SE504108C2 - Human Kalcium sensor - Google Patents
Human Kalcium sensorInfo
- Publication number
- SE504108C2 SE504108C2 SE9301764A SE9301764A SE504108C2 SE 504108 C2 SE504108 C2 SE 504108C2 SE 9301764 A SE9301764 A SE 9301764A SE 9301764 A SE9301764 A SE 9301764A SE 504108 C2 SE504108 C2 SE 504108C2
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- calcium sensor
- calcium
- protein
- sensor protein
- ccs
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
- A61P3/14—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis for calcium homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Obesity (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
504 1oà 2
sekvens hittills varit okända.
SAMMANFATTNING AV UPPFINNINGEN
Mot denna bakgrund har syftet med den aktuella uppfinningen varit att erbjuda
tillräckliga strukturella data rörande kalciumsensor/receptor molekylen för att
möjliggöra komplett molekylär karakteristik av densamma.
Som ytterligare en viktig del erbjuder föreliggande uppfinning prober som kan
användas för att identifiera andra nya liknande kalciumsensor proteiner.
Ett annat mål med uppfinningen har varit att använda föreliggande strukturella data
för att skapa nya behandlingsmetoder eller ämnen och föreningar som kan användas
för att behandla kalciumrelaterade sjukdomar.
Två viktiga humana sjukdomar associerade med störning av kalciumjon-
homeostasen är hyperparathyroidism (HPT) och osteoporos. Som en viktig del av
uppfmningen kan celler uttryckande kalciumsensor proteinet eller innehållande
cDNA kodande för kalciumsensor proteinet, utnyttjas i en assay för att identifiera
molekyler med effekten att blockera eller potentiera aktiviteten i kalciumsensor
proteinet. Härigenom identifierade molekyler förmodas vara användbara för
behandling av vissa humana sjukliga tillstånd orsakade av störda nivåer för PTH,
vitamin D3 produktion, östrogen, osteoklast- eller osteoblast aktivitet (orsakande
benresorption och/eller nybildning), kalciumsekretion eller kalciumjon homeostas.
Föreliggande uppfinning beskriver isolering och partiell karakteristik av en cDNA
klon kodande för kalciumsensor/receptor molekylen i human placenta liksom
verifikation genom Northern blot av uttryck för motsvarande mRNA i parathyroidea
och njurvävnad. Påtaglig likhet mellan kalciumsensor molekylen och ett tidigare
beskrivet Heymann nefrit antigen från råtta (11), har antytt att den gemensamma
kalciumsensor molekylen för plaoenta, parathyroidea och njurtubuli är släkt med
detta antigen eller representerar dess humana homolog, och att kalciumsensor
3 i 504 108
molekylen tillhör en familj stora glykoproteiner med receptorfunktion och
kalciumbindande förmåga.
KORT BESKRIVNING AV FIGURER
Fig 1. Isolering genom HPLC av peptider erhållna efter digestion av kalciumsensor
proteinet med Lys-C endoproteas (obruten linje). Den streckade linjen i figuren
representerar kromatografi av en identisk reaktion där kalciumsensor proteinet har
utelämnats. Flödeshastigheten har hållits konstant IOQuI/min. Två
peptid fraktioner som givit lätt avlâsbara sekvenser harindikerats
i figuren med pilar.
Fig 2. Sekvenser för två Lys-C peptider isolerade med HPLC från kalciumsensor
proteinet.
Fig 3. Partiell nukleotid sekvens och överensstämmande aminasyresekvens för
cDNA klonen, pCAS-2, kodande för delar av kalciumsensor proteinet. Delar av
överenstämmande aminosyrasekvens för peptiderna 292 och 293 är understrukria.
Fig 4. Beskrivning av aminasyrasekvens för kalciumsensor proteinet jämfört med
motsvarande delar av Heymann antigenet (HEYMANN), low density lipoprotein
receptor (LDL-RC), och LDL relaterad receptor protein (LDL-RRP). Asterisk
anger identitet mellan kalciumsensor proteinet och någon av övriga proteinsekvenser,
x anger positioner inom Heymann antigenets sekvens där identiteten för en
aminosyra inte publicerats.
Fig 5. Analys genom Northern blot av total RNA från parathyroidea adenom (1),
njure (2), lever (3), placenta (4), pankreas (5), binjure (6), tunntarm (7). Filter har '
hybridiserats med 2,8 kb pCAS-Z proben och reaktioner har visualiserats med
användning av .fosforimagen Positionema för 28S och 18S ribosomalt RNA har
indikerats.
504 108 h
DETAUERAD BESKRIVNING Av PArENrr-rrs oMFAnmNG
Såvida inte annat anges har nedanstående beteckningar följande betydelse:
Beteckningen "polypeptid" innbär ett linjärt arrangemang av aminosyror kopplade
till varandra med peptídbindningar mellan a-amino och karboxyl grupper av
närliggande aminosyror.
"Väsentligen renad" används i betydelsen huvudsakligen homogen dvs ett ämne eller
en substans i huvudsak fri från andra ämnen eller substanser som kan vara bundna
till ämnet i sin naturligt förekommande form (dvs andra proteiner eller peptider,
kolhydrater, lipider). "Väsentligen ren" används inte för att utesluta artificiella eller
syntetiska sammansättningar med andra ämnen. Beteckningen utesluter inte heller
närvaro av vissa föroreningar som inte interfererar med biologisk aktivitet och vilka
kan vara närvarande, t ex p g a inkomplett rening eller blandning med farmaceutiskt
acceptabla preparationer.
"Biologiskt aktiv polypeptid" betecknar den naturligt förekommande polypeptiden i
sig, liksom biologiskt aktiva analoger därav, inkluderande syntetiskt producerade
polypeptider och analoger därav liksom naturliga och farmaceutiskt acceptabla salter
och farmaceutiskt acceptabla derivat därav. “Biologiskt aktiva polypeptider"
innefattar också biologiskt aktiva fragment, liksom "biologiskt aktiva sekvens-
analoger". Olika former av peptiden kan finnas. Dessa variationer kan karakteriseras
av skillnader i nukleotidsekvens för den strukturella gen som kodar för proteiner
med identisk biologisk funktion.
