SE445887B - Forfarande for framstellning av ett stabilt, injicerbart, zinkhaltigt insulinpreparat av tvafastyp - Google Patents

Description

20 25 50 35 HO 7801163-2 2 asparagin- eller glutaminrest) i insulinmolekylen till motsvarande karboxyl- eller karboxylatgrupp.

Det är känt, att deamidering av insulin äger rum under hydro- lytiska betingelser, speciellt i sur lösning, vilket resulterar i bildning av desamidoinsuliner. Eftersom extraktion av insulin från bukspottkörtelns vävnader vanligen utföres under sura betingelser, är dess amidoinsuliner, speciellt monodesamidoinsuliner, normala för- oreningar, inte enbart i råinsulinfraktioner utan även i insulin er- hållet därav genom kristallisation. Även om insulin, såväl av gris- som av bovinursprung,innehåller totalt 6 karboxamidogrupper, vilket innebär att man skulle kunna för- vänta sig en komplex blandning av desamidoinsuliner, är hastigheten för syrahydrolysen av A-kedjans karboxylgrupp i ändställning i aspara- ginkarboxamidogruppen avsevärt mycket högre än hastigheten för de återstående amidogrupperna, vilket innebär att desamidoinsulinfrak- tionen till övervägande delen består av monodesamido-A21-insulin.

Enligt föreliggande uppfinning åstadkommes sålunda ett förfarande för framställning av ett stabilt, injicerbart, zink- haltigt insulinpreparat av tvåfastyp, vilket förfarande innebär att man blandar kristallint zinkinsulin, en från insulin härledd, vattenlöslig förening och vatten samt, om så erfordras, tillsät- ter ett zinksalt och inställer blandningens pH på ett värde inom området från 6 till 8, varvid det kristallina insulinet och den vattenlöslíga insulinföreningen härrör från samma djurart.

Det utmärkande för förfarandet är att man som den från insulin härledda, vattenlöslíga föreningen använder ett monodesamidoinsu- lin i en mängd motsvarande från 10 till 75 %, företrädesvis frän 20 till 50 %, av den totala insulinaktiviteten för det färdiga preparatet.

Enligt en speciell utföringsform av föreliggande uppfinning är såväl det kristallina insulinet som monodesamidoinsulinet av bovin- ursprung. Det har sålunda visat sig att, under de betingelser som råder vid framställningen av de ovan omtalade kända tvåfas-insulin- preparaten, bovin-monodesamidoinsulin uppvisar sådan grad av löslig- het att det kan ersätta det hittills använda grisinsulinet. Även om en deamidering av insulin sänker den isoelektriska punkten, kunde man inte förvänta sig att ökningen ifråga om löslighet skulle vara tillräckligt stor för att möjliggöra bildning av en stabil lösning inom ett pH-område av från 6 till 8. Det är också överraskande-att 10 15 20 25 30 M 7801165-2 tvåfaspreparatet uppvisar den stabilitet som erfordras för praktisk användning.

I detta avseende utgör föreliggande uppfinning ett väsentligt industriellt framsteg. Det är känt, att de kvantiteter av bovinbuk- spottkörtlar som finns tillgängliga för insulinframställning vida överstiger de kvantiteter grisbukspottkörtlar som finns tillgängliga för denna framställning. Med hjälp av föreliggande uppfinning kommer det att bli lättare att tillfredsställa det ökande behovet av två- fas-insulinpreparat av det angivna slaget.

Enligt en andra konkret utföringsform av föreliggande uppfin- ning är såväl det kristallina insulinet som monodesamidoinsulinet av grisursprung.

Det har sålunda även befunnits, att grismonodesamidoinsulin förblir i lösning i närvaro av zinkjoner vid avsevärt mycket högre koncentration än grisinsulin i sig självt. Denna överraskande egen- skap gör det möjligt att framställa stabila, injicerbara insulinpre- parat av tvåfastyp, vari de suspenderade kristallerna är grisinsulin- kristaller, som förblir i suspension på grund av den ökade zinkjon- halten. Man kunde icke förvänta sig, att ett sådant preparat skulle ha den stabilitet som erfordras för praktisk användning.

Ovannämnda specifika utföringsformer av föreliggande uppfin- ning öppnar tillsammans nya vägar för framställning av injioerbara insulinpreparat av tvåfastyp och av ett enda slags insulin. Det har antagits, att grisinsulin och bovininsulin ingående i de kända insu- linpreparaten ger upphov till bildning av olika insulinantikroppar och att av immunologiska skäl preparat med insulin av ett enda slag skulle ge den fördelen att erbjuda möjlighet till övergång från ett slag av insulin till ett annat. Genom föreliggande uppfinning har det blivit möjligt att framställa injicerbara insulinpreparat av tvåfas- typ där insulinbeståndsdelarna, såväl i lösning som i suspension, är av ett och samma slag, företrädesvis nötkreatur eller gris.

Det är känt, att kommersiellt kristallint insulin innehåller föroreningar och att dessa föroreningar kan avlägsnas i sådan omfatt- ning att det renade insulinet uppträder i form av en enda topp vid gelfiltreringsanalys (se t.ex. Diabetes, vol. 21 (1972) sid 657-60).

I fortsättningen kommer insulin uppvisande sådan grad av renhet att benämnas: "högrent insulin". På motsvarande sätt kommerinsulin, som uppfyller det ytterligare kravet att uppvisa i huvudsak en enda kompo- nent vid analys medelst diskontinuerlig polyakrylamidgelelektrofores \J'l 10 15 20 25 30 40 7801163-2 H (DISC PAGE), att benämnas: "enkomponentínsulin" (se t.ex. den brit- tiska patentskriften l 285 025). Suspensioner av kristallint insulin bestående av högrent insulin respektive enkomponentínsulin är före- dragna utföringsformer av föreliggande uppfinning.

Såsom omtalats ovan, har monodesamidoinsulin detekterats som en förorening i råinsulin eller kristallint insulin, t.ex. genom att man _ har utsatt sådana kvaliteter av insulin för analytisk jonbyteskroma~ tografi (se t.ex.: J. Biol. Chemistry, vol. 235 (1960), sid 2294-2299; Diabetes, vol. 21 (1972), sid 463). På motsvarande sätt har det varit möjligt att identifiera monodesamidoinsulin, och speciellt monodes- amido-Agl-insulin, som en beståndsdel i partiellt hydrolyserat insu- lin erhållet under noggrant reglerade betingelser vad beträffar syra- stynæu temperatur, varaktighet av hydrolysen, etc. (se t.ex. J. Biol.

Chemistry, vol. 237 (1962), sid 5406-3411). Ingen av dessa skrifter avslöjar emellertid i verkligheten isolering av monodesamidoinsulin.

För framställning av väsentliga mängder av monodesamidoinsulin för syftet enligt föreliggande uppfinning utsattes partiellt hydro- lyserat råinsulin eller kommersiellt insulin, företrädesvis framställt under noggrant kontrollerade sura betingelser, för fraktionering ge- nom jonbyteskromatografi, företrädesvis på en anjonbytare. Eluerade fraktioner motsvarande den centrala delen av monodesamidoinsulintoppen uppsamlades. Utvinning av monodesamidoinsulinet kan åstadkommas genom utfällning, t.ex. som ett något lösligt zinkkomplex ur en lösning vid ett pH inom det neutrala området, följt av avsaltning av det åter- upplösta monodesamidoinsulinet, t.ex. genom gelfiltrering, samt slut- ligen utvinning av monodesamidoinsulin från den avsaltade lösningen.

Utgående från enkomponentínsulin erhölls på detta sätt i huvudsak rent monodesamido-A2l~insulin.

Alternativt kan monodesamidoinsulin utvinnas under framställ- ningen av enkomponentinsulinet såsom beskrivs i den brittiska patent- skriften l 285 024. Fraktionen motsvarande monodesamidoinsulintoppen kan uppsamlas och det däri ingående monodesamidoinsulinet utvinnas och användas för syftet enligt föreliggande uppfinning. Det är lämp- ligt att monodesamidoinsulinet använt för syftet enligt föreliggande uppfinning uppvisar sådan renhet att gelfiltrering därav resulterar i en enda topp och att diskontinuerlig polyakrylamidgelelektrofores ger i huvudsak ett enda band.

