SE526941C2 - Förfarande för 3D-återskapning med hög upplösning - Google Patents

Description

15 20 25 30 526 941 . o o o Q n ø u n 0 u lv 2 Vanligtvis görs ett stort antal prover och placeras under olika förhållanden, t.ex. oli- ka omgivande lösningar, låg temperatur, hög temperatur, varierande temperatur, va- rierande pH och ionstyrka, i förhoppningen att några av förhållandena kommer att vara gynnsamma för att utveckla kristaller. I senare steg anpassas och ñnjusteras förhållanden som leder till bildandet av mikrokristaller (små kristaller mycket mind- re än ungefär 10 mikrometer), för att erhålla makrokristaller som kan användas för avbildning med röntgen- och neutronkristallografiska tekniker.

Kristallerna som bildas varierar från mycket små till, i bästa fall, några som är till- råckligt stora för att användas. Proverna som inte ger tillräckligt stora kristaller, ty- piskt sett de flesta proverna, slängs bort.

Syftet med uppfinningen Det är ett syfte med uppfinningen att möjliggöra användning av en större andel av proverna för avbildning.

Sammanfattning av uppfinningstanken Detta uppnås enligt uppfinningen genom ett förfarande for att uppnå en 3D- återskapning med hög upplösning av en kristall, innefattande steget att en kristall utvecklas på ett känt sätt, känríetecknat av stegen att - kristallen krossas till mikrokristaller, - ett prov av mikrokristallerna vitrifieras för kiyotransmissionselektronmikroskopi - en serie med varierande lutning (tilt-serie) registreras - en första 3D-återskapning erhålles medelst en iterativ återskapningsmetod i vil- ken en uppskattad sannolikhetsfördelning (prior prejudice distribution) förfinas i åtminstone ett steg på basis av en jämförelse med den insamlade bildinformatio- 11611.

En sådan metod vore att använda mjukvara för filtrerad bakåtprojektion (FB) eller någon annan snabb procedur för att erhålla en initial uppskattning av 3D-strukturen, 10 15 20 25 30 526 941 i n u c | c | ; o I u nu 3 och sedan en förfiningsprocedur som ger en 3D-struktur med hög upplösning. Före- trädesvis används för bildåterskapning efter FB-proceduren, Comet-tekniken som beskrivs i internationell patentansökan WO97/33255 vilken här inkluderas genom referens (motsvarande europeisk patentansökan EP 885 430 och svensk patentansö- kan 9601229-9).

Comet-tekniken baseras på följande steg: En första uppskattad fördelning av provet tillhandahålls.

En utsuddad (blurred) uppskattad sannolikhetsfördelning tillhandahålls baserad på den uppskattade fördelningen.

Observerade data av provet tillhandahålls.

I en iterativ process beräknar ett beräkningsorgan, för varje iteration, en ny upp- skattad fördelning av provet med användning av en jämförelse mellan den uppskat- tade fördelningen och observerade data av provet. En ny uppskattad sannolikhets- fördelning som är mindre suddig än den förra beräknas också.

Iterationerna fortsätter tills skillnaden mellan den nya uppskattade fördelningen och den närmast föregående uppskattade fördelningen är mindre än ett förbestämt vill- kor.

Om provet håller hög kvalitet bestäms kristallens repetitiva struktur och, om möjligt, kristallens rymdgrupp.

Om rymdgruppen kunde bestämmas, förñnas geometrin och en andra 3D- återskapning erhålls, innefattande information om rymdgruppen, med användning av en procedur såsom beskriven ovan, t.ex. kombinationen av filtrerad bakåtprojektion och Comet.

Om rymdgruppen inte kunde bestämmas, utförs korrelationsberäkning av genom- snitt på provet. 10 15 20 25 30 526 941 o o . Q u Q n u | n o . nu 4 Information om provets kvalitet kan också användas som återkoppling för processen att utveckla kristaller.

Förfarandet enligt uppfinningen möjliggör användning av mikrokristaller för att er- hålla 3D-återskapningar med mycket hög upplösning, i storleksordningen l0Å.

Detta innebär i sin tur att sådana 3D-återskapningar kan göras för molekyler som i dag inte kan avbildas med röntgen- eller neutronkristallografitekniker eftersom det har varit omöjligt att utveckla tillräckligt stora kristaller för de metoder som finns enligt teknikens ståndpunkt. Det är endast ett litet antal av makromolekylerna som inte kan utvecklas till mikrokristaller. I motsättning till detta kan, såsom nämnts ovan, endast en liten del utvecklas till makrokristaller.

En stor fördel med förfarandet är att molekyler som har modiñerats kan identifieras och analyseras. I allmänhet kan, även om en molekyl kan kristalliseras, en liten mo- difiering, såsom tillägg av en ligand, göra det svårt eller omöjligt att kristallisera molekylen till makrokristaller. Studier av hur ligander binds till en viss protein är av stort intresse för proteinkemister och med den uppfinningsenllga metoden kan detta studeras ned till nivån av vilken aminosyra liganden är bunden till. Strukturerna kan också jämföras med proteinstrukturer som redan har bestämts. Med det uppfinnings- enliga förfarandet möjliggörs därför en mer flexibel hantering av ligander.

Det uppfinningsenliga förfarandet möjliggör också att 3D-återskapningar görs av helt nya typer av molekyler, såsom proteoglykaner.

