SE504108C2 - Human Kalcium sensor - Google Patents

Description

504 1oà 2 sekvens hittills varit okända.

SAMMANFATTNING AV UPPFINNINGEN Mot denna bakgrund har syftet med den aktuella uppfinningen varit att erbjuda tillräckliga strukturella data rörande kalciumsensor/receptor molekylen för att möjliggöra komplett molekylär karakteristik av densamma.

Som ytterligare en viktig del erbjuder föreliggande uppfinning prober som kan användas för att identifiera andra nya liknande kalciumsensor proteiner.

Ett annat mål med uppfinningen har varit att använda föreliggande strukturella data för att skapa nya behandlingsmetoder eller ämnen och föreningar som kan användas för att behandla kalciumrelaterade sjukdomar.

Två viktiga humana sjukdomar associerade med störning av kalciumjon- homeostasen är hyperparathyroidism (HPT) och osteoporos. Som en viktig del av uppfmningen kan celler uttryckande kalciumsensor proteinet eller innehållande cDNA kodande för kalciumsensor proteinet, utnyttjas i en assay för att identifiera molekyler med effekten att blockera eller potentiera aktiviteten i kalciumsensor proteinet. Härigenom identifierade molekyler förmodas vara användbara för behandling av vissa humana sjukliga tillstånd orsakade av störda nivåer för PTH, vitamin D3 produktion, östrogen, osteoklast- eller osteoblast aktivitet (orsakande benresorption och/eller nybildning), kalciumsekretion eller kalciumjon homeostas.

Föreliggande uppfinning beskriver isolering och partiell karakteristik av en cDNA klon kodande för kalciumsensor/receptor molekylen i human placenta liksom verifikation genom Northern blot av uttryck för motsvarande mRNA i parathyroidea och njurvävnad. Påtaglig likhet mellan kalciumsensor molekylen och ett tidigare beskrivet Heymann nefrit antigen från råtta (11), har antytt att den gemensamma kalciumsensor molekylen för plaoenta, parathyroidea och njurtubuli är släkt med detta antigen eller representerar dess humana homolog, och att kalciumsensor 3 i 504 108 molekylen tillhör en familj stora glykoproteiner med receptorfunktion och kalciumbindande förmåga.

KORT BESKRIVNING AV FIGURER Fig 1. Isolering genom HPLC av peptider erhållna efter digestion av kalciumsensor proteinet med Lys-C endoproteas (obruten linje). Den streckade linjen i figuren representerar kromatografi av en identisk reaktion där kalciumsensor proteinet har utelämnats. Flödeshastigheten har hållits konstant IOQuI/min. Två peptid fraktioner som givit lätt avlâsbara sekvenser harindikerats i figuren med pilar.

Fig 2. Sekvenser för två Lys-C peptider isolerade med HPLC från kalciumsensor proteinet.

Fig 3. Partiell nukleotid sekvens och överensstämmande aminasyresekvens för cDNA klonen, pCAS-2, kodande för delar av kalciumsensor proteinet. Delar av överenstämmande aminosyrasekvens för peptiderna 292 och 293 är understrukria.

Fig 4. Beskrivning av aminasyrasekvens för kalciumsensor proteinet jämfört med motsvarande delar av Heymann antigenet (HEYMANN), low density lipoprotein receptor (LDL-RC), och LDL relaterad receptor protein (LDL-RRP). Asterisk anger identitet mellan kalciumsensor proteinet och någon av övriga proteinsekvenser, x anger positioner inom Heymann antigenets sekvens där identiteten för en aminosyra inte publicerats.

Fig 5. Analys genom Northern blot av total RNA från parathyroidea adenom (1), njure (2), lever (3), placenta (4), pankreas (5), binjure (6), tunntarm (7). Filter har ' hybridiserats med 2,8 kb pCAS-Z proben och reaktioner har visualiserats med användning av .fosforimagen Positionema för 28S och 18S ribosomalt RNA har indikerats. 504 108 h DETAUERAD BESKRIVNING Av PArENrr-rrs oMFAnmNG Såvida inte annat anges har nedanstående beteckningar följande betydelse: Beteckningen "polypeptid" innbär ett linjärt arrangemang av aminosyror kopplade till varandra med peptídbindningar mellan a-amino och karboxyl grupper av närliggande aminosyror.

"Väsentligen renad" används i betydelsen huvudsakligen homogen dvs ett ämne eller en substans i huvudsak fri från andra ämnen eller substanser som kan vara bundna till ämnet i sin naturligt förekommande form (dvs andra proteiner eller peptider, kolhydrater, lipider). "Väsentligen ren" används inte för att utesluta artificiella eller syntetiska sammansättningar med andra ämnen. Beteckningen utesluter inte heller närvaro av vissa föroreningar som inte interfererar med biologisk aktivitet och vilka kan vara närvarande, t ex p g a inkomplett rening eller blandning med farmaceutiskt acceptabla preparationer.

"Biologiskt aktiv polypeptid" betecknar den naturligt förekommande polypeptiden i sig, liksom biologiskt aktiva analoger därav, inkluderande syntetiskt producerade polypeptider och analoger därav liksom naturliga och farmaceutiskt acceptabla salter och farmaceutiskt acceptabla derivat därav. “Biologiskt aktiva polypeptider" innefattar också biologiskt aktiva fragment, liksom "biologiskt aktiva sekvens- analoger". Olika former av peptiden kan finnas. Dessa variationer kan karakteriseras av skillnader i nukleotidsekvens för den strukturella gen som kodar för proteiner med identisk biologisk funktion.

