanxing, Z. (2009). Rational introduction of disulfide bond to enhance optimal temperature of Lipomyces starkeyi alpha-dextranase expressed in Pichia pastoris.

Journal of Microbiology and Biotechnology 19, 1506-1513 Pellequer, J.-L., Chen, S.-W., W. (2006). Multi-template approach to modeling engineered disulfide bonds. Proteins-Structure Function and Bioinformatics 65, 192-202.

Mårtensson, L.-G., Karlsson, M. and Carlsson, U. (2002). Dramatic stabilization of the native state of human carbonic anhydrase ll by an engineered disulfide bond. Biocnemistry 41, 15867-15875.

Karlsson, M., Mårtensson, L.-G., Karlsson, C and Carlsson, U. (2005).

Denaturant-assisted formation of a stabilizing disulfide bridge from engineered cysteines in nonideal conformations. Biocnemistry 44, 3487- 3493.

Freskgård, P.-O., Carlsson, U., Mårtensson, L.-G., Jonsson, B.-H. (1991). Folding around the C-terminus of human carbonic anhydrase ll - Kinetic characterization by use of a chemically reactive SH-group introduced by protein engineering. FEBS /etters 289, 117 -122.

Pace, C.N. and Shaw, K.L. (2000). Linear extrapolation method of analyzing solvent denaturation curves. Proteins 41, 1-7.

Wilbur, K.M. and Anderson, N.G. (1948). Electrometric and colorometric determination of carbonic anhydrase. Journal of biological chemistry 176, 147- 154.

Rickli, E.E., Ghazanfar, S.A.S., Gibbons, B.H. and Edsall, J.T. (1964), Carbonic anhydrase from human erythrocytes. Preparation and properties of two enzymes. Journal of biological Chemistry, 239, 1066- 1078. 39 21) 22) 23) 24) 536 936 Khalifah R.G. (1971). The carbon dioxide hydration activity of carbonic anhydrase. Journal of biological Chemistry 246, 2561-2573.

Armstrong J.M., Wyers, D.W., Verpoorte, J.A. and Edsall, J.T. (1966).

Purification and properties of human erythrocyte carbonic anhydrases.

Journal of biological Chemistry 241, 5137 - 5149.

Cimini, S., Prisciandaro, M. and Barba, D. (2005). Simulation ofa waste incineration process with flue-gas cleaning and heat recovery sections using Aspen plus. Waste Management 25, 171 - 175.

National Center for Biotechnology Information. URL: http://wvvw.ncbi.nlm.nih.govl 40

Claims (16)

10 15 20 25 30 536 936

1. PATENTKRAV i. isoierad poiypeptid som har karboarrhydrasaktivitet, vare sekvens rnot- svarar rnodiiierat humant karhoanhydrae ii, varvid ooiyoeoiideri inneiariar mutationerna A236, S996, LZOQG, (32058 och Vârii C, har ökad iysikaiisk siaoiiitei jarniori; med viidiypskarooanhydras ii och vidare inneiartar dieoiiid~ bryggor meiian C23 ooh C202 oonfeiiar rneiian C99 och C241.

2. isoierad ooiyoeotid som har karboarihydrasaktivitet eriiigi; irrav i, viiken har en termodynarnisk stabilitet ökad med 23,5 kJ/moi jämfört med viidtyos- karhoanhydras ii.

3. isoierad ooiyoeotid som har karooanhydrasakiiviiei eniigt nagot av fore- gàende krav, viikeh har en smàitounki Ökad med 18,5 °C jämfört med viidtypekarooanhydras ii.

4. isoierad ooiyoeotid som har karboanhydraeaktivitei erriigt nagot av före- gående krav, sorn har en akiiveringseriergi får uooveokning ökad med 25 kJ/moi iàrrrföri; med viidrypskarooanhydras il.

5. isoierad poiyoeotid som har karboannydrasaktivitet eriiigt nagot av iöre~ gående krav, som nar en uooveokriirigshastighei i vatten vid 21 °C sorn är ungefär 22 OQO gånger iàngsamrnare jämfört med viidtyps humant karooanhydras ii.

6. isoierad ooiyoeotid som har karooarihydrasaktivitei eriiigr nagot av iöre~ gående krav, som nar en haiveringstid på 86 dagar vid 60 °C, 8 dagar vid 65 °C och iß dagar vid 70 “CL

7. iaoierad ooiyoeotid som har karooanhvdrasairtivitet eniigt nagot av fore- gàande krav, varvid den isoierade poiypeoiziden bihehaiier sin ökade fysikaliska stabiiiiïet jämfört med viidtypskarboanhydras ii i vaitenbaserade 41 10 15 20 25 30 536 936

8. Eösningar av etaneiaminer. innefattande rnetyidietandiarriin (MIIDEA), rnonoetaneiarrtin (MEA), dietaneiantin (BEA) och amineetexietanoi. ä. isolerad poiypeptid eern har Karbdanhydrasaktivitet eniigt någon av före- gående krav, varvid sekvensen ar SEKV IEI) NR: 8.

9. Förfarande för att öka den tysikaiiska stabiliteten hes kartneanhydraser (EEG 4.221) utvaida från superfanfiiijen av naturligt förekommande eller rnediiiera- de rvkarhdanhydraser, innefattande insättning av en kdrribinatien av tva stahiiiserande disuifidhrygger vid de tredirnensioneiit ekvivaienta eiier sek~ ventieiit herneioga pdsitidnerna tiii C23, C99, C202 een C241 i SEKV 1D NR: 8, motsvarande positionerna A23, S99, L202 och V241 i humant karet» anhydrae ti.

10. Konstruktion innefattande en peiynukieotid kodande för en peiypeptid eniigt nagot av kraven 'i~8, eperabett keppiad tili en etter fiera kentrdii- sekvenser som styr produktionen av potypeptiden i en exnreesinnsvàrd.

11. Rekorntainant expressionevektoi* innefattande kenstruktionen eniigt krav 1G.

12. Rekornhinant vàrdeeii innefattande konstruktionen eniigt krav 10 etter den rekdrnhinanta expressinnsvektorn eniigt krav 1 t.

13. Användning av en isoierad pciiypentid som har karbeanhydrasaktivitet eniigt någon av kraven 1 - 8 för extraktien av keidioxid fran ett koidiexid~ innehàiiancie rnediurn.

14. Användning eniigt krav 13, varvid den iseierade poiypeptiden som har karbeanhydrasaktivitet används i en bioreaktor.

15. Förfarande för framstäiining av en isoierad poiypeptid eniigt SEKV EE) NR: 8, innefattande aeeeieratinn av biidandet av disuitidhrygger genem inkubering 42 536 936 av poâypepticien vid förhëjda temperaturer fràn 25 - 5G °G i närvaro av ett oxicíatëonsmeciei vid ett pH av 7-10.

16. isoierafi poiynukiectid sem har en sekvens som kodar för poiypepïiden eniigt definâïion i något av kraven 1-8. 43