SE444989B - Reagenskomposition for radioimmunologiska bestemningsmetoder - Google Patents

Description

7910382-6 liga strålningsabsorberande material beror till stor del på egenskaperna hos den radioaktiva isotop som används vid bestäm- 125 ningen. Exempelvis när den vitt använda isotopen I används uppnås en effektiv avskärmning av strålningen med ett stort an- tal olika element även innefattande sådana med ett förhållande- vis lågt Z-tal. Lämpliga element innefattar silver, kadmium, volfram och vismut. De specifika utföringsformer som beskrivs i ovan nämnda patentskrift använder volframpulver som avskärm- ningsmaterial.

Vid valet av lämpligt avskärmningsmaterial och fysikalisk form för detta är det önskvärt att materialet inte stör antigen- antikroppsbindningen eller, om det är olösligt, inte adsorbe- rar bestämningsmetodens reaktanter på sin yta. Olösliggörande av den bundna eller obundna radioaktiva liganden för att åstad- komma separation av dessa komponenter för mätning uppnås i ovan nämnda patentskrift genom användning av i och för sig kända tekniker och reagens, dvs. dubbel antikroppsseparation, kemisk utfällning, eller genom att använda antikroppar och anti- gen bundna till vattenolösliga polymerer i partikelform.

Alternativt görs det oreagerade radioaktiva materialet olösligt genom att det adsorberas på en partikelformad adsorbent, van- ligen aktivt kol, som företrädesvis är behandlat med dextran.

Kolet kan blandas fysikaliskt med ett strâlningsabsorberande material enligt en ytterligare utföringsform i ovan nämnda patentskrift. Slutligen är ytterligare ett alternativt mate- rial, som där används, en radioaktivitetsabsorbent, vilken även absorberar det oreagerade radioaktiva materialet. Ett exempel på sådana material är vismutkarbonatpulver.

Föreliggande uppfinning avser nya kompositioner av skärm- ningsmaterial, som är användbara som reagens i en förbättrad mätmetod med intern skärmning av provet för radioimmunologiska bestämningsmetoder och besläktade bestämningsmetoder med radio- aktiva ligander. Dessa kompositioner omfattar enskilda partiklar, var och en innehållande ett avskärmningsmaterial med hög kapa- citet för absorption av utsänd strålning som en första aktiv komponent och ett material som reagerar med ett reagens eller en reaktionsprodukt i bestämningsproceduren som en andra aktiv komponent. 7910382-6 I en form av kompositionerna enligt uppfinningen utgörs den andra aktiva komponenten av ett material som är immunolo- giskt reaktivt med antingen reagensen eller reaktionsprodukten i radioimmunobestämningsmetoden. Lämpliga material innefattar sålunda exempelvis antikroppar (en första antikropp), som är specifikt riktad mot den substans som skall mätas i den radio- immunologiska bestämningen, antigen och antikroppar (en andra antikropp) alstrade i en andra art mot serum från det species i vilket den första antikroppen frambringats. Den andra aktiva komponenten kan också vara biologiskt aktiva bindare, som är av icke-immun typ såsom transportproteiner såsom tyroxin- bindande globulin eller receptorer av cellulärt ursprung såsom estrogenreceptorer från cytoplasma eller hormonreceptorer från plasmamembran.

Den första aktiva komponenten kan vara varje slag av känt avskärmningsmaterial med hög kapacitet med avseende på absorp- tion av strålning, som avges av en radioaktiv ligand. Speciellt innefattar sådana material de avskärmningsmaterial som tidigare beskrivits för detta ändamål, dvs. silver, kadmium, volfram, vismut eller föreningar innehållande sådana element, såsom oxider av dem. En speciellt föredragen första aktiv komponent utgörs av vismut, speciellt vismutoxid (Bi2O3).

En föredragen form av denna aspekt av uppfinningen erhålles genom att kombinera nämnda första och andra aktiva komponenter med en stödmatris. En sådan matris kan erhållas från geler, glas eller polymera material, som har använts konventionellt inom omrâdet immobilisering av biologiskt aktiva molekyler.

Föredragna matrismaterial för detta ändamål innefattar agaros, polyakrylamid, stärkelse och polyvinylidenfluorid.

Ett lämpligt tillvägagångssätt för att framställa en kom- position i enlighet med denna aspekt av uppfinningen är att olösliggöra, gelera eller polymerisera matrismaterialet i när- varo av den första aktiva komponenten för att erhålla partiklar, företrädesvis mikropartiklar, av det polymera materialet inne- hållande den första aktiva komponenten. Den andra aktiva kom- ponenten kopplas sedan kovalent till partiklarnas yta eller kopplas kovalent till eller insnärjes i partiklarnas matris 7910382-6 med användning av åtgärder kända inom området koppling, in- snärjning eller annan typ av immobiliering av biologiskt aktiva substanser på ett fast stödmaterial.