"Biologiskt aktiva sekvens analoger" inkluderar icke-naturligt förekommande analoger vilka har enkla eller multipla aminosyra-substitutioner, deletioner, additioner eller ersättningar. Alla liknande allel-variationer, modifikationer och analoger resulterande i derivat vilka bibehållit en eller flera av de nativa biologiskt aktiva egenskaperna inkluderas inom ramen för uppfinningen. 5 504 108 I denna ansökan är nukleotider angivna genom sina baser med användning av följande enbokstavs-förkortningar: Guanin G Adenin A ïymin T Cytosin C Okänd N I denna ansökan anges enstaka aminosyror med användning av följande enbokstavs- förkortningar: Alanin Cystein Asparaginsyra Glutamínsyra Fenylalanin Glycin Histidin Isoleucin Lysin Leucin Metionín Asparagin Prolin Glutarnin Argínin Serin Treonín Valin Tryptofan Tyrosin Okänd ><>-<É<*-JC0VUO*UZZF"N”CEC3W1IT1UÛ> 50 4 1 0 8 6 Beteckningen "aminosyra" används härvid för att beteckna någon av ovan nämnda naturliga aminosyror eller funktionella ekvivalenter därav.

Den aktuella uppfinningen presenterar en isolerad nukleinsyra molekyl kodande för ett kalciumsensor protein och har kodande sekvens innehållande sekvenser angivna i Fig 3.

Dessutom omfattar uppfinningen en vektor innehållande en isolerad nukleinsyra- molekyl kodande för kalciumsensor proteinet.

Uppñnningen omfattar också en metod för att preparera det aktuella kalciumsensor proteinet vilken innebär insättning av nukleinsyror kodande för kalciumsensorn i en lämplig vektor, insättning av den härvid erhållna vektorn i en lämplig värdcell, återvinnande av kalciumsensor proteinet producerat av värdcellen och rening av det således erhållna kalciumsensor proteinet. Denna metod for preparering av kalciumsensor proteinet utnyttjar väl känd rekombinant DNA teknologi.

Material och metod Vävnadspreparat. Delar av humana parathyroidea körtlar har tillvaratagits vid operation av patienter med primär HPT. Andra humana vävnadsdelar (njure, epididymis, lever, bukspottkörtel, binjure, tunntarm, mjälte, lunga och tvärstrimmig muskel) har tillvaratagits från organ avlägsnade vid annan typ av kirurgi. Human placenta vävnad har tillvaratagits i samband med fiirlossing efter okomplicerad fullgången graviditet. Alla vävnadsprov har omedelbart snabbfrusits i isopentan och förvarats vid -70°C.

Isolering av kalciumsensor proteinet från human placenta. 500 kDa kalciumsensor proteinet har isolerats och renats genom immun- och jonbytar kromatografi, i enlighet med ett tidigare beskrivit protokoll (7). Härvid utnyttjas två olika monokloriala antiparathyroidea antikroppar (1,7), E11 och G11, vilka visats binda till olika epitoper av kalciumsensor proteinet; E11 har inte uppvisat funktionella effekter, emedan G11 effektivt inhiberar kalcium regulation i såväl 7 ' 504 108 parathyroidea som placenta celler (1,7). Efter rening har kalciumsensor protein- preparationen blivit föremål för gelkromatografi på en Zorbax GF25 gelkolonn (9,2x250 mm), före enzymatisk nedbrytning.

Det biologiskt aktiva kalciumsensor proteinet i föreliggande ansökan har isolerats enligt ovan. Det kan också prepareras genom kemisk syntes utnyttjande ett rekombinant DNA bíosystem. Biologiskt aktiva fragment av kalciumsensor proteinet kan också prepareras med användning av väl etablerad syntetisk teknik eller rekombinant teknologi.

Klyvning och sekvensbestämning av isolerade peptider.

Klyvning av 500 kDa proteinet med endoproteas Lys-C från Achromobacter lyticus har gett upphov till peptider, vilka separats på en Brownlee microbore C, kolonn (2,2x30 mm), ekvilibrerad i 5% acetonitrile i 0,02% trifluor-ättiksyra. En linjär gradient av 5 till 60% acetonitril i 0,02% trifluor-ättiksyra har utnyttjats för peptideluering, monitorering har skett vid 214 nm med användning av en Waters 990 diod-array detektor (Millípore Corporation, Millford, Mass). Amino-terminala sekvenser av peptiderna har bestämts i en ABI 470A gas-fas sekvenator, utrustad med en ABI 120A PTH-aminosyra kromatograf (Applied Biosystems, Foster City, Ca., USA).

Oligonukleotid syntes. Oligonukleotider har syntetiserats med användning av en ABI 381 oligonukleotide synthesizer (Applied Biosystems). Följande oligonukleotid blandning har utnyttjats som probe för screening av ett placenta cDNA bibliotek: CCA ATA IAG CTG ATC CTC AAA GAT ATC IAG IGA ATA IGG ATT CAT IGC G G G G G G Följande två oligonukleotider har syntetiserats för användning i PCR reaktioner: GCGGAATTC GTA ATG CAA CCA GAC GG C G C T G G T T 504 108 8 ATAGGATCC TG ATC CTC AAA AAT ATC G T G G G T De första nio nukleotidema innehåller ett EcoR I och ett BamH I site, och övriga nukleotider motsvarar aminosyrorna 2till 7 'av peptid 293 till aminosyroma 14 till 9 av peptid 292.

Screening av ett placenta cDNA bibliotek med en sammansatt oligonukleotid probe. Ett placenta Ä. gt 11 cDNA bibliotek (Clontech, Ca., USA) har sätts ut med en täthet av cirka 2x105 plaque inom 20x2š aga; platta. Filterkopior (Hybond-N+, Amersham) av tio plattor har prehybridiserats i SXSSPE; 120 mM NaCl, 8 mM NaH2PO4, 0,8 mM EDTA, pH 7,4) Sx Denharfs lösning (12), 0,5% SDS, 20ug/ml enkelstrandat laxspermie DNA (Sigma Chemical Co., Szt Louis, Ohio). Den sammansatta oligonukleotid proben, inmärkt med Ä-[32P]-APT och polynukleotidkinas (Amersham) har tillsatts hybridiserings-blandningen (30xl0ó cpm i 50 ml), och hybridiseringen har utförts över natt i 42° C. Filtren har tvättats två gånger i 2x SSPE och en gång i 0,1xSSPE, exponerats på en autoradiografi skärm och analyserats med en fosforimager (Molecular Dynamics, Image Count S.W, Sun Valley Ca).

PCR reaktion. Delar av Ä gt 11 cDNA klonen CAS-1 har amplifierats medelst PCR med användning av två degenererade prober motsvarande delar av peptidema 292 och 293. Följande förhållande har förelegat: 170 ng templat DNA, 1 pmol av vardera oligonukleotid blandningen som primer, dNTP l50nm, Taq-polymerase 0,75 u. Reaktionen har utförts i 20 ul av 10nM Tris-HCL, pH 8,0, 1,5 mM MgCl» 50mM KCL i en Coy Temp cycler model 60 (Coy laboratory Products Inc. Ann Arbor Mich., USA). Två denaturerings cykler har utförts vid 94° C under 2 min, följt av annealning vid 47° under 1 min och extendering vid 72° C under 1 min och 30 sek efterföljt av 33 cykler vid 94° under 1 min, 54° under 45 sek, 72° under 1 min och med en slutlig extendering vid 72° under 10 min. 9" I 504 108 Screening av ett placenta cDNA bibliotek med ett PCR-fragment som probe.

Ett humant placenta k ZAP-11 cDNA bibliotek har screenats med PCR-fragment från cDNA klonen CAS-1, märkt genom random priming, som probe. Screeningen har utförts som ovan. 211106 plaque fördelade på. tio 20x25 agarplattor har screenats.

Nukleotid sekvens bestämning. De inklonade cDNA fragmentet i fagklonen CAS- 2 har överförts från fagvektorn till Bluescript+ vektorn med hjälp av en hjälparfag (Stratagene, La Jolla, Ca). Nukleotidsekvens reaktioner har utförts enligt cykle- sekvens-förfarandet, med användning av ett kit från Applied Bíosystems. Sekvenser har analyserats i en sekvenator med användning av databehandlings programmet VIII soft-Ware (Applied Biosystems).

Databas sökning. EMBL-31 data basen i Intelligenetics format (Intelligenetics Rel. 5.4), har utnyttjats för sökning av sekvenslikheter med placenta cDNA sekvensen med användning av FASTDB algoritmen (13).

Immunfárgning och Northern blot. Immunhistokemiska studier har utförts på acetonfixerade 6p.m tjocka fryssnitt med användning av de monoklonala antiparathyroidea antikropparna E11 och G11 i koncentrationen Sug/ml, med användning av en mus peroxidas-antiperoxidas teknik på human placenta, parathyroidea, njure och epidídymis vävnad liksom övriga humana vävnader - enligt ovan (1-7). Monoklonala antikroppar mot kollagen typ II har utnyttjats som negativa kontroller (14).

Total RNA har extraherats från vävnadsproven med användning av acid phenol/chloroforrn metoden. För Northem blot har ca 10ug av total RNA utnyttjats för elektofores i en 1,5%/37% agaros/formaldehyd gel, varefter blottning skett till nylon membran (Qiabrane, Diagen Gmbh, Düsseldorf, Germany) och hybridisering utförts med 2,8 kb klonen (se resultat) märkt med random priming metoden.

Hybridiseringar har genomförts vid 42° C under 18-24 timmar i 50% formamid, 4x saline sodium citrat (SSC; 150 mM NaCl, 15 mM Na-citrate, pI-I 7,0) 2x Denhart's lösning, 10% dextran sulfat (Kabi-Pharmacia, Uppsala, Sweden) och 100ug/ml lax 504 108 1” spermie DNA. Filtren har tvättats med en slutlig stringens motsvarande 1xSSC/0,1% SDS under 30 min vid 42° C, och exponerats i en fosforimager (se ovan).

RESULTAT.

Isolering av kalcium sensor proteinet, peptid klyvning och sekvensbestämning.