Den använda mängden monodesamidoinsulin beror på den önskade 10 15 25 50 55 40 7801163~2 graden av snabbt begynnande insulinverkan. Dock utgör aktiviteten av monodesamidoinsulinet, såsom omtalas ovan, från 10 till 75, företrädesvis från 20 till 50 procent av preparatets totala insulin- aktivitet, varvid aktiviteten är uttryckt i internationella enheter (inšv).

Monodesamidoinsulinlösningens pH-värde bör ligga inom området från 6 till 8, företrädesvis från 6,5 till 7,5.

Lösligheten hos insulin respektive monodesamidoinsulin och följaktligen den fysikaliska stabiliteten hos tvåfaspreparaten enligt föreliggande uppfinning är relaterad till den fria zinkjonkoncentra- tionen hos preparatets vätskefas. Därför bör man lämpligen undvika tillsats av hjälpsubstanser som stör tillgängligheten av fria zink- joner, såsom komplexbildande medel och/eller utfällningsmedel för zink. Under dessa betingelser väljes den totala zinkjonhaten för ett bovininsulinpreparat vid pH 7 inom området från 0,25 X l0_2 X A till 1o'2 X A, företrädesvis från o,45 X 1o'2 X A till 0,85 X 1o'2 X A, mikromol per ml, varvid A anger det totala antalet internationella enheter (i.e.) insulin per ml av preparatet.

I fallet grisinsulinpreparat är respektive områden från 0,7 X 2 2 X A och från 1o'2 X A till 1,3 X 1o'¿ X A io' X A till 1,5 X 10" mikromol zinkjon per ml.

Det är underförstått att, om preparatet innehåller hjälpsub- stanser som binder zinkjoner och/eller om preparatets pH-värde är väsentligt mycket högre än 7,0, preparatets totala zinkhalt måste ökas i motsvarande grad. För ytterligare vägledning i detta avseende hänvisas till den brittiska patentskriften 840 870.

En steril suspension av kristallint, företrädesvis högrent eller enkomponent-, insulin, varvid mängden insulin beräknades för fram- ställning av en slutlig suspension med förutbestämd aktivitet, t.ex. 40, 80 eller 100 i.e. per ml, framställdes i en vattenbaserad lös- ning innehållande ett konserveringsmedel, t.ex. metylparaben, ett buffrande medel, t.ex. natriumacetat, och ett fysiologiskt acceptabelt salt, t.ex. natriumklorid, för att göra lösningen isotonisk. Suspen- sionens zinkhalt justerades till det önskade värdet genom tillsats av en lösning av ett zinksalt, t.ex. zinkklorid. pH-värdet justera- des till ett värde inom området från 6 till 8, företrädesvis ca 7, varefter suspensionen späddes till slutgiltig volym.

Separat framställdes en steril lösning av monodesamidoinsulin med förutbestämd insulinaktivitet, t.ex. 40, 50 eller 100 i.e. per KT! 20 BO 55 H0 7so11s5~2 6 i ml, genom upplösning av den beräknade mängden monodesamidoinsulin _ vatten tillsammans med konserveringsmedel, buffrande medel och fysio~ logiskt acceptabelt salt för åstadkommande av en isotonisk lösning, varvid man i samtliga fall använde samma beståndsdelar som vid fram- ställning av insulinsuspensionen. Eventuellt kan den totala mängden zinksalt som erfordras för det slutgiltiga preparatet uppdelas mel- lan insulinsuspensionen och monodesamidoinsulinlösningen. pH justera- des till ett värde inom området från 6 till 8, företrädesvis ca 7, följt av en justering av lösningens slutgiltiga volym.

Provvolymer av insulinsuspensionen och monodesamidoinsulin- lösningen kombinerades därefter, varvid volymförhållandet bestämdes av den procentuella monodesamidoinsulinaktivitet som önskades i det slutliga tvåfaspreparatet.

Föreliggande uppfinning illustreras ytterligare genom följande exempel, vilka emellertid icke är avsedda att begränsa uppfinningens omfattning.

I exemplen steriliserades vattenbaserade lösningar och vatten, de förstnämnda genom filtrering, och den efterföljande hanteringen utfördes under aseptiska betingelser.

Framställning av monodesamidoinsulin.

Exempel l Från kristallint grisinsulin Grisinsulin (0,5 g râinsulin, kristalliserat ur citratbuffert) löstes i vatten innehållande saltsyra (5 ml av en 0,2 N lösning).

Vatten tillsattes till en total volym av 50 ml. Lösningen (pH 2,02) steriliserades genom filtrering och lämnades därefter att stå vid rumstemperatur (2500) i 50 dagar.

En blandning av insulin och monodesamidoinsulin utfälldes genom tillsats av en vattenbaserad lösning innehållande zinkjoner (0,5 ml av ett M zinkacetat) följt av en justering av pH-värdet till 5,5.

Fällningen (innehållande ca 50 procent monodesamidoinsulin en- ligt "DISC PAGE"-analys) löstes i vatten innehållande EDTA (50 mg av dinatriumsaltet), etanol (20 ml 607-ig, vol/vol) och natriumklorid (0,08 g), varvid tris(hydroximetyl)aminoetan tillsattes för justering av pH-värdet till 8,4. En olöslig återstod avlägsnades genom centri- fugering.

Supernatanten anbringades på en 2,5 cm x 50 om kolonn inne- hållande "QAE-Sephadex A-25" bringad i jämvikt med en buffert av följande sammansättning: 10 20 30 b] kfi 40 7 7801163-2 Tris(nydroximetyl)aminoetan (l2l,l g) Natriumklorid (6l,56 g) Saltsyra (50 ml 6 N) Etanol (6,24 liter 96%-ig, vol/vol), utspädd med vatten till en total volym av l0 liter. Buffertens pH- -värde var 8,6.

Eluering utfördes med samma buffert vid 2500, och fraktioner (vardera på 4,9 ml) uppsamlades vid en elueringshastighet av 50 ml per timme. Eluatets OD-värde registrerades vid 276 nm.

Fraktioner av den centrala delen av den andra stora toppen upp- samlades, och monodesamidoinsulinet utfälldes genom tillsats av en lika stor volym av en vattenbaserad lösning av zinkacetat (0,0l M, pH 6,6) och utvanns därefter genom centrifugering.

Fällningen, upplöst i en vattenlösning av ättiksyra (5 ml av en l M lösning), avsaltades på en kolonn (2,5 om x 40 cm) av "SEPHADEX G 10". Eluering med en vattenlösning av ättiksyra (ett M lösning) med en hastighet av 0,6 ml per minut följdes av en registre- ring av 0D-värdet vid 276 nm. Fraktioner motsvarande huvudtoppen uppsamlades, indunstades och frystorkades till bildning av monodes- amidoinsulin (140 mg).

Exempel 2 Från kristallint bovininsulin.

Bovininsulin (0,5 g råinsulin, kristalliserat ur citratbuffert) löstes i vatten innehållande saltsyra (5 ml 0,2 N lösning). Vatten tillsattes till en total volym av 50 ml. Lösningen (pH 2,09) sterili- serades genom filtrering och lämnades därefter att stå vid rumstem- peratur (25OC) i 30 dagar.

Monodesamidoinsulin utvanns genom en procedur identisk med den från Exempel 1. Utbytet av monodesamidoinsulin var 147 mg.

Exempel § Från enkomponent-grisinsulin.

Grisinsulin av enkomponenttyp (40 g) löstes i vatten innehål- lande saltsyra (30 ml 2 N lösning). Vatten tillsattes till en total volym av 2000 ml. Lösningen (pH 2,08) steriliserades genom filtre- ring och lämnades därefter att stå vid rumstemperatur (2500) i 45 da- gar.

Utfällning av insulin och monodesamidoinsulin âstadkoms genom tillsats av en vattenbaserad lösning innehållande zinkjoner (20 ml av 10 15 20 25 50 55 78Û¶ 163-2 ett M zinkacetat) följt av en justering av pH~värdet till 5,5.

Monodesamidoinsulin separerades från de övriga komponenterna genom jonbyteskromatografi på en 15 cm x Ä0 cm kolonn av "QAE- -SEPHADEX A-25" och utvanns genom utfällning med zinkacetat följt av avsaltning, varvid man använde sig av procedurer analoga med de från Exempel l. Utbytet av gris-monodesamido~A2l-insulin var 19,8 g.

Exemnel 4 Från enkomponent-bovininsulin.

Bovininsulin av enkomponenttyp (25 g) löstes i vatten innehål- lande saltsyra (25 ml 2 N lösning) följt av justering av volymen till 2500 ml med vatten. Lösningen (pH 2,09) steriliserades genom filtre- ring och lämnades därefter att stå vid rumstemperatur (2500) i 50 da- gar.

Blandningen av insulin och monodesamidoinsulin utfälldes genom tillsats av en vattenbaserad lösning innehållande zinkjoner (25 ml 'ett M zinkacetat) följt av en justering av pH-värdet till 5,5.

Fraktionering utfördes på en 10 cm x 42 om kolonn innehållande "QAE-SEPHADEX A-25" bringad i jämvikt med en buffert med en .samman- sättning identisk med den från Exempel l. Fraktioner (vardera på 250 ml) uppsamlades vid en elueringshastighet av 550 ml per timme.

Eluatets OD-värde registrerades vid 276 nm.

Fraktioner av den centrala delen av den andra stora toppen uppsamlades, och monodesamidoinsulinet utfälldes genom tillsats av zinkacetat följt av avsaltning under användning av samma procedur som i Exempel l.

Utbytet av bovin-monodesamido-A21-insulin var 10,8 g.

Exempel 5 Isolering av monodesamidoinsulin under framställning av enkom- ponentínsulin från kristallint insulin.

Monodesamidoinsulin, som erhålles tillsammans med insulin vid gelfiltrering, separeras från sistnämnda substans genom anjonbytes- kromatografi (jämför den brittiska patentskriften l 285 025). Frak- tioner motsvarande den centrala delen av monodesamidoinsulintoppen på anjonbyteskromatogrammet uppsamlades, varpå monodesamidoinsulinet utfälldes genom tillsats av zinkacetat och utvanns på ett sätt ana- logt med de enligt de föregående exemplen. io 20 50 35 40 9 7801163-2 Insulinpreparat av tvåfastvp.

Exemgel 6 Tvàfasprenarat av bovin-enkomoonentinsulin och löst bovin- -monodesamidoinsulin (20% av total aktivitet) innehållande 0,18 mikromolzink per ml.

A 1. Bovin-enkomponentinsulin-kristallsuspension. (a) Kristallint enkomponent~bovininsu1in (l,45 g) innehållande 0,4% Zn och med aktivitet av 40.000 i.e. löstes i vatten innehållande zinkklorid (602 mikroliter av en 1%-ig vattenlösning, beräknat som Zn++) genom tillsats av saltsyra (750 mikroliter av 2 N).

Vatten tillsattes till en totalvolym av 50 ml. (b) Den sålunda framställda insulinlösningen sattes till en vatten- baserad lösning av natriumacetat (l,56 g), natriumklorid (7,0 g) och en vattenlösning av natriumhydroxid (275 mikroliter av 2 N), utspädd till en totalvolym av 50 ml. _ (c) Den erhållna blandningen innehållande amorft insulin (lOO ml) med pH 5,48 bringades att kristallisera såsom beskrivs i den brit- tiska patentskriften 766 995 genom ympning med en vattenbaserad sus- pension (l ml) av mikrokristallint insulin med en medeldiameter av ca l um och framställt såsom beskrivs i den brittiska patentskrif- ten 766 994.

A 2. Framställning av enkomponentinsulin-kristallsuspensioni 40 i.e. per ml.

Till en lösning av metylparaben (575 mg) i vatten (280 ml) sattes saltsyra (ÄYO mikroliter av 0,2 N) tillsammans med en prov- mängd (57,5 ml) av suspension A l. Den erhållna suspensionen, som hade ett pH-värde av 5,52, lämnades att stå i ca 2 timmar, varefter en lösning av natriumhydroxid (575 míkroliter av 2 N) i vatten (50 ml) tillsattes långsamt under omröring. Efter en justering av totalvoly- men med vatten till 575 ml innehöll den erhållna suspensionen av bovininsulinkristaller 40 i.e. insulin per ml. Suspensionens pH~värde en total var 7,1.

B 1. Framställning av bovin-monodesamidoinsulinlösning.

Bovin-monodesamido-A21-insulin (200 mg), framställt enligt Exempel 4 och med en total aktivitet av 5000 i.e., löstes i vatten innehållande zinkklorid (150 mikroliter av en 1%-ig lösning, räknat som Zn++) och saltsyra (l,55 ml av 0,2 N). Totalvolymen justerades till 10 ml.

B 2. Framställnng av monodesamidoinsulinlösning, 40 i.e. per ml.

Till en lösning av metylparaben (150 mg) i vatten (75 ml) sattes natriumacetat (170 mg), natriumklorid (375 mg) och en vattenlösning 10 15 20 25 BO 35 40 7sa¶165-2 10 av natriumhydroxid (2,1 ml av 0,2 N) följt av lösning B l. Total- volymen justerades till 125 ml genom tillsats av vatten, vilket gav en lösning av monodesamidoinsulin med ett pH av 7,1 och innehållande 40 i.e. per ml.

C. Injicerbart insulinpreparat av tvåfastyn.

Ett preparat med pH 7,1 framställdes genom blandning av en prev- mängd (80 ml) av suspension A 2 med en provmängd (20 ml) av monodes- amidoinsulinlösning B 2. Preparatet överfördes till steriliserade ampuller.

Exempel I Tvåfaspreparat av högrent bovininsulin ooh löst bovin-monodes- amidoinsulin (20% av total aktivitet). innehållande 0.26 mikro- mbl zink per ml.

A l. Högrent bovininsulin-kristallsuspension.

Förfarandet var analogt med det från Exempel 6 med undantag av att följande mängder användes av materialen: (a) Kristallint, högrent bovininsulin (620 mg, total aktivitet 16.000 i.e.) innehållande 0,57 procent zink.

Vattenbaserad zinkkloridlösning (2,5 ml av en 0,107 procentig lösning, räknat som Zn++) Saltsyra (2,85 ml av 0,2 N) Vatten upp till 2 ml. (b) Natriumacetat (544 mg) Natriumklorid (2,8 g) Vattenlösning av natriumhydroxid (1,1 ml av 0,2 N) Vatten upp till 15 ml. pH-värdet var 5,45. (c) Den vattenbaserade suspensionen ympades och lämnades därefter i 24 timmar för att kristallisera vid rumstemperatur.

A 2. Framställning av insulinkristallsuspension, 40 i.e.

Till en lösning av metylparaben (400 mg) i vatten (500 ml) sat- tes en vattenlösning av zinkacetat (103 mikroliter av en M lösning) tillsammans med totalvolymen av insulinkristallsuspensionen A l. Ben erhållna suspensionen (pH 5,56) lämnades att stå i 2 timmar, varefter en lösning av natriumhydroxid (400 mikroliter av 2 N) i vatten (50 ml) långsamt tillsattes under omröring. Den erhållna suspensionens pH-värde justerades till 7,03 genom tillsats av saltsyra (225 mikroliter av 0,2 N) och volymen inställdes på totalt 400 ml med vatten.

B l. Framställning av bovin-monodesamidoinsulinlösning.

Bovin-monodesamidoinsulin, framställt enligt Exempel 2 (240 mg, total aktivitet 5600 i.e.), löstes i vatten innehållande saltsyra (280 mikroliter av 0,2 N). Totalvolymen justerades till 20 ml. ner ml. lO 15 20 25 ÉO 35 40 78Û1163~2 ll B 2. Framställning av bovin-nmnodesamidoinsulinlösning, 40 i.e, per ml.

Till en lösning av metylparaben (140 mg) i vatten (105 ml) sattes natriumacetat (l90,4 mg), natriumklorid (980 mg) och en vatten- lösning av natriumhydroxid (235 mikroliter av 2 N) följt av lösning B l. pH-värdet justerades till 6,99 med en vattenlösning av natrium- hydroxid (50 mikroliter av 0,2 N) och totalvolymen till 140 ml, vilket sålunda gav en lösning av bovin-monodesamidoinsulin innehållande 40 i.e. per ml. ' C. Injicerbart insulinpreparat av tvåfastyp.

Ett preparat med pH 7,01 framställdes genom blandning av sus- pension A 2 (395 ml) med lösning B 2 (l3l,7 ml). Preparatet överfördes till sterila ampuller.

Exemgel 8 Tvåfaspreparat av gris-enkomponentinsulin och löst gris-mono- desamidoinsulin (lO% av total aktivitet). innehållande 0,55 mikromol zink ger ml.

A l. Gris-enkomponentinsulinkristallsuspension.

Förfarandet var analogt med det från Exempel 6 med undantag av att följande mängder av material användes: (a) Kristallint gris-enkomponentinsulin (l,49j g, total aktivitet 40.000 i.e.) innehållande 0,37 procent zink.

Vattenlösning av zinkklorid (650 mikroliter av en 1,02 procentig lösning, räknat som Zn++) Saltsyra (710 mikroliter av 2 N) Vatten upp till 60 ml. (b) Natriumacetat (l,56 g) Natriumklorid (7,00 g) Vattenlösning av natriumhydroxid (275 mikroliter av 2 N) Vatten upp till 40 ml. pH-värdet var 5,49. (0) Den vattenbaserade suspensionen ympades och lämnades därefter att stå i 24 timmar för att kristallisera vid rumstemperatur.

A 2. Framställning av insulinkristallsuspension, 40 i.e. per ml.

Till en lösning av metylparaben (400 mg) i vatten (500 ml) sattes en lösning av vattenbaserat zinkacetat (168 mikroliter av en ett M lösning) tillsammans med en provmängd (Ä0 ml) av insulinkristall- suspension A l. Den erhållna suspensionen (pH 5,62) lämnades att stå i 2 timmar, varefter en vattenlösning av natriumhydroxid (575 mikro- liter av 2 N) i vatten (50 ml) långsamt tillsattes under omröring.

Den bildade suspensionens pH-värde justerades till 7,02 genom tillsats lO 15 20 25 50 55 40 ”ïåülléš-Q 12 av saltsyra (225 mikroliter av 0,2 N) och volymen inställdes på totalt 400 ml med vatten.

B. Framställning av gris-monodesamidoinsulinlösning_ 40 i.e. per ml.

Gris-monodesamido-A21-insulin framställt enligt Exempel 5 (86,7 mg, total aktivitet 2000 i.e.) löstes i vatten (10 ml) till bildning av lösning B l.

Till en lösning av metylparaben (50 mg) i vatten (55 ml) sattes natriumacetat (68 mg), natriumklorid (550 mg) och en vattenlösning av natriumhydroxid (840 mikroliter av 0,2 N), följt av lösning B l. pH-värdet justerades till 6,98 och totalvolymen till 50 ml, vilket sålunda gav en lösning av gris-monodesamidoinsulin innehållande 40 i.e. per ml.

C. Injicerbart insulinpreparat av tvåfastyp.

.Ett preparat med pH-värdet 7,01 framställdes genom blandning av suspension A 2 (595 ml) med lösning B 2 (44 ml). Preparatet över- fördes till sterila ampuller.

Exempel 2 Tvåfaspreparat av gris-enkomponentinsulin och löst gris-monc- desamidoinsulin (28 procent av total aktivitet) innehållande 0,5 mikromol zink per ml. g_l¿ Grisinsulinkristallsuspensionen A l från Exempel 8 an- vändes för detta preparat.

A 2.

Till en lösning av metylparaben (400 mg) i vatten (500 ml) sat- tes en vattenbaserad lösning av zinkacetat (92 mikroliter av en ett M lösning) tillsammans med en provmängd (40 ml) av insulinkristall- suspension A l från Exempel 8. Den erhållna suspensionen (pH 5,61) lämnades att stå i 2 timmar, varefter en vattenlösning av natrium- hydroxid (575 mikroliter av 2 N) i vatten (50 ml) långsamt tillsattes under omröring. Den erhållna suspensionens pH-värde var 7,05. Volymen inställdes på totalt 400 ml med vatten. En provmängd av denna sus- pension (200 ml) justerades till pH 6,64 genom tillsats av saltsyra (200 mikroliter av 0,2 N).

B. Framställning av gris-monodesamidoinsulinlösning. 40 i.e. per ml.

Gris-monodesamido-A21-insulin framställt enligt Exempel 5 (277,5 mg, total aktivitet 6400 i.e.) löstes i vatten (25 ml) till bildning av lösning B 1.

Till en lösning av metylparaben (160 mg) i vatten (150 ml) sattes natriumacetat (2l7,6 mg), natriumklorid (ll20 mg) och natrium- Framställning av insulinkristallsuspension, 40 i.e. per ml. 1: 7801163-2 hydroxídlösning (2,688 ml av 0,2 N), följt av lösning B 1 till bild- ning av lösning B. pH-värdet sänktes från 7,30 till 6,60 med 0,2 N saltsyra, och volymen inställdes på totalt 160 ml med vatten. _C_._ 'tt preparat med pH-värde 6,61 framställdes genom bland- ning av suspension A 2 (pH 6,61%, 195 ml) med en provmängd (75 ml) av lösning B. Preparatet överfördes till sterila ampuller. w-w-M- -

Claims (8)

7801165°~2 ru PATENTKRAV

1. Förfarande för framställning av ett stabilt, injicer- bart, zínkhaltigt insulinpreparat av tvåfastvp. varvid man blan- dar kristallint zinkinsulin, en från insulin härledd, vattenlös- lig förening och vatten samt, om så erfordras, tillsätter ett zínksalt och inställer blandningens pH på ett värde inom området från 6 till 8, varvid det kristallina insulinet och den vattenlös- liga insulinföreningen härrör från samma djurart, k ä n n e t e e k- n a t av att man som den från insulin härledda, vattenlösliga föreningen använder ett monodesamidoinsulín i en mängd motsvarande från 10 till 75%, företrädesvis från 20 till 50%, av den totala insulinaktiviteten för det färdiga preparatet.

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att det kristallina zinkinsulinet är högrent insulin.

3. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att det kristallina zinkinsulinet är enkomponentinsulin.

4. Förfarande enligt något av de föregående kraven, k ä n - n e t e c k n a t av att monodesamídoínsulinet är monodesamido- A21-insulin.

5. Förfarande enligt något av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t av att det kristallina zinkinsulinet och monodesamidoínsulinet båda är av bovinursprung.

6. Förfarande enligt något av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t av att det krístallína zínkinsulinet och monodesamidoinsulinet båda är av grisursprung.

7. Förfarande enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a t av att preparatets totala zinkhalt vid pH 7 justeras till från 0,0025 X A till 0,01 X A, företrädesvis från 0,0045 X A till 0,0085 X A, /umol per ml preparat, varvid A är det totala anta- let internationella insulinenheter per ml preparat.

8. Förfarande enligt krav 6, k ä n n e t e c k n a t av att preparatets totala zinkhalt vid pH 7 justeras till från 0,007 x A till 0,015 x A, företrädesvis från 0,01 x A till 0,013 x A, /umol per ml preparat, varvid A är det totala antalet internationella ínsulinenheter per ml preparat. ...vi h.