SE448167B - Peptidderivat till anvendning som substrat for bestemning av enzymatisk aktivitet - Google Patents

Description

10 15 20 25 30 35 448 167 2 Peptidderivatet kan ha formen av ett syraadditions- salt, exempelvis med ättiksyra eller saltsyra, eller av ett hydrat.

Det ovan angivna peptidderivatet är 7-(lysyl)- amino-4-metylkumarin, om R är en väteatom, 7-(isoleucyl- glutamyllysyl)amino-4-metylkumarin, om R är en isoleucyl- glutamylgrupp, 7-(fenylalanylglutamyllysyl)amino-4-metyl- kumarin, om R är en fenylalanylglutamylgrupp, 7-(glutamyl- lysyllysyl)amino-4-metylkumarin, om R är en glutamyllysyl- grupp, 7-(fenylalanylglutamyllysyllysyl)amino-4-metylkumarin, om R är en fenylalanylglutamyllysylgrupp, och 7-(valylleucyl- lysyl)amino-4-metylkumarin, om R är en valylleucylgrupp.

Peptidderivat kan syntetiseras på följande sätt. 7-amino-4-metylkumarin och lysin, vars båda amino- grupper är skyddade, omsätts i närvaro av ett kondensa- tionsmedel, såsom dicyklohexylkarbodiimid, som brukar användas för peptidsyntes. Därefter avspjälkas skydds- grupperna för aminogrupperna med en vid peptidsyntes bruklig metod, så att 7-lysylamino-4-metylkumarin erhålls.

Andra peptidderivat enligt uppfinningen kan fram- ställas genom att den enligt ovan erhållna Nu- och NE- skyddade 7-lysylamino-4-metylkumarinen används som ut- gångsmaterial i metoder som är brukliga vid peptidsyntes.

Exempelvis kan man framställa 7-(Na-glutamyllysyl)amino- 4-metylkumarin genom att omsätta glutaminsyra, vars aminogrupp och Y-karboxylgrupp är skyddade, med det ovan- nämnda metylkumarinderivatet, vars Na icke är skyddat, i närvaro av det nämnda kondensationsmedlet eller om- sätta en aktiv ester av den ovannämnda glutaminsyran med det nämnda metylkumarinderivatet samt avspjälka skydds- grupperna. Genom att omsätta 7-(glutamyllysyl)amino-4- metylkumarin, som har Na-oskyddad Y-skyddad glutamylgrupp och Ng-skyddad lysylgrupp, med en aktiv ester av isoleucin, vars aminogrupp är skyddad, och sedan avspjälka skydds- 10 20 25 30 35 448 167 3 grupperna, fâr man 7-(isoleucylglutamyllysyl)amino-H- metylkumarin. Om man använder en aktiv ester av fenyl- amin med skyddad aminogrupp i nyssnämnda reaktion i stället för den aktiva estern av aminogruppsskyddad iso- leucin och avspjälkar skyddsgrupperna på liknande sätt, lar man 7-(funylalanylglutamyllysyl)amino-4-metylkumarin.

Genom att omsätta Nu-oskyddad NE-skyddad 7-lysyl- amino-H-metylkumarin med en aktiv ester av aminogrupps- skyddad leucin och avspjälka skyddsgrupperna kan man framställa 7-(leucyllysyl)amino-H-metylkumarin.

Genom att omsätta 7-(leucyllysyl)amino-H-metyl- kumarin, vars leucylgrupp är Na-oskyddad och vara lysyl- grupp är NE-skyddad, med en aktiv enter av aminogrupps- skyddad valin och avspjälka skyddsgrupperna kan man fram- ställa 7-(valylleucyllysyl)amino-H-metylkumarin.

Genom att omsätta IW-oskydaaa ras-skyddad 7~1ysy1- amino-H-metylkumarin med en aktiv ester av a,a-diskyddad lysin och avspjälka skyddsgrupperna kan man framställa 7-(lysyllysyl)amino-4-metylkumarin.

Genom att omsätta 7-(lysyllysyl)amino-H-metyl- kumarin, som är Na-oskyddad i den terminala lysylgruppen och NC-skyddad i båda lysylgrupperna, med en aktiv ester av glutaminsyra, vars y-karboxylgrupp är skyddad, och av- spjälka skyddsgrupperna, kan man framställa 7-(glutamyl- lysyllysyl)amino-H-metylkumarin.

Genom att omsätta 7-(glutamyllysyllysyl)amino-4- metylkumarin, ann är Nu-oskyddad och Y-skyddad i gluta- mylgruppen och NE-skyddad i lysylgrupperna, med en aktiv ester av aminogruppsskyddad fenylalamin och avspjälka skyddsgrupperna kan man framställa 7-(fenylalanylglutamyl- lysyllysyl)amino-4-metylkumarin.