Kalciumsensor proteinet renades från placenta vävnad med användning av lectin- kromatografi, immunaffinitetskromatografi utnyttjande de immobiliserade monoklonala antiparathyroidea antikroppama, och slutligen jonbytarkromatografi (1,7). Samma antikroppar har använts i en Sandwich ELISA för att kontrollera reningsproceduren. För att förhindra kontaminering med lågmolekulära peptider gjordes hela den slutliga preparationen, bestående av 200ng av 500 kDa protein kedjan, 6M med avseende på guanidin-HCl och applicerades sedan på en gelkromatografi kolonn, ekvilibrerad med 2 M guanidin-HCI, 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5. Kolonnen eluerades med samma buffert. I det närmaste allt proteinmaterial kom fram nära void volymen på den förväntade platsen för ett protein med molekylvikten 500 kDa. Separata fraktioner innehållande detta material kombinerades och endoproteinas Lys-C (Ing) tillsattes. Digestionen tilläts fortgå över natt vid 370 C.

Det fragmenterade proteinet reducerades genom inkubering med 0,1% ß- mercaptoetanol vid 37° C under 30 min och alkylerades slutligen med 4-vinyl pyridine (0,3%) vid rumstemperatur under 2 tim. Peptidblandningen applicerades sedan på en reversed fas Ci kolonn ekvilibrerad i 5% acetonitril i 0,2% trifluor- ättikssyra. Peptider eluerades genom en linjär gradient av 5-60% acetonitrile i 0,02% trifluor ättikssyra (Fig 1). P g a det stora antalet peptider var elutionsmönstret komplext. Flera peptidfraktioner blev föremål för sekvensbestämning i en gasfas sekvenator och lätt tolkbara sekvenser erhölls för två fraktioner (Fig 2).

Isolering av en cDNA klon kodande fór 500 kDa kalciumsensor proteinet.

En oligonucleotid blandning (48 bp) konstruerades med syfte att koda for aminosyroma 2 till 17 av den sekvensade peptiden 292. För att göra oligonukleotid blandningen mindre komplex insattes fem inosin-baser i degenererade positioner där ingen ledning erhölls av kodonets användning i humana gener. I nio positioner där två baser var möjliga föreslogs en av basema med en sannolikhet överskridande 'l ' 504 108 70% med hänsyn till kodonanvändningen och denna bas utnyttjades därför i oligonukleotid blandningen.

Den sammansatta oligonukleotiden märktes radioaktivt och användes som probe för att screena ett humant placenta Ä-gt 11 cDNA bibliotek. Omkring 2x10° plaque screenades och en enstaka positiv klon, erhölls-Den genetiska koden för denna klon bestämdes till 2,3 kb genom restriktions mappning. För att erhålla en igenkännbar sekvens för klonen på ett snabbt sätt gjordes ett försök att PCR- ampliñera delar av sekvensen med användning av degenerade oligonukleotider motsvarande delar av peptiderna292 och 293 .som primers. Ett distinkt DNA fragment motsvarande omkring 450bp erhölls. Delar av fragmentet sekvensades med oligonukleotid blandningen motsvarande peptid 293 som primer. I en läsram av den erhållna sekvensen kunde sekvensen VGRl-l] härledas, med utmärkt överensstämmelse med den karboxyltenninala 5 aminosyra långa ändan av peptid 293. För att erhålla en längre klon screenades ett humant placenta 7» ZAP-II cDNA bibliotek. Screeningen utfördes med PCR fragrnentet som probe. Bland 2x106 plaque erhölls en enda klon, CAS-Z. cDNA-fragmentet i denna klon, bestämd till 2,8 kb, insattes i bluescript+ vektorn med användning av en hjälparfag. Delar av denna klon, PCAS-2, kundepartiellt sekvensas med syntetiska oligonukleotider som primers (Fig 3). En öppen läsram erhölls innehållande båda peptidema 292 och 293.

Perfekt överenstämmelse förelåg- mellan peptid sekvensema och den förmodade aminosyra sekvensen från cDNA klonen. 500 kDa placenta kalcium sensorn tillhör LDL receptor superfamiljen.

Sökning i databas med den tillgängliga utlästa aminosyrasekvensen från cDNA- klonen för placenta 500 kDa proteinet visade homologi mellan detta protein och receptorer tillhörande LDL-receptor superfamiljen.

Största likheten påvisades med Heymarm nefrit antigenet från råtta (11). Fig 4 visar jämförelse mellan den tillgängliga placenta 500 kDa protein sekvensen och sekvenser fór I-“Ieymann antigenet liksom för två andra medlemmar av samma protein-superfamilj, LDL-receptom och LDL-receptor relaterat protein (identiskt med 01-2 macroglobulin receptom) (11,15,16). Sekvenslikheten mellan placentas 12 504 108 kalcium sensor och Heymann antigenet beräknades till 82% inom den region som var tillgänglig för jämförelse (innehållande 236 aminosyror), vilket är högt, med hänsyn till att de två proteinerna härrör från olika species.

Immunhistokemi och Northern blot Den påtagliga likheten mellan placentas 500 .kDa kalciumsensor kedja och Heymann nefrit antigenet föranledde en utvidgad immunhistokemisk undersökning inom ramen för föreliggande studie. Antiparathyroidea antikroppama (E11 och G11) visades härvid färga inte bara parathyroidea, placenta och proximala njurtubuli celler utan också epididymis celler, i likhet med tidigare påvisad reaktivitet för antikroppar reaktiva med Heymann antigenet (17,20). Northern blot analys av total RNA (uppskattningsvis IOug/lane) från human njure, placenta och parathyroidea körtlar med den identifierande 2,8 kb klonen som probe, visade hybridiserande RNA av en ungefärlig storlek motsvarande 15 000 baser i samtliga dessa vävnader (Fig 5). RNA från human lever, pancreas, binjure och tunntarrn (Fig 5) liksom mjälte, lunga och tvårstrimmig muskel (ej illustrerat) saknade hybridisering.

