RU96124092A - Способ обнаружения целевой нуклеиновой кислоты - Google Patents

Claims (16)

1. Способ обнаружения целевой нуклеиновой кислоты, который содержит стадии: амплифицирования целевой нуклеиновой кислоты для получения продукта амплификации с использованием полимеразы, первого праймера с или без сегмента, несмежного с первой праймирующей последовательностью, и второго праймера с или без сегмента, несмежного со второй праймирующей последовательностью в присутствии олигонуклеотида, который является неспособным действовать как праймер для указанной полимеразы, где указанный нуклеотид имеет по меньшей мере 5 последовательных нуклеотидов, полностью комплементарных по меньшей мере 5 последовательным нуклеотидам указанного первого праймера; и обнаружения присутствия целевой нуклеиновой кислоