SE522170C2 - Metod och anordning för detektering av förändringar av magnetisk respons hos magnetiska partiklar försedda med yttre skikt i bärarvätska - Google Patents

Description

i. w n»- :inta 10 15 20 25 4 522 17 2 partiklar med en magnetiskt ordnad struktur. De skall inte förväxlas med kärnmagnetiska (NMR) resonansfenomen, då de senare beskriver resonanser inom atomkärnan. De senare resonansfenomen har resonansfrekvenser typiskt i GHz-området till skillnad mot resonansfrekvenser för de fenomen som här avses som ligger i intervallet från några Hz till några MHz.

Néel relaxation I N éel relaxationen relaxerar magnetiseringen i partikeln utan att partikeln roterar fysiskt (ingen termisk blockering). Relaxationstiden för denna typ av relaxation beror starkt på storlek, temperatur, material och (vid höga partikelkoncentrationer) på den magnetiska växelverkan mellan partiklarna. För att denna relaxation skall föreligga måste magnetiseringsriktningen i partikeln ändra riktning snabbt med tiden, partiklarna måste vara superparamagnetiska. Néel relaxation tiden i nolltält kan vi beskriva enligt nedanstående ekvation: E! IN = roe *T där 70 är en karakteristisk relaxationstid, K är den magnetiska anisotropikonstanten, V magnetisk partikelvolym, k Boltzman's konstant och T temperaturen.

Brownsk relaxation Iden Brownska relaxationen roterar magnetiseringsriktningen när partikeln fysiskt roterar.

För att denna relaxation ska uppvisas måste magnetiseringen vara låst i en specifik riktning i partikeln, partikeln måste vara termiskt blockerad. Relaxationstiden för Brownsk relaxation beror på hydrodynarnisk partikelvolym, viskositet av den bärvätska där partiklarna är dispergerade i, koppling mellan partikelns yta och vätskeskiktet närmast dess yta (hydrofobicitet respektive hydrofilicitet), partikelns yttopografi samt på temperaturen.

Den Brownska relaxationstiden kan approximativt beskrivas enligt nedanstående ekvation: ;»::| 10 15 20 25 . Q u ø en Ä 522 170 TB z 3VH17 kT där VH är den hydrodynarniska volymen för den totala partikeln (inklusive polymer skiktet), 77 viskositeten för den omgivande bärvätska, k Boltzmann”s konstant och T är temperaturen.

I härledningen ovan har man antagit en perfekt vätning (hydrofilicitet) samt en konstant rotationshastighet (den initiala approximationen har försummats).

Den Brownska relaxationstiden beror alltså på partikelns (effektiva) storlek samt på omgivningens inverkan på partikeln. För att särskilja om en partikel uppvisar Brownsk relaxation eller Neélsk relaxation kan man bl.a. studera huruvida ändrad yttre påverkan (till exempel annan vätskeviskositet, temperatur ändringar, applicerat statiskt magnetfält) ändrar relaxationstiden.

Man kan även studera fenomenen i frekvensdomänen, varvid det gäller att bestämma resonansfrekvenserna för partikelsystemet ifråga. Dessa kan erhållas Lex. rn.h.a. AC- susceptometri (för Brownsk relaxation några Hz till kHz regionen och för N éelsk relaxation typiskt i MHz regionen).

Som synes ovan beror Brownsk rörelse (Brownsk relaxation) bl.a. på partikelns volym: ju större en partikel är desto längre blir relaxationstiden dvs. desto mindre blir partikelns rörelse. Relaxationstider för partiklar större än ca 1 um är mycket längre än 1 sekund, vilket i praktiken innebär en försumbar rörelse. Trots det kan även sådana partiklar användas vid detektion. Större partiklar kan dock uppvisa andra typer av relaxationer där partiklamas tröghet och bärarvätskans viskoelastiska egenskaper måste inkluderas för en tillfredställande datatolkning.

F rekvensberoende susceptibilitet Magnetiserin gen för ett partikelsystem i ett alternerande magnetfält kan beskrivas enligt: c u-v- 10 15 20 52 2 i 1 7 0 fi* - 3 4 M =zH =(z'-1'z")H där M är magnetiseringen, H det alternerande yttre rnagnetfáltet, gden frekvensberoende komplexa susceptibiliteten bestående av en ifas komponent (realdel), 1! , och en ur fas komponent (imaginärdel), Ifas och urfas komponenterna för ett magnetiskt partikelsystem kan approximativt beskrivas som: lo ”zíšïtïï -- _ XOQÛCT) l -Hlzm F Där 10 är DC värdet av susceptibiliteten och tär relaxationstiden för magnetisk relaxation.

Om vi antar att vi har ett partikelsystem med varierande partikelstorlekar där en del partiklar genomgår Brownsk relaxation (de större partiklarna) och en del Néelsk relaxation (de mindre partiklarna) erhåller man ett magnetiskt responsbidrag från båda relaxationsprocessema beroende av frekvensområde AC fältet. Fi g. 1 visar schematiskt den totala magnetiska responsen som funktion av frekvensen för ett partikelsystem som uppvisar både Brownsk och Néelsk relaxation. Den övre kurvan (streckad linje) i figuren är realdelen av susceptibiliteten och den undre kurvan (heldragen linje) är den imaginära delen av susceptibiliteten. Maximumet för imaginärdelen vid lägre frekvenser är från den Brownska relaxationen och maximumet vid högre frekvenser är från den Néelska relaxationen. Den totala magnetiska responsen blir då summan av bidragen från de båda processema för både real och imaginärdel av susceptibiliteten.

För denna tillämpning är man endast intresserad av den Brownska relaxationen, varför diskussionen koncentreras vid dessa lägre frekvenser. 10 15 20 25 Q o o u oo .i 522 170 . . a u u» 5 För ett partikelsystem med partiklar som uppvisar Brownsk relaxation med endast en hydrodynamisk volym erhålls ett maximum i urfaskomponenten ( 1", den imaginära delen av den komplexa susceptibiliteten) vid en frekvens enligt: _ 1 _ kT Zmrß 6zVHr7 -fflÉX Runt denna frekvens, fw, kommer realdelen av susceptibiliteten, 1' , att minska kraftigt medan den imaginära delen av susceptibiliteten, 1", kommer att uppvisa ett maximum.