Om ett peptidderivat har aktiva grupper (N8-amino- grupp eller Y-karboxylgrupp) jämte den terminala amino- syrarestens Na-aminogrupp och bland dessa aktiva grupper endast den terminala aminosyrarestens Na-aminogrupp skall vara skyddad, kan det peptidderivat, vari de andra aktiva grupperna jämte den terminala aminosyrarestens Na-amino- grupp är skyddade, utsättas för en lämplig avspjälknings- 10 15 20 25 30 448 167 H process, såsom hydrering över en av palladium på kol be- stående katalysator, beroende på skyddsgruppernas art. Om exempelvis Na-skyddsgruppen är en t-alkyloxikarbonylgrupp och de andra skyddsgrupperna är karbobensoxigrupper eller bensylestergrupper, kan skyddsgrupperna för andra aktiva grupper än den terminala aminosyrarestens Nu-aminogrupp selektivt bortskaffas genom sådan hydrering.

Kondensationsreaktionen för syntes av peptidderi- vatet enligt uppfinningen bör helst genomföras i ett lämpligt lösningsmedel, såsom dimetylformamid, dimetyl- sulfoxid eller vatten eller en blandning därav. Den karboxylkomponent, som skall omsättas med en aminokompo- nent, bör helst användas i form av en aktiv ester, som lämpligen kan vara en N-hydroxisuccinimidester eller p- nitrofenylester. Vid användning av en sådan aktiv ester fortskrider reaktionen i allmänhet tillräckligt snabbt vid rumstemperatur, men den kan vid behov främjas genom värmning.

Efter reaktionens slut koncentreras reaktions- blandningen och intorkas till en fast substans, som renas medelst gelkromatografi och frystorkas.

Om den erhållna föreningen har skyddsgrupper för aminogrupper eller karboxylgrupper, kan dessa skyddsgrupper bortskaffas medelst en bruklig metod för bortskaffande av sådana skyddsgrupper. Exempelvis kan karbobensoxigrupper eller bensylestergrupper bortskaffas genom hydrering i alkohol eller liknande lösningsmedel och t-butyloxi- karbonylgrupper genom omsättning med toluensulfonsyra under ca 90 min i ättiksyra eller annat lösningsmedel.

Peptidderivatet enligt uppfinningen i isolerad form kan omvandlas till syraadditionssalt, eller också kan ett peptidderivat i form av salt omvandlas till den fria formen efter behov. Exempel på salter är salter med oorganiska syror, såsom hydroklorider, sulfat, nitrat och fosfat, och salter med organiska syror, såsom acetat, oxalat, tartrat, succinat, citrat och toluensulfonat.

De erhållna peptidderivaten har identifierats genom elementaranalys, aminosyraanalys och bestämning av x. '- p 10 15 »2Û 25 30 35 448 167 Is ultraviolettabsorptionspektrum samt bestämning av ultra- íviolettspektrum för det med trypsin hydrolyserade peptid- derivatet i jämförelse med spektrum för 7~amino-U-metyl- "kumarin§ Föreningarna enligt uppfinningen kan hydrolyseras -med trypsin, plasmin och liknande enzymer, varför de är synnerligen lämpliga som syntetiska substrat för dessa 'specifika enzymer; Den i peptidderivatet enligt uppfinningen ingående aminosyran kan vara i L- eller Dfform, men L-formen före- * dras¿ enär aminosyran av Dëform vid'karboxylgruppsände _ inte hydrolyseras av enzymer.

Uppfinningen belyses av följande exempel.

A 19 g (0,05 mol) Nu-t-butyloxikarbonyl-NE~karbo- bensoxi-Lflysin ocn 8,7 g (0,05 mol) 7-amino-U-metyl- kumarin löstes i 80 ml dimetylformamid. Till lösningen sattes 11 g (0,053 mol) dicyklohexylkarbodiimid på isbad. _ Blandningen omrördes 15.h vid 20oC, det bildade dicyklo- hexylurinämnet avfiltrerades, och filtratet koncentrerades._ Till den återstående produkten sattes 100 ml 0,5N saltsyra, 'och den därvid bildade oljiga substansen extraherades med t2Ü0 ml etylacetat. Den organiska fasen tvättades två *gånger med 100 ml 0¿5N saltsyra, två gånger med 5-procentig ~vatten1ösning av natriumbikarbonat och med 100 ml vatten, torkades över magnesiumsulfat och indunstades till en fast substans. 200 ml eter sattes till återstoden, vilken så- lunda triturerades och utvanns genom filtrering. Produkten löstes i 150 ml metanol, avfärgades med aktivt kol och _försattes med 0,1N saltsyra, varpå den bildade fasta substansen utvanns genom filtrering. Produkten tvättades med 200 ml vatten, varvid 7-(Na-t-butyloxikarbonyl~N8- karbobensoxi-L-lysyl)amino-U-metylkumarinhydrat erhölls.