Storleken och egenskaperna hos sådana partiklar beror i stor utsträckning på den första aktiva komponentens egenskaper.

Det är att föredraga att denna komponent är i mikrokristallin form med en största kristalldimension under 5 mikron. Större partiklar är lämpliga, men den mest föredragna storleken är en med 2 mikrons kristalldimension. Sålunda kan exempelvis en lämplig första komponent såsom vismutoxid införlivas i en polyakrylamidmatris genom att akrylamidmonomeren polymeriseras i närvaro av vismutoxiden. Polymerisationen utföres lämpligen i en emulsion av vatten-organiskt lösningsmedel. På grund av den höga densiteten hos partiklarna innehållande vismutoxid är det önskvärt att utföra polymerisationen med användning av ett organiskt lösningsmedel med hög densitet såsom koltetraklorid som den organiska fasen. I ett alternativt tillvägagångssätt används ett organiskt lösningsmedel med lägre densitet såsom toluen för att låta partiklarna sedimentera under polymerisa- tionen.

Polymerisationsreaktionsblandningen kommer att förutom ovan angivna komponenter innehålla ett konventionellt polyme~ risationsframkallande medel för den använda monomeren och en konventionell emulgator såsom mannitolmonooleat, som är kom- mersiellt tillgängligt som Arlacel A från Serva,_Heidelberg.

En representativ polymerisationsreaktionsblandning omfattar följande komponenter i viktsdelar: 0,4 - 2,0, företrädesvis 1,9 delar akrylamid; 0,2 - 0,4, företrädesvis 0,4 delar N,N'- metylenbisakrylamid; 0,1 - 2,0, företrädesvis 1,0 delar vismut- oxid; omkring 10,0 delar vatten och en organisk fas om 50 - 250 ml koltetraklorid innehållande 1 - 4, företrädesvis 2 % Arlacel A. Polymerisationen av polyakrylamid till en matris aktiveras genom 0,1 delar av 50 % ammoniumsulfat i vatten och 0,4 - 0,5 delar N,N,N',N'-tetrametyletylendiamin och utförs vid en temperatur i omrâdet från omkring 0°C till 10°C, före- trädesvis vid omkring 2°C. 7910382-6 Förutom polyakrylamid kan valet av matris innefatta agaros 1 - 5 %, företrädesvis 2 %, eller stärkelse 40 - 80 %, företrädesvis 60 %. Matrisen (agaros eller stärkelse) i värmd och smält fonn blandas med den första aktiva komponenten till en homogen suspension. Liksom vid polyakrylamid geleras ovan nämnda suspension till partiklar i ett system av vatten- organiskt lösningsmedel. Små droppar av stärkelse- eller agarosgelprodukten eller polyakrylamidpolymeren bringas sedan till fast tillstånd i form av fasta partiklar med den önskade storleken i området från 1 till 100 mikron, företrädesvis mindre än 10 mikron. Dessa partiklar kommer att ha en densi- tet liggande mellan 1,2 och 8 g/cma. För att erhålla separation av partiklarna under deras övergång till fast tillstånd kan den organiska lösningsmedelsfasen sättas i rörelse såsom genom om- rörning eller ultraljudvibrering. Ännu ett matrisval är polyvinylidenfluorid (PVF). 0,4 - 3,0 g, företrädesvis 2,0 g, PVF löst i 20 ml dimetylformamid blandas med 10 - 50 g, företrädesvis 40 g,vismutoxid. Små droppar av det erhållna materialet bringas till fast tillstånd i form av små partiklar med den önskade storleken i området från 1 till 100 mikron genom att blanda in nämnda material i 200 - 500 ml isopropanol, etanol eller vatten. Partiklarnas storlek kan minskas ytterligare genom homogenisering.

I en alternativ utföringsform av denna aspekt av upp- finningen kan den första och den andra aktiva komponenten blan- das intimt samman med gel- eller polymermaterialet i smält, löst eller icke-polymeriserad form, vilken blandning sedan kan gjutas eller olösliggöras till en styv matris, som sedan slutligen delas, exempelvis genom malning, till det önskade partikelstorleksområdet. Alternativt delas matrisen först grovt, suspenderas i en vattenfas och homogeniseras sedan med en homogenisator (t.ex. Polytron) till den önskade partikel- storleken.

Oberoende av den metod som används för att framställa partiklarna kan det vara önskvärt att uppnå ett snävare inter- vall för partikelstorleken än som åstadkommes med denna metod.