Diskussion Parathyroideas övergripande, reglerande roll inom kalcium homeostasen har satts i samband med dess ovanliga förmåga att avkänna och svara på förändringar i extracellulär kalciumjon koncentration. Av väsentlig betydelse för registrering av dessa förändringar är en katjon receptor eller sensor i parathyroideas cellmembran, vars fórkomst har implicerats genom en serie studier av parathyroideacells- regulation in vitro (9,10,21-24). Idén om en cellmembran bunden receptor har orts ytterligare sannolik i samband med att monoklonala antiparathyroidea antikroppar visats identifiera och interferera med parathyroidea cellens törrnåga att avkänna extracellulära kalcium koncentrationer (1-6). Ett ytterligare viktigt bevis för förekomst av denna kalciumsensor mekanism har erhållits när cytotrofoblast celler i human placentavävnad, selekterade genom sin reaktivitet med en av antiparathyroidea antikropparna har uppvisat en i det närmaste parathyroidea- identisk reaktivitet vis-a-vis förändringar i extracellulärt kalcium och denna förmåga visats kunna blockeras av en av antiparathyroidea antikroppama (7,8). 13 ' 504 108 Parathyroideas kalciumsensor har härefter isolerats genom immunaffinitets-och jonbytar kromatografi och visats utgöras av ett stort glykoprotein med en uppskattad molekylvikt runt 500 kDa (7). Genom immunprecipitation har också kunnat visas att ett protein av samma storlek reagerar med antiparathyroidea antikroppama i parathyroidea- och njurtubuli- celler (opublicerade data., 25).

Parathyroideas kalcium sensor/ receptor haruuppvisat egenskaper liknande andra klassiska receptorer för cellaktivering trots att sensorn har den unika förmågan att binda och aktiveras av di- och trivalenta katjoner. Katjon bindning initierar bifasisk stegring i [Cazfl] och samtidig aktivering av fosfolipas C, troligen via ett kopplat G- protein, resulterande i bildning avinositolfosfater (2,5,9,10). En initial, transient stegring i [Cazfl] orsakas av inositol-trisfosfat (Ip 3) inducerad mobilisering av kalcium från intracellulära kompartment, emedan en efterföljande bestående förhöjning av [Cazfl] orsakas av Caz* inflöde genom plasmamembran kanaler, troligen medierad genom ökning av inositol-tetrafosfat (Ip 4) (9,10,23).

Sekvensbestämning av den erhållna partiella cDNA-klonen och data-bas jämförelse utnyttjande den utlästa aminosyra sekvensen har visat att placeutas kalciumsensor tillhör LDL-receptor superfamiljen av proteiner, och tillgängliga sekvenser har uppvisat påtaglig likhet med Heymann nefirit antigenet från råtta (l1,15,16). Detta antigen har ursprungligen beskrivits som ett 330 kDa glykoprotein (gp330) förekommande i proximala njurtubulis borstbräm samt i placenta och epididymis celler, men genom speciella fárgningstekniker också påvisats förekomma sparsamt i glomeruliceller i råttnjure liksom pneumocyter typ Il i lunga samt sporadiskt i vissa leverceller och tunntarmsceller (17,19). Det har senare föreslagits att molekylvikten för proteinet har underskattats och egentligen torde ligga omkring 500 kDa (20).

Heymann antigenet har visats varadet huvudsakliga antigen som orskar membranös, autoimmun glomerulonefrit hos råtta efter immunisering med en (oren) tubuliprotein fraktion (17,19). Med användning av anti-gp330 antikroppar har ett protein med en beräknad molekylvikt större än 400 kDa identifierats hos homo (20). Sekvens- likheter mellan nu tillgängliga delar av det humana placenta 500 kDa kalciumsensor proteinet och Heymann nefrit antigenet frånråtta, med 82% likhet inom hittills sekvensade 236 aminosyror, antyder att det egentligen rör sig om två likartade former av kalciumsensor proteinet i två olika species. Denna förmodan stöds av 504 108 V* likheter i vävnadsdistribution mellan de två proteinema, som visats genom immunhistokemiska undersökningar i den aktuella studien. Antikropparna E11 och G11, vilka reagerar med kalciumsensor proteinet, har alltså visats färga parathyroidea celler, proximala tubuliceller, cytotrofoblast celler i placenta och också epididymis celler. Dessutom har vi nyligen rapporterat färgning med en av antiparathyroidea antikroppama huvudsakligen inom sk' coated pits och basen av microvilli i proximala tubuli, liknande det fárgningsmönster som tidigare beskrivits med antikroppar mot gp330 proteinet (19,26).