Utbytet var 9,8 g (ss %), smälfpunkten var 125 - 127°c, och den specifika vridningen var[d]27 = -8,00 (C=2,96, DME>;i n e D de 0 Elementaranalys» iFunnen_. 1 c 63,35, H 6,56, N s,2u % Ber. för c29H35o¿N¿-1/2H2o e 63,72, H 6,su, N 7,70 %. : 44sj1e7 _ Exempel 2" _ Till 2,7 g (5 mm0l)'7-(Nu-tfbutyloxikarbonyl-NE- karbobensQxi¿L-lysyllamino-H~metylh1marin sattes S ml ättiksyra och därpå 1,15 g (6 mmol) toluensulfonsyra- monohydrat. Den erhållna blandningen omrördes under 60 -admin vid 2590 och försattes med zøo mi etyiaèerat, varpå ; 10 15 20 30” det bildade fasta ämnet avskildes genom filtrering. Detta l löstes i 10 ml dimetylformamid, nentraliserades med 0,7 ml trietylamin och försattes med 3,0 g (6,9 mmol) t-butylkar- bonyl-y-bensyl-Leglütamyl-N-hydroxisuccínimidester. Den sålunda erhållna blandningen omrördes under 20 h vid 25OC. 100 ml 5-procentig vattenlösning av natriumbikarbonat sattes Û till den erhållna blandningen, och den därvid bildade oljiga. substansen extraherades_med 100 ml etylacetat, Det organiska .skiktet tvättades två gånger med 100 ml Srprocentig vatten- lösning-av natriumkarbonat¿ två gånger med 100 ml 0,5N salt: syra och med 100 ml vatten, torkades över magnesiumsulfat, koncentrerades och torkades till en fast substans. Denna försattes med 20 ml etylacetat och 200 ml etyleter, och en bildad gelartad fast substans avskildes genom filtrering och tvättades med 100 ml etyleter, varvid 7~(Nu-t-butyloxi- 1karbonyl-y-bensyl-L~glutamyl-NE-karbobensoxi-L-lysyl)amino- -4~metylknmarinmonohydrat erhöl1s¿ Utbyte 2,7 g,smp.” " Elementaranalys: PunnenrDC 63;61¿ H 6,41; N 7,76 % Begägnaa} för cuifiußolomu-H20; C 63,55, nV§,so, N 7,23 %. 112 f 11s°c; specifik vridning[¿f7'= -o,2° (c:1,ss, DMP>. _ Éxempel 3 _ _ Till 0,73 g (1 mmol) 7-(Na~t-butyloxikarbonyl-yë bensyl-L-glutamyl-NE-karbobensoXi~L~lysyl)amino-H-metyl- kumarin_sattes 2,0 ml ättiksyra och 0,23 g (1,2 mmol) -tolnensulfonsyramonohydrat. Den erhållna blandningen om- rördes 3 h vid 2090 och försattes med so ml efyiaceraf. 7 Den erhållna fasta substansen_avskildes genom filtrering '~ Och tvåttades med 20 ml etylacetat. Den tvättade fasta 35 substansen-löstes i 5-ml dimetylformamíd,-neutraliserades med 0,1H ml trietylamin och försattes med 0,54 g (1,5 mmol) it-butyloxikarbonylfL~fenylalanin-N~hydroXisuccinimidester, och den bildade produkten omrördes vid 2000 under 20 h. är b» 446 167 7 -Till den_erhållna produkten sattes 100 ml âeprocentig vattenlösning_av natriumbikarbonat, och den därvid bildade. oljiga produkten extraherades med 100 ml etylacetat. Det ' organiska skiktetztvättades två gånger med 100 ml 5- V procentig vattenlösning av natriumbikarbonat, två gånger med 100 ml-0,5N saltsyra och med 100 ml vatten i angiven ordning, torkades över magnesiümàulfat, koncentrerades ~ _öch torkades till en fast substans. Till denna sattes 200- 10 _15, -20 25 604 ss: ml etyleter, och den bildade blandningen kokades med återä_ lopn under 30 min. Sedan den vid värmningen olösta âterf I Stoden hade filtrerats av, tvättades blandningen med 50 ml etyleter, varvid 7-(Nu-t-bntylonikarbonyl-LÉfenylalanyl-y- bensyl-L-glutamyl-NE-karbobensoxiëtflysyl)amino-H-metyl- kumarlnmonøhydratlerhölls. Utbyte 755 mg (63 6), amp. 161 á 166°c,ispe@ifik vridning[¿f7 = -7,s° (c = 1,46, Dnr). 0 1 6 E1emenfarana1ys=_Funnen DC 65,32; H 6,40; N 7,54 6.

