SE445146B - Forfarande, apparat och automatiserat system att bestemma hematokriten i ett helblodprov - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 7902734-8 2 analys. Föreliggande uppfinning beskriver även korrek- tionen för hematokriteffekter vid användning av diffu- sionmetoder för genomförande av analyser.

Uppfinningen belyser vidare hur en analyt kan bestämmas direkt av plasmat av ett helblodprov, som diffunderat in i en gel eller ett annat poröst medium genom observation av två färgändringar i det porösa mediet: (1) färgändringen på grund av en utåtriktad diffusion av färg från mediet som funktion av blod- provets hematokrit, och (2) färgändringen på grund av reaktion av en analyt i plasmat av provet med ett reagens, som befinner sig i det porösa mediet.

Föreliggande uppfinning avser ett förfarande och en apparat för analys av helblodprov utan behov av föregående separation av proven i cell- och plasmabe- ståndsdelar. 7 En gel eller ett annat poröst medium användes för erhållande av en exakt alikvot av plasma från ett helblodprov medelst diffusionsteknik. Helblodprovet pla- ceras på en föreskriven ytarea av mediet och plasmat får diffundera in i mediet under en reglerad tidperiod.

Om helblodprovet endast bestod av plasma skulle en konstant alikvot av plasmat befinna sig i mediet vid slutet av denna reglerade tidperiod, såsom beskrivs i den amerikanska patentansökningen 922 611.

Eftersom röda blodkroppar emellertid finns när- varande i helblodprov är plasnatsdiffusion något hindrad.

Eftersom några av de röda blodkropparna täcker en del av mediets föreskrivna ytarea, är ytarean effektivt reducerad, varvid medeldiffusionsväglängden för lösta molekyler till gelytan är större och diffusionshastig- heten för i plasmat lösa ämnen är reducerad. Effekten på diffusionshastigheten av plasmakomponenterna från olika helblodprov kommer att variera, eftersom an- delen, som består av blodkroppar, varierar mellan olika prov. Konstanta alikvoter av plasma kan inte erhållas på grund av variationer i hematokrit i dessa prov. 10 15 25 30 35 7902734-s 3 Uppfinningen belyser användningen av en korrek- tionsfaktor för hematokritvariationerna för exakt be- stämning av plasmaalikvoten, som díffunderat in i ett gelmedium. Denna korrektionsfaktor kan erhållas på flera sätt: (a) hematokriten kan först bestämmas i en separat gel och en korrektionsfaktor sedan beräknas på analyser utförda i andra gelmedia med användning av olika delar av helblodprovet, eller (b) reaktionen av en analyt i plasmat av helblodet med ett reagens i gel- mediet kan bestämmas direkt genom mätning av två färg- ändringar: (1) den som härrör från analyt-reagens reak- tionen; och (2) den som härrör från minskningen av färg i mediet som funktion av hematokrít i helblodprovet, vilket beskrives utförligare i det följande.

I Sättet att man inför en (a) bestämmes hematokriteffekten genom inert indikator i ett separat poröst medium, som inte innehåller nägra andra reagens. Denna inerta indikator kan vara en färgad molekyl, till exempel vitamin B-12 (cyanokobalamin), som inte signifikant rea- gerar med helblodprovet. Det är känt, att substanser i det porösa mediet diffunderar utåt därifrån när plasmat diffunderar in i mediet från helblodprovet. Blodkropp- arna kommer att blockera diffusion av utträdande inert färg på liknande sätt som i plasma lösta ämnen hindras från att tränga in i mediet. Försök har visat, att diffu- sionen av färgen från gelen eller något annat poröst medium är_proportionell mot hastigheten, vid vilken i plasma lösta ämnen diffunderar in i gelen. Dessutom har man funnit, att diffusionen av färgen är omvänt propor- tionell mot blodprovets hematokrit. För dessa försök kan en korrektionsfaktor baserad på förlust av färgen från mediet bestämmas. Denna korrektionsfaktor tillåter be- räkning av halten av en, vilken som helst, viss i plasmat närvarande analyt. Dessutom har man visat, att hematokritbestämningen med användning av diffusions- teknik är jämförbar med hematokritbestämningen med standardtekniker för centrifugering (separation). 10 15 20 _25 30 35 79-02734-8 4 Det är mycket viktigt, att färgen i gelen eller ett annat poröst medium inte reagerar med någon del av helblodprovet, d.v.s. varken i plasma lösta ämnen eller blodkroppar. Detta beror på att varje reaktion, klump- bildning eller koagulering i blodprovet kan inverka på diffusionshastigheten och sålunda påverka korrek- tionsfaktorn.

I sättet (b) genomföres optiska mätningar sam- tidigt för bestämning av reaktionsprodukten av en analyt i mediet och förlust av färg från samma medium. Detta förutsätter att färgändringen på grund av förlusten av _färg från mediet på intet sätt stör färgändringen, som .beror på analytens reaktion.

I detta förfarande göres en direkt analys på analyten genom mätning av bägge färgändringar i samma medium. Färgämnets färg och reaktionsfärgen bör inte interferera med varandra inom respektive färgändrings- områden.

Föreliggande apparat kan i korthet sammanfattas så att den innefattar ett poröst medium med en före- skriven ytarea, på vilken en kvantitet.helblod placeras.

En inert substans är anbringad i mediet för diffusion utåt från mediet när helblodprovet placeras på den före- skrivna ytarean för diffusion in i mediet. Den inerta substansen är inert med avseende på helblodprovet, d.v.s. både de i plasma lösliga ämnena och blodkropparna.

Föreliggande förfarande kan i korthet samman- fattas med att den innefattar att man (a) bringar en yta av ett medium innehållande en inert substans i kon- takt med ett helblodprov; (b) bringar minst en del av i plasma lösta ämnen av helblodprovet att diffundera in i mediet; och (c) bringar minst en del av den inerta substansen från mediets inre att diffundera genom ytan, som är i kontakt med helblodet. Mängden diffunderad inert substans från mediet är ett mätt på hematokrit- värdet i helblodprovet. 10 20 25 30 7992734-8 5 Det är ett föremål för föreliggande uppfinning att tillhandahålla ett förfarandet och en apparat för analys av helblod utan föregående separation av hel- blodet í dess beståndsdelar.

Det är ett annat föremål för föreliggande upp- finning att tillhandahålla ett förfarande och en appa- rat för genomförande av helblodanalys med användning gav diffusionsteknik.

Det är ytterligare föremål för föreliggande uppfinning att tillhandahålla ett förfarande och en apparat för analys av helblodprov med användning av gel- diffusionsteknik.

Det är ännu ett annat föremål för föreliggande uppfinning att tillhandahålla ett förfarande och en apparat för att bestämma hematokrit och korrigera för dess effekter för att erhålla exakta analyser av hel- blodprov.

Det är ännu ett annat föremål för föreliggande uppfinning att tillhandahålla en hematokrit-korrektions- faktor för helblodanalys, som inbegriper diffusionstek- nik för erhållande av alikvoter av blodplasmat i poröst medium. .

Dessa och andra föremål av föreliggande upp- finning framgår tydligare och förstås bättre av den följande detaljerade beskrivningen och de medföljande ritningarna, på vilka: fig. 1 är en perspektivvy av en utföringsform av föreliggande uppfinning; fig. 2 är ett tvärsnitt av fig. 1, tagen utmed linjen 2 - 2 med en droppe av ett helblodprov på plats, fig. 3 är en perspektivvy av en annan utförings- form av föreliggande uppfinning med ett böjligt täck- ark över en del av kaviteten, som skall fyllas; fig. H är en pcrspektivvy såsom i fig. 3 med en transparent tejp, som stänger till hela kavitetcn, som har fyllts med ett en inert substans innehållande poröst medium; 7902734-8- 6 fig. 5 är en perspektivvy såsom i fig. 3 och H med den transparenta tejpen under borttagning; fig. 6 är en perspektivvy av ytterligare en annan utföringsform av föreliggande uppfinning; fig. 7 är en annan utföringsform, som visar en perspektivvy av en doppsticka av föreliggande appa- rat; V fig. 8 är en annan utföringsform, som visar schematiskt ett automatíserat system; ' fig. 9 är ytterligare en annan utföringsform, som också schematiskt visar ett automatiserat system; K fig. 10 är en perspektivvy av ett exempel på en -kontinuerlig tejp för det i fig. 8 och 9 visade auto- matiserade systemet; fig. 11 är en kurva, som visar diffusionen av vitamin B-12 från agaros i helblod som funktion av hema- tokrit (HCT), 1 fig. 12 är en kurva, som visar att vitamin B-12 diffunderar från agaros som funktion av kvadratroten ur tiden, såsom förutsäges av diffusionslagen; fig. 13 är en kurva, som visar.korrelationen mellan hematokrit (HcT), bestämd genom diffusion och genom standardcentrifugeringsteknik; fig. 1H är en kurva, som visar effekten av hemato- krit (HcT) på albuminanalys.

Uppmärksamhet riktas nu till ritningarna för olika strukturella utföringsformer av uppfinningen. I fig. 1 och 2 visas ett plant rektangulärt underlag 11, som avgränsar en brunn 12 fylld med en gel eller ett annat poröst medium 13, t.ex. agaros som innehåller en inert substans, t.ex. vitamin B-12. Underlaget 12 kan bestå av plast eller glas. Fastän dimensionen inte är av yttersta vikt, förutser man att brunnen 12 har ett djup av 0,1 - 2 mm och en diameter av 5 - 20 mm. I den i fig. 1 och 2 visade utföringsformen har en brunn 12 ett djup av 1 mm och en diameter av 8 mm. Brunnen är vanligen centrerad i underlaget 11, där gelen skär ljus- strålen av en lämpligt fotometer eller spektrofotometer. 10 15 20 30 35 '7902734-8 7 Galen bör företrädesvis fylla brunnen 12 till ytan, var- vid god kontakt erhålles med det tillförda helblodprovet.

När exempelvis en droppe av helblodprov IH användes, mäste droppen överlappa delen av underlaget, som om- ger brunnen. Nödvändigheten att fylla fördjupningen (brunnen) helt och hållet med gelen är ännu viktigare när päföringen av provet sker med hjälp av en ektra bärare. Exempelvis kan ett helblodprov tillsättas en kapillär väv. En sådan väv bringas sedan i anliggande kontakt med ytan av gelen. Plasmadelen av provet dif- funderar in i gelen direkt från helblodprovet i den kapillära väven. Efter en i förväg vald tidperiod kan :väven avlägsnas från gelytan. Plasmat, som penetrerar in i en del av gelen, diffunderar samtidigt in i gelen samtidigt som den inerta substansen diffunderar från gelen in i helblodprovet. Vid slutet av en given tid- period, kommer en given mängd av den inerta substansen att ha diffunderat ut från gelen, vilken mängd är om- vänt proportionell mot hematokrit (HCT) i helblodprovet.

Stöd för detta påstående är visat i fig. 11 respektive 12. Pig. 12 visar, att diffusion av den inerta substansen, (i detta fall vitamin B~12 (cyanokobalamin)) från agaros gel mediet in i ett helblodprov följer Binsteins lag för den Brownska rörelsen, referens: Intro- duktion to Colloid Chemistry, K. J. Mysels, Interscience (1959) New York. Observera, att diffusion, mätt genom minskning i absorption, är en linjär funktion av kvadrat- roten ur tiden.

Pig. 11 visar, att den utåtriktade diffusionen av den inerta substansen (vitamin B-12) från gelmediet är en linjär funktion av mängden hematokrit (HCT) i helblodprovet.

Uppmärksamhet riktas nu till fig. 3, 4 och 5.

Där visas att ett underlag 15 har en U-formad kavitet 16 i en yta av underlaget 15. Den breda änden av kavi- teten 16 är öppen vid änden av underlaget. Anordningen av denna utföringsform leder till tillverkning i stor _.. .__..-_..._.__._._._:.___. 10 15 20 35 79o21š4~a 8 skala. Detta åstadkommes genom att man tillsluter den öppna huvudytan av ett flertal identiska underlag med tryckkänslig tejp 17, men varvid änddelen av kavi- teten är öppen, genom vilken änddel gelen 13 kan föras in i kaviteten. Gelen tillåtes att hårdna. Därefter lindas den kvarvarande fria delen av den tryckkänsliga tejpen 17 omkring änden av underlaget för förslutning av den återstående delen av kaviteten 16. I denna ut- föringsform kan anordningen användas som en doppsticka för nedsänkning i provet under en i förväg bestämd tid.

Tejpen 17 avlägsnas före användning. Doppstickan ned- Äsänkes sedan i det flytande helblodprovet under en i .förväg bestämd tidperiod, som är tillräcklig för att tillåta i helblodprovets plasma lösta ämnen diffundera in i det porösa mediet och, samtidigt därmed, tillåta den inerta substansen att diffundera från mediet in i blodprovet.

Pig. 6 visar en utföringsform, som liknar den i fig. 3, 4 och 5. Ett flertal kaviteter 20a, 20b och 20c är visade, så att ett flertal tester eller analyser kan genomföras på ett enda underlag 19, förutom bestäm- ning av hematokriteffekten för helblodprovet. Helblodet placeras i överlappande förhållande över alla tre kavi- teterna 20a, 20b och 200. 20a kan innehålla en gel med en inert färg för hematokritbestämning medan kavítet- erna 20b och 20c kan innehålla geler med reagens för reaktion med speciella plasmaanalyter.

I det föregående har anordningen varit ett underlag med en brunn däri eller åtminstone en för- djupning av något slag. Inom ramen för föreliggande uppfinning ligger även att en doppsticka Också kan framställas av en speciellt behandlad tejprulle. Följ- aktligen riktas uppmärksamhet till fig. 7 för en sådan anordning. Först framställer man en beläggning av en gel på minst en yta av en bandformig transparent tejp.

Gelen får stelna eller hårdna därpå, även om en viss grad av böjlighet kan vara önskvärd för hanteringsändamål. 10 15 20 25 30 35 79 02734- 8 9 Gelen har liksom liksom tidigare tillförts en inert sub- stans för användning vid bestämning av hematokrit i hel- blodprovet. I Den erhållna remsan kapas i lämpliga längder 50, vilket är visat i fig. 7 som en sprängd vy. Gelen 51 är riktat uppåt medan det bandformiga underlaget 52 befinner sig under gelen. Underlaget 52 är täckt med ett bindemedel på sin undersida. Kompositbandet fästes i ett tämligen ' stelt plaststöd 53, som kan vara betydligt längre än längden 50. Den förlängda delen kan innefatta ett_handtag 54, med hjälp av vilket doppstickan kan nedsänkas i en mängd av ett flytande helblodprov, såsom är angivet i det föregående.

Det ligger vidare inom föreliggande uppfinningsram, att den i fig. 7 visade remsan kan användas i en form, var- vid delarna inte kapas utan hela rullen användes i ett automatiserat system. Följaktligen riktas uppmärksamhet till fig. 10. Pig. 10 visar en remsa 60 med ett antal grupper av geler i form av "brickor" 76. Varje grupp av "brickor" (gel- er) innefattar en bricka 76a innehållande en inert färg för hematokritanalysen, och två andra brickor 76b och 76c, vilka innehåller reagens för två andra analyser av analyter i blodplasmat. Rullen 60 användes i ett automatiserade syste- met, som är visat i fig. 8. Figuren betraktas från höger till vänster. En gelremsa 60 lindas av från ett matarhjul 61 och går horisontellt utefter en med pilar visad bana. Bandet 60 passerar en provpåsättningsstation 62, vid vilken diskreta helblodprov páföres droppvis. En vibrationsomrörare 71 är anordnad intill bandet 60 vid påsättningsstationen för blandning provet och förhindra sedimentering av röda blodkroppar i helblodprovet medan i plastma lösta ämnen di- funderar in i gelerna. Bestämning av hematokriteffekten kommer inte att vara exakt om sedimentering av röda blod- kroppar får äga rum under diffusion av de i plasma lösta ämnena in i gelerna. Bandets bana och förflyttningshastighet är sådana, att tillräcklig diffusion sker i gelen. Vid stationen 63 sköljes det kvarvarandra helblodprovet bort under kort tid med lämpliga välkända medel. Vid nästa station inkuberas bandet för ytterligare diffusion i gelen 10 15 20 25 30 35 - 7992734-8 10 76b och 76c, så att reagensen i dessa kan reagera med ana- lyterna i plasmat, såsom är beskrivet i den amerikanska patentansökningen 922 611. Därefter förs bandets 60 till en avläsningsstation 65, vid vilken reaktionsytorna avläses optiskt på konventionellt sätt. Bandet kan sedan lindas upp på en upptagningsrulle 66. Läsaren 65 innefattar två sek- tioner 65a och 65b. Sektionen 65a mäter optiskt färgänd~ ringen i hematokritgelen 76a. Sektionen 65b mäter optiskt färgändringarna i gelerna 76b och 76c för bestämning av närvarande analyt. De optiska mätningarna från sektionen 65a inmatas i ett minne eller annan anordning 74 för er- hållande av en hematokrit~korrektionsfaktor. Korrektions- 'gfaktorn matas tillbakas áll läsaren 65b för erhållande av ett korrigerat värde för analyserna i gelerna 76b och 76c.

De korrigerade analytvärdena registreras sedan i en upp- tagningsanordning 75 eller annat lämpligt utorgan. Gelen 76a kan avläsas efter den initiala diffusionstiden för färgändring pâ grund av förlust av färg från gelmediet, men avläses för automatiseringens skull tillsammans med gelerna 76b och 76c vid lässtationen 65.

I den föregående utföringsformen kan underlaget för bandet vara ett av flera välkända transparenta plastmateriaL t ex polyetylentenftalat fmylar), polyetylen, polypropylen, metylmetakrylat (lucit).

Uppmärksamhet riktas till fig. 9 för ett annat automatiserat system, som är visat schematiskt. Även här be- finner sig ett gelband på ett hjul 61. I denna utföringsform päföres provht¶4æu*inte direkt på genremsan 60. I stället an- vände man ett andra tillförselhjul 67, som uppbär ett vatten- permeabelt material 68. Materialet 68 kan bestå av cellu- losa, cellulosaacetat, nylon eller andra vätbara material och material, som kan genomträngas av lösta ämnen. Material- et 68 dras av hjulet 67 ut efter en bana, som går genom en provpâsättningsstation 69. Provpåsättningsstationen 69 av- ger en provdroppe till materialet 68. Provdroppen penetrerar materialet 68 genom diffusion eller kapillärverkan, och provet väter gelremsan genom undersidan av materialet 68 när det kommer i anliggande kontakt vid läget 70. Tillräck- 10 15 20 25 30 35 79o2734fs 11 ligt lång tid erfordras för diffusion av de i plasma lösta ämnena i provet från remsan 68 in i gelremsan 60. När materialet 68 och banden delar sig, lindas materialet 68 på upptagningshjulet 72. En vibrationsomrörare 71 kan vara anordnad intill läget 70 för att förhindra sedimentering av röda blodkroppar, d v s förhindra de i det föregående angivna hematokriteffekterna. Efter diffusion av de i plasma lösta ämnena in i gelerna fortsätter remsan 60 att gå utmed sin bana (utmärkt med pilar) till en inkubator 64, såsom tidigare är visat i fig. 8. Därefter föres remsan till en mätstation 65 för analys. Läsaren innefattar två sektioner 65a och 65b. Sektionen 65a mäter optiskt färg- :ändringen i hematokritgelen 76a. Sektionen 85b mäter optiskt färgändringarna i gelerna 76b och 76c för bestäm- ning av närvarande analyter. De optiska mätningarna från sektionerna 65a matas in i ett minne eller en annan anord- ning 74 för erhållande av en hematokrit korrektionsfaktor.

Korrektionsfaktorn matas tillbaka till läsaren 65b för er- hållande av ett korrigerat värde för analyterna i gelerna 76b och 760. De korrigerade analytvärdena registreras sedan av en upptagningsanordning_75 eller annat lämpligt utorgan.

Slutligen lindas remsan 60 upp på upptagningshjulet 66.

Det inses att föreliggande uppfinning leder till genomförande av olika klinisktkemiska analyser med helblod- prov. Bandet 60 i fig. 10 kan bestå av mylar, polystyren eller annat lämpligt transparent material.

De_i det föregående angivna brickorna (skivbitarna) 76 i fig. 10 är vidhäftande anbringande på avstånd från varandra på remsan 60. Den första raden av brickor 76a an- vändes för bestämning av hematokriteffekten av helblodproven så att analytanalysen av de andra gelen 76b och 760 kan korrigeras. Brickorna 76b i den andra raden kan alla vara avsedda exempelvis för en albuminanalys. Brickorna 76c i den tredje raden kan alla användas för en glykosanalys t ex.

Andra brickor 76d, 76e, etc (ej visade) kan även finnas på bandet 60 för genomförande av ytterligare analyser, t ex LDH.

Mätstationen 65 är inrättad för analys av reaktions- 10 15 20 '25 30 35 -79532734-8 12 resultaten, erhållna i korresponderande brickor på korrelerat sätt med avseende på varje helblodprov.

I det föregående system är ett antal diskreta brickor 76 visade. Det ligger även inom före1iggande.upp- finningäram att brickorna är icke-diskontinuerliga, så att parallella avlånga remsor kan användas, d v s en för varje önskad vald analys.

Linjariteten i ett kemiskt analyssystem är ett viktigt kriterium på tillförlitlighet. Línjaritet förut- sätter en kinetisk reaktion av första ordningen, så att testsubstansernas koncentration.enkelt kan mätas. Det är välkänt, att man måste ha.överskott av reagens i mediet “för att erhålla linjaritet. Detta åstadkommes i detta gel- system genom att analysen utföres i ett tvåstegsförfarande.

Vissa analyter kan även bestämmas genom mätning av reaktionshastigheten för enzymer i gelen.

Användning av de i det föregående angivna systemen för analys av analyter beskrives i det följande. Man bringar gelen;väldefinierade yta i kontakt med provet under kort tid, d v s i storleksordningen 10 - 60 sekunder. Provet avlägsnas sedan. Detta möjliggör diffusion av provanalyten in i ytomrädet av gelen. Det är uppenbart att man lätt kan 1 välja sådana betingelser att penetreringsdjupet av analyt- molekylerna är litet i förhållande till gelens tjocklek.

Detta förfarande skapar en "reservoar" av analyt nära den utåtriktade delen av gelen.

För större effektivitet erfordras ytterligare diffusion av analyten in i gelen efter borttagning av vätskeprovet från kontakt med gelytan. Detta tillåter omför- delning av de i plasma lösta ämnena av provet i gelen. Den efterföljande diffusionen är ekvivalent med att utföra om- blandningen av en känd utspädning av provsubstansen i jäm- förbara lösningskemiska tillämpningar. De i plasmat lösta ämnena av provet fördelas nu inom gelen med lika koncentra- tion på alla ställen och med lägre koncentration än i det ursprungliga provet, som undersöks. De vanliga alikvotför- faranden och utspädningsförfaranden har ersatts med detta diffusionsförfarande i tvâ steg. Föreliggande förfarande 10 15 20 25 30 35 7992734-8 13 är även användbart för att erhålla en alikvot och utspäda störande ämnen i provet, varvid deras inverkan på analysen minskas. På grund av utspädningen erfordras lägre reagens- halter för fullständig reaktion med provet. Sådana åter- ställande betingelser är fördelaktiga för etablering av första ordningens kenitik och kalibreringskurvor, som är linjära med analythalten. Emellertid är, såsom det är an- givet i det föregående, reaktionens tid-beroende inte linjär, eftersom diffusionssträckan är en funktion av kvadratroten ur tiden. Sålunda ger fel vid mätning av tiden, under vilken gelen är i kontakt med ett flytande prov, mindre analytiska fel, vilka är proportionella endast mot kvadratroten ur tiden.

Uttrycket gel hänför sig till ett material, i vilket en polymersubstans bildar ett skelett med en given tre- dimensionell form. Mekanismen för ett sådant uppträdande förstås endast partiellt, men dessa material innehåller relativt stora mängder lösningsmedel, som bildar en samman- hängande del med gelmaterialet. Valet av skelettmaterial varierar och beror på den avsedda användningen. Lämpliga skelettmaterial för vattenhaltiga gelmedia kan innefatta hydrofila material, vilka innefattar både naturligt före- kommande substanser, såsom gelantin, gelantinderivat, hydrofila cellulosaderivat, polysackarider, exempelvis dextran, gwmd.anflficwn,agaros och liknande, och syntetiska substanser, t ex vattenlösliga polyvinylföreningar, t ex poly(vinklalkohol) och poly(vinylpyrrolidon), akrylamid- polymerer.