Hittills identiñerade medlemmar av LDL-receptor superfamiljen, LDL-receptor, LDL-receptor relaterat protein och Heymannantigenet, har förmodats ha funktion som protein receptorer, men alla uppvisar också funktionellt betydelsefull Caz* bindning (16,27,28). Således är Caz* nödvändigt för interaktion mellan LDL- receptom och apo-B (27). LDL-receptor relaterat protein (aQ-macroglobulin receptorn) har också förmågan att binda Cazfl vilket inducerar konforrnationsförändringar och Ca” är också nödvändigt för bindning av aktiverat aQ-makroglubulin till denna receptor (16). Nyligen har Heymann antigenet från råtta genom en blotting teknik visats interagera med Ca” (28). i Det återstår fortfarande att säkert identifiera Ca2*-bindande sekvenser inom kalcium sensor proteinet. Sensor proteinet (liksom Heymann antigenet) innehåller EGF- liknande moduler, liksom andra medlemmar av LDL-receptor superfamiljen (11,16,27), vilket kan representera sannolika Ca2*- bindande sites. EGP-liknande moduler som påvisats i koagulationsfaktorerna IX, X och protein C har således visats binda en Caz* jon vardera, och EGF-liknande moduler har också påvisats mediera Cazflberoende protein/proteininteraktion (35). Kinetiska data har antytt att kalciumsensor proteinet uppvisar positiv kooperativitet i sin interaktion med Cazfi ett fenomen som synes vara av 'avgörande betydelse för den sigmoidala regulationen av [Cazfl] och PTH-frisättning, med en speciellt brant relation inom det fysiologiska området för extracellulärt Caz* (9i,10). Denna positiva kooperativitet bör kräva multipla bindnings-sites för Cazfl möjligen beroende på repetitiva EGP-liknande moduler, vilka är vanligt förekommande i molekyler av LDL-reoeptor superfamiljen (11,16,27). Eftersom Caß-bindning till EGP-liknande domäner visats inducera 15 504 108 endast smärre, lokaliserade förändringar av den tredimensionella strukturen (32) är det också möjligt att kalciumsensor proteinet innehåller andra Cazßbindande sites.

Ett 43 kDa membranprotein (otz-macroglobulin receptor associerat protein, eller heparin-bindande protein) (28,36) har visats interagera både med LDL-receptor relaterat protein och med rått Heymann antigenet på ett CaB-beroende sätt (28).

Ingen fysiologisk funktion har *kunnat kopplas till-detta protein, men det uppträder också i vävnader där Heymann antigenet och LDL-receptor relaterat protein inte är uttryckta (28). En intressant iakttagelse är närvaron av ett sannolikt leucine-zipper motif i den aminoterminala delen av 43 kDa proteinet (36), med hänsyn till att sådana motif har ansetts påverka öppning och stängning av membran jonkanaler (37). Eftersom 43 kDa proteinet interagerar med Heymann antigenet, kan det förmodas bilda ett komplex också med kalciumsensor proteinet på ett Ca”- beroende sätt. Interaktion med 43 kDa proteinet kan vara betydelsefullt för fortledning av Caz* inducerade konformations förändringar inom den extracellulära delen av molekylen till cellens inre. Det är också möjligt att ytterligare proteiner interagerar med kalciumsensom på ett Caß-beroende sätt, och att sådan interaktion är av betydelse för modulering av sensor svaret. Mekanismer genom vilka en aktiverad kalsiumsensor triggar ytterligare signaler till cellens inre är hittills okända, men vi har utnyttjande immunprecipitation kunnat isolera en fosforylerad form av sensor proteinet i dispergerade parathyroidea celler laddade med [32p]-ortofosfat (ej publicerade data).

Kalcium sensor proteinet i placenta kan vara involverat i upprätthållande av en feto- matemell Caz* gradient och Caz* transport över placenta, möjligen genom att mediera Caz* regulation av parathormon relaterad peptid (PTHrP) produktion och/eller 1,25 (OH)2D3 metabolism (8). Dess närvaro redan i blastocyststadiet (opublicerad iakttagelse) kan antyda funktion också som adhesions molekyl, och möjligen också betydelse för differentieiing eller tillväxtregulation, vilket tidigare föreslagits för Heymann antigenet (38). En möjlig funktion för kalciumsensom inom njurtubulis borstbräm är ofullständigt undersökt. Det bör dock påpekas att enzymet l-ot- hydroxylas, vilket förekommer i placenta och proximala njurtubuli, regleras av extracellulära Ca” nivåer, och kalciumsensom kan härigenom alltså möjligen reglera 1,25 (OH)2D3 metabolism, men den kan också påverka Ca” reabsorption från 504 108 16 glomerulus filtratet (7-9). Betydelsen av ett kalciumsensor protein på epididymis celler liksom sporadiskt förekommande också på rått-pneumatocyter, vissa lever och tunntarmsceller, vilket antytts av studier rörande Heymann antigenets distribution, är för närvarande okänd. Det har emellertid föreslagits att många olika celltyper kan ha förmågan till Caz* avkärining/sensing för regulation av olika cellfunktioner, förutom de som har betydelse för den allmänna homostasen, antingen under stadier i cellutveckling eller i differentierade stadier (10).

Sambandet med autoimmun nefrit understryker att Heymann antigenet är en immunogen molekyl. Detta kan ha betydelse också för parathyroidea sjukdom, eftersom vi nyligen påvisatnärvaro av cirkulerande parathyroidea autoantikroppar och induktion av klass II transplantation antigen i patologisk parathyroidea vävnad från patienter med primär HPT. Dessa resultat antyder att autoimmuna fenomen kan vara involverade i utvecklingen av HPT (39) och autoimmunitet har också ansetts ha betydelse för patogenesen för sällsynt idiopatisk hypoparathyroidism. Den nu tillgängliga cDNA klonen för kalciumsensom bör erbjuda möjligheter till studier rörande patofysiologi för parathyroidea sjukdom och också undersökning av möjliga genetiska defekter med påverkan på kalciumsensor funktion i parathyroidea och njurtubuli hos patienter med t ex familjär hypokalciurisk hyperkalcemi (FHI-I) (40,41).