Beräknad för c H Jo NS-H20, c 65,13; H 6,46; N 7,60 6.

I 50 57 Il _ ' ExemEel_4 ~ 6 - K 'Till 0,73 g (1 mmol) 7-(Na~t~butyloxikarbonylfY- bensyl-L-glutamyl~Ne-karbobensoxi~L-lysyl)amino-U-metyl- knmarin satteš,2g5 ml ättiksyra och 0,23 g (1,2 mmol) toluensulfonsyramonohydrat,-och blandningen omrördes under *åh vid 20°C och försattes med 50 ml etylacetat. Den där- ifvid bildade fasta substansen löstes i*5 ml dimetylformamidf Knentraliseradeš»med 0,14 ml trietylamin, försattes med 0,49 g (1,5 mmol) t-butyloxikarbonyl~L-isolencin~N-hydroxi- suocinimidester ooh omrördes under 20 h vid 2000. Till 'den erhållna produkten aattes 100 ml Håprocentig vatten- llösning av natriumbikarbonat, varvid det bildades en oljig substanš, som extranerades med etylaçetat. Det organiska 'skiktet tvättades_två gånger_med,100 ml Bfprocentig vatten- , lösning av natriumbikarbonat, två gånger med 0,5N saltsyra och sedan_med 100 ml vatten,ívarvid ett olösligt material erhölls. Ytterligare olösligt material ntekildes genom tillsats av-200 ml eter, varpå det olöaliga materialet av- ~ filtrerades. Den återstående prodnktenïtvättades med 50 ml 7.'eter, varvid 7-(Naft-butylokikarbonylålfiàoleucyl-y-bensyl- LeglutamylÉNE-karbobensoxi4L¿1y5yllamín üfmetylkumarinfß/H~ l0 15 20] ehydrat'epnö11$Lf 0%t44s71e7 se B Utbyte-ess mg (7a”%>§ gmp. 19u - 19s°c; specifik 0evrídníng}§f7.=¶-ß,5° (C = 0,85, DMF>. .jElgmentaranalys; Funnen C 63530; H 6,95; N_7,84 %. 0 Beräknad för cu7H o N -5/4 H20, c s3,25; H 6,95; N 7,85 %. 0 se 1105- Exemgel 5 _ e . = 0jTi11 o,su g (1 mmo1> 7-(Nasr-buty1oxikarbony1-NE- :karbobensoxi-L-lysyl)amino-4-metylkumarin sattes 2,5 ml '-ättiksyna och 0,57 g (3 mmol) toluensnlfonsyramonohydrat. e,Den erhållna produkten omrördes vid 2000 under 1 h oeh försattes sedanmed 50 ml etylacetat, varvid det bildades en efast substans, som avskildes genom filtrering. Denna fasta substans löstes i 10 ml kloroform, neutraliserades med 0Q14 ml tnietylamin, försattes med 0,30 g (1,2 mmol) t- butyldxikarbonyl-L-leucin~N-hydroxisnceinimidester och 7_omrördes¿under 20 h vid 2000. Sedan lösningsmedlet hade _avdrivíts; försattes återstoden med 30 ml 5-procentig vattenlösníng av natriumbikarbonat, varvid en oljig substans _ntskildes, vilken extraherades med 30 ml etylacetat. Det Vonganiska skiktet tvättades_med.30 ml 5~procentig vatten- '~ lösning av natrinmbíkarbonat? 30 ml 0,5.N7saltsyra och 0 25 mäns 0 Beräknad för C H 0 35 «30 ml vatten, torkades över-magnesiumsülfat, konoentrenades -beh-indunstades till tørrhet. Till återstoden sattes 10 ml jetyleter, och den därvid bildade fasta substansen av- filtrerades Qch tvättades med vatten, varvid 7~(Na-t- 'butyloxikanbeny1jL4leucyl-Neekarbobensoki-L-lysyl)amino-4- metylkumarin-I/4-hydrat erhölls. eurbyte sou mg (us %>; smp. 163 = 1ss° c; specifik vridníng]@f7 = -9,3°_(DMF).'V _' eàslåmentaranalysg funnen c s4§21; H 7,07; N 8,60 %.