"Biologiskt aktiva sekvens analoger" inkluderar icke-naturligt förekommande
analoger vilka har enkla eller multipla aminosyra-substitutioner, deletioner,
additioner eller ersättningar. Alla liknande allel-variationer, modifikationer och
analoger resulterande i derivat vilka bibehållit en eller flera av de nativa biologiskt
aktiva egenskaperna inkluderas inom ramen för uppfinningen.
5 504 108
I denna ansökan är nukleotider angivna genom sina baser med användning av
följande enbokstavs-förkortningar:
Guanin G
Adenin A
ïymin T
Cytosin C
Okänd N
I denna ansökan anges enstaka aminosyror med användning av följande enbokstavs-
förkortningar:
Alanin
Cystein
Asparaginsyra
Glutamínsyra
Fenylalanin
Glycin
Histidin
Isoleucin
Lysin
Leucin
Metionín
Asparagin
Prolin
Glutarnin
Argínin
Serin
Treonín
Valin
Tryptofan
Tyrosin
Okänd
><>-<É<*-JC0VUO*UZZF"N”CEC3W1IT1UÛ>
50 4 1 0 8 6
Beteckningen "aminosyra" används härvid för att beteckna någon av ovan nämnda
naturliga aminosyror eller funktionella ekvivalenter därav.
Den aktuella uppfinningen presenterar en isolerad nukleinsyra molekyl kodande för
ett kalciumsensor protein och har kodande sekvens innehållande sekvenser angivna i
Fig 3.
Dessutom omfattar uppfinningen en vektor innehållande en isolerad nukleinsyra-
molekyl kodande för kalciumsensor proteinet.
Uppñnningen omfattar också en metod för att preparera det aktuella kalciumsensor
proteinet vilken innebär insättning av nukleinsyror kodande för kalciumsensorn i en
lämplig vektor, insättning av den härvid erhållna vektorn i en lämplig värdcell,
återvinnande av kalciumsensor proteinet producerat av värdcellen och rening av det
således erhållna kalciumsensor proteinet. Denna metod for preparering av
kalciumsensor proteinet utnyttjar väl känd rekombinant DNA teknologi.
Material och metod
Vävnadspreparat. Delar av humana parathyroidea körtlar har tillvaratagits vid
operation av patienter med primär HPT. Andra humana vävnadsdelar (njure,
epididymis, lever, bukspottkörtel, binjure, tunntarm, mjälte, lunga och tvärstrimmig
muskel) har tillvaratagits från organ avlägsnade vid annan typ av kirurgi. Human
placenta vävnad har tillvaratagits i samband med fiirlossing efter okomplicerad
fullgången graviditet. Alla vävnadsprov har omedelbart snabbfrusits i isopentan och
förvarats vid -70°C.
Isolering av kalciumsensor proteinet från human placenta. 500 kDa
kalciumsensor proteinet har isolerats och renats genom immun- och jonbytar
kromatografi, i enlighet med ett tidigare beskrivit protokoll (7). Härvid utnyttjas två
olika monokloriala antiparathyroidea antikroppar (1,7), E11 och G11, vilka visats
binda till olika epitoper av kalciumsensor proteinet; E11 har inte uppvisat
funktionella effekter, emedan G11 effektivt inhiberar kalcium regulation i såväl
7 ' 504 108
parathyroidea som placenta celler (1,7). Efter rening har kalciumsensor protein-
preparationen blivit föremål för gelkromatografi på en Zorbax GF25 gelkolonn
(9,2x250 mm), före enzymatisk nedbrytning.
Det biologiskt aktiva kalciumsensor proteinet i föreliggande ansökan har isolerats
enligt ovan. Det kan också prepareras genom kemisk syntes utnyttjande ett
rekombinant DNA bíosystem. Biologiskt aktiva fragment av kalciumsensor proteinet
kan också prepareras med användning av väl etablerad syntetisk teknik eller
rekombinant teknologi.
Klyvning och sekvensbestämning av isolerade peptider.
Klyvning av 500 kDa proteinet med endoproteas Lys-C från Achromobacter lyticus
har gett upphov till peptider, vilka separats på en Brownlee microbore C, kolonn
(2,2x30 mm), ekvilibrerad i 5% acetonitrile i 0,02% trifluor-ättiksyra. En linjär
gradient av 5 till 60% acetonitril i 0,02% trifluor-ättiksyra har utnyttjats för
peptideluering, monitorering har skett vid 214 nm med användning av en Waters
990 diod-array detektor (Millípore Corporation, Millford, Mass). Amino-terminala
sekvenser av peptiderna har bestämts i en ABI 470A gas-fas sekvenator, utrustad
med en ABI 120A PTH-aminosyra kromatograf (Applied Biosystems, Foster City,
Ca., USA).
Oligonukleotid syntes. Oligonukleotider har syntetiserats med användning av en
ABI 381 oligonukleotide synthesizer (Applied Biosystems). Följande oligonukleotid
blandning har utnyttjats som probe för screening av ett placenta cDNA bibliotek:
CCA ATA IAG CTG ATC CTC AAA GAT ATC IAG IGA ATA IGG ATT CAT IGC
G G G G G G
Följande två oligonukleotider har syntetiserats för användning i PCR reaktioner:
GCGGAATTC GTA ATG CAA CCA GAC GG
C G C T
G G
T T
504 108 8
ATAGGATCC TG ATC CTC AAA AAT ATC
G T G G G
T
De första nio nukleotidema innehåller ett EcoR I och ett BamH I site, och övriga
nukleotider motsvarar aminosyrorna 2till 7 'av peptid 293 till aminosyroma 14 till 9
av peptid 292.
Screening av ett placenta cDNA bibliotek med en sammansatt oligonukleotid
probe. Ett placenta Ä. gt 11 cDNA bibliotek (Clontech, Ca., USA) har sätts ut med
en täthet av cirka 2x105 plaque inom 20x2š aga; platta. Filterkopior
(Hybond-N+, Amersham) av tio plattor har prehybridiserats i SXSSPE; 120 mM
NaCl, 8 mM NaH2PO4, 0,8 mM EDTA, pH 7,4) Sx Denharfs lösning (12), 0,5%
SDS, 20ug/ml enkelstrandat laxspermie DNA (Sigma Chemical Co., Szt Louis,
Ohio). Den sammansatta oligonukleotid proben, inmärkt med Ä-[32P]-APT och
polynukleotidkinas (Amersham) har tillsatts hybridiserings-blandningen (30xl0ó cpm
i 50 ml), och hybridiseringen har utförts över natt i 42° C. Filtren har tvättats två
gånger i 2x SSPE och en gång i 0,1xSSPE, exponerats på en autoradiografi skärm
och analyserats med en fosforimager (Molecular Dynamics, Image Count S.W, Sun
Valley Ca).
PCR reaktion. Delar av Ä gt 11 cDNA klonen CAS-1 har amplifierats medelst
PCR med användning av två degenererade prober motsvarande delar av peptidema
292 och 293. Följande förhållande har förelegat: 170 ng templat DNA, 1 pmol av
vardera oligonukleotid blandningen som primer, dNTP l50nm, Taq-polymerase
0,75 u. Reaktionen har utförts i 20 ul av 10nM Tris-HCL, pH 8,0, 1,5 mM MgCl»
50mM KCL i en Coy Temp cycler model 60 (Coy laboratory Products Inc. Ann
Arbor Mich., USA). Två denaturerings cykler har utförts vid 94° C under 2 min,
följt av annealning vid 47° under 1 min och extendering vid 72° C under 1 min och
30 sek efterföljt av 33 cykler vid 94° under 1 min, 54° under 45 sek, 72° under 1
min och med en slutlig extendering vid 72° under 10 min.
9" I 504 108
Screening av ett placenta cDNA bibliotek med ett PCR-fragment som probe.
Ett humant placenta k ZAP-11 cDNA bibliotek har screenats med PCR-fragment
från cDNA klonen CAS-1, märkt genom random priming, som probe. Screeningen
har utförts som ovan. 211106 plaque fördelade på. tio 20x25 agarplattor har screenats.
Nukleotid sekvens bestämning. De inklonade cDNA fragmentet i fagklonen CAS-
2 har överförts från fagvektorn till Bluescript+ vektorn med hjälp av en hjälparfag
(Stratagene, La Jolla, Ca). Nukleotidsekvens reaktioner har utförts enligt cykle-
sekvens-förfarandet, med användning av ett kit från Applied Bíosystems. Sekvenser
har analyserats i en sekvenator med användning av databehandlings programmet
VIII soft-Ware (Applied Biosystems).
Databas sökning. EMBL-31 data basen i Intelligenetics format (Intelligenetics Rel.
5.4), har utnyttjats för sökning av sekvenslikheter med placenta cDNA sekvensen
med användning av FASTDB algoritmen (13).
Immunfárgning och Northern blot. Immunhistokemiska studier har utförts på
acetonfixerade 6p.m tjocka fryssnitt med användning av de monoklonala
antiparathyroidea antikropparna E11 och G11 i koncentrationen Sug/ml, med
användning av en mus peroxidas-antiperoxidas teknik på human placenta,
parathyroidea, njure och epidídymis vävnad liksom övriga humana vävnader - enligt
ovan (1-7). Monoklonala antikroppar mot kollagen typ II har utnyttjats som
negativa kontroller (14).
Total RNA har extraherats från vävnadsproven med användning av acid
phenol/chloroforrn metoden. För Northem blot har ca 10ug av total RNA utnyttjats
för elektofores i en 1,5%/37% agaros/formaldehyd gel, varefter blottning skett till
nylon membran (Qiabrane, Diagen Gmbh, Düsseldorf, Germany) och hybridisering
utförts med 2,8 kb klonen (se resultat) märkt med random priming metoden.
Hybridiseringar har genomförts vid 42° C under 18-24 timmar i 50% formamid, 4x
saline sodium citrat (SSC; 150 mM NaCl, 15 mM Na-citrate, pI-I 7,0) 2x Denhart's
lösning, 10% dextran sulfat (Kabi-Pharmacia, Uppsala, Sweden) och 100ug/ml lax
504 108 1”
spermie DNA. Filtren har tvättats med en slutlig stringens motsvarande 1xSSC/0,1%
SDS under 30 min vid 42° C, och exponerats i en fosforimager (se ovan).
RESULTAT.
Isolering av kalcium sensor proteinet, peptid klyvning och sekvensbestämning.
Kalciumsensor proteinet renades från placenta vävnad med användning av lectin-
kromatografi, immunaffinitetskromatografi utnyttjande de immobiliserade
monoklonala antiparathyroidea antikroppama, och slutligen jonbytarkromatografi
(1,7). Samma antikroppar har använts i en Sandwich ELISA för att kontrollera
reningsproceduren. För att förhindra kontaminering med lågmolekulära peptider
gjordes hela den slutliga preparationen, bestående av 200ng av 500 kDa protein
kedjan, 6M med avseende på guanidin-HCl och applicerades sedan på en
gelkromatografi kolonn, ekvilibrerad med 2 M guanidin-HCI, 0,1 M Tris-HCl, pH
8,5. Kolonnen eluerades med samma buffert. I det närmaste allt proteinmaterial kom
fram nära void volymen på den förväntade platsen för ett protein med molekylvikten
500 kDa. Separata fraktioner innehållande detta material kombinerades och
endoproteinas Lys-C (Ing) tillsattes. Digestionen tilläts fortgå över natt vid 370 C.
Det fragmenterade proteinet reducerades genom inkubering med 0,1% ß-
mercaptoetanol vid 37° C under 30 min och alkylerades slutligen med 4-vinyl
pyridine (0,3%) vid rumstemperatur under 2 tim. Peptidblandningen applicerades
sedan på en reversed fas Ci kolonn ekvilibrerad i 5% acetonitril i 0,2% trifluor-
ättikssyra. Peptider eluerades genom en linjär gradient av 5-60% acetonitrile i
0,02% trifluor ättikssyra (Fig 1). P g a det stora antalet peptider var elutionsmönstret
komplext. Flera peptidfraktioner blev föremål för sekvensbestämning i en gasfas
sekvenator och lätt tolkbara sekvenser erhölls för två fraktioner (Fig 2).
Isolering av en cDNA klon kodande fór 500 kDa kalciumsensor proteinet.