I detta fall kan de framställda partiklarna separeras efter 7910382-6 storlek genom siktning eller genom.sedimentering i en vätska eller i en luftström. ' För att erhålla önskade sedimenteringskarakteristika för de olika typerna av partiklar kan den suspension i vilken par- tiklarna finns även innefatta ytaktiva komponenter såsom Tween® 20, dextran, polyetylenglykol eller proteiner i kon- centrationer som är välkända för att påverka aggregationen av partiklar i suspension.

Koppling av den andra aktiva komponenten till de erhållna partiklarna innehållande den första aktiva komponenten för- delad inuti gel- eller polymermatrisen kan verkställas genom användning av kopplingsmedel såsom cyanbromid eller ett bivalent kopplingsmedel såsom en dialdehyd, företrädesvis glutaraldehyd, som uppträder som sammanlänkande grupp mellan reaktiva grupper i matrisens yta och reaktiva grupper i den andra aktiva kom- ponenten.

När PVF används som matris kan koppling av den andra aktiva komponenten i form av ett antiserum utföras genom be- handling av PVF-täckta vismutoxidpartiklar med isopropanol i 1 h, varefter partiklarna tvättas 3 gånger med 0,1 M fosfat- buffert pH 7,0 innehållande 0,15 mol natriumklorid. Sedan inkuberas partiklarna 24 h vid rumstemperatur.

Vid en utföringsform av denna uppfinning väljs sedimenta- tionshastigheten, erhâllen genom användning av konventionella sedimentationsåtgärder, för partiklarna innehållande den första och den andra aktiva komponenten så att den passar till reak- tionshastigheten för den andra aktiva komponenten. Genom att välja en kombination av partikelstorlek och partikeldensitet inom ovan nämnda områden kan partiklarnas sedimentationshastig- het specificeras så att partiklarna kommer att avsätta sig på rörets botten inom en viss tidrymd varierande från 1 till 180 minuter, företrädesvis 15 - 30 minuter. Bindningskapaciteten för partiklarnas andra komponent är så hög att den önskade immunologiska reaktionen kommer att äga rum under partiklarnas sedimentation. Vid en alternativ form av denna utföringsform ersätts partiklarnas första komponent med ett material med samma höga densitet som de som nämnts i det föregående men med 7910382-6 mycket lägre strålningsabsorptionskapacitet. Lämpliga radio- aktiva isotoper innefattar de radioaktiva formerna av barium- och jodhaltiga föreningar. När partiklarna har sedimenterat till rörets botten, måste den överstående vätskan avlägsnas från provröret för att medge mätning av vätskans halt av radio- aktivitet eller alternativt medge mätning av den med sedimentet förknippade radioaktiviteten.

Vid en speciell form av uppfinningen delas partiklarna innehållande de första och andra aktiva komponenterna upp i separata doseringsenheter i torkad eller lyofiliserad form.

Varje doseringsenhet pressas till tablettform. Tabletten inne- håller även fyllmedel som behövs för att bevara tablettformen och påskynda upplösningen av tabletten när denna suspenderas i vatten. Sådana tablettsammansättningar är välkända inom den farmaceutiska industrin och innefattar fyllmedel såsom stärkel- se, laktos eller magnesiumkarbonat. Vid denna form förbättras och underlättas den noggranna tillsatsen av en förutbestämd mängd av de aktiva komponenterna till varje provrör.

Vid en specifik utföringsform av denna aspekt av uppfin- ningen kopplades get-antikroppar mot kaninimmunglobuliner (sekundär antikropp) genom användning av glutaraldehyd till partiklar innehållande vismutoxid fördelad inuti polyakryl- amid, såsom beskrivits ovan. Det erhållna materialet användes i en radioimmunologisk bestämning av humant koriongonadotropin (HCG) med användning av fast fas dubbel antikroppsseparation med skärmning. Vid denna bestämning inkuberades HCG-standard- 1251-HLH (0,2 ng) och kaninantiserum mot HCG prov (0,1 ml), (1:4000) i en total volym av 0,5 ml i 1 h vid rumstemperatur.

Sedan tillsattes 1 ml av en suspension innehållande 0,1 ml (andra antikropp)~vismutoxid-polyakrylamid-partiklar och 0,4 g vismutoxid suspenderad i 1 ml buffert. Rören roterades sakta i 3 h. Sedan fick de stå i 15 minuter för sedimentering och mättes sedan i en hålkristallräknare. Erhållna data har sammanställts i den standardkurva som visas i figur 1 i bifo- gade ritningar. p Vid en alternativ utföringsform kopplades kaninantikropp mot HCG till vismutoxidhaltiga polyakrylamidpartiklar. En kon- 7910382-6 stant mängd av sådana partiklar inkuberades med HCG-standard och 125I-HLH i en total inkubationsvolym av 1 ml. Rören rote- rades långsamt över natt. Sedan lämnades de att stå 15 minu- ter för att partiklarna skulle få sedimentera. Sedan mättes de i en hålkristallräknare. Resultaten var i huvudsak iden- tiska med de som visas i figur 1.