I I Nu¿1/4 Hzø: C su¿1s; H 7,15; N s,ss %. 35-H6 8 .Exempel 6 ' _ ~ _ Till z17_mg_(o,ss mmo1> 7- KL-leucyl-N8-karbobensexífL-lysyl)aminó>H-metylkumarin sattes 5~ml ättíksyra_ochl191_mg_(1 mmol) tolucnsulfon- syfamonohydrat, och blandning omnördes vid 2000 under 2 h. '~Ättiksyran7avdrevs sedan{ 20 ml etyleter sattes till åter- stoden, och den erhållna fasta'pródnkten utvanns genom .ß »fl b. xü* - 10 15 .ZU 25' 30 35 448*167 _ _ 9 i A _ filtrering och tvättades med 10 ml etyleter. Den fasta substansen löstes i 10 ml kloroform, neutraliserades med -0,05 ml trietylamin, försattes med 126 mg (0,0 mmol) t- '_bntyloxikarbonyl-L-valin-N-hydroxisuccinimidester'och om- gröraee under 20 h vid 2o°c. Den bildade produkten in- ' dunstades till torrhet. Återstoden försattes med 20 ml mvatten, och den lösliga substansen frånskildes. Återstoden vlöstes i 10 ml etylacetat och försattes med n-hexan, var- vid en gelartad substans bildades. Denna tillvaratogs genom filtrering och tvättades med 20 ml etyleter. Sålunda erhölls dev¿(N~-f-burylexikerbenyl-L-velyl~L-1euey1-N-kerbebeneoxi-L- lysyl)amino~4-metylkumarinsemihydrat. iiutbyte 240 mg (es %>; emp. 199 - 20o°c; specifik -vrianingfiu 7 = 17,s° (C = 1,15, nME).

Elementaranalys: Funnen C 63,52; H 7,29; N 9,27 %.

Beräknad för c4DH55o9N5-l/2 nzoi c 63,30; H 7,n3; N 9,20 %. 7 >Exempel=7 * _ * Till 1,s1.gí(s mmel) 7-(Na-f-buiylexikerbenylfN - karbobensoxi-L-lysyl)amino-4-metylkumarin sattes_7,5 ml fättiksyra och 1;7-g (9 mmol) toluensulfonsyramonohydrat, och blandningen omrördes vid ZOOC under 1 h. Den bildade fasta äflßtansfillöstes í'30 ml kloroform, neutraliserades med o,uz ml <3 mmel>'lrietylamin och försattes med 1,72 g -($,6'mmOl) Nq-tfbutyloxikarbonyl-NE-karbobensoxi-L-lysin- N-hydroxisuccinimidester, och den erhållna blandningen omrördes Vid 2000 under 20 h¿ Losningsmedlet avdrevs, och en oljig substans; som bildades vid tillsats av 100 ml 57 procentig vattenlösning av natriumbikarbonat, extraherades med 100 ml etylacetat. Det organiska skiktet tvättades två gånger med 100 ml 5-procentig vattenlösning av natrium- bikarbonat; två gånger med 100 ml 0,5 N saltsyra och med a100"ml vatten i angiven ordning, torkades över magnesiumsul- fat, konoentrerades och indunstades till en fast substans. 200 ml etyleter sattes till återstoden, och den erhållna ffasta substansen utvanns genom filtrering och tvättades med 100 ml efyletêrí Sålunda erhölls 7-(Na-t-butyloxikarbonylr '_N$-karbobensoxi-L-lysyl-NE-karbobensoxiFL-lysyl)amino-H- metylkumarin-1/Hfhydrat. 4480167 00 _ 010m 0 utbyte 1,25 g (52 %); :mp sal- 1oo°c; specifik Jivridning[¿f7 ="§2,6° (c¿= 1,ss, DMF). 0 Elgmentaranalysz funnen-C_6%,23; H BQÉ8; N 8,59 %.

Beräknad för Cu5H53010N -1/H H20: C 50,20; H 6,70; N 8,70 %.