Värdet av 1" vid maximumet (B i figur 1) är bl.a. ett mått på antalet partiklar som genomgår Brownsk relaxation medan nivån hos den magnetiska responsen för 1' (C i figur l) efter maximumet i 1" är ett mått på totala antalet partiklar som fortfarande magnetiskt kan följa med det applicerade AC fältet (i detta fall partiklar som genomgår Néelsk relaxation). Vid tillräckligt låga frekvenser kan alla partiklar magnetiskt följa med AC fältet, d.v.s. realdelen av susceptibiliteten vid dessa låga frekvenser (A i figur 1) är ett mått på det totala antalet partiklar. Bidraget från de Brownska partiklarna kan då kvantifieras som skillnaden mellan totalbidraget, A, och det Néelska bidraget, C (Di figur 1). Vid högre frekvenser erhålls ett nytt maxima i 1" p. g.a. den Néelska relaxationen (E i figur 1). Jämförelse mellan dessa två värden är alltså ett mått på koncentrationen av partiklar i ett prov som genomgår den Brownska relaxationen vilket är av intresse för denna tillämpning. Bredden hos maximumet hos 1" , 5 fmx, (och hastigheten på avklingningen av j) är ett mått på energidissipationen pga. vätskans återverkan på partiklar (friktionen). Friktionen varierar med (framför allt) spridningen i den hydrodynamiska volymen mellan partiklarna som en partikelpopulation i ett prov kan uppvisa, men beror i viss mån också på statistiska (temperaturberoende) fluktuationer.

Genom att mäta susceptibilitet, den Brownska relaxationstiden saint energidissipationen skulle man kunna bestämma den totala partikelkoncentrationen, graden av partiklar som genomgår Brownsk relaxation i denna partikelpopulation, medelstorleken av en partikel i en bärvätska samt spridningen i partikelvolymer. - vw» 10 15 20 25 u u n c nu ' n u n o co II ° 2 .I ',. . _ .u e u I I ß I I' i I l I' 4' I 9 . s.. .w e. n u s s. . u ' , g gl O I I Ü Ü Ö O I I I Ü' . a u u u av Man har tidigare använt magnetiska partiklar som bärare av biomolekyler eller antikroppar för att mäta förändringar i deras magnetiska respons. I dessa metoder har man antingen bundit partiklarna till en fast yta eller låtit partiklarna att aggregera. Man har mätt hur den magnetiska remanensen avtar med tiden [6] efter det att partikelsystemet blivit magnetiserat eller så har man mätt upp den magnetiska responsen då ett extemt magnetfält applicerades över de magnetiska partiklarna [8]. I dessa mätningar har man kunnat skilja mellan den Néelska relaxationen och den Brownska relaxationen. Även Grossman et al, ref. 6, använder sig också av antikroppsbeklädda magnetiska nanopartiklar för att bestämma särskilda målmolekyler, men kombinerar detta med SQUlD teknologi, dvs. med en supraledande detektor.

Kötitz et al, ref. 7, har också studerat den Brownska relaxationen i system av magnetiska nanopartiklar. De har använt sig av magnetiska kulor som var täckta med biotin. De har till detta system tillsatt olika mängd avidin. Då avidin har 4 bindningsställen till biotin, bildas avidin-inducerade agglomerat. I föreliggande metod väljs molekyl 1 och molekyl 2 på ett sådant sätt att agglomerat inte bildas. Det kan t ex vara monoklonala antikroppar (molekyl 1) som binds in till den magnetiska kulan. Denna monoklonala antikropp skall endast binda till en specifik epitop på målmolekylen, vilket leder till förhindrande av agglomerat (Pig. s).

Alla dessa arbeten behandlar endast detektion av skillnader i grundtonen hos den magnetiska responsen av partiklar på ett variabelt magnetfält.

I en tidigare inlämnad patentansökan beskrivs detektion av förändringar av den magnetiska responsen hos magnetiska partiklar som uppvisar den Brownska relaxationen i en bärvätska (tex. vatten eller en lämplig buffert vätska, eller annan vätska lämplig för de biomolekyler |sana 10 15 20 25 ¿ 522 170 n | ~ u av 7 som är det slutliga målet för detektionen) under inverkan av ett yttre AC-magnetfält. Vid modifiering av partiklarnas effektiva volym eller deras växelverkan med den omgivande vätskan, till exempel då biomolekyler eller antikroppar bindes på deras ytor, så kommer den hydrodynamiska volymen av respektive partiklar att ändras (öka) vilket innebär en ändring (rninskning) av den frekvens, fw, där urfas komponenten av den magnetiska susceptibiliteten har sitt maximum.

Ibland kan ändringen av den hydrodynamiska volymen utebli vid mätning på en grundton.

Detta kan komma att ske om olika bidrag till en sådan ändring tar ut varandra; till exempel när ökning av den fysiska volymen hos partikeln pga adsorption av biomolekyler åtföljs av minskning av partikelvätska växelverkan pga av nämnda adsorption. Således föreligger önskemål att kunna mäta även i sådana situationer.

Kortfattad beskrivning av uppfinningen Ett ändamål med uppfinningen är att kunna mäta även i ovannämnda situationer.

En principiell aspekt av uppfinningen är att detektera förändringar av den magnetiska responsen hos magnetiska partiklar som uppvisar den Brownska relaxationen i en bärarvätska under inverkan av ett yttre AC-magnetfált, varvid responsen från partiklar som roterar med en frekvens som är ungefär dubbelt så hög som frekvensen hos det yttre magnetfältet (andra överton), eller ungefär tredubbelt så hög (tredje överton), eller ännu högre multipel av grundtonen, dvs. när den magnetiska responsen uppvisar icke linjära fenomen.