En oligonucleotid blandning (48 bp) konstruerades med syfte att koda for
aminosyroma 2 till 17 av den sekvensade peptiden 292. För att göra oligonukleotid
blandningen mindre komplex insattes fem inosin-baser i degenererade positioner där
ingen ledning erhölls av kodonets användning i humana gener. I nio positioner där
två baser var möjliga föreslogs en av basema med en sannolikhet överskridande
'l ' 504 108
70% med hänsyn till kodonanvändningen och denna bas utnyttjades därför i
oligonukleotid blandningen.
Den sammansatta oligonukleotiden märktes radioaktivt och användes som probe för
att screena ett humant placenta Ä-gt 11 cDNA bibliotek. Omkring 2x10° plaque
screenades och en enstaka positiv klon, erhölls-Den genetiska koden för
denna klon bestämdes till 2,3 kb genom restriktions mappning. För att erhålla en
igenkännbar sekvens för klonen på ett snabbt sätt gjordes ett försök att PCR-
ampliñera delar av sekvensen med användning av degenerade oligonukleotider
motsvarande delar av peptiderna292 och 293 .som primers. Ett distinkt DNA
fragment motsvarande omkring 450bp erhölls. Delar av fragmentet sekvensades med
oligonukleotid blandningen motsvarande peptid 293 som primer. I en läsram av den
erhållna sekvensen kunde sekvensen VGRl-l] härledas, med utmärkt
överensstämmelse med den karboxyltenninala 5 aminosyra långa ändan av peptid
293. För att erhålla en längre klon screenades ett humant placenta 7» ZAP-II cDNA
bibliotek. Screeningen utfördes med PCR fragrnentet som probe. Bland 2x106
plaque erhölls en enda klon, CAS-Z. cDNA-fragmentet i denna klon, bestämd till
2,8 kb, insattes i bluescript+ vektorn med användning av en hjälparfag. Delar av
denna klon, PCAS-2, kundepartiellt sekvensas med syntetiska oligonukleotider som
primers (Fig 3). En öppen läsram erhölls innehållande båda peptidema 292 och 293.
Perfekt överenstämmelse förelåg- mellan peptid sekvensema och den förmodade
aminosyra sekvensen från cDNA klonen.
500 kDa placenta kalcium sensorn tillhör LDL receptor superfamiljen.
Sökning i databas med den tillgängliga utlästa aminosyrasekvensen från cDNA-
klonen för placenta 500 kDa proteinet visade homologi mellan detta protein och
receptorer tillhörande LDL-receptor superfamiljen.
Största likheten påvisades med Heymarm nefrit antigenet från råtta (11). Fig 4 visar
jämförelse mellan den tillgängliga placenta 500 kDa protein sekvensen och
sekvenser fór I-“Ieymann antigenet liksom för två andra medlemmar av samma
protein-superfamilj, LDL-receptom och LDL-receptor relaterat protein (identiskt
med 01-2 macroglobulin receptom) (11,15,16). Sekvenslikheten mellan placentas
12
504 108
kalcium sensor och Heymann antigenet beräknades till 82% inom den region som
var tillgänglig för jämförelse (innehållande 236 aminosyror), vilket är högt, med
hänsyn till att de två proteinerna härrör från olika species.
Immunhistokemi och Northern blot
Den påtagliga likheten mellan placentas 500 .kDa kalciumsensor kedja och
Heymann nefrit antigenet föranledde en utvidgad immunhistokemisk undersökning
inom ramen för föreliggande studie. Antiparathyroidea antikroppama (E11 och G11)
visades härvid färga inte bara parathyroidea, placenta och proximala njurtubuli celler
utan också epididymis celler, i likhet med tidigare påvisad reaktivitet för antikroppar
reaktiva med Heymann antigenet (17,20). Northern blot analys av total RNA
(uppskattningsvis IOug/lane) från human njure, placenta och parathyroidea körtlar
med den identifierande 2,8 kb klonen som probe, visade hybridiserande RNA av en
ungefärlig storlek motsvarande 15 000 baser i samtliga dessa vävnader (Fig 5). RNA
från human lever, pancreas, binjure och tunntarrn (Fig 5) liksom mjälte, lunga och
tvårstrimmig muskel (ej illustrerat) saknade hybridisering.
Diskussion
Parathyroideas övergripande, reglerande roll inom kalcium homeostasen har satts i
samband med dess ovanliga förmåga att avkänna och svara på förändringar i
extracellulär kalciumjon koncentration. Av väsentlig betydelse för registrering av
dessa förändringar är en katjon receptor eller sensor i parathyroideas cellmembran,
vars fórkomst har implicerats genom en serie studier av parathyroideacells-
regulation in vitro (9,10,21-24). Idén om en cellmembran bunden receptor har orts
ytterligare sannolik i samband med att monoklonala antiparathyroidea antikroppar
visats identifiera och interferera med parathyroidea cellens törrnåga att avkänna
extracellulära kalcium koncentrationer (1-6). Ett ytterligare viktigt bevis för
förekomst av denna kalciumsensor mekanism har erhållits när cytotrofoblast celler i
human placentavävnad, selekterade genom sin reaktivitet med en av
antiparathyroidea antikropparna har uppvisat en i det närmaste parathyroidea-
identisk reaktivitet vis-a-vis förändringar i extracellulärt kalcium och denna
förmåga visats kunna blockeras av en av antiparathyroidea antikroppama (7,8).
13 ' 504 108
Parathyroideas kalciumsensor har härefter isolerats genom immunaffinitets-och
jonbytar kromatografi och visats utgöras av ett stort glykoprotein med en uppskattad
molekylvikt runt 500 kDa (7). Genom immunprecipitation har också kunnat visas att
ett protein av samma storlek reagerar med antiparathyroidea antikroppama i
parathyroidea- och njurtubuli- celler (opublicerade data., 25).
Parathyroideas kalcium sensor/ receptor haruuppvisat egenskaper liknande andra
klassiska receptorer för cellaktivering trots att sensorn har den unika förmågan att
binda och aktiveras av di- och trivalenta katjoner. Katjon bindning initierar bifasisk
stegring i [Cazfl] och samtidig aktivering av fosfolipas C, troligen via ett kopplat G-
protein, resulterande i bildning avinositolfosfater (2,5,9,10). En initial, transient
stegring i [Cazfl] orsakas av inositol-trisfosfat (Ip 3) inducerad mobilisering av
kalcium från intracellulära kompartment, emedan en efterföljande bestående
förhöjning av [Cazfl] orsakas av Caz* inflöde genom plasmamembran kanaler,
troligen medierad genom ökning av inositol-tetrafosfat (Ip 4) (9,10,23).