Kortfattad beskrivning av ritningen I det följande kommer uppfinningen att beskrivas mer i detalj, med hänvisning till bifogade figur l, som är ett övergripande flödesschema över det uppfinningsenliga förfarandet. 10 15 20 25 30 n n un no I I 00.: . ,. en I 0 i- :z :g 1, ,,. . u". 2 f 2.. .s e n. ...u-tg j' 4 . . g s ou I: z . . . o q nu e - n u Detaljerad beskrivning När den ovan beskrivna förberedelseprocessen för att utveckla kristaller (S1) är av- slutade, granskas enligt uppfinningen först proverna för att se vilka som kan tänkas innehålla kristaller överhuvudtaget. Detta kan göras genom att se på dem, först med blotta ögat eller med ett ljusmikroskop, sedan t.ex. genom ett transmissionselek- tronmikroskop.

Ett prov som innehåller kristaller väljs ut (S2) och behandlas enligt följande: Först utsätts det för en process, t.ex. spinning (S3) för att krossa kristallerna till väl- digt små kristaller, mikrokristaller, i storleksordningen l00nm. Dessa mikrokristal- ler kan behandlas på samma sätt som för proteiner i en lösning för att vitrifiera dem för kryo-transmissionselektronmikroskopi (S4), dvs.

Placera en tunn film av lösningen innefattande mikrokristallerna på ett galler och frysa den genom att doppa den (plunge freeze).

Registrera en vanli g serie med varierande lutning (tilt-serie) med kryo- transmissionselektronmikroskopi för 3D-återskapningen. Rikta in, t.ex. med guld- markörer.

Generera en šD-återskapning (S6) med användning av en iterativ återskapningsme- Stod i vilken en uppskattad sannolikhetsfördelning förfinas i åtminstone ett steg base- rat på en jämförelse med den insamlade bildinfonnationen, t.ex. kombinationen av filtrerad bakåtprojektion och Comet såsom diskuterats ovan. Detta innebär att först göra en bakåtprojektion eller erhålla en uppskattning av strukturen på ett alternativt sätt före avbildning med användning av den iterativa metoden. Detta resulterar i in- formation om strukturen av kristallfragmentet.

Hämäst identifieras och analyseras kristallfragmentet (S7). Om det är av dålig kva- litet slängs det bort (S9) och processen börjar om med ett nytt prov. Informationen att provet är av dålig kvalitet kan användas som återkoppling för att utesluta förhål- 10 15 20 25 30 526 941 6 landena under vilka provet placerades, vilka inte var gynnsamma för att utveckla kristaller.

Om kristallfragmentet är av god kvalitet fortsätter proceduren enligt följande: in- formationen om provets kvalitet kan âtermatas för att anpassa förhållandena som användes för provet så att större kristaller kan utvecklas.

Dessutom, vilket är viktigare för processen enligt uppfinningen, bestäms kristallens repetitiva struktur och dess rymdgrupp, om möjligt (S10).

Om rymdgruppen inte kan bestämmas görs en korrelationsbestäinning av genom- snittet (S12) på de repetitiva fragmenten och regulariteten hos kristallgittret upp- skattas.

Detta möjliggör en uppskattning av kvaliteten och även preliminär information om BD-strukturen.

Om rymdgruppen kan bestämmas fortsätter processen enligt följande: Geometrin för rymdgruppen förfmas och dess orientering bestäms (S13). Avbild- ning (S 14) med användning av de ovan diskuterade metoderna innefattande rymd- gruppens symmetri. Detta ger en 3D-återskapning med mycket hög upplösning, tro- ligtvis av samrna storleksordning som kan uppnås för makrokristaller enligt tidigare känd teknik. Hur detta kan göras för en ikosaederstruktur har redan beskrivits i in- ternationell patentansökan WO97/33255 vilken här inkluderas genom referens (mot- svarande europeisk patentansökan EP 885 430 och svensk patentansökan 9601229- 9). Alla symmetrigrupper, kristallografiska likväl som icke-kristallografiska kan en- kelt implementeras i Comet-proceduren med användning av metoderna som be- skrivs i detta dokument eftersom det endast avser genomsnittsberäkning av gradi- entkartor i sökriktningarna. I exemplet i referensen användes ikosaedersymmetrin för att förfina adenovirusstrukturen genom genomsnittsberäkning av de två sökrikt- ningarna hos 3D gradientdensitetskartor av chi-kvadrat och entropifunktioner. Ge- 5 2 6 9 4 1 - 33- 'IF n n o a c no 7 nomsnittsberäkningarna följde då precist specifikationen för den specificerade symmetrigruppen. Fackmannen inser att Comet-proceduren kan tillämpas på vilken som helst typ av symmetrioperator och skall implementeras på ett analogt sätt till det ovan nämnda exemplet.

Claims (5)

10 15 20 25 , . . . . u . o c o N Patentkrav

1. l. Förfarande för att uppnå en flšD-återskapning med hög upplösning av en kristall, innefattande steget att en kristall utvecklas på ett känt sätt, kännetecknat av stegen att - kristallen krossas till mikrokristaller, - ett prov av mikrokristallerna vitrifieras for kryotransmissionselektronmikroskopi - en serie med varierande lutning registreras - en första BD-återskapning erhålles medelst en iterativ återskapningsmetod i vil- ken en uppskattad sannolikhetsfördelning förfinas i åtminstone ett steg på basis av en jämförelse med den insamlade bildinformationen.

2. F örfarande enligt krav 1, varvid den iterativa återskapningsmetoden är en filtrerad bakåtprojektion och därefter Comet-proceduren.

3. Förfarande enligt krav 2, vidare innefattande steget att: om provet är av hög kvalitet bestäms kristallens repetitiva struktur och, om möjligt, kristallens rymdgrupp.

4. F örfarande enligt krav 3, vidare innefattande följande steg: om rymdgruppen kunde bestämmas förfinas geometrin och en andra 3D- återskapning erhålls innefattande information om rymdgruppen.

5. Förfarande enligt krav 4, vidare innefattande steget att om rymdgruppen inte kun- de bestämmas utförs korrelationsberäkning av genomsnittet på provet.