Vid en andra utföringsform av den andra aktiva komponenten används material som reagerar med den radioaktiva ligandkompo- nenten i radioimmunobestämningens reaktionsblandning genom ad- sorption. Vid denna utföringsform är aktivt kol den föredrag- na andra aktiva komponenten. Lämpliga kompositioner innehål- lande aktivt kol och den första aktiva komponenten erhålles enkelt genom blandning av dessa tillsammans med ett bindemedel såsom agaros och därefter formning av kompositionen till de önskade partiklarna. Genom att framställa och/eller välja partiklar av önskad storlek och densitet väljs deras sedimen- tationshastighet så att optimal adsorption av den radioaktiva ligandkomponenten erhålles. Vid en specifik utföringsform be- lades vismutoxid med kol, varvid agaros användes som bindeme- del i enlighet med följande tillvägagångssätt: 100 g vismutoxid blandades med 1,0 - 100 g, företrädesvis 2,5 g, aktivt kol. Sammanlagt 25 ml smält 1,5 % agaros till- sattes och blandningen rördes om tills den blev homogen. Den lämnades i kylskåp över natten. Gelen maldes omsorgsfullt med en mortel. Den fragmenterade gelen suspenderades i 250 ml 0,075 M diemalbuffert innehållande 0,25 % bovinserumalbumin och 0,05 % dextran T 70. Alternativt kan andra tidigare nämnda matrismaterial såsom stärkelse, polyakrylamid pch PVF användas med kol som den andra aktiva komponenten. Kolet blandas med vismutoxiden i ovan angivna proportioner, varefter partiklar av matriserna framställs såsom beskrivits, när partiklarna innehöll endast matrismaterialet och vismutoxid. 1 ml av denna suspension användes som absorbent-avskärmare vid radioimmunologisk bestämning av tyroxin (T4). Vid denna bestämning inkuberades 0,05 ml T4-standardprov med 0,2 ml kaninantiserum mot T4 (1:100) och 0,2 ml 125I-T4 (200 pg) vid 4°C över natten. En suspension av 0,4 g kol-vismutoxid-agaros- 7910382-6 partiklar i 1 ml buffert tillsattes. Rören omskakades i 5 sekunder och lämnades i upprätt ställning i 15 minuter. Sedan mättes de i en automatiserad gammaräknare (LKB-Wallac Ultro Gamma II). Den erhållna standardkurvan för denna utförings- form visas i figur 2.

Claims (8)

7910382-6 10 PATENTKRAV

1. Komposition till användning vid radioimmunologiska bestämningar, vid vilka aväënflming av strålning äger rum i själva provet, k ä n n e t e c k n a d a v att den be- står av partiklar som var och en har en storlek mellan 1 och 100 um och innehåller en första och en andra aktiv komponent i kombination med en bärarmatris, varvid partikelstorlek och partikeltäthet är så avpassade i förhållande till varandra att partiklarna uppvisar en sedimentationshastighet av 1-180 min. och att var och en av dessa partiklar som första kompo- nent innehåller ett avskärmningsmedel i stånd att absorbera den av en radioligand vid den radioimunologiska bestämning- en utstrâlade radioaktiviteten och som andra aktiv komponent ett material som kan inverka på ett reagens eller en reak- tionsprodukt vid den radioimunologiska bestämningen.

2. Komposition enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d a v att den andra aktiva komponenten är ett material som är immunologiskt reaktivt med antingen reagensen eller reak- tionsprodukten vid den radioimmunologiska bestämningen.

3. Komposition enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d a v att den första aktiva komponenten är fördelad i bärar- matrisen och den andra aktiva komponenten är kovalent kopp- lad till bärarmatrisens yta.

4. Komposition enligt krav 3, k*ä n n e t e c k n a d a v att den första aktiva komponenten är vismutoxid, den andra aktiva komponenten är al en första antikropp, b) en andra antikropp, c) ett antigen eller d) ett bindemedel av icke-immun-typ och bärarmatrisen är polyakrylamid.

5. Komposition enligt krav 4, k ä n n e t e c k n a d a v att den har formen av partiklar med en storlek i om- rådet omkring 1-100 mikron.

6. Komposition enligt krav 3, k,ä n n e t e c k n a d a v att den andra aktiva komponenten är kovalent kopplad till bärarmatrisen genom glutaraldehyd-1änkgrupper. 7910382-6 11

7. Komposition enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d a v att den andra aktiva komponenten kan adsorbera den radioaktiva ligandkomponenten vid den radioimmunologiska bestämningen.

8. Komposition enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a d a v' att den första aktiva komponenten är vismutoxid och den andra aktiva komponenten är kol och hålles samman av agaros, stärkelse eller polyvinylidenfluorid som bindemedel.