Sekvensbestämning av den erhållna partiella cDNA-klonen och data-bas jämförelse
utnyttjande den utlästa aminosyra sekvensen har visat att placeutas kalciumsensor
tillhör LDL-receptor superfamiljen av proteiner, och tillgängliga sekvenser har
uppvisat påtaglig likhet med Heymann nefirit antigenet från råtta (l1,15,16). Detta
antigen har ursprungligen beskrivits som ett 330 kDa glykoprotein (gp330)
förekommande i proximala njurtubulis borstbräm samt i placenta och epididymis
celler, men genom speciella fárgningstekniker också påvisats förekomma sparsamt i
glomeruliceller i råttnjure liksom pneumocyter typ Il i lunga samt sporadiskt i vissa
leverceller och tunntarmsceller (17,19). Det har senare föreslagits att molekylvikten
för proteinet har underskattats och egentligen torde ligga omkring 500 kDa (20).
Heymann antigenet har visats varadet huvudsakliga antigen som orskar membranös,
autoimmun glomerulonefrit hos råtta efter immunisering med en (oren) tubuliprotein
fraktion (17,19). Med användning av anti-gp330 antikroppar har ett protein med en
beräknad molekylvikt större än 400 kDa identifierats hos homo (20). Sekvens-
likheter mellan nu tillgängliga delar av det humana placenta 500 kDa kalciumsensor
proteinet och Heymann nefrit antigenet frånråtta, med 82% likhet inom hittills
sekvensade 236 aminosyror, antyder att det egentligen rör sig om två likartade
former av kalciumsensor proteinet i två olika species. Denna förmodan stöds av
504 108 V*
likheter i vävnadsdistribution mellan de två proteinema, som visats genom
immunhistokemiska undersökningar i den aktuella studien. Antikropparna E11 och
G11, vilka reagerar med kalciumsensor proteinet, har alltså visats färga
parathyroidea celler, proximala tubuliceller, cytotrofoblast celler i placenta och också
epididymis celler. Dessutom har vi nyligen rapporterat färgning med en av
antiparathyroidea antikroppama huvudsakligen inom sk' coated pits och basen av
microvilli i proximala tubuli, liknande det fárgningsmönster som tidigare beskrivits
med antikroppar mot gp330 proteinet (19,26).
Hittills identiñerade medlemmar av LDL-receptor superfamiljen, LDL-receptor,
LDL-receptor relaterat protein och Heymannantigenet, har förmodats ha funktion
som protein receptorer, men alla uppvisar också funktionellt betydelsefull Caz*
bindning (16,27,28). Således är Caz* nödvändigt för interaktion mellan LDL-
receptom och apo-B (27). LDL-receptor relaterat protein (aQ-macroglobulin
receptorn) har också förmågan att binda Cazfl vilket inducerar
konforrnationsförändringar och Ca” är också nödvändigt för bindning av aktiverat
aQ-makroglubulin till denna receptor (16). Nyligen har Heymann antigenet från råtta
genom en blotting teknik visats interagera med Ca” (28). i
Det återstår fortfarande att säkert identifiera Ca2*-bindande sekvenser inom kalcium
sensor proteinet. Sensor proteinet (liksom Heymann antigenet) innehåller EGF-
liknande moduler, liksom andra medlemmar av LDL-receptor superfamiljen
(11,16,27), vilket kan representera sannolika Ca2*- bindande sites. EGP-liknande
moduler som påvisats i koagulationsfaktorerna IX, X och protein C har således
visats binda en Caz* jon vardera, och EGF-liknande moduler har också påvisats
mediera Cazflberoende protein/proteininteraktion (35). Kinetiska data har antytt att
kalciumsensor proteinet uppvisar positiv kooperativitet i sin interaktion med Cazfi ett
fenomen som synes vara av 'avgörande betydelse för den sigmoidala regulationen av
[Cazfl] och PTH-frisättning, med en speciellt brant relation inom det fysiologiska
området för extracellulärt Caz* (9i,10). Denna positiva kooperativitet bör kräva
multipla bindnings-sites för Cazfl möjligen beroende på repetitiva EGP-liknande
moduler, vilka är vanligt förekommande i molekyler av LDL-reoeptor superfamiljen
(11,16,27). Eftersom Caß-bindning till EGP-liknande domäner visats inducera
15
504 108
endast smärre, lokaliserade förändringar av den tredimensionella strukturen (32) är
det också möjligt att kalciumsensor proteinet innehåller andra Cazßbindande sites.
Ett 43 kDa membranprotein (otz-macroglobulin receptor associerat protein, eller
heparin-bindande protein) (28,36) har visats interagera både med LDL-receptor
relaterat protein och med rått Heymann antigenet på ett CaB-beroende sätt (28).
Ingen fysiologisk funktion har *kunnat kopplas till-detta protein, men det
uppträder också i vävnader där Heymann antigenet och LDL-receptor relaterat
protein inte är uttryckta (28). En intressant iakttagelse är närvaron av ett sannolikt
leucine-zipper motif i den aminoterminala delen av 43 kDa proteinet (36), med
hänsyn till att sådana motif har ansetts påverka öppning och stängning av membran
jonkanaler (37). Eftersom 43 kDa proteinet interagerar med Heymann antigenet, kan
det förmodas bilda ett komplex också med kalciumsensor proteinet på ett Ca”-
beroende sätt. Interaktion med 43 kDa proteinet kan vara betydelsefullt för
fortledning av Caz* inducerade konformations förändringar inom den extracellulära
delen av molekylen till cellens inre. Det är också möjligt att ytterligare proteiner
interagerar med kalciumsensom på ett Caß-beroende sätt, och att sådan interaktion
är av betydelse för modulering av sensor svaret. Mekanismer genom vilka en
aktiverad kalsiumsensor triggar ytterligare signaler till cellens inre är hittills okända,
men vi har utnyttjande immunprecipitation kunnat isolera en fosforylerad form av
sensor proteinet i dispergerade parathyroidea celler laddade med [32p]-ortofosfat (ej
publicerade data).