Alla analytiska förfarande anpassas till föreliggan- de uppfinning. Även om föreliggande apparat och förfarande är speciellt lämpliga för rutinmässig blodkemi, t ex på glykos, blodkarbamid, kväve, urinsyra, albumin, kreatinin, bilirubin, fosfat, total protein, amylas, kalcium, kan många andra analytiska test, som utföres periodiskt, automa- tiskt genomföras enligt föreliggande uppfinning. Även om det i fig. 8 och 9 visade automatiserade systemet har beskrivits med ett förfarande, i vilket hemato- krit bestämmes oberoende av blodanalysen, är det även möjligt 10 15 20 25 30 - 7902734-8 lä att automatiserade system bestämmer hematokrit och analyt med användning av samma gelmedium. I ett sådant system inne- håller alla brickor 76 en inert färg tillsammans med rea- gens, som erfordras för den speciellt avsedda analytanalysen När de i plasma lösta ämnena har diffunderat in i gelen från helblodprovet och har inkuberat vid stationen 64, mäter avläsningsstationen 65 två färgändringar. Dessa färg- ändringar kan avläsas med vanliga fotometriska anordningar.

Den första av det två färgändringarna hänför sig till för- lusten av inert substans från gelen som funktion av mängden hematokrit i helblodprovet, vilket tidigare har belysts i fig. 11. Denna avläsning kan genomföras i eller utan gel- Åmediet, eftersom förlusten av den inerta substansen från mediet kan observeras i gelen eller i det pä gelen befint- liga helblodet. Den andra av de två färgändringarna hänför sig till den kemiska reaktionen i gelen mellan analyten som undersöks, och dess speciella reagent. Den andra färgen av analytreaktionen ger en indikation på mängden analyt i blodplasmat utan hematokritkorrektion. Avläsningsstationen 65 bestämmer hematokrit från den första färgavläsningen och korrigerar automatiskt det erhållna värdet via ett minne 74 för den erhållna analythalten från den andra färgavläsningen I ett sådant förfarande är det nödvändigt, att färg- intervallet för förförlusten inte interfererar med färg- ändringen, som åstadkommas av reaktionen mellan analyt och reagens. Det är även nödvändigt, att den inerta färgen inte på något sätt, som inverkar på endera färgavläsning eller diffusionseffekter, reagerar med reagenset.

Efter beskrivning av föreliggande uppfinnings olika utföringsformer koncentreras nu beskrivningen på hur hemato- kritkorrektionen utföres.

I fig. lä visas resultatet från en typisk analys (i detta fall - albumin) på helblodprov med varierande hematokrithalt. Linjen "a" visar den sanna (korrigerade) albuminhalten i helblodproven, och linjen "b" visar effekten av ökande hematokrit för absorbansen vid 630 nm. Det fram- gär, att absorbansen för albuminanalysen minskar när mängden hematokrit ökar i blodproven. Man antar att blod- ...__ ,.----v--...--.......-........ ...ufi .vmq-.m-fl -- - 10 15 20 25 30 35 7902734-8 15 kropparna blockerar ytan av gelen och begränsar diffusionen V av de i plasma lösta ämnena av helblodproven in i gelen.

Detta leder till att mindre mängd i plasma lösta ämnen och följaktligen mindre albumin slutligen kommer att befinna sig i gelen efter en given tidsperiod. Det kommer därför att vara en svagare reaktion mellan albumin och reagenset på grund av hematokriteffekten. Denna svagare reaktion leder till den observerade minskningen i absorbans.

Från data från varje analyt under analys kan effekterna av ökande mängder hematokrit i helblodproven be- stämmas. Detta ger korrektionsfaktorer för korrigering av de optiska avläsningarna, så att de rätta värdena avspeglas för mängderna analyt, såsom är visat för albuminanalysen i fig. 14.

Fig. 13 visar en kurva, som korrelerar hematokrit- bestämningarna för olika blodprov, genomförda med diffu- sionsmetoder enligt uppfinningen, med hematokritbestäm- ningar för dessa prov med standardcentrifugeringstekniker.

Såsom framgår av kurvan, är mängderna hematokrit, bestämda ' med diffusionstekniken enligt uppfinningen, ekvivalenta med bestämningarna, som erhålles med standardcentrifugerings- förfaranden.

De följande exemplen underlättar ytterligare för- stäelsen av figurerna 11 - 14.

Exempel 1 - Framställning av vitamin B-12 i agarosgel I en 25-ml Erlenmeyerkolv placeras 0,1 agaros och 9,00 ml PD§ (se nedan). Kolven placeras på ett kokande vattenbad i 5 minuter för lösning av agarosen. Lösningen får svalna till 5000 och 1,0 ml 1,0 % vitamin B-12 (i PBS) tillsättes. Gelstickorna framställs sedan genom att man avsätter 2 - 3 droppar av denna varma lösning i brunnarna och täcker dem med ett täckskikt av plast. Om gelen inte skall användas omedelbart, kan de lagras vid rumstemperatur i en behållare med fuktig atmosfär. Den röda färgen av gel- erna befanns vara stabil vid lagring vid rumstemperatur eller i kylskåp i flera månader.