Enligt ytterligare en aspekt av uppfinningen utnyttjas övertoner av magnetisk respons, som uppstår genom att amplituden på ett tidsvarierande magnetfält ökas tillräckligt eller genom att använda ett tillräckligt högt konstant magnetfält som i tiden ligger överlagrat på det tidsvarierande magnetfältet. »unna 10 15 20 25 ' n o v» v a n u. . ø u o n n 1 0 0 a .I . Q u . - - v a u o n a: zur: - n . s a n u s n 1 e v : . . . . i ann nu nu o n u o: I z 0 . . ' . 2 z 2 'f ' , . .nu a" I . , c n u Enligt en föredragen utföringsfonn av uppfinningen åstadkoms en metod för detektering av förändring av magnetisk respons hos en magnetisk partikel försedd med yttre skikt i en bärarvätska, innefattande mätning av nämnda magnetiska partikelns karaktäristiska rotationstid med hänsyn till nämnda yttre skikts påverkan, vilken innefattar: utnyttjande av en mätmetod som innefattar mätning av övertoner av magnetisk respons, företrädesvis genom att amplituden på ett tidsvarierande magnetfält ökas tillräckligt eller genom att ett tillräckligt högt konstant magnetfält används i tiden som ligger överlagrat på det tidsvarierande magnetfältet.

Uppfinningen avser även en metod för bestämning av mängd av molekyler i en bäraivätska innehållande magnetiska partiklar innefattande stegen att: A. förse partiklar med ett skikt, vilket inter-/reagerar med den substans som skall analyseras, B. blanda de magnetiska partiklarna med det prov som skall analyseras med avseende på molekyler, fylla en provbehållare med vätskan som har förberetts enligt B, placera provhållare i detekteringssystem, .NGC applicera ett externt mätfált över provet med viss amplitud och frekvens, 111 uppmäta den magnetiska responsen (både ifas och urfas komponenterna) hos övertoner av denna frekvens, G. ändra frekvens och utför mätning igen enligt D och E, H. analysera resultatet genom att bestämma en Brownsk relaxationstid från ifas och urfas komponenter genom att använda data i det undersökta frekvensintervallet.

Uppfinningen avser även en anordning för utförande av en metod för detektering av förändringar av en magnetisk respons hos en magnetisk partikel försedd med yttre skikt i en ».v»:| 10 15 20 25 . ¿,. . g g; I! I l I 0 II O O Û Ü z . , , . e . - ~ ~ s 1 o n e: :fi-I: n ~ . | a n n i n f e I z . . . un. nu n: n u n u: : z I o - ' . 2 2 I Ü' 2.' .in n u n. .u n I 9 bärvätska, vilken metod innefattar mätning av nämnda magnetiska partikels karaktäristiska rotationstid med hänsyn till nämnda yttre skikts påverkan, varvid anordningen innefattar åtniinstone två väsentligen identiska detektionsspolar anslutna till detekteringselektronik och provhållare för upptagande av bärarvätska. varvid anordningen är anordnad att utföra mätning av övertoner av magnetisk respons, genom att amplituden på ett tidsvarierande magnetfält ökas tillräckligt eller genom att ett tillräckligt högt konstant magnetfält används i tiden som ligger överlagrat på det tidsvarierande magnetfältet.

En fördel med uppfinningen är att stora skillnader i magnetisk respons erhålls genom att använda övertoner varvid även låga koncentrationer kan analyseras. En ytterligare fördel med uppfinningen är att också vid höga koncentrationer då grundtonens frekvensskift är i litet kan övertoners frekvensskift variera kraftigt vilket underlättar att avgöra huruvida en ändring av partiklars ytbeläggning ägt rum eller inte.

Kortfattad beskrivning av figurer I det följande beskrivs uppfinningen med hänsyn till några utföiingsforrner med hänvisning till bifogade figurer, i vilka: Fig. l visar magnetisk respons som funktion av frekvens för ett partikelsystem som uppvisar både Brownsk och Néelsk relaxation.

Fig. 2 visar hur m2f varierar med frekvensen vid rumstemperatur för partikel, partikel med diametern 130 nm, sarnt partikel med inbunden AntiPSA, AntiPSA mot partikelytan.

Fig. 3 visar situationen för m3f, men för övrigt med samma betingelser som anges i Fig. 2.

Fig. 4 visar hur ifas och urfas komponenten av den magnetiska susceptibiliteten varierar med frekvensen vid rumstemperatur för samma betingelser som i Fig. 2 och Fig. 3. 1-11: 10 15 20 25 30 | | Q n :n 10 Fig. 5 visar ett schematiskt snitt genom ett mätsystem, enligt en utföringsform av uppfinningen.

Fig. 6 schematiskt visar en alternativ detektionskrets (differentiell mätning utan excitationsspole) enligt uppfinningen.

Fig. 7 schematiskt visar en applikation, enligt uppfinningen.

Fig. 8 visar en monoklonal antikropp som interagerar specifikt med endast en epitop på ett antigen.

DETAIJERAD BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN Enligt en aspekt av uppfinningen, kan magnetiska responsen hos övertoner mätas, vilket förklaras närmare nedan.

Om exempelvis amplituden på ett tidsvarierande magnetfält ökas tillräckligt högt eller ett tillräckligt högt konstant magnetfält i tiden som ligger överlagrat på det tidsvarierande magnetfältet används kan man förflytta sig in i fältornråden där inte längre magnetiseringen är endast linjär mot det pålagda magnetfältet. I dessa faltornråden kan man beskriva magnetiseringen som högre ordningens termer av det pålagda magnetfältet. Dessa högre ordningens termer av magnetfältet kommer att ge upphov till att man erhåller en magnetisk respons som varierar med 2f, 3f,.... nf (där f är frekvensen på det pålagda tidsvarierande magnetfältet och n är ett heltal). Magnetisk respons vid 2f, 3f, etc. kan dock uppstå även vid låga magnetfält t ex om partiklarna växelverkar med varandra i lösningen eller om det magnetiska innehållet hos enskilda partiklar förändras under inverkan det pålagda magnetfältet (det yttre fältet), eller t ex om det magnetiska innehållet roterar i förhållande till paitikelns rotation eller om det förändrar sin form under inverkan av det pålagda magnetfältet.

Det finns flera möjligheter att detektera övertonerna av vilka några kommer att beskrivas närmare. ...in 10 15 20 25 f522 170 ll Med lock-in teknik eller spektralanalys av responsen är det möjligt att detektera den magnetiska responsen på 2f och 3f, vilket i Fig. 2 och Fig. 3 betecknas m2f och m3f när ett fält med frekvensen f exciteras. Dessa figurer visar hur in- och urfas komponenter av susceptibiliteten mätta vid övertoner, m2f och m3f, varierar för partiklar utan antikroppar respektive med antikroppar, i detta fall AntiPSA, bundna mot partikelytan. Lösningen med partiklar (med diametern 130 nm) hölls vid rumstemperatur. Partiklarna befinner sig i buffertlösning, i detta fall PBS. Notera den stora förändringen i respons mellan endast partikel och partikel med AntiPSA både i m2f och m3f. Magnetisk respons hos ytterligare högre ordningars övertoner, här betecknat mnf, där n är ett heltal, kan naturligtvis även mätas, men beskrivs inte närmare. Diarnetem på partiklama, 130 nm, och lösningens temperatur, är naturligtvis enbart exempel och andra di ametrar respektive temperaturer är fullt möjliga utan att begränsa uppfinningen.

I Fig. 4 visas hur den magnetiska responsen ser ur när man mäter på samma frekvens (dvs grundtonen) som man exciterar fältet med, vilket vi kallar för mf. Mätningarna utförs på partiklar utan antikroppar, betecknat med partikel i figurema, och när partiklar där man bundit in AntiPSA, betecknat med AntiPSA i figurerna. Notera att ingen förändring i frekvensutseende i responsen mellan endast partikel och partikel med AntiPSA erhölls.

Enbart en liten signalminskning erhölls, vilken beror på en liten utspädning av partiklarna vid inbindning av AntiPSA. Mätningar visade att m2f och m3f inte uppkommer pga. av växelverkan mellan partiklarna. Andra mätningar (som inte visas med figur) visade vidare att m2f och m3f påverkas av koncentrationen av partiklar på liknande sätt som grundtonen gör. Detta innebär att även övertoner (m2f, m3f, etc.) kan användas för att bestämma partikelkoncentrationen i lösningen.

Mätmetoder: En känd metod är att detektera både 1' och j' över ett brett frekvensintervall från några Hz till uppemot några MHz för olika (yt-)modifikationer och jämföra dessa med varandra via en efterbehandling av insamlade data. 10 15 20 25 522.170 ~~~~ ~ nu o n u u u 12 Om önskemålet är att undersöka effekten av partikelmodifieringen (-modifieringar) så bör vätskans viskositet förbli konstant. Viskositetsändringar ändrar också partiklarnas Brownska rörelse, och ändrar j och g" frekvensberoende. Inverkan av viskositetsändringar kan därför vara svåra att skilja från bidrag orsakade p. g.a. partikelmodifikationer. Å andra sidan kan effekten utnyttjas för att jämföra olika vätskors viskositet varvid man använder identiska partiklar men ändrar vätskan ifråga.

En metod är att fokusera på detektionen av joch I" vid endast en frekvens, fm, och samtidigt bestämma âfmax, eller kring ett fåtal diskreta frekvensvärden. Vid behov kan man separat karakterisera ett givet partikelsystem, till exempel map graden av Brownsk relaxation eller storleksspridning.

För att dessa metoder skall fungera måste partiklarna ha en terrniskt blockerad magnetisk kärna (magnetisk partikelvolym), vilket begränsar partikelstorlekar och den magnetiska anisotropin av den magnetiska kärnan. Även om den magnetiska volymen är terrniskt blockerad kan den andra sin form under inverkan av det yttre pålagda magnetfältet, vilket kan ge upphov till uppkomsten av övertoner, vilka utnyttjas i föreliggande uppfinning för bestämning av analytkoncentration.

Ett typiskt partikelsystem lämpligt att användas för denna metod är partiklar med en magnetisk kärna av magnetit eller maghemit med en diameter på ca. 20 nm. Det finns även andra material med partiklar som uppvisar terrniskt blockerad magnetisering, t.ex. Co dopad järnoxid eller CoFe2O4 med en storlek på cza 10 nm - 15 nm, ev. sällsynta jordartsmetaller, och andra. mm; 10 15 20 25 30 522 170 " n o o u u: 13 I många applikationer, speciellt de som behandlas nedan, beläggs den magnetiska kärnan med ett extra skikt, till exempel en polymer såsom polyacrylamid eller dextran. Naturligtvis kan även andra beläggningsmaterial förekomma, till exempel metallskikt (såsom Au), andra polymerer, specifika kemiska föreningar såsom silaner eller thioler, etc. Ofta är det lämpligt att välja skiktets tjocklek så att den totala partikeldiametem varierar från ca. 25 nm upp till 1 um (eller högre). För att erhålla så stor procentuell frekvensändring vid partikelmodifikationer som möjligt skall dock relativt små partiklar (kring 50 nm) användas. Det antas att om totalstorlekar (diametrar) från cza 50 nm till 1 um används så erhålles tillräckligt stora procentuella frekvensändringar med vår metod.

Mätning och mätanordning: Nedan kommer en typisk mätmetod beskrivas mera detaljerat, varefter exempel ges på mätanordningar för utförande av denna.

Typiskt mäts i- och/eller urfaskomponenter av en magnetisk susceptibilitet i ett frekvensplan. Dessutom innebär nämnda mätning att vid modifiering av partiklarnas effektiva volym eller dess växelverkan med den omgivande vätskan ändras en hydrodynamisk volym av respektive partikel, vilket innebär en ändring av den frekvens (fm) där en urfaskomponent av den magnetiska susceptibiliteten har sitt maximum.

Mätningen är i själva verket en relativ mätning, varvid ändringar i ett modifierat partikelsystem jämförs med ett ursprungligt system. För mätningen används lärnpli gen en mätanordning som innefattar minst två provhållare och två detektorspolar, vilka typiskt kräver AC-ström som är så lika som möjligt i de båda spolama. Altemativt kan spolama t ex (eller excitationsspolen) matas med brus, varvid en bruskälla används och systemets respons analyseras med hjälp av FFI” (Fast Fourrier Transform) analys av en utgående signal.

Lämpligen nollställes signalskillnaden mellan spolarna, vilken typiskt sker genom att mekaniskt justera in lägena hos respektive provhållare altemativt ändra läget av respektive detektionsspole så att differenssignalen minimeras. Nämnda nollställning kan ske genom att min: 10 15 20 25 522.170 s » | n nu 14 minimera signalen genom att tillföra en bestämd mängd av ett magnetiskt ämne i ett av utrymmen där provhållarna är placerade, så att ämnet skapar ett extra bidrag till den ursprungliga signalen som därigenom kan nollställas. Det magnetiska ämnet uppvisar väsentligen noll magnetisk förlust (imaginärdel=O) och att en realdel av susceptibiliteten är konstant i det undersökta frekvensområdet.

I fall av en grundton, är det gemensamt för alla dessa metoder att man kan representera egenskaper hos en lindad spole med en ekvivalent elektrisk krets bestående av en induktans, L, i serie med en resistans, R, (som är anslutna till en kapacitans, C, parallellt med dessa. Kapacitansen beror på den elektriska isolationen av tråden och kan oftast försummas vid lägre frekvenser.) där kretsens resistans och induktans ändras då ett magnetiskt prov placeras i spolen. Om en variabel (AC) ström I(u>t) (som är i fas med AC- magnetfältet) flyter i kretsen så kommer den att inducera en komplex spänning vars realdel är i fas med strömmen medan den imaginära delen är fasförskjuten i förhållande till I(tnt).

Liknande resonemang kan tillämpas även på mätningar av övertoner. Även där kommer en variabel ström ge upphov till en komplex spänning där dock fasförskjutningen ofta är annorlunda än för en grundton.

Eftersom i första hand skillnader skall bestämmas i susceptibiliteten som uppstår vid olika partikelpreparationer (eller jämföra viskositeter hos två olika vätskor) konstrueras ett mätsystem 1 typiskt annorlunda än gängse använda mätsystem. Mätsystemet 1, som visas schematiskt i Fi g. 5, består av två identiska detektionsspolar 2, 3, som omger två st. identiska provhållare 4, 5 liknande de som finns kommersiellt tillgängliga.

I figur 5 visas att spolar samt provhållare är placerade koncentriskt samt injusterade kring en vertikal centrumaxel. Både provets läge samt mätspolens läge kan justeras separat.

Mätsystemet består av endast två spolar som bägge två matas med identisk AC-ström.

Mätspolarna måste inte vara anordnade koncentriskt i förhållande till varandra, utan kan vara anordnade på annat lämpligt sätt. Spolama kan placeras till exempel bredvid varandra, 10 15 20 25 522 170 n ~ ø Q nu 15 på ett lämpligt stativ. Det är även möjligt att anordna en excitationsspole (som inte visas) omslutande spolarna för att undvika uppkomsten av (en liten) fältgradient inuti spolama, men då måste de vara koncentriskt placerade.

De väsentliga fördelarna med systemet är dels möjligheten till komparativa mätningar och dels de olika möjligheterna till justering av systemet. Mätsystemets känslighet bestäms inte endast av si gnal-lbrusförhållandet, eller faltgradienter inuti spolama, utan också av obalansen mellan två nominellt identiska delsystem innehållande provhållarna 4, 5 med var sin detekteringsspole 2, 3. Obalansen, som vanligtvis är den viktigaste orsaken till försämrad känslighet, mäts utan provhållare eller med identiska provhållare och kan uppstå till exempel p.g.a.: 0 Något olika varvtal i respektive detekteringsspole 0 Inhomogent magnetfält pga. av små toleranser vid tillverkning vad gäller placering av prov i förhållande till respektive detekteringsspolen resp. excitationsspolen I Olika inbördes placeringar av provhållare inuti detektionsspolar I Inverkan av tillverkiiingstoleranser För att nollställa (balansera ut) skillnaden i signal mellan detekteringsspolarna kan lämpligen två olika metoder användas: Systemet kan vara konstruerat så att det är möjligt att mekaniskt justera in läge hos respektive provhållare alternativt ändra läget av respektive detektionsspole något så att obalans differenssignalen minimeras, eller genom att en bestämd mängd av torra magnetiska partiklar (kulor) anordnas i ett av utrymmen där provhållarna är placerade.

Vare sig man har endast 2 st norninellt identiska spolar eller omger dessa med en extra excitationsspole kan dessa anslutas till en lämplig detektionskrets antingen som excitationsspole och 2 detektionsspolar (parallellkopplade), eller som excitationsspole och 10 15 20 25 a o c ø v; 522 . 170 n » a o oo 16 2 detektionsspolar seriekopplade. Om en extra spole inte används så används de andra två spolarna både för excitation och detektion.

Ett annat alternativ är att enbart använda 2 seriekopplade spolar, utan excitationsspole.

Dessa används då både för excitation och detektion Dessa metoder kan tillämpas antingen som excitationsspole och 2 detektionsspolar (parallellkopplade), eller som excitationsspole och 2 detektionsspolar seriekopplade. Dessa används både för excitation och detektion.

Ett annat alternativ är att enbart använda 2 seriekopplade spolar, utan excitationsspole.

Dessa används då både för excitation och detektion.

Mätspolar som drivs mha av en frekvensgenerator: En annan mätprincip för att detektera den önskade spänningsdifferensen bygger på faslåsning (en s.k. Phase Locked Loop, PLL) enligt Fig. 6, som visar en principskiss över en altemativ detektionskrets där man använder en variabel frekvensgenerator altemativt brusgenerator 10, som ingångssignal samt mäter den komplexa spänningsskíllnaden m.h.a. en faslåst slinga. Spänningsskillnaden åstadkommes mha. lämplig inkoppling av operationsförstärkare 11. Liknande effekt kan fås även då man bildar en AC-brygga där två av bryggans fyra grenar utgörs av spole 12 respektive spole 13. Teoretisk bestäms spänningsskíllnaden förskj uten med 00 respektive med 900 i förhållande till ingångssignalen. I praktiken tillkommer en viss extra fasförskjutning pga. operationsförstärkare. Återigen detektering av signalskyllanden vid en och samma frekvens mellan de två detekteringsspolarna önskas.