Kalcium sensor proteinet i placenta kan vara involverat i upprätthållande av en feto-
matemell Caz* gradient och Caz* transport över placenta, möjligen genom att mediera
Caz* regulation av parathormon relaterad peptid (PTHrP) produktion och/eller 1,25
(OH)2D3 metabolism (8). Dess närvaro redan i blastocyststadiet (opublicerad
iakttagelse) kan antyda funktion också som adhesions molekyl, och möjligen också
betydelse för differentieiing eller tillväxtregulation, vilket tidigare föreslagits för
Heymann antigenet (38). En möjlig funktion för kalciumsensom inom njurtubulis
borstbräm är ofullständigt undersökt. Det bör dock påpekas att enzymet l-ot-
hydroxylas, vilket förekommer i placenta och proximala njurtubuli, regleras av
extracellulära Ca” nivåer, och kalciumsensom kan härigenom alltså möjligen reglera
1,25 (OH)2D3 metabolism, men den kan också påverka Ca” reabsorption från
504 108 16
glomerulus filtratet (7-9). Betydelsen av ett kalciumsensor protein på epididymis
celler liksom sporadiskt förekommande också på rått-pneumatocyter, vissa lever och
tunntarmsceller, vilket antytts av studier rörande Heymann antigenets distribution, är
för närvarande okänd. Det har emellertid föreslagits att många olika celltyper kan ha
förmågan till Caz* avkärining/sensing för regulation av olika cellfunktioner, förutom
de som har betydelse för den allmänna homostasen, antingen under stadier i
cellutveckling eller i differentierade stadier (10).
Sambandet med autoimmun nefrit understryker att Heymann antigenet är en
immunogen molekyl. Detta kan ha betydelse också för parathyroidea sjukdom,
eftersom vi nyligen påvisatnärvaro av cirkulerande parathyroidea autoantikroppar
och induktion av klass II transplantation antigen i patologisk parathyroidea vävnad
från patienter med primär HPT. Dessa resultat antyder att autoimmuna fenomen kan
vara involverade i utvecklingen av HPT (39) och autoimmunitet har också ansetts ha
betydelse för patogenesen för sällsynt idiopatisk hypoparathyroidism. Den nu
tillgängliga cDNA klonen för kalciumsensom bör erbjuda möjligheter till studier
rörande patofysiologi för parathyroidea sjukdom och också undersökning av möjliga
genetiska defekter med påverkan på kalciumsensor funktion i parathyroidea och
njurtubuli hos patienter med t ex familjär hypokalciurisk hyperkalcemi (FHI-I)
(40,41).
En person med utbildning inom detta område inser att information som kan erhållas
från nukleotid sekvensen i Fig 3 kan användas för att isolera total DNA och
gensekvens kodande för kalciumsensor proteinet. För detta kan med fördel analys av
överlappande cDNA kloner tillsammans med PCR teknik användas. Gen sekvensen
kan erhållas efter analys av överlappande genom kosmid, och/eller lambda fag
kloner.
504 108
17
Referenser
l.Juhlin, C., Holmdahl, R., Johansson, H., Rastad, J., Åkerström,
G., Klareskog, L., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84, 2990-
2994.
2.Juh1in, C., Johansson, H., Holmdahl, R., Gylfe, E., Larsson, R.,
Rastad, J., Åkerström, G., Klareskog, L., (1987) Biochem. Biophys.
Res. Commun. 143, 570-574.
3.Juh1in, C., Klareskog, L., Nygren, P., Gylfe, E., Ljunghall, S.,
Rastad, J., Åkerström, G., (1988) Endocrinol. 122, 2999-3001.
4.Juh1in, C., Åkerström, G., Klareskog, L., Gylfe, E., Holmdahl,
R., Johansson, H., Ljunghall, S., Larsson, R., Nygren, P., Rastad,
J., (1988) World. J. Surg. 12, 552-558.
5.Gylfe, E., Juhlin, C., Åkerström, G., Klareskog, L., Rask, L.,
Rastad, J., (1990) Cell Calcium. 11, 329-332.
6.Juhlin, C., Rastad, J., Klareskog, L., Grimelius, L., Åkerström,
G., (1989) Am. J. Pathol. 135, 321-328.
7.Juh1in, C., Lundgren, S., Johansson, H., Lorenzon, J., Rask, L.,
Larsson, E., Rastad, J., Åkerström, G., Klareskog, L., (1990) J.
Biol. Chem. 265, 8275-8279.
Euflellman, P., Ridefelt, P., Juhlin, c., Åkerström, G., Rastad,
J., Gylfe, E., (1992) Arch. Biochem. Biophys. 293, 174-180.
9.Åkerström, G., Rastad, J., Ljunghall, S., Ridefelt, P., Juhlin,
C., Gylfe, E., (1991) World. J. Surg. 15, 672-680.
10.Brown, E- M., (1991) Phys. Rev. 71, 371-411.
11.Raychowdury, R., Niles, J: L., Mc Cluskey, R. T., Smith, J. A.,
(1989) Science. 244, 1163-1165.
12.Denhardt, D.T., (1966) Biochem. Biophys. Res: Commun. 23, 641-
646.
13.Pearson, W. R., Lipman, D. J., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 85, 2444-2448.
l4.Holmdah1, R., Rubin, K., Klareskog, L., Larsson, E., Wigzell,
H., (1986) Arthritis. Rheum. 29, 400-410.
15.Yamamoto, T., Davis, C. G., Brown, M. S., Schneider, W. J.,
Casey, M. L.,Goldstein, J. L., Russel, D. W., (1984) Cell. 39, 27-
38.
16.Herz, J., Haman, U., Rogne, S., Myklebost, O., Gausepohl, H.,
Stanley, K. K.,(1988) EMBO. J- 7, 4119-4127.
.504 108
18
l7.Chatelet, F., Brianti, E., Ronco, P., Roland, J., Verroust, P.,
(1986) Am. J. Pathol. 122, 500-511.
18.Chatelet, F., Brianti, E., Ronco, P., Roland, J., Verroust, P.,
(1986) Am. J. Pathol. 122, 512-519.
19.Kerjaschki, D., Farquhar, M. G., (1984) in Nephrology' ed
Robinsson R.R., New York Springer-Verlag pp 560-574.