V ExemBel'8> - - _ _ 0 ' _ Till iizo g (1,5 mmol) 7- karbobensoxi*L-lysvl-N5~karbobensoxi-L-lysyl)amino~4-metyl- fm! 07_kumarin sattes 10 ml0ättiksyra och 860 mg (455 mmol) 10 15 ,2Û toluensulfonsyramonohydratl och den bildade blandningen om-l rördes under 2fh vid 2000. Ättiksyran avdrevs, och en vid 0tillsats av 100 ml etyleter bildad fast substans utvanns . genom filtrering och tvättades med 50 ml etyleter. Den tvättade fasta substansen löstes i 50 ml kloroform, ned? traliserades med 0,21 ml (1,5 mmol) trietylamin och för- ísattes med 8280mg (1,8 mmol) Na-t-butyloxikarbomyl-y- bensyl¥L-glutamylfp-nitrofenylester, och den erhållna bland- ' ningen omrördes under020 h vid ZOOC. Lösningsmedlet avdrevs, och 100 ml etyleter sattes till återstoden för_bortskaffande av lösligt material. Återstoden bringades att kristallisera genom tillsats av 100 ml vatten. Krístallerna utvanns genom filtrering,.tvättades med 20 ml vatten och tvättades sedan med 30 ml etyleterf Sålunda erhölls 7-(Nu-t+butyloxikar- -¶ bonyi-Y-bensy1~L-glutamyl-NE-karbobensøxi-L-1ysy1-NE-kafbo- 25 raol” 35 , vridninÉ[šf7 = Beräknad för C5šH66O ~bensoXi-Lfllysyl)amino-4-metylkumarin. 1 *Utbyte 1,45 g (9s'%>; smp 150 - 1s2°c; specifik -q,s° (Ce= 1,23; DMF> o 0 0 Elgmentaranalys; Punnen C 60,54; H 6,H7; N 8,14 %. 0 0 c su;s1; H 6,53; N 8,25 %. 0 ¶ -13 så " _EšSEBâl_2_ _ 0 0 0 __ 00_Ti11 1,02 g0(i fim¿1)07~ bensylfL-glntamyleN8fkarbobensoxifL-lysyl~NÉ?karbobensoXi- Lflysyl)amino-4-metylkumarin sattes 5 mlíättiksyra och 573 f_mg (3 mmol)_toluensulfonsyramonohydrat, och den erhållna,, ¶blandningen omrördes under 2 h vid 2000. Ättiksyran av- -drevs, och en vid tillsats av 100 ml etyleter bildad fast 0substans utvanns genom.filtrering¿ Denna fasta substans .wa W löstes í_5iml0dimetylformamid, nentraliserades med 0;1H ml tríetylamin och försattes med 435 mg (1,2-mmol) t-butyl- 0 i! 'w :i ä? in 16 15; 20 25 30 35 ilN 8,14 %. 448 167 , , 11 oxikarbonyl-L-fenylalanin-N-hydroxisuccinimidester, och blandningen omrördes under 20 h vid 20oC. Den erhållna produkten koncentrerades och torkades till en fast sub- istans, som försattes med 100 ml etyleter för upptagning fav lösligt material. 100 ml vatten sattes till återstoden, -som sedan utvanns genom filtrering som kristaller. Dessa tvättades med 30 ml vatten och 50 ml etyleter. Sålunda er- hölls 7-(Na-t~butyloxikarbonyl-L-fenylalanyl-y-bensyl-L- "glutamyl=NE~karbobensoxi-L-lysyl~Ne-karbobensoxi-L-lysyl)~ _amino-4-metylkumarin.

Utbyte 1,03 g (88 %); smp 165 - 16800; specifik _vridning[§f7 = -8,40 (C = 1,72, DMF)..

. Elgmentaranalyszrïunnen C 65,72; H 6,00; N 8,20 %.

Beräknad för C6uH7501uN7: C 65,90; H 6,48; N 8,41 %.

ExemEel 10 ~ - _ 757 mg (1 mmol) 7-(Na-t-butyloxikarbonyl-y-bensyl- »L~glutamyl-NE-karbobensoxi+L-lysyl)amino-H-metylkumarin löstes i 20 ml metylalkohol, 5 ml ättiksyra och 5 ml vatten samt försattes med.80 mg 5-procentig palladium på kol. Blandningen omrördes under 3 h vid rumstemperatur 7 och atmosfärtryck under genomledning av väte. Katalysatorn avfiltrerades, och filtratet koncentrerades och torkades till en fast substans. 50 ml etyleter sattes till åter- stoden, och den därvid bildade fasta substansen utvanns genom filtrering och tvättades med 10 ml etyleter. Sålunda, erhölls 7-(Na-tebutyloxikarbonyl-L-glutamyl-L~lysyl)amino- - U4metylkumarin. utbyte soo mg (73 %>; smp. 1uo°c specifik vr1dning|§f7 = -ss,s° (c = 3,12, H20) Elementaranâlys: Funnen C 52,25; H 6,75; N 8,57 %.

Beräknad för c2sH36N,o82cH3c0oH-2H2o= c 52,31; H 7,02; jsxemgel 11 ess mg (0,7 mmcl) 7-(N“-f-bufy1oxikarbony1-L- 7fenylalanyl-y-bensyl-L-glutamyl-NE~karbobensoxi-L-lysyl)- amino-4-metylkumarin löstes i 20 ml metylalkohol, 5 ml., ättiksyra och 5 ml vatten samt försattes med 60 mg 5- procentig palladium på kol. Blandningen omrördes under oe44s1e7l - 12 _3 h vid rumstemperatur och atmosfärtryck under genomledning K: av väte- Katalysatorn avfiltrerades, och filtratet koncent- 10 15 20 25 30 35 0 N s,7u %; rerades och torkades till en fast substans. Återstoden ute _sattes för krdmatografi på silikagelspelare (lösningsmedels- »system kloroform-metylalkohol~ättiksyra i förh. B5:15;5 och lss=so=s, peiarens storlek 1,5 X 15 cm) för rening och kon- centrering aj huvudfraktionerna, Den återstående produkten Ülöstes genom tillsats av 15 ml ättiksyra och frystorkades, 'Sålunda-erhölls.7-(Na-t-hutyloxikarbonyl-L-fenylalanyl-Lä glutamyläL-lysylÄamino-4-metylkumarin. « 0 Utbyte 355 ng (53 %>; smp.í1§o°c (söndepfai1); specifik vridning[a 7 = -q1,e° (c = 0,335, so % DMP), _ Hj Elementaranalys:'Funnen C 55,87§ H 6,48; N 7,90 %.