En möjlig princip att åstadkomma spänningsskíllnaden enligt figuren är genom användning av operations(instrument)-förstärkare i en lämplig koppling. En annan möjlighet bygger på innan 10 15 20 25 u - ø | a; .522 170 17 att placera respektive spole i en AC-brygga. Bryggan matas av en oscillator/frekvensgenerator med variabel frekvens varvid amplituden hos strömmen som flyter genom spolarna hölls konstant. Amplituden hos den resulterade spänningsskillnaden för en given fasförskjutning i förhållande till ingångssignalen kan bestämmas m.h.a. en PLL krets 14 (fasskillnaden blir proportionell mot en DC-spänning som bestärns/ genereras av PLL kretsen). Innan PLL kretsen 14 är ett filter 15 anordnad som filtrerar bort grundtonen. Tillsammans med mätning av signalens amplitud får man återigen en tillräcklig beskrivning av provkarakteristika vid en viss frekvens. Metodens fördelar är framför allt att kunna mäta partikelsystemets magnetiska egenskaper över ett relativt brett frekvensintervall samt att excitationsspole ej behöves.

Ett altemativ till att använda oscillator/frekvensgenerator signaler för att generera tidsvariabel ström är att excitera spolarna m.h.a. vitt brus. Fördelen är att man kan erhålla frekvensberoende information genom en FFT-filtrering av responsen utan att behöva använda frekvensgenerator, dvs. att man erhåller information både om övertoner och om grundtonen på en och samma gång utan att behöva använda extra komponenter såsom filter, PLL, etc.

Den sensor som beskrivs ovan är ett generellt analysinstrument för analys av olika biomolekyler eller andra molekyler i vätska enligt principen som visas i figur 8. där man kopplar en lämplig molekyl till den magnetiska partikeln och sedan låter den till partikeln bundna molekylen att reagera med en annan lämplig molekyl ur lösningen. I figur 8 åskådliggörs detta mha antikropp antigen reaktion. Figur 9 visar att om man vill detektera antikropp/antigen inbindning så bör det vara en monoklonal antikropp för att undvika klustring (såsom beskrevs ovan). Exempel på andra molekyler som kan analyseras kan vara tex proteiner som finns i vätskelösning, såsom blod, blodplasma, serum, urin.

Förutsättningen för att metoden ska fungera är att analyten (molekyl 2) kan kopplas till partikeln på något sätt, t ex genom specifik interaktion med en annan molekyl (molekyl 1) 522 170 - - - | en 18 som redan innan analysens början har kopplats till kulan. Observera att dimensionerna (molekylernas storleki förhållande till kulans storlek) inte är skalenliga.

Eftersom specifika interaktioner är vanligt förekommande i biologiska system är det troligt 5 att sensorn kan få en framträdande roll för analyser inom detta område, t ex för analys av biokemiska markörer för olika sjukdomar. Exempel på molekyler som kan interagera specifikt med varandra är: a) antikropp - antigen b) receptor - hormon 10 c) två komplementära enkelsträngar av DNA d) enzym - substrat / enzym - inhibitor Partikelsystemet (t ex partikelstorlek och val av molekyl 1) skall anpassas efter storlek och art på molekyl 2. 15 Sensorn kan t ex användas inom medicinsk diagnostik. Den nya biosensom skulle t ex kunna ersätta vissa ELISA-analyser (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Denna metod används idag i hög utsträckning för att bestämma halter av biokemiska markörer (t ex proteiner) som finns i komplexa kroppsvätskor, såsom blod, serum och cerebrospinalvätska. Exempel på ELISA analyser som bör kunna ersättas med den nya 20 biosensom är: a) analys av tau-protein i cerebrospinalvätska (del i diagnos av Alzheimers sjukdom) b) analys av PSA i serum (diagnos av prostatacancer) c) analys av akutfasproteiner som mäts i samband med hjärtsjukdom d) analys av CA 125 i serum (diagnos av canceri äggstockarna) 25 Det kan antas att sensorn kan användas för detektion av flera markörer samtidigt genom »nuru användandet av kulor med olika storlekar och/eller av olika material i samma system. De olika kuloma ska då också vara belagda med olika ”biomolekyl 1”. ,»»:: 10 15 20 25 o v - u I» 522 170 , 19 Den nya tekniken kan användas för ”low throughput screening”, dvs. genomförandet av en eller ett fåtal analyser åt gången, eller för ”high throughput screening", dvs. genomförandet av ett stort antal analyser simultant. Det senare kan åstadkommas genom att mångfaldiga SCIISOITI.

Uppfinningen baseras på användandet av magnetiska partiklar. För att molekyl 2 i provet ska kunna fästa på den magnetiska kulan kan den magnetiska kulans yta modifieras på ett ändamålsenligt sätt. Detta kan ske t ex genom att belägga kulans yta med dextran, med alkanethioler med lämpliga ändgrupper, med vissa peptider, etc. På dextranytan (eller annan lämpligt mellanskikt) kan sedan molekyl 1, tex en antikropp, bindas in med hjälp av t ex cyanobromidaktivering eller med karboxylsyraaktivering. När molekyl 1 är kopplad till den magnetiska kulan blandas kulorna med det prov som skall analyseras, tex serum.

För att bestämma närvaro av biomolekyler eller antikroppar i en bärvätska innehållande magnetiska partiklar med den metod som vi föreslår, utförs lämpligen följande steg i provpreparering, mätning och analys av mätdata. 1. Blanda de magnetiska partiklarna med det prov som skall analyseras med avseende på en viss substans. 2. Fyll en provbehållare med det prov som har preparerats enligt punkt 1. 3. Placera provbehållare i detekteringspolarria eller detekteringssystemet (beroende på vad man använder för utrustning för att mäta upp den magnetiska responsens frekvensberoende). 4. Applicera ett externt mätfált över provet med en viss amplitud och frekvens. 5. Uppmät den magnetiska responsen (både ifas och urfas komponentema) vid övertoner och eventuell grundton av denna frekvens. 6. Ändra frekvens och utför mätning igen enligt punkterna 4 och 5. sirap 10 15 20 25 5 :'. -, ,- -- -- . . . . .. , ' i a. . s .- , I... n n n a 4 g , 2 z O' lo n. s. n; , , u: ou 0 o o u n y ' I n s i ° ~ - . . , _ ; ß . . . ' 0 u u" n o f, _ v 1 20 7. Analysera resultatet genom att bestämma den Brownska relaxationstiden från ifas och urfas komponentema genom att använda alla data i det undersökta frekvensintervallet (upp till ca. 10 kHz). En alternativ analys skulle kunna vara att enbart bestämma hur stort frekvensskiftet är (för samma värde av ifas och urfas komponent) vid ett par olika frekvenser, till exempel vid en grundton och en överton.