20.Kerjaschki, D., Horvat, R., Binder, S., Susani, M., Dekan, G.,
Ojha, P. P., Hillermans, P., Ulrich, W., Doninn, U., (1987) Am.
J. Pathol. 129, 183-191.
21.Wal1felt, C., Larsson, R., Johansson, H., Rastad, J., Åker-
ström, G., Ljunghall, S., Gylfe, E., (1985) Acta. Physiol. Scand.
124, 239-245.
22.Gylfe, E., Larsson, R., Johansson, H., Nygren, P., Rastad, J.,
Wallfelt, C., Åkerström, G.,(l986) Febs. lett. 205, 132-136.
23.Nemeth, E., Scarpa, A., (1987) J. Biol. Chem. 262, 5188-5196.
24.Gy1fe, E., Åkerström, G., Juhlin, C., Klareskog, L., Rastad,
J., (1990) In: Hormones and Cell Regulation. Eds: Dumont, J.E.,
Nunez, J., King, R.J.B., John Libhey Eurotext Ltd, London pp 5-15.
25.Lundgren, S., Juhlin, C., Rastad, J., Klareskog, L., Åkerström,
G., Rask, L., Submitted.
26.Bjerneroth, G., Juhlin, C., Åkerström, G., Rastad, J., (1992)
J. Submicrosc.Cytol. Pathol. 24, 179-186.
27.Brown, M. S., Goldstein, J. L., (1986) Science. 232, 34-47.
28.Christensen, E. J., Glieman, J., Moestrup, S. K., (1992) J.
Histochem. Cytochem.40, 1481-1490.
29.Handford, P. A., Baron, M., Mayhew, M., Willis, Å., Beasly, T.,
Brownlee, G. G., Campbell, I. D., (1990) EMBO J. 9, 475-480.
30.Huang, L. H., Ke, X-H., Sweeny, W., Tam, I. P., (1989) Biochem.
Biophys. Res. Commun. 160, 133-139.
31.Persson, E., Selander, M., Linse, S., Drakenberg, T., Öhlin,
A. K., Stenflo,J., (1989) J. Biol. Chem. 264, 16897-16904.
32.Öh1in, A. K., Linse, S., Stenflo, J., (1988) J. Biol. Chem.
263, 7411-7417.Urukawa, T., 33.Öh1in, A. K., Landes, G., Bourdan,
P., Oppenheimer, C., Wydro, L., Stenflo, J.,
(1988) J. Biol. Chem. 263, 19240-19248.
504 108
19
34.Selander - Sunnerhagen, M., Ullner, M., Persson, C., Teleman,
O., Stenflo, J., Drakenberg, T., (1992) J. Biol. Chem. 267, 19642-
19649.
35.Rebay, I., Fleming, R. J., Felion, R. G., Cherbas, L., Cherbas,
P., Artavanis -Tsakonas, S., (1991) Cell. 67, 687-699.
36.Furukawa,T., Ozawa, M., Hvang, R. P., Muramatsu, T.,
Biochem. 108, 297-302.
37.McCormack, K., Campanelli, I. T., Ramaswami, M.,
Tanoye, M. A., Iverson, L.E., Rudy, B., (1989) Nature. 340, 103.
38.Mendrick, D. L., Chung, D. C., Remcke, H. G., (1990) Exp. Cell.
(1990) J.
Mathew M. K.,
Research. 188, 23-25.
39.Bjerneroth, G., (1992) Comprehensive summaries of Uppsala
Disertations from the Faculty of Medicine 360, ISBN. 91-54-2928-9.
40.Marx, S.J., Attie, M. F., Levine, M. A., Spiegel, A. M., Downs,
R. W., Lasker, R. D., (1981) Medicine 60, 397-412.
41.Choo, Y-H. W., Brown, E. H., Levi, T., Crowe, G, B., Atkinson,
A. B., Arnqvist, H. J., Toss, G., Fuleihan, G, E-H., Seidman, J.
G., Seidman, C. E., (1992) Nature Genetics. l, 298-300.
Claims (6)
- 504 108 PATENTKRAV 20 1- En cDNA klon kodande För det humana kalcium sensor proteinet inne- hållande följande nukleotid sekvens: TAC TAC GAG AGT A -A 'CÄG C C ä Anv- _» CCS 'CAC AGA »fw _.- _f~«~ TGB GCC CLRA ATC GGC CCT GT. ÖIÄG AAA fifi s, CX TAC .JC AGC Ars css c;A GÉ-.C CCA rrvfif- _\I'\I ACT AAG ACT fl-fi .C CCS Gfl.. GAG “AG ATA ;«~ A416 su-vnw å-.. CCT GAC us -n 'fu-vw __- GAG fr' v» CTC GAT vw run- lfiff' -_.~ ATG GA- AAG AGA GAG CCC CCC GE; ACT." TAC -C-f ,-._ .:.--\ ATC CCS 1:e _.-- Tfn? ACC 24: GAC CSC 25 GQFH Glxfl! -<- ACC CCC G... GTA S67 AAC AAG Il AGA L _' ACC 729 .lv-_ AGG 782 Tff- -uwc GCC- ~ ms 5-6; v-~ a __1\_ - GTS max _ C-L mp.- _~.x¿ C-'AC CCS ~n~a 41-» AGC G 'IA GTS CCT mr»- - -TC a w ~..\ s... CCS CCS. CCT C-n _» p .JJ f) 'å »a CF; f--n x- f~ 41159 CCT ÄGC 5.”. GCE-G un» n-\_ CAA AA CTC cá: 'EGT Gfw TAC anv-n .\_- Fp. v- flfläfi .XAC- ACC ACT mflfl -uu GC C ACC IH/*HI -d- 64 CC 7G 8 f. a .é ATC GAS» I] m 21 i 504 108
- 2. Ett kalcium sensor protein innehållande aminosyra sekvens som kan erhållas från nukleotid sekvensen beskriven i krav 1.
- 3. Användning av nukleotid sekvens beskriven i krav 1 för isolering och komplett nukleotid sekvens bestämning för kalciumsensor proteinet.
- 4. Användning av nukleotid sekvens beskriven i krav 1 och/eller kalcium sensor proteinet beskrivet i krav 2 för utveckling av agonister och/eller antagonister till Caz* eller andra katjoner med bindning till nämnda humana kalciumsensor proteiner.
