SE192426C1 - - Google Patents

Description

Uppfinnare: E P Abraham och G G F Newton Prioritet begard frau den 2 f ebruari och 16 junt 1955 (Storbritannien) Det har redan pavisats, att ett naringssubstrat, om det fOrjases med mOgel av den art, av vilken Cephalosporium I. M. I. 49 137 (American Type Culture Collection No. 11 550) Or en medlem, far antibiotisk aktivitet. Isoleringen av Lva olika antibiotika ur medlet har redan beskrivits i detalj. Det ena av dessa antibiotika är huvudsakligen verksamt mot grampositiva bakterier och Or kOnt sorn cephalosporin P. Det andra antibiotikumet, vilket Or kant som cephalosporin N, utgOr ett penicillinas-kansligt material, som Or verksamt mot bhde gramnegativa och grampositiva bakterier.

I den brittiska patentskriften 745 208 beskrives ett jasningsforfarande for framstallning av cephalosporin N och olika forfaranden for ea:allande av cephalosporin N i ren form.

Foreliggande uppfinning grundar sig ph den iakttagelsen, att ndr cephalosporin N i rapreparat av ndmnda Mune OverfOres i en inaktiv forming, hdr bendmnd cephalosporin N penillinsyra, genom att preparatet Mlles en viss tid vid surt pH, exempelvis 2,5-5,5, kommer preparatet trots detta att uppvisa antibiotisk aktivitet ph grund av ndrvaron av en Latins okand substans. Detta tredje antibiotiska material, vilket nu betecknas cephalosporin C, Or liksom cephalosporin N aktivt mot bade grampositiva och gramnegativa bakterier men i motsats till cephalosporin N okdnsligt mot penicillinas framstalld av B. subtilis. Det nya materialet Or losligt i vatten och ndstan olosligt i etanol och eter. Det kan identifieras genom sitt ultravioletta absorptionsspektrum, vilket, da. antibiotikumet foreligger i form av en vattenlosning av dess natriumsalt med en specifik vridning av [a]r + 103°, har ett ultraviolett absorptionsmaximum vid 260 miz.

Genom foreliggande uppfinning erhalles sAlunda Dupl. kl. 30 h: 2/03 ett antibiotikum, vilket i fortsdttningen bendmnes cephalosporin C samt kan erhallas i blandning med cephalosporin N penillinsyra, om ett rapreparat av cephalosporin N halles vid sadant pII-varde, att cephalosporin N omsdttes till cephalosporin-N-penillinsyra. Detta antiobiotikum, cephalosporin C, besitter aktivitet mot bAde grampositiva och gramnegativa bakterier, är stabilt vid pH 2,5-5, Or lOsligt i vatten och ndstan olOsligt i etanol och eter. Det uppvisar vidare, dd. det foreligger i form av en vattenlOsning av natriumsaltet, cii specifik vridningsformaga av [a] g + 103° och ett ultraviolett absorptions-. maximum vid 260 mitt.

Ovan namnda brittiska patentskrift 745 208 omfattar bl. a. ett forfarande for rening av cephalosporin N genom separering av mycelium frau mdsken, efterfoljande adsorbtion av cephalosporin N ur den klara vdtskan ph aktivt kol och darph foljande elnering den antibiotiska substansen frau adsorbtionsmedlet. Eluatet bringas i kontakt med aluminiumoxid och det absorberade antibiotikumet elueras sedan fran denna. Det har visat sig, att cephalosporin C är narvarande tillsammans med cephalosporin N i det eluat, vilket erhalles fran aluminiumoxiden. Detta eluat ut- ddrfOr ett utgangsmaterial for cephalosporin C. Andra ramaterial for cephalosporin C utgoras av sjalva mdsken eller av losningar eller rapreparat erhallna av denna. Fackmannen kan ldtt bestdmma, under vilket reningsstadium vid nagot visst forfaramle cephalosporin N kan utvinnas, utan att cephalosporin C elimineras. Ett rApreparat av cephalosporin N kan salunda utsdttas for inverkan av ett lampligt penicillinaspreparat eller halls vid ett pH av 2,5-5 och sedan provas ph aterstaende aktivitet mot lampliga bakterier, exempelvis B.coli. 2- - Cephalosporin C är surt till sin natur. Bade den fria syran och dess natriumsalt aro lattlosliga i vatten och olosliga i aceton eller eter. En vattenlosning av natriumsaltet [ale + 103° uppvisar 1 y en absorption vid 260 ma med E= 200. 1 cm Cephalosporin C innehaller kol, \rate, syre, kvdve och svavel men icke halogen eller fosfor. Elementaranalys av natriumsaltet och den fria syran ha gett foljande resultat: Natrumsaltet: Punnet: C, 39,5, 40,0; H, 4,8, 5,2; N, 8,9; S, 6,2; Na, 4,9 %. Ekvi. (titratering) 480 ± 15. Molvikt enligt rontgenkristallografisk analys 470 1 15.

C161-102N2SNa, 2 H20 krdver C, 40,5; H, 5,1; N, 8,9; S, 6,7; Na 4,9 %, molvikt 473.

Fri syra: Funnet: C, 44,4; H, 5,6; N, 9,8; S, 7,3 %. C16112108N2S - H20 kraver G, 44,5; H, 5,3; N, 9,7; S, 7,4 %.

Analysvardena visa, att cephalosporin C kan ha bruttoformeln C16H2102N3S. Denna formel dr emellertid endast preliminar och kan behova andras senare.

Cephalosporin C ger ninhydrinreaktion. Elektrometrisk titrering visar, att amnet utgOr en monoaminodikarboxylsyra med tvâ syragrupper med lagre pH-varden an 2,6 och 3,1 samt en basisk grupp med ett pK-varde av 9,8. Da dmnet underkastas jonofores pa papper i en kollidinacetatbuffert vid pH 7, migrerar det till anoden med ungefar samma hastighet som cephalosporin N.

Det infraroda spektrumet for natriumsaltet av cephalosporin C (i paraffinpasta) visar band vid foljande vaglangder: 2,94 ft, 3,06 au (NH), 5,77 it (ester- eller laktongruppering), 6,0ti och 6,57 ft (C = 0 av mono- substituerad amid), 6,29 ,a (-000-), 7,17 ,a och 7,36 ja (isopropylgrupp). Uppgifterna Mom parentes utgara tankbara tolkningar. Natriumsal- tet av cephalosporin C uppvisar aven ett band vid 5,61 pt. Ett band Mom detta omrade uppvisas av cephalosporin N och av natriumbensylpenicil- lin och hanfores vid den sistnamnda foreningen till C = 0-gruppen i det smalta fl-laktamtiazolidinringsystemet (Thompson, Brattain, Randall och 'Rasmussen, The Chemistry of Penicillin, kapitel 13, Princeton University Press, 1949).

I motsats till cephalosporin N och bensylpenicillin ãr cephalosporin C stabilt i vattenlosning vid pH 2,5. Amnet inaktiveras emellertid snabbt vid pH 12. Sedan det hade Milts vid pH 12 under 2 h, visade atertitrering, att det hade bildats tva syragrupper per mol. Under liknande forhallanden friges endast en syragrupp per mol av cephalosporin N och av bensylpenicillin. Cephalosporin C dr stabilare i ndrvaro av vissa tungmetalljoner, sasom Cu+ +, Pb+ + och Zn++, an cephalosporin N eller bensylpenicillin.

Vid hydrolys med syra (1-N HC1 under 8 h vid 110° C) avspaltar cephalosporin C liksom cephalosporin N koldioxid och en aminosyra, vii-ken forhdlIer sig pal samma satt som a-aminoadipinsyra pa papperskromatogram. Den produkt, som erhalles da cephalosporin C far reagera med 1,2,4-fluordinitrobensen, ger vid hydrolys en produkt, vilken forhaller sig ph samma satt som dinitrofenylderivatet av a-arninoadipinsyra. Det verkar darfor som om a-aminogruppen i a-amingadipinsyra dr fri i cephalosporin C och som am aven a-karboxylgruppen aven är fri (eftersom denna aminogrupp uppvisar ett pK-varde av 9,8).

Nagra antydningar ha icke erhallits pa bildning av nagon starre mangd penicillamin (fl-tiolvalin) vid hydrolys av cephalosporin C. Hydrolys av den produkt, som erhalles av amnet vid hydrogenolys med raneynickel, gay aminosyror, vilka uppforde sig sasom a-aminoadipinsyra respektive valin pa papperskromatogram.

Cephalosporin C uppvisar en aktivitet av samma styrka mot ett stort antal grampositiva och gramnegativa bakterier. Amnet dr mindre verksamt an cephalosporin N mot Staph. Aureus och Salm. typhi in vitro, eftersom det uppvisar en aktivitet av 8-10 enheter per meg. (den enhet, som anges av Abraham, Newton och Hale, 1954, Biochem. J. 58, 94). Det har ungefar samma aktivitet som cephalosporin N mot en stam av Bact. coll.

Amnets toxicitet liar icke kunnat bedomas genom fullstandiga biologiska forsOk men antages vara lag, eftersom moss kunna ges minst 10 mg av det renade materialet intravenOst utan att synas lida av skadliga verkningar.

Cephalosporin C kan separeras &En en blandning av densamma med cephalosporin N genom att blandningen underkastas fordelning mellan tva losningsmedel, vilka bdgge dro i stand att upplosa bkle cephalosporin N och cephalosporin C. Varje lampligt Isningsmedelssystem kan anvandas, dar fordelningskoefficienten är gynnsam vid de pHvarden, vid vilka de bagge antibiotika aro stabila. Cephalosporin N ar instabilt vid pH-varden under 5, medan cephalosporin C Or stabilt aven vid sa laga pH-varden som 2,5. Da man. enligt uppfinningen uppoffrar cephalosporin-N-aktiviteten, kan fordelningen genomforas vid pH-varden, vid vilka endast cephalosporin C Or stabilt.

Enligt uppfinningen kan salunda cephalosporinet N i blandningen overfOres till cephalosporinN-penillinsyra och den bildade blandningen be- handlas for avskiljning av cephalosporin C frau densamma, exempelvis genom losningsfraktione- ring, fraktionerad absorption pa en fast absor- bent, sasom aluminiumoxid eller en anjonbytare, genom att penillinsyra omsattes till ett olosligt derivat, eller genom nagon kombination av dessa bdgge metoder. Det lampligaste sattet att omsatta cephalosporin N till dess penillinsyra Or att haila blandningen vid ett pH, vid vilket cephalosporin N är instabilt. Omsd.ttningen kan salunda astadkommas genom att blandningen helt enkelt — —3 Mlles vid pH 3 under 2 h vid en temperatur av 37° C.

Foljande forfaranden for separering av cephalosporin C fran cephalosporin-N-penillinsyra ha vi-sat sig ge goda resultat. - 1. En vattenlosning av blandningen sattes till en pelare av ett anjonbytande harts, sasom »amberlite IR4B (XE-59)», varefter elueringen genomfores med en utspadd syra, nagon lamplig buffertlosning, sasom en vattenlosning av ammoniumformiat eller ammoniumacetat, med ett pH av 3,2-5,0, eller en vattenlosning av en ter-. tiar bas, sasom pyridin, delvis neutraliserad med svavelsyra eller oxalsyra. Ett band, som bestir av cephalosporin-N-penillinsyra uttrader ur pelaren fore ett band bestaende av cephalosporin C.

En vattenlOsning av blandningen underkastas i en fOrdelningsmaskin en motstromsfordelning under svagt sura fithallanden i ett tvafassystem av vatten och fenol (eller nagon lamplig, substituerad fenol, sasom kresol eller nagon xylenol). Fordelningskoefficienterna i systemet kunna eventuellt modifieras genom tillsats av en lamplig mangd av nagot organiskt losningsmedel, exempelvis koltetraklorid. Systemets pH installes ph 2-5 genom tillsats av attiksyra eller ammoniumacetat eller ammoniumformiatbuffert. Overforingar genomfOras, tills cephalosporin C och cephalosporin-N-penillinsyra ha bildat separata band. Forhallandena installas lampligen sa, att cephalosporin C uttages fran maskinen i vattenfasen.

En vattenlosning av blandningen uppsattes pa en pelare av syratvattad aluminiumoxid och elueringen genomfores med utspadd lut, sasom 0,01 N natronlut. Cephalosporin C uttrader frail pelaren som en losning av sitt natriumsalt fore cephalosporin-N-penillinsyra.

En vattenbisning av merkuriklorid sattes till en losning innehallande en rhblandning av cephalosporin C och cephalosporin-N-penillinsyra, vilken sistnamnda forening omsattes till en pe- nillamin, vilken utfalles som en merkaptid. Den overstaende losningen innehaller ratt cephalosporin C.

Losningar av fritt cephalosporin C, vilka ha erhallits genom nagot av foregaende forfarings- satt, kunna indrivas till torrhet i vakuum och cephalosporinet C ledas genom en annan anjonbytarpelare for ytterligare rening. Det renade cephalosporinet C kan omsattas till natriumsaltet genom upplbsning i vatten och installning av pH pa 6,0 med natriumhydroxid.

Losningar av natriumsaltet av cephalosporin G, vilka ha erhallits ph nagot av dessa satt, kunna avfargas om sh. Or nodvandigt under anvandning av aktivt trakol, och koncentreras i vakuum. Cephalosporinets C natriumsalt bildar monoklina kristaller innehallande kristallvatten. Pet kan om- kristalliseras ur vattenhaltig etanol eller propanol. Vid torkning i vakuum vid rumstemperatur for- lorar antibiotikumet kristallvattnet, som snart upptages igen vid kontakt med laboratorieluften. Uppfinningen belyses av fOljande exempel.

Exempel 1. 6,9 g ratt cephalosporin N erhallet vid daring fran alumininmoxid, sasom beskrives i den brittiska patentskriften 745 208 med en styrka av 20 enheter/mg, kistes i 110 ml vatten. Ett prov togs ut fOr att anyandas som referens- prov vid efterfoljande spektroskopiska matningar. 10 N saltsyra (vanligen cirka 1 ml) tillsattes, tills losningen fick ett pH av 2,7-3,0. Losningen varm- des sedan till 37° C och prov logos ut varje halvtimma. Proven spaddes med vatten till losningar innehallande 0,075 mg/ml och den optiska tatheten vid 240 my fOr dessa losningar mattes i forhallande till referensprovet, som hade utspatts pa samma salt. Reaktionen antogs vara fullstandig, da flagon ytterligare okning i den optiska tatheten vid 240 my icke kunde iakttagas (120180 min). Okningen i tathet vid 240 my var vanligen c:a 0,3 tathetsenheter, da en 1 cm cell och en koncentration av 0,075 mg/ml utnyttjades. DA omsattningen av cephalosporin-N-komponenten till pennillinsyra var fullstandig, frystorkades lOsningen, varvid man fick 7,0 g av blandningen.

Ett anjonbytarharts (Amberlite XE 59) buffrat med 0,2 M ammoniumformiat vid pH 3,0-3,2 framstalldes ph det salt, som beskrives av Hirs, Moore och Stein (1952, J. Biol. Chem., 195, 699). En pelare pa 59 x 4 cm packades med det buff-. rade hartset, varefter 500 ml av 0,2 M ammoniumformiat innehallande 0,5 % tiodiglykol fick strOmma genom pelarna. 3,5 g av blandningen av cephalosporin C och cephalosporin-N-penillinsyra lostes i 30 ml 0,2 M buffert och losningens pH installdes sa, att det var 0,2 pH-enheter hOgre an for bufferten i pelaren. Denna lasning halides ph pelaren i 3 portioner pa 10 ml. Pelarens genomstromningshastighet installdes sa, att varje portion pa 10 ml behOvde 10-15 min for att sjunka in i pelaren. DUningen spolades sedan in i pelaren med 2 x 10 ml 0,2 M buff ert innehallande 0,5 °A, tiodiglykol. Pelaren fylldes sedan med samma buffertlOsning och anslots till en behallare for konstant tryck. Pelarens genomstromningshastighet installdes sa, att man kunde uppsamla en fraktion pa 20 ml var trettionde minut.

Prov frail var fjarde fraktion logos ut och spaddes 10 ganger med vatten. De utspadda losningarnas optiska tathet mattes vid 240 m,u, och 260 my i fOrhallande till ett pa samma satt utspatt prov av buffertlosningen. Cephalosporin C Aterfanns huvudsakligen i fraktionerna nr 96-118.

Fraktionerna 96-118 slogos samman och koncentrerades till c:a 60 ml i en roterande vakuumevaporator vid en temperatur under 25° C. Koncentratet drevs sedan in till en tjock sirap i en frystorkningsapparat. Sirapen tvattades tva ganger med aceton for avlagsnande av tiodiglykolen. En blandning av ammoniumformiat och ammoniumsaltet av cephalosporin C aterstod. Ammoniumformiatet kunde avlagsnas genom antingen A) sublimering vid Mgt vakuum eller B) elektrofores.

A) Den fasta massa, som hterstod efter tvatt- 4— — ningen med aceton, lostes i nagra f ml vatten och overfordes till en sublimeringsapparat. Sublimeringen genomfordes pa det satt, som beskriYes av Hirs, Moore och Stein (1952, J. Biol. Chem. 195, 699). Aterstoden fran sublimeringen utgjordes huvudsakligen av ammoniumsaltet av cephalosporin C. Saltet lostes i 2-3 ml vatten och losningen fick stromma genom en liten pelare (0,5 x x 0,5 cm) av aktivt kol f6r avlagsnande av fargamnen. DA perkolatet lick indunsta langsamt, kristalliserade produkten.

B) Den fasta massa, som aterstar efter tvattningen med aceton, lOstes i 25 ml vatten och inftirdes i den neutrala kammaren i en fyrkammarcell (Synge, 1951, Biochem. J. 49, 642). Cellen var forsedd med en kylslinga, genom vilken alkohol pa — 5' C pumpades. Attiksyra- och ammoniakkamrarna byttes var tredje timme. Avsaltningen var vanligen fullbordad pa 12-16 h, (la spanningar Tipp till 500 V anvandes. Liisningarna Iran attiksyrakamrarna slogos samman och frystorkades. Produkten, som bestod ay den fria syran av cephalosporin C fororenad med spar av attiksyra, befriades fran attiksyra genom upplosning i en ringa mangd vatten, fanning med ett stort overskott av aceton och omroring av fallningen med torr aceton. Den fria syran av cephalosporin C lostes sedan i vatten och neutraliserades med 2N .NaOH (0,3-0,2 ml). DA losningen lick avdunsta langsamt, kristalliserade natriumsaltet. Kristallerna befriades frail icke kristalliserat slemamne genom tvattning med 70-procentig etanol och omkristalliserades sedan ur vattenhaltig alkohol. I.:tbytet av omkristalliserat material var 100 10/ mg. Vid 260 my var E200. 1 cm Exempel 2. Ratt cephalosporin N (4 mg innehallande 22 enheter/mg) lostes i 30 ml vatten och lasningens pH installdes pa 3,0 med 2N HC1. Losningen halls yid 37' C under 2,5 h och leddes sedan genom en 14 cm lang pelare innehallande 10 g aluminiumoxid (Savory & Moore Ltd., London. For Chromatographic Analysis). Aluminiumoxiden hade forut omrorts med tillracklig mangd utspadd saltsyra for att den overstaende vatskans pH skulle bringas till jamvikt vid pH 4,8.

Da all losningen hade satts till aluminiumoxiden, upptradde ett tunt, brunt band ur pelarens ovre ande och ett svagt gult band strackte sig nedat fran detta till c:a 2/3 av pelarens langd. Endast spar av ninhydrinpositivt material upptradde i perkolatet. Pelaren tvattades med 20 ml vatten, varefter elueringen borjade med 0,01N NaOH. Eluatet uppsamlades i fraktioner pa 5 ml. Stromningshastigheten var 1 ml/min. Utslackningen i dessa fraktioner vid 240 my och 260 my mattes i en Beckmans spektrofotometer. Fran och med fraktionen 13 borjade absorptionen vid bagge vaglangderna att stiga hastigt. Fran fraktionerna 13-17, vilka innehollo cephalosporin C, blev absorptionen storre Yid 260 my an vid 240 my. Vid fraktionen 18 upptradde en pltitslig Okning i den relativa absorptionen vid 240 my pa. grund av upp tradandet i eluatet av cephalosporin-N-penillinsyra. Vid fraktion 21 upptradde ett gult pigment I eluatet.

Fraktionerna 13-17 (pH 5,0) slogos samman och koncentrerades i vakuum till 2 ml. Pigmentet avlagsnades Iran den resulterande losningen genom att denna leddes genom en liten pelare av aktivt kol (0,5 cm diameter och 3 cm hojc1), vii-ken forut hade tvattats med vatten. Vid koncentrering av perkolatet i vakuum hardnade det till en kristalliserad massa av cephalosporin C. Produkten vagde 33 mg. Den inneholl en mindre mangd icke kristalliserade slemainnen och matningen av dess absorption yid 260 my visade narvaron av 25 mg cephalosporin C. Kristallerna avskildes fran slemamnet genom omroring med en. singe mangd 70-procentig etanol och filtrering. Den kristalliserade produkten omkristalliserades ur vattenhaltig propanol.

Exempel 3. Losningssystem. 5 1 vatten mattad med fenol, 4,5 1 fenol matted med vatten och 0,45 1 isattika blandades och lingo komma till jamvikt yid 20° C. Det byre skiktets pH var yid jamvikt 2,6 matt med glaselektrod.

Fordelning. 7,3 g blandning av cephalosporinN-pennillinsyra och cephalosporin C erhallen pa samma Ott som enligt exempel 1 lostes i 80 ml av toppfasen och 40 ml av bottenfasen i losningssystemet. Bottenfasen, 20 ml, och toppfasen, 40 ml, av denna losning infordes i 'Oren »0» och »1» i en helt ay glas bestaende maskin for motstromsfOrdelning (Craig och Craig, 1950 Technique & Organic Chemistry, volym 3, kapitel 4). Toppskiktet, 40 ml, omsattes 100 ganger under anvandfling av den grundlaggande proceduren, med efterfOljande 300 avtappningar av det byre skiktet, 40 ml, fran roret »100».

Analys av fraktionerna. Ett prov pa 0,2 ml togs ut Iran var tionde fraktion av den avtappade serien och den fArgtathet, som utvecklades vid upphettning med ninhydrin (0,5 ml), mattes fotometriskt pa det Ott, som anges av Moore och Stein, 1948, J. Biol Chem. 176, 367. DA de varden pa den optiska tatheLen, som erh011os pA detta satt, aysattes mot fraktionens nummer, upptacktes ett band innehallande cephalosporin-Npenillinsyra i fraktionerna 51-120 och ett band innehallande cephalosporin C i fraktionerna 190300. Det varde for fordelningskoefficienten (K = = konc. i vattenfasen/konc. i fenolfasen) for cephalosporin C, som beraknas frail laget for bandets topp, var 0,2, inedan vardet for cephalosporin-N-penillinsyra var 0,63.

De uttagna fraktionerna 200-300 slogos samman och koncentrerades till c:a 400 ml (400 ml vattenskikt och 100 ml fenolskikt) i en roterande vakuumevaporator. Koncentratet halides sedan i en skiljetratt och skakades med 400 ml koltetra- klorid. Sedan skiktet hade separerat, avtappades koltetrakloridfasen, medan yattenfasen extraherades tre ganger med samma volym bensen. Den vattenhaltiga resten koncentrerades till c:a 100 ml i en roterande evaporator och frystorkades sedan. Spar av attiksyra avlagsnades Iran produk- — — ten genom att denna uppltistes i en ringa mangd vatten och cephalosporin C (fri syra) falldes med overskott av aceton. Fallningen tvattades med torr aceton.

Den fria syran lostes i en ringa mangd vatten och neutraliserades sedan med 2N NaOH (0,5- 0,6 ml). Natriumsaltet av cephalosporin C kri- stalliserade, cla den neutraliserade losningen fick avdunsta langsamt. Kristallerna tvattades med 70-procentig etanol, varigenom icke kristalliserat material avlagsnades. Utbyte 168 mg. Detta material omkristalliserades ur vattenhaltig propanol. Exempel 4. En vattenlosning av ran cephalosporin C, surgjordes till pH 2,5 och holls vid. 37° C under 2 h. Cephalosporinet N var di full- standigt inaktiverat. Losningen frystorkades, sedan dess pH hade installts ph 5,0. Produkten (600 mg med 0,45 enheter per mg) sattes till 3 ml pyridin-acetatbuffert pH 5,0, 150 ml 2 M attiksyra, 250 ml N-pyridin och 600 ml vatten, var- efter nagot olosligt material avlagsnades genom centrifugering. Den bildade, klara losningen (pH 5,0) sattes sakta i tvi portioner till ovre delen av en pelare (1,9 x 20 cm) Amberlite IR4B (korn- storlek svarande mot sikt nr 200-400). Hartset buffrades till pH 5,0 med pyridinacetat genom tvattning av hartsets acetatform med pyridinacetatbuffert, som hade framstalas enligt ovan, pa ett filter, tills den tillfOrda och den avgaende bufferten hade samma pH, dvs. 5,0.

Sedan losningen av raft cephalosporin C hade flutit ned i pelaren, fOlj des den av tvâ tillsatser ph 2 ml pyridinacetatbuffert, varefter pelarens byre ankle anslots till en behallare for konstant tryck innehallande pyridinacetatbuffert. Behal larens niva installdes for erhallande av onskad stromningshastighet (9 ml/h). Donna stromnings- hastighet uppnaddes, di buffertens hojd i behallaren var endast nagra fa cm ovanfor pelarens bottenplatta. Effluatet uppsamlades i fraktioner pa 3 ml var tjugonde minut.

Alternerande fraktioner analyserades genom bestamning av antibakterieaktiviteten mot S. typhi pa pray, som bade neutraliserats med natronlut, samt aven genom en fotometrisk ninhydrinmetod (Moore och Stein, 1948, J. Biol. Chem. 176, 367). Cephalosporin C eluerades i fraktionerna nr 108. Dessa fraktioner slogos samman och koncentrerades i vakuum (vid en badtemperatur av 30° C) i en roterande evaporator. Aterstoden lostes i en ringa volym vatten och overfordes till en skid samt torkades Over natten vid vakuum Over KOH och 1320, varefter man icke kunde upptacka nagon lukt av pyridin eller attiksyra. Produkten lostes i en ringa mangd vatten (0,3 ml) och 10 ml aceton tillsattes. Fallningen centrifugerades at, omrordes med nagra fa ml aceton, centrifugerades pa nytt och torkades i vakuum, varvid man fick ett vitt pulver av den fria syran cephalosporin C. Donna fria syra lostes i 2 ml vat- ten till bildning av en lOsning med pH 3,0, varefter 0,49 ml 0,1 N NaOH tillsattes fOrsiktigt fran en byrett, tills pH hade stigit till 6,5. Den harvid bildade losningen av natriumsaltet av cephalosporin C frystorkades. Det torkade materialet kristalliserades genom upplOsning av detsamma i en ringa mangd vatten och langsam indunstning av losningen. Det torra, kristalliserade materialet (39 mg) befriades frail icke kristalliserade fOroreningar genom tvattning med en ringa mangd 70-procentig (v/v) etanol.

Exempel 5. En Riming av ratt cephalosporin C surgjordes till pH 2,5. Den Mills sedan vid 37° C under 2 h, varunder all cephalosporin-N-aktivitet fOrstordes. Losningen frystorkades, sedan dess pH hade installts pa 5,0. Produkten. (4 g med 0,08 enheter per mg) skakades med 8 ml pyridinacetatlosning med pH 5,0 (se exempel 7). Nagra fa' drop-par pyridin tillsattes for att halla losningens reaktion vid pH 5,0. Efter c:a 20 min centrifugerades losningen och den klara vatskan dekanterades ay. Fallningen skakades med ytterligare 4 ml buff ert och centrifugerades pa nytt, varefter den andra satsen av klarnad vatska (12 ml) i 4 portioner pa 3 ml infordes i en pelare pa 2 x 42 cm av Amberlite IR4B (79 % svarande mot sikt nr 40-60 och 20 % mot sikt nr 60-100). Hartset hade buff-rats med pyridinacetatbuffert (pH 5,0) sasom beskrives i exempel 7. LOsningen av raft cephalosporin C fOljdes av tva portioner ph 3 ml vardera av pyridinacetatbuffert, varefter pelaren drevs pa samma satt som enligt exempel 7.

Cephalosporinet C aterfanns i effluatvolymen 280-500 ml. Materialet i effluatvolymen 387443 ml befriades frail pyridinacetatbuffert och falldes med aceton sasom beskrives i exempel 7, varvid man erholl 18 mg av den fria syraformen av cephalosporin C i orent tillstand. Den fria syran lostes i 2,0 ml vatten och 0,14 ml 0,1 N NaOH tillsattes, tills pH stag till 6,5. Da denna ltisning hade indunstat langsamt, utskildes nagot av materialet i kristalliserad form. Blandningen av kristalliserat och icke kristalliserat material tvattades med 40-procentig etanol pi ett filter, varvid man fick 2 mg av det kristalliserade natriumsaltet av cephalosporin C. Ur den Rr tvattningen anvanda etanolen erholls 14 mg av ett material med 2,5 enheter/mg. Den aterstaende lOsningen frail effluatvolymen 280-500 ml uppskattades innehalla 23 mg material med 2,5 enheter/mg.

Det ma framhallas, att de ovan beskrivna exemplen av foredragna utforingsformer endast ha till uppgift att belysa uppfinningen, samt att olika avvikelser kurma vidtagas utan att man darfor overskrider uppfinningens ram. Det ma i detta sammanhang omnamnas, att vilket som heist av de losningssystem, som ha anvants vid separering av cephalosporin C frail cephalosporin-N-penillinsyra genom motstromsfordelning, kan tillampas pa fordelningskromatografering, varvid en av faserna absorberas pa en barare, sasom kiselgur, eller att de kunna anvandas i en kontinuerlig extraktionspelare, exempelvis den som beskrives av Scheibel & Karr (Ind. Eng. Chem. 42, p. 1048, 1950).

Det har namnts ovan, att cephalosporin C Or okansligt for penicillinas, dvs. att det forblir i 6— 192 926 — huvudsak opaverkat darav. Detta dr en mycket fordelaktig egenskap hos det nya antibiotikumet, emedan den Or detsamma vardefullt mot sa.dana mikroorganismer, som alstra penicillinas och darfor aro mer eller mindre resistenta mot penicillin. Cephalosporin C kan darfor anvandas for att skydda penicillin mot inaktivering genom sadana mikroorganismer.

Prov ha visat, att cephalosporin C forblir i huvudsak opaverkat av rent penicillinas alstrat av stammar av B. subtilis och B. cereus. Foljande tabell visor de mangder av olika penicillinaspreparat, som fordras fOr astadkommande av en 50- procentig inaktivering uttryckt i den mangd, som fordras fOr cephalosporin C, dividerad med den mangd, som fordras for samma mangd cephalosporin N.

Tahell 1.

Penieillinas Ursprung B. subtilis (slam 749) B. cereus (NRRL 569) B. cereus (NRRL 569) B. cereus 5/B De lagre, relativa mangder, vilka anges for de mindre rena penicillinaspreparaten, hero troligen pa narvaro av fororeningar med skadlig inverkan pa cephalosporin C.

Cephalosporinets C verkan mot olika mikroorganismer framgar av foljande tabell, vilken emellertid icke far betraktas sasom angivande det fullstandiga bakteriologiska spektrumet och endast belyser den antibiotiska verkan, som liar kunnat faststallas hittills.

Tabell 6.

Organism LAgsta koneentration, som forhindrar tillvdxt under 24 h i pg/m1 Staph. aureus, Heatleystammen, penicillinkanslig 50-100 Staph. aureus, penicillinresistent Str. pyogenes B. anthracis N. meningilidis 1,6 N. gonorrhoeae 1,6 H. pertussis 1,6 H. influenzae 12, S. typhi S. paratyphi B.

S. typhimurium V. cholerae Bad. friedlanderi Bact. coli 200 Cephalosporinets C egenskaper belysas genom bifogade ritningar, ddr fig. 1 utgor den ultra violetta absorptionskurvan och fig. 2 är det infraroda spektrumet.

Claims (10)

Patentansprak:

1. Satt att framstalla ett nytt, saval mot grampositiva som gramnegativa bakterier verksamt antibiotikum, kannetecknat ddrav, att ett naringssubstrat, som forjases med en art av Cephalosporium och som forutom det kanda antibiotiska amnet cephalosporin N innehaller annan, antibiotiskt verksam substans, eller lOsningar, som innehaller dessa antibiotiska substanser och som erhallits ur sadana forjasta naringssubstrat, behandlas for forstoring av cephalosporin N genom att naringssubstratet utsattes for inverkan av penicillinas eller ocksa. Mlles vid ett pH-varde av 2,5-5,5, varefter man fran naringssubstratet isolerar det nya antibiotiska amnet, som hdr benamnes cephalosporin C och som kan identifieras, dels darigenom att dess natriumsalt i vattenlos- ning liar en vridningsfOrmaga av [a]g =103°, dels darigenom att det ger en absorptionskurva for ultraviolett enligt fig. 1 och for infrarOtt enligt fig. 2 och dels darigenom att detsamma är okansligt for penicillinas, bildat av B. Subtilus.

2. sat enligt patentanspraket 1, kannetecknat darav, att cephalosporin N fOrstores genom att naringssubstratet upphettas vid ett pH-varde av 2,5-5,0.

3. Satt enligt patentanspraket 1 eller 2, Munetecknat darav, att cephalosporin C isoleras frau det behandlade naringssubstratet genom losningsmedelsextraktion.

4. Satt enligt patentanspraket 1 eller 2, kannetecknat darav, att cephalosporin C isoleras Iran det behandlade naringssubstratet genom adsorption pa ett jonbytarmaterial och efterfoljande eluering ur delta med en vattenhaltig elueringslosning.

5. Satt enligt patentanspraket 4, kannetecknat darav, att elueringen genomfores med en vattenhaltig buffertlosning buffrad till ett pH av 2,58,0.

6. Satt enligt patentanspraket 5, kannetecknat darav, att buffertlosningen bildas genom neutralisering av en svag, tertiar bas.

7. Satt enligt patentanspraket 6, kannetecknat darav, att buffertlosningen framstalles genoni neutralisering av pyridin.

8. Satt enligt patentanspraket 4 eller 5, ka.nnetecknat darav, att cephalosporin C adsorberas pa ett konstharts.

9. Satt enligt nagot av patentanspraken 4-8, kannetecknat darav, att den eluerade lOsningen av cephalosporin G behandlas med en jordalkalimetall for fanning ay syran ur buffertlosningen och bildning av jordalkalimetallsaltet av cephalosporin C, vilket omvandlas till natriumsaltet genom att losningen bringas i kontakt med ett katjonbytarmaterial i natriumformen. Renhet Relativ mangd C/N ra> 100 ra renad kristalliserad 10000 — —7

10. satt enligt nagot av patentanspraken 1-9, kannetecknat darav, att det forjasta naringssubstratet forst renas genom kontakt med aktivt kol, som elueras, varefter eluatet adsorberas pa aluminiumoxid, som sedan elueras till biklning av en renad losning innehallande de bagge typerna cephalosporin. Anforda publikationer: Chemical abstracts 46 (1952), sp. 10295. (Antibiotic production by species of cephalosporium). Nature 175 (1955), p. 548.