Systemet tillåter en kvantitativ jämförelse mellan olika vätskors viskositeter. Speciellt viktigt är det att mäta både på grundtonen och på övertoner då detta möjliggör en slags sj älvtest för mätmetodiken och kontroll för modellen som används för att beräkna viskositeten ur mätdata. Viskositeten kan mätas analogt med vad som har beskrivits i uppfinningen i övrigt med den skillnaden att man använder identiska partiklar vid viskositetsmätningar. Frekvensändringar uppstår p.g.a. olika viskositeter. Det är inte endast resonansfrekvensen, fm, som kommer att ändras utan också Ö fm. Metodens fördel jämfört med andra sätt att mäta viskositet är: 0 relativt små vätskemängder som behövs 0 möjligheten att mäta viskositeten lokalt kring partikeln vilket möjliggör detektion av viskositetsgradienter i en vätskevolym Denna viskositetsdetekteringsmetod bygger dock på att partiklarna fortfarande är stabila i de olika vätskoma.

Uppñnningen begränsas inte till de visade och beskrivna utföringsfonnerna. Modifieringar, ändringar och skillnader inom ramen för de närslutna patentkravens skyddsomfång kan förekomma. 4:11: 20 25 522 170 -- a » - Q en 21 Referenser 1. E. Kneller, in:Magnetism and Metallurgy vol. 1, eds. A.E. Berkowitz and E. Kneller, Academic Press New York (1969) 365. 2. C.P. Bean and J. Livingston, J. Appl. Phys. 30 (1959) 120S. 3. L. Néel, C.R. Acad. Sci. 228 (1949) 664. 4. Brown, W.F., 1963, J. App1.Phys. 34, 1319. 5. Fannin, P.C., Scaife, B.K.P. and Charles, S.W, 1988 J. Magn. Magn. Mater., 72, 95. 6. R. Kötitz, T. Bunte, W. Weitschies, L. Trahms, Superconducting quantum interference device-based magnetic nanoparticle relaxation measurement as a novel tool for the binding specific detection of biological binding reactions, J. Appl. Phys., 81, 8, 4317, 1997. 7. R. Kötítz, H. Matz, L. Trahms, H. Koch, W. Weitschies, T.Rheinlander, W. Semmler, T. Bunte, SQUID based remanence measurements for immunoassays, IEEE Transactions on Applied Superconductivity, vol. 7, no. 2, 3678-81, 1997. 8. K. Enpuku, T. Minotani, M. Hotta, A. Nakohado, Application of High T., SQUID Magnetometer to Biological Immunoassays, IEEE Transactions on Applied Superconductivity, Vol. 11, No. 1, 661-664, 2001. 9. H. L. Grossman, Y. R. Chemla, Y. Poon, R. Stevens, J. Clarke, and M. D. Alper, Rapid, Sensitive, Selective Detection of Pathogenic Agents using a SQUID Microscope, Eurosensors XIV, 27-30, 2000. 10. Applications of Magnetic Particles in Irmnunoassays, Mary Meza. Ch.22 (pp.303-309) in “Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers” ed. Häfeli, et al. Plenum Press, New York,1997; Lecture at conference in Rostock, Germany September 1996. 11. “The art of electronics”. P. Horowitz and W. Hill, Cambridge Univ. Press, 2” edition (1989). oooo u: ||||| no 522 % 170 22 12. “Design of crystal and other hannonic oscillators", B. Parzen, Wiley-Intersci Publ. (1983) a | | | n..

Claims (1)