En person med utbildning inom detta område inser att information som kan erhållas från nukleotid sekvensen i Fig 3 kan användas för att isolera total DNA och gensekvens kodande för kalciumsensor proteinet. För detta kan med fördel analys av överlappande cDNA kloner tillsammans med PCR teknik användas. Gen sekvensen kan erhållas efter analys av överlappande genom kosmid, och/eller lambda fag kloner. 504 108 17 Referenser l.Juhlin, C., Holmdahl, R., Johansson, H., Rastad, J., Åkerström, G., Klareskog, L., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84, 2990- 2994. 2.Juh1in, C., Johansson, H., Holmdahl, R., Gylfe, E., Larsson, R., Rastad, J., Åkerström, G., Klareskog, L., (1987) Biochem. Biophys.

Res. Commun. 143, 570-574. 3.Juh1in, C., Klareskog, L., Nygren, P., Gylfe, E., Ljunghall, S., Rastad, J., Åkerström, G., (1988) Endocrinol. 122, 2999-3001. 4.Juh1in, C., Åkerström, G., Klareskog, L., Gylfe, E., Holmdahl, R., Johansson, H., Ljunghall, S., Larsson, R., Nygren, P., Rastad, J., (1988) World. J. Surg. 12, 552-558. 5.Gylfe, E., Juhlin, C., Åkerström, G., Klareskog, L., Rask, L., Rastad, J., (1990) Cell Calcium. 11, 329-332. 6.Juhlin, C., Rastad, J., Klareskog, L., Grimelius, L., Åkerström, G., (1989) Am. J. Pathol. 135, 321-328. 7.Juh1in, C., Lundgren, S., Johansson, H., Lorenzon, J., Rask, L., Larsson, E., Rastad, J., Åkerström, G., Klareskog, L., (1990) J.

Biol. Chem. 265, 8275-8279.

Euflellman, P., Ridefelt, P., Juhlin, c., Åkerström, G., Rastad, J., Gylfe, E., (1992) Arch. Biochem. Biophys. 293, 174-180. 9.Åkerström, G., Rastad, J., Ljunghall, S., Ridefelt, P., Juhlin, C., Gylfe, E., (1991) World. J. Surg. 15, 672-680. 10.Brown, E- M., (1991) Phys. Rev. 71, 371-411. 11.Raychowdury, R., Niles, J: L., Mc Cluskey, R. T., Smith, J. A., (1989) Science. 244, 1163-1165. 12.Denhardt, D.T., (1966) Biochem. Biophys. Res: Commun. 23, 641- 646. 13.Pearson, W. R., Lipman, D. J., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.

USA. 85, 2444-2448. l4.Holmdah1, R., Rubin, K., Klareskog, L., Larsson, E., Wigzell, H., (1986) Arthritis. Rheum. 29, 400-410. 15.Yamamoto, T., Davis, C. G., Brown, M. S., Schneider, W. J., Casey, M. L.,Goldstein, J. L., Russel, D. W., (1984) Cell. 39, 27- 38. 16.Herz, J., Haman, U., Rogne, S., Myklebost, O., Gausepohl, H., Stanley, K. K.,(1988) EMBO. J- 7, 4119-4127. .504 108 18 l7.Chatelet, F., Brianti, E., Ronco, P., Roland, J., Verroust, P., (1986) Am. J. Pathol. 122, 500-511. 18.Chatelet, F., Brianti, E., Ronco, P., Roland, J., Verroust, P., (1986) Am. J. Pathol. 122, 512-519. 19.Kerjaschki, D., Farquhar, M. G., (1984) in Nephrology' ed Robinsson R.R., New York Springer-Verlag pp 560-574. 20.Kerjaschki, D., Horvat, R., Binder, S., Susani, M., Dekan, G., Ojha, P. P., Hillermans, P., Ulrich, W., Doninn, U., (1987) Am.

J. Pathol. 129, 183-191. 21.Wal1felt, C., Larsson, R., Johansson, H., Rastad, J., Åker- ström, G., Ljunghall, S., Gylfe, E., (1985) Acta. Physiol. Scand. 124, 239-245. 22.Gylfe, E., Larsson, R., Johansson, H., Nygren, P., Rastad, J., Wallfelt, C., Åkerström, G.,(l986) Febs. lett. 205, 132-136. 23.Nemeth, E., Scarpa, A., (1987) J. Biol. Chem. 262, 5188-5196. 24.Gy1fe, E., Åkerström, G., Juhlin, C., Klareskog, L., Rastad, J., (1990) In: Hormones and Cell Regulation. Eds: Dumont, J.E., Nunez, J., King, R.J.B., John Libhey Eurotext Ltd, London pp 5-15. 25.Lundgren, S., Juhlin, C., Rastad, J., Klareskog, L., Åkerström, G., Rask, L., Submitted. 26.Bjerneroth, G., Juhlin, C., Åkerström, G., Rastad, J., (1992) J. Submicrosc.Cytol. Pathol. 24, 179-186. 27.Brown, M. S., Goldstein, J. L., (1986) Science. 232, 34-47. 28.Christensen, E. J., Glieman, J., Moestrup, S. K., (1992) J.