Beräknad rör c35HHšN5og§acH3ço0H§H2o, c 55,83; H s,7u; N 7,9u_%. t _f _ _t se e _Exem2ei 12_”0 _ __. _ 609 mg (0,7'mmol) 7-(Na~t-Butyloxikarbonyl-L- isoleucyley-hensyl~Leglutamyl-NEfkarhobensoxi-L-lysyl)- amino-4-metylkumarin löstes i 20 ml metylalkohol, 5 ml ättiksyra och 5 ml ratten samt försattes med 60 mg 5- procentig palladium på kol. Blandningen omrördes under 3 h vid rumstemperatur och atmosfärtryck under genomledning av väte. Katalysatorn avfiltrerades, och filtratet koncentre- srades~och torkades till en fast substans. Återstoden ut? 'sattes för kromatografi på silikagel (lösningsmedelssystem 0kloroform-metylalkohol-ättiksyra i förh. 85:15:5 och. _85§30ÅS, pelarens storlek 1,5 x 15 cm) för rening, och huvudfraktionerna koncentrerades och torkades till en fast produkt. Den återstående substansen löstes genom till- sats av 15_ml ättiksyra och frystorkades. Sålunda erhölls 7-(Na-t-butyloxikarbónyl-L-isoleucylrL~glutamyl~L~lysyl)- amino-4-metylkumarin, Utbyte 350 mg (62 %); smp. 145°C '(sönderfall); specifik vridningläfj =.~U7,2° (C = 0,305, _50 %oDMP1; 0 D 0 Elementaranalys: Funnen C 53;70; H 7,13; N 8,50 %.

Beräknad för-c32Hn7N¿o9-2'cH3cooH-2 Hzoi c 53,92; H 7,42; 4,11 m) m; (h »kg 10 15 20 25' 448 157 _ _13 .EkemEel'13 0150 mg (0,2 mmol) 7-(Na-t-butyloxikarbonyl-L-valyl-_ L-leucyl-N8-karbobensoxi-L-lysyl)amino-H-metylkumarin löstes i 10 ml metylalkohol, 5 ml ättiksyra och 5 ml vatten samt försattes med 20 mg 5-procentig palladium på kol. Blandning- en omrördes under 3 h vid rumstemperatur och atmosfärtryck under genomledning av väte; Katalysatorn avfiltrerades, och filtratet koncentrerades till en fast substans. Återstoden utsattes för kromatografi på silikagel (lösningsmedels- system kloroform-metylalkoho1-ättíksyra i förh. 85:15:5 och 85:30:5, pelarens storlek 1,5 x 15 cm) för rening, och huvudfraktionerna uppsamlades och koncentrerades till ene fast substans. Produkten löstes i 10 ml ättiksyra och frys- torkades. Sålunda erhölls 7-(Na-t-butyloxikarbonyl-L-valyl- L-leucyl-L-lysyl)amíno-U-metylkumarín. I I 7 Utbyte 100 mg (65 %); smp. 160oC (sönderfal1); specifik vrianingßfl 7, = -79,s° (c = 1,03, H20).

Elementaranalys: funnen C 55,86; H 7,41; N 9,37 %.

Beräknad för C32H4gNšO7-2CH COOH ~ 2 H20: C 55,01; H.7,97; N 9,08 %u.- q i e Exemgel 11+ 200 mg (0,2 mmol) 7-(Na-t-butyloxikarbony1-y- 0bensyl-L-glutamyl-NE-karbobensoxi-L-lysyl-Ne-karbobensoxi- L-lysyl)amino-H-metylkumarin löstes i 10 ml metylalkohol, 5 ml ättiksyra och 1 ml vatten samt försattes med 20 mg 5- procentig palladium på kol. Blandningen omrördes under 3 h ' _vid rumstemperatur och atmosfärtryck under genomledning av ,3O 35 väte; Katalysatorn'avfiltrerades, och filtratet koncentre-.“ rades till en fast substans. Återstoden renades genom pelar- kromatografi på "LH-20 gel" tillverkat av Pharmacia Inc. (lösningsmedel 1-molar ättiksyra, pelarens storlek ,3,H x 135 cm). Huvudfraktionerna uppsamlades och koncent- rerades till en fast substans, som löstes i 10 ml vatten och frystorkades. Sålunda erhölls 7-(Na-t-butyloxikarbonyl- L-glutamyl-L-lysyl-L-lysylamino-4-metylkumarin.