1. nißa; 10 15 20 25 n o o u vc ,--.;-. .522 170 23 PATENTKRAV Metod för detektering av förändring av magnetisk respons hos en magnetisk partikel försedd med yttre skikt i en bärarvätska, innefattande mätning av nämnda magnetiska partikels karaktäristiska rotationstid med hänsyn till nämnda yttre skikts påverkan, kännetecknad av utnyttjande av en mätmetod som innefattar mätning av övertoner av magnetisk respons, företrädesvis genom att amplituden på ett tidsvarierande magnetfält ökas tillräckligt eller genom att ett tillräckligt högt konstant magnetfält används i tiden som ligger överlagrat på det tidsvarierande magnetfältet. Metod enligt krav 1, kännetecknad av att nämnda mätmetod innebär mätning av Brownsk relaxation i nämnda bärarvätska under inverkan av ett yttre altemerande magnet fält. Metod enligt krav 2, kännetecknad av, att nämnda mätning innebär mätning av i- och/eller urfaskomponenter av en magnetisk susceptibilitet i frekvensplan. Metod enligt krav 2, kärmetecknad av, att nämnda mätning innebär att vid modifiering av nämnda partiklars effektiva volym eller dess växelverkan med den omgivande vätskan ändras en hydrodynarnisk volym av partiklarna, vilket innebär en ändring, av den frekvens ( fm) där en urfas komponent av den magnetiska susceptibiliteten har sitt maximum. ønar» 10 15 20 25 10. u n ø | oo . n - . . p u 24 Metod enligt krav 2, kännetecknad av, att mätningen innefattar en relativ mätning, varvid ändringar i ett modifierat partikelsystem jämföres med ett ursprungligt system. Metod enligt krav 5, kännetecknad av, att åtminstone två provhållare och två detektorspolar används. Metod enligt krav 5, kännetecknaa' av, 2 att en extern oscillator-/frekvensgenerator anordnas, varvid spolar placeras i en altemerande brygga så att skillnaden mellan bägge detektorspolar mäts, och att fasskillnaden mellan frekvensgeneratorns utgångsström och/eller -spänning och en ström/spänning over bryggan mäts. Metod enligt krav 7, kännetecknaa' av, att en amplitudskillnad mellan oscillatoms utgångs- ström/spänning mäts och jämförs med en amplitud hos strömmen/spänningen i bryggan. Metod enligt krav 7, kännetecknad av, att mätningen utföres vid en eller flera olika frekvenser. Metod enligt krav 5, kännetecknad av, att en bruskälla, företrädesvis vitt brus, användes och att systemets respons analyseras med hjälp av en FFT (Fast Fourrier T ransform) analys av en utgående 1522 170 25 signal. 11. Metod enligt krav 5, kännetecknar! av, 5 att en signalskillnad mellan nämnda spolar nollställes. 12. Metod enligt krav 11, kännetecknad av, att nämnda nollställning sker genom att mekaniskt justera in läge hos respektive 10 provhållare alternativt ändra läget av respektive detektionsspole så att differenssignalen minimeras. 13. Metod enligt krav 11, kännetecknaa' av, 15 att nämnda nollställning sker genom att minimera signalen genom att tillföra en bestämd mängd av ett magnetiskt ämne i ett av utrymmen där provhållama är placerade, så att ämnet skapar ett extra bidrag till den ursprungliga signalen som kan genom nollställas. 20 l4. Metod enligt krav 13, kännetecknad av, att nämnda magnetiska ämne uppvisar väsentligen noll magnetisk förlust (imaginärdel=O) och att en realdel av susceptibiliteten är konstant i det undersökta frekvensområdet. 25 15. Metod enligt något av kraven 1-14, kännetecknad av, -¿ - »j att metoden används i analysinstrument för analys av olika biomolekyler eller andra 10 15 20 25 16. 17. 18. 19. 20. o n u u oo n - 522,170 I s u - v. 26 molekyleri vätska. Metod enligt krav 15, kännetecknad av, att nämnda molekyler innefattar en eller flera proteiner i en vätskelösning, såsom blod, blodplasma, serum eller urin. Metod enligt krav 16, kännetecknad av, att nämnda analyt (molekyl 2) kopplas till nämnda partikel genom interaktion med en andra molekyl (molekyl 1), vilken innan analysens början kopplas till partikeln. Metod enligt krav 16, kännetecknad av, att molekyler som kan interageras specifikt med varandra innefattar en eller flera av antikropp - antigen, receptor - hormon, två komplementära enkelsträngar av DNA och enzym - substrat / enzym - inhibitor. Metod enligt något av föregående krav, kännetecknad av, att de magnetiska partiklarnas ytor modifieras genom att belägga ytan med en eller flera av dextrane, med alkanethioler med lämpliga ändgrupper eller med vissa peptider. Metod enligt krav 19, kännetecknad av, att dextranytan (eller annan lämpligt mellanskikt) kan sedan en första molekyl, t ex en antikropp, bindas in med hjälp av t ex cyanobromidaktivering eller med 10 15 20 25 21. l\) h.) 23. 24. n a » n u o o o nu | a u u | o I 1 522 170 ø u - . n 27 karboxylsyraaktivering. Anordning för utförande av en metod för detektering av förändringar av magnetisk respons hos en magnetisk partikel försedd med yttre skikt i en bärvätska, vilken metod innefattar mätning av nämnda magnetiska partikels karaktäristiska rotationstid med hänsyn till nämnda yttre skikts påverkan kännetecknad därav, att anordningen innefattar åtminstone två väsentligen identiska detektionsspolar anslutna till detekteringselektronik och provhållare för upptagande av bärarvätska. varvid anordningen är anordnad att utföra mätning av övertoner av magnetisk respons, företrädesvis genom att amplituden på ett tidsvarierande magnetfält ökas tillräckligt eller genom att ett tillräckligt högt konstant magnetfält används i tiden som ligger överlagrat på det tidsvarierande magnetfaltet. . Anordning enligt krav 20, kännetecknad därav, att nämnda mätspolar samt provhållare är placerade koncentriskt samt injusterade kring dess vertikala centrumaxel. Anordning enligt krav 22, kännetecknad därav, att spolarna som omger respektive prov är elektriskt fasvridna gentemot varandra så att resonansfrekvensen bestäms av skillnaden mellan respektive spolens induktans och resistans. Anordning enligt krav 23, kännetecknad därav, att spolarna är placerade i en AC-brygga. unna; 10 15 20 25 25. 26. 27. 28. 29. 30. Q ø o n oo 522 170 28 Anordning enligt krav 21, kännetecknad därav, att en op-förstärkare är anordnad för subtrahering av två spänningar från varandra. Anordning enligt krav 21, kännetecknad därav, att anordningen innefattar en faslåsningskrets. Anordning enligt krav 21, kännetecknad därav, att anordningen innefattar oscillator/frekvensgeneratorsignaler för att generera tidsvariabel ström för att excitera spelarna medelst vitt brus. Anordning enligt krav 21, kännetecknad därav, att frekvensberoende infonnation erhålla genom en FFI-filtrering av responsen. Anordning enligt krav 21, kännetecknad därav, att magnetsensor används för detektion. Metod för bestämning av mängd av molekyleri en bärvätska innehållande magnetiska partiklar innefattande stegen att: A. Förse partiklar med ett skikt, vilket inter-/reagerar med den substans som skall analyseras, B. Blanda de magnetiska partiklarna med det prov som skall analyseras med avseende på molekyler, C. Fylla en provbehållare med vätskan som har förberetts enlig B, o o n u nu a S22 170 29 D. Placera provhållare i detekteringssystem, E. Applicera ett externt mätfält över provet med viss amplitud och frekvens, F. Uppmäta den magnetiska responsen (både ifas och urfas komponenterna) hos övertoner av denna frekvens och eventuellt en grundton, 5 G. Ändra frekvens och utför mätning igen enligt D och E, H. Analysera resultatet genom att bestämma en Brownsk relaxationstid från ifas och urfas komponenter genom att använda data i det undersökta frekvensintervallet. 10 31. Metod enligt krav 30, kännetecknar! av, att bestämina frekvensskiftet (för samma värde av ifas och urfas komponent) vid olika frekvenser. 15 32. Metod enligt krav 30-31, kännetecknad av, att nämnda molekyl består av en biomolekyl. snar;