Histochem. Cytochem.40, 1481-1490. 29.Handford, P. A., Baron, M., Mayhew, M., Willis, Å., Beasly, T., Brownlee, G. G., Campbell, I. D., (1990) EMBO J. 9, 475-480. 30.Huang, L. H., Ke, X-H., Sweeny, W., Tam, I. P., (1989) Biochem.

Biophys. Res. Commun. 160, 133-139. 31.Persson, E., Selander, M., Linse, S., Drakenberg, T., Öhlin, A. K., Stenflo,J., (1989) J. Biol. Chem. 264, 16897-16904. 32.Öh1in, A. K., Linse, S., Stenflo, J., (1988) J. Biol. Chem. 263, 7411-7417.Urukawa, T., 33.Öh1in, A. K., Landes, G., Bourdan, P., Oppenheimer, C., Wydro, L., Stenflo, J., (1988) J. Biol. Chem. 263, 19240-19248. 504 108 19 34.Selander - Sunnerhagen, M., Ullner, M., Persson, C., Teleman, O., Stenflo, J., Drakenberg, T., (1992) J. Biol. Chem. 267, 19642- 19649. 35.Rebay, I., Fleming, R. J., Felion, R. G., Cherbas, L., Cherbas, P., Artavanis -Tsakonas, S., (1991) Cell. 67, 687-699. 36.Furukawa,T., Ozawa, M., Hvang, R. P., Muramatsu, T., Biochem. 108, 297-302. 37.McCormack, K., Campanelli, I. T., Ramaswami, M., Tanoye, M. A., Iverson, L.E., Rudy, B., (1989) Nature. 340, 103. 38.Mendrick, D. L., Chung, D. C., Remcke, H. G., (1990) Exp. Cell. (1990) J.

Mathew M. K., Research. 188, 23-25. 39.Bjerneroth, G., (1992) Comprehensive summaries of Uppsala Disertations from the Faculty of Medicine 360, ISBN. 91-54-2928-9. 40.Marx, S.J., Attie, M. F., Levine, M. A., Spiegel, A. M., Downs, R. W., Lasker, R. D., (1981) Medicine 60, 397-412. 41.Choo, Y-H. W., Brown, E. H., Levi, T., Crowe, G, B., Atkinson, A. B., Arnqvist, H. J., Toss, G., Fuleihan, G, E-H., Seidman, J.

G., Seidman, C. E., (1992) Nature Genetics. l, 298-300.

Claims (6)

1. 504 108 PATENTKRAV 20 1- En cDNA klon kodande För det humana kalcium sensor proteinet inne- hållande följande nukleotid sekvens: TAC TAC GAG AGT A -A 'CÄG C C ä Anv- _» CCS 'CAC AGA »fw _.- _f~«~ TGB GCC CLRA ATC GGC CCT GT. ÖIÄG AAA fifi s, CX TAC .JC AGC Ars css c;A GÉ-.C CCA rrvfif- _\I'\I ACT AAG ACT fl-fi .C CCS Gfl.. GAG “AG ATA ;«~ A416 su-vnw å-.. CCT GAC us -n 'fu-vw __- GAG fr' v» CTC GAT vw run- lfiff' -_.~ ATG GA- AAG AGA GAG CCC CCC GE; ACT." TAC -C-f ,-._ .:.--\ ATC CCS 1:e _.-- Tfn? ACC 24: GAC CSC 25 GQFH Glxfl! -<- ACC CCC G... GTA S67 AAC AAG Il AGA L _' ACC 729 .lv-_ AGG 782 Tff- -uwc GCC- ~ ms 5-6; v-~ a __1\_ - GTS max _ C-L mp.- _~.x¿ C-'AC CCS ~n~a 41-» AGC G 'IA GTS CCT mr»- - -TC a w ~..\ s... CCS CCS. CCT C-n _» p .JJ f) 'å »a CF; f--n x- f~ 41159 CCT ÄGC 5.”. GCE-G un» n-\_ CAA AA CTC cá: 'EGT Gfw TAC anv-n .\_- Fp. v- flfläfi .XAC- ACC ACT mflfl -uu GC C ACC IH/*HI -d- 64 CC 7G 8 f. a .é ATC GAS» I] m 21 i 504 108
2. 2. Ett kalcium sensor protein innehållande aminosyra sekvens som kan erhållas från nukleotid sekvensen beskriven i krav 1.
3. 3. Användning av nukleotid sekvens beskriven i krav 1 för isolering och komplett nukleotid sekvens bestämning för kalciumsensor proteinet.
4. 4. Användning av nukleotid sekvens beskriven i krav 1 och/eller kalcium sensor proteinet beskrivet i krav 2 för utveckling av agonister och/eller antagonister till Caz* eller andra katjoner med bindning till nämnda humana kalciumsensor proteiner.
5. 5. Användning av nukleotid sekvenser beskrivna i krav 1 och/eller kalcium sensor proteinet beskrivet i krav 2 för utveckling av ämnen vilka interfererar med funktionen av nämnda kalciumsensor protein, t ex i samband med immunreaktioner mot kalciumsensor proteinet eller därmed associerade molekyler.
6. 6. En eukaryotisk cell uttryckande nukleotid sekvens i enlighet med krav 1 för användning i en assay för att identifiera molekyler med förmåga att blockera eller öka aktiviteten av nämnda kalciumsensor protein.