Utbyte 110 mä (65 %)1 smp. 14000 (sönderfall); specifik vridning a 7 = -65,00 (C = 1,08, H O). ¿ 1 V 2 10 15 25 sd 35 >Beräknad_för c32H aN 9,86 %; ValanyleY-bensyl~L~glutamyl~NE-karbobensoxi-L-lysyl-NE-kar- Beräknad för CH1H Wšeàan varje provrör hade skakats 20 min vid 37oC, infördes ' ökningen av fluorescensen genom användning av en våglängd 448 då? ,l_f _ _ _ c c a"14' s c _Elementaranalys: Funnen C S0;92; H 6,97; N 9,88 %, 'u8N6Q¿<2çH3cooH-hinzoa c 50,69; H 7,57; -M g Éxempel löv _ , A i?34 mg (0,2 mmol) 7-Nmet-butyloxikarbonyl-Lffenvl- (35 bobensoxi~L+lysyl)amino~U-metylkumarin löstes i 10 ml ' metylalkohol, 5 ml.ättiksyra och 1_ml vatten samt försattes med 20 mg 5-procentig palladium på kol. Blandningen omrördes_ funder 3 h vid rumstemperatur och atmosfärtryck under genom- ledning av väte. Katalysatorn avfiltrerades; och filtratet koncentrerades till en fast substans. Den återstående prof _dukten renades genom pelarkromatografi på "LHf20 gel“' (lösningsmedel'I~molar ättíksyra,Vpelarens storlek 3,H Q 135 cm), och huvudfraktionerna uppsamlades och utsattes v¿för koncentrering till en fast substans. Denna löstes i l0' * ml och frystorkadess Sålunda erhölls 7-(Na-t4butyloxikar- abpnyl-L-fenylalanyl-L¥glutamyl~L~lysyl-L-lysyl)amino-H- 1 metylkumarin;._ I 'll ' l i 20. i _ V. specifik vridning[d?7 =~~49,2° (C = >Ufbyte izb mg <ß1g%);_smp. 1so°c (sönderfa11>; 3,31, H2o>.n Elementary-gnalys: Funnen C_55,30; H 7,06; N 9,99 %. 57N7O10'2CH3COOH'3H3O2 C 55,03; H 7,29; N 9,99 %, . - '1Nedan besnrivna försök visar, att peptidderivatet _enligt uppfinningen kan användas som fluorescent substrat för enzymer, 7 _ I I UQ1 - OQZ mmol substraï löstes i en blandning av 5 ml dimetylsulfoxid och 5 ml vatten, och den erhållna lösningen späddes till 500 ml med en buffertlösning (0,U5 M _tris-saltsyra; PH 8,0, innehållande b,1M Nacl och 1omM caclzf för framställning av substratlösningar. 2 ml av varje sub- 'istratlösning infördes i ett provrör och fick stå 5 min vid- í37oC. Sedan sattes 20 ul enzymlösning till varje provrör. *ëè 0,5 ml 100-procentig ättiksyra i varje provrör för avslut- ande av reaktionen. För varje sålunda erhållet prov mättes .(9 _. gf._\ 10 448 167 15 áv'Em460 mm àvzfluorescensspektfum (eficiterat vid 380 nm) *för bestämning av hydrolysgraden. Resultaten anges i nedan- esfiåenae ta5e11.' Plasmin umol/min Trypsin umol/min 'per mg Subetrat j ' 7 per mg protein protein i Boc-Phe-Glu-Lys-MCA- 2AcoH - H20 i 7 i 0 , 12 BocëI1e-G1u-Lys-McA-2AcoH-H20 12 0,11 7Boc-Phe-Glu-Lyš-Lys-MCA-2AcOH-3H20 2" " 0,23 Boc-Glu-Lys-Lys-MCA*2AcOH-4H2O 146 0,57 Boc-vai-Leu-Lys-McA-2AcoH-2H2o 6 0,54

Claims (1)

1. 44sd167 PATENT-KRAV' V' V 'Pepfiidderivatrayffoxmeln« - R-:Nn-cifl-coun _ ffflá 2 w N32 1 , där R betydeff en glutamyllysyl-, valjlleücyl-, fenylalanylqlutamyl-, iseleucylglutamyl-, ' eller fenylelanylglufiamyllysylgrupp, eller ett salt därav med en syra,_VarVid eventuellt Na-aminogruppen är skyddad med en tert{-butyloxikarbonylgrupp. 7 11' 7 .än