- 5. Användning av nukleotid sekvenser beskrivna i krav 1 och/eller kalcium sensor proteinet beskrivet i krav 2 för utveckling av ämnen vilka interfererar med funktionen av nämnda kalciumsensor protein, t ex i samband med immunreaktioner mot kalciumsensor proteinet eller därmed associerade molekyler.
- 6. En eukaryotisk cell uttryckande nukleotid sekvens i enlighet med krav 1 för användning i en assay för att identifiera molekyler med förmåga att blockera eller öka aktiviteten av nämnda kalciumsensor protein.
Priority Applications (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE9301764A SE504108C2 (sv) | 1993-05-24 | 1993-05-24 | Human Kalcium sensor |
CA002163013A CA2163013A1 (en) | 1993-05-24 | 1994-05-24 | Human calcium sensor |
PCT/SE1994/000483 WO1994028019A1 (en) | 1993-05-24 | 1994-05-24 | Human calcium sensor |
JP6525857A JPH08510135A (ja) | 1993-05-24 | 1994-05-24 | ヒトカルシウムセンサー |
EP94917235A EP0700401A1 (en) | 1993-05-24 | 1994-05-24 | Human calcium sensor |
AU69021/94A AU685127B2 (en) | 1993-05-24 | 1994-05-24 | Human calcium sensor |
US08/476,515 US6239270B1 (en) | 1993-05-24 | 1995-06-07 | Nucleic acids encoding human calcium sensor protein |
US08/652,877 US6187548B1 (en) | 1993-05-23 | 1996-05-23 | Methods using human calcium sensor protein, fragments thereof and DNA encoding same |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE9301764A SE504108C2 (sv) | 1993-05-24 | 1993-05-24 | Human Kalcium sensor |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SE9301764D0 SE9301764D0 (sv) | 1993-05-24 |
SE9301764L SE9301764L (sv) | 1994-11-25 |
SE504108C2 true SE504108C2 (sv) | 1996-11-11 |
Family
ID=20390033
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SE9301764A SE504108C2 (sv) | 1993-05-23 | 1993-05-24 | Human Kalcium sensor |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0700401A1 (sv) |
JP (1) | JPH08510135A (sv) |
AU (1) | AU685127B2 (sv) |
CA (1) | CA2163013A1 (sv) |
SE (1) | SE504108C2 (sv) |
WO (1) | WO1994028019A1 (sv) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0792159A4 (en) * | 1994-11-23 | 2003-01-02 | Rhone Poulenc Rorer Pharma | HUMANES "CALCIUM SENSOR" PROTEIN, FRAGMENTS OF IT AND DNA WHICH CODES THIS |
US5723343A (en) * | 1995-08-28 | 1998-03-03 | University Of Florida | Autoantibodies in patients with acquired hypoparathyroidism and assay method therefor |
WO1999038500A2 (en) * | 1998-01-30 | 1999-08-05 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | The human calcium-sensing receptor in the detection and treatment of cancer |
-
1993
- 1993-05-24 SE SE9301764A patent/SE504108C2/sv not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-05-24 WO PCT/SE1994/000483 patent/WO1994028019A1/en not_active Application Discontinuation
- 1994-05-24 EP EP94917235A patent/EP0700401A1/en not_active Withdrawn
- 1994-05-24 AU AU69021/94A patent/AU685127B2/en not_active Ceased
- 1994-05-24 JP JP6525857A patent/JPH08510135A/ja active Pending
- 1994-05-24 CA CA002163013A patent/CA2163013A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
SE9301764L (sv) | 1994-11-25 |
SE9301764D0 (sv) | 1993-05-24 |
JPH08510135A (ja) | 1996-10-29 |
WO1994028019A1 (en) | 1994-12-08 |
CA2163013A1 (en) | 1994-12-08 |
AU685127B2 (en) | 1998-01-15 |
EP0700401A1 (en) | 1996-03-13 |
AU6902194A (en) | 1994-12-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Peng et al. | Structural conservation of the genes encoding CaT1, CaT2, and related cation channels | |
WO2001070769A1 (fr) | Derive peptidique | |
CA2430558A1 (en) | Proteins and nucleic acids encoding same | |
SE504108C2 (sv) | Human Kalcium sensor | |
US6187548B1 (en) | Methods using human calcium sensor protein, fragments thereof and DNA encoding same | |
JP2001211886A (ja) | L−体及びd−体アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性小型中性アミノ酸トランスポーター及びその遺伝子 | |
US6239270B1 (en) | Nucleic acids encoding human calcium sensor protein | |
JPH11503308A (ja) | ヒトstat4 | |
Boutou et al. | Isolation of a mouse brain cDNA expressed in developing neuroblasts and mature neurons | |
EP1109824A1 (en) | Novel bag proteins and nucleic acid molecules encoding them | |
AU2207999A (en) | Novel nucleic acid and polypeptide | |
AU726886B2 (en) | Human calcium sensor protein, fragments thereof and DNA encoding same | |
AU715537B2 (en) | Nucleic acid encoding a signal mediator protein that induces cellular morphological alterations | |
Shintani et al. | Identification and characterization of integrin-binding sialoprotein (IBSP) genes in reptile and amphibian | |
US6037449A (en) | Osteometrin related peptides and nucleic acids and diagnosis and therapies using them | |
US20040109854A1 (en) | Novel traf6 inhibiting protein | |
JP4357003B2 (ja) | 形態形成タンパク質 | |
WO1996015801A9 (en) | Human calcium sensor protein, fragments thereof and dna encoding same | |
JPH09173087A (ja) | Atpおよび核酸に結合し、ヘリカーゼおよびatpアーゼの性質を有すると推定される蛋白質 | |
WO1998037195A9 (en) | Morphogenic proteins | |
JP2002500501A (ja) | ヒトカルシウムセンサータンパク質、その断片及びそれをコードするdna | |
US20030143670A1 (en) | DNA encoding SNORF44 receptor | |
WO2002024943A9 (en) | Method of identifying osteoregenerative agents using differential gene expression | |
AU2795001A (en) | Cbp86, a sperm specific protein | |
CA2343360A1 (en) | Human cytoskeleton associated proteins |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
NUG | Patent has lapsed |