PBS, fosfatbuffrat saltlösning, innehåller de följande substanserna per liter: 80 ml 0,1 M Na?HPOu, 20 ml 10 15 20 25 30 35 79o27s4;s, 16 0,1 M KHZPOu, 8,5 g Nacl Qch 0,2 g NaN3, pH = 7,3.

Exempel 2 ~ Bestämning av gelhematokrit genom diffusion av vitamin B-12 ut ur gelmediet Den initiala absorbansen vid 5H0 nm avläses för varje gelsticka med enbart agarosgel som referens. Gel- stickorna nedsänks sedan i 1,5 ml prov av helblod med känd, genom centrifugering känd, hematokrit (HcT). Ned- doppningen varar typiskt 10 minuter. Gelstickorna avlägs- wnas sedan från blodet och sköljes snabbt fria från blod genom neddoppning i tvâ bägare med ren PBS, Därefter be- stämmes åter absorbansen vid 540 nm. Absorbansändringen _víd 51l0 nm, AA = A före - A efter bestämmas sedan.

Experimentella data avsattes med A A vid SMO nm som ordinata mot genom med centrifugering bestämd hemato- krit (HcT) som abskissa. I fig. 11 är resultaten från H9 helblodprov visade. Varje genancentrifugering erhållet värde för hematokrit (HCT) var medelvärde av ett dubbel- prov, som genomfördes med mikroförfarandet (7 minuter).

Exempel 3 - Framställning av gelen för albuminana- lysen I en 25-ml Erlenmeyerkolv placeras 1250 mg agaros, och tillsättes 7,0 ml succínatbuffert (definierad i det _ följande), pH 4,4. Agarosen löses genom nedsänkning av kolven i ett kokande vattenbad i ungefär 5 minuter. Därefter tillsättes 3,0 ml 1,5 mM lösning av bromkresolgrönt (BCG) och blandningen omrördes och uppvärmningen upphörde. Gel- stickorna framställdes såsom är beskrivet under B-12/agaros- gel.

Succinatbuffert: i 800 ml destillerat vatten löstes 8,85 g bärnstenssyra (75 mmol),pH inställdes på H,2 genom tillsats av NaOH-pastiller, varefter 5,0 ml Brij-35, en 30 %-ig tensidlösning, och 5,36 g natriumklorid tillsattes.

Därefter utspädde man till 1 liter.

Exempel 4 - Bestämning för gelalbuminanalysen Den initiala absorbansen för varje geldoppsticka avlästes vid 630 nm. En droppe helblod, plasma eller serum placerades på ytan av galen av exakt 30 sekunder, därefter sköljdes provet snabbt bort i tvâ tvättningar med ren 10 15 20 25 30 790273-4-8 - 17 succinatbuffert. Den slutliga absorbansen vid 630 nm av- lästes efter 20 minuter. En kurva av A A 630 som funktion av hematokrit (HCT) vid en bestämd plasma-albuminhalt är visad i fig. 14, som visar hematokriteffekten.

Uttrycket "inert substans" hänför sig till ett material, som är lösligt i ett lösningsmedel; och inert med avseende på cell- eller partikelfraktionen och i lös- ningsmedlet lösta substanser. Speciellt får det inte binda till eller reagera med lösta molekyler, celler eller partikelformig substans. Det får varken passivt eller aktivt tränga in i cellernas eller partiklarnas inre.

Iktta inre rum förblir därför en utesluten volym. Detta Amaterial mäste ha en tillräckligt liten effektiv molekyl- diameter med avseende på gelmediets medelporstorlek, så att det kan diffundera i mediet och över gränsytan mellan lösningsmedlet och gelen.

Användningen av olika inerta färger har beskrivits för hematokritbestämningen. Vitamin B-12 (cyanokobalamin) är en av dessa färger och är ett gott val, eftersom det kan lätt erhållas i ren form, visar mycket liten bindning med plasmaproteiner, (humanplasma innehåller omkring 100 ng/ml vitamin B-12-bindande proteiner, kallade transkobalaminer, referens: Allen, R. H. och Majerus, P.W.: Journal of Biologícal Chemistry 23(10); 7695, (1972), och uppvisar ett spektralt intervall, som lätt kan observeras med foto- metriska metoder. Inerta färger, som kan användas i före- liggande förfarande för bestämning av hematokrit, måste speciellt uppfylla de följande fordringarna: (a) de måste vara vattenlösliga; (b) de måste ha minimal elektrisk laddning, och (c) om de mäts optiskt, måste ha stor molär absorbans i det synliga området, före- trädesvis vid en våglängd, som kan diskrimineras.

Vitamin B-12 uppfyller de angivna fordringarna. Det är är stor molekyl (molekylvikt 1355), som har endast en negativ laddning i nukleotiden. +3-laddningen av kobolt- jonen är mycket delokaliserad på grund av de sex liganderna.

Frånvaron av mycket laddade grupper erfordras, så att molekylen inte binder till albumin och andra proteiner. 10 15 79Û2734~8f 18 Genom att den är en stor molekyl försvårar den bindning genom steriska effekter. Med elektriskt neutral avses mini- mering av joniska grupper, t ex: C02_; NH3+; NR2H+; NRH2+; S03 lighet i polyaromatiska färger.

Lösligheten av vitamin-B-12-molekylen erhålles via _; vilka vanligen användes för att åstadkomma vattenlös- polyhydroxylering med ett antal "OH-grupper" (hudroxylgrupp- er) och "-0-“ (eterbindningar). Polära är även grupperna - , - NH2. Molekylens löslighet härledes emellertid huvud- il 0 sakligen från nukleotiden.- Det ligger även inom ramen för föreliggande upp- Éfinning att difusionstekniken användes i tester på halter . av partiklar i andra lösningar än blod. En sådan lösning kan exempel vara en annan biologisk lösning eller en lös- ning av framställda substanser.

Claims (10)

10 15 20 25 30 35 7902734-8 19 PATENTKRAV

1. Förfarande för bestämning av hematokriten i ett helblod- prov, k ä n n e t e c k n a t av att man (a) bringar en yta på ett poröst medium innehållande en vattenlöslig inert substans i kontakt med ett helblodprov, var- vid den inerta substansen är inert mot helblodprovet, (b) under en viss tid bringar åtminstone en del av i hel- blodprovets plasma löst material att diffundera genom ytan in i mediet, 7 (c) under en motsvarande tid bringar åtminstone en del av den inerta substansen att diffundera från mediet genom den i kontakt med helblodprovet varande ytan, och (d) bestämmer koncentrationen av den från mediet diffun- derade inerta substansen som mått på helblodprovets hematokrit.

2. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e - t e c k n a t av att man inskränker diffunderingsstegen (b) och (c) till en kontrollerad tid.

3. Förfarande enligt patentkravet 1 eller 2, t e c k n a t av att mediet innehåller ett enzym för reaktion med en analyt i helblodprovet och att man mäter enzymets reak- k ä n n e - tionshastighet.

4. Förfarande enligt patentkravet 1, t e c k n a t av att det porösa mediet är ett gel. k ä n n e -

5. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e - t e c k n a t av att mediet innehåller ett reagens för reaktion med en analyt i det i plasman lösta materialet och att man mäter en reaktion av reagenset med analyten.

6. Apparat för bestämning av hematokriten i ett helblodprov, k ä n n e t e c k n a d av en gelmassa med ett exponerat före- skrivet ytområde inrättat att motta ett helblodprov, så att kon- takt av det föreskrivna ytområdet med helblodprovet under en given tid bringar en alikvot av i plasman lösta ämnen attdiffun- dera från helblodprovet till gelmassan, en i gelmassan upptagen vattenlöslig substans, som är inert mot helblodprovet och diffun- derbar genom det föreskrivna ytområdet, när gelmassan är i kon- takt med helblodprovet, varvid mängden från gelmassan diffunde- rad inert substans är ett mått på helblodprovets hematokrit, en anordning för att bära gelmassan och bestämma det föreskrivna ytområdet, ett i gelmassan anordnat reagens för att bilda en 10 15 20 25 30 1902734-s 20 detekterbar färgreaktionsprodukt med åtminstone en beståndsdel av helblodprovet, varvid närvaron av den inerta substansen i gelmassan på intet sätt stör eller påverkar detekteringen av färgreaktionsprodukten, och en anordning för att oberoende av varandra bestämma dels färgreaktionsprodukten, dels mängden inert substans i helblodprovet eller gelmassan efter diffusionen.

7. Apparat enligt patentkravet 6, k ä n n e - t e>c k n a d av att bäranordningen har formen av ett stelt underlag med gelmassan anordnad på dess ena ände och ett handtag anordnat på dess andra ände, och ett bindemedel för att binda gelmassan vid underlagets ena ände, som är ägnad att doppas i helblodprovet.

8. Apparat enligt patentkravet 6, av att bäranordningen innefattar en långsträckt k ä n*n e ~ t e c k n a d underlagsyta som bildar en fördjupning vid ena änden för att innehålla gelmassan. .

9. Automatiserat system för att bestämma hematokriten i successiva helblodprov, k ä n n e t e c k n a t av ett konti- nuerligt underlag bärande flera porösa medier, varav åtminstone vissa har exponerade föreskrivna ytområden och innehåller en känd koncentration av en mot helblodproven inert substans, och en given kvantitet av ett reagens för att bilda en färgreaktions- produkt med en speciell analyt i helblodprovet, varvid deninerta substansen är diffunderbar från de valda medierna och löslig i helblodproven, när dessa är i kontakt med nämnda ytområden, en provavgivningsstation för att avge ett helblodprov på det expo- nerade ytområdet hos varje valt medium under en reglerad tid, en mätstation för att oberoende av varandra bestämma dels den i de valda medierna bildade färgreaktionsprodukten, dels mängden från varje valt medium diffunderad inert substans som mått på de respektive helblodprovens hematokrit.

10. System enligt patentkravet 9, k ä n n e t e c k n a t av att avgivningsstationen innefattar medel för att avge hel- blodproven droppvis mot de valda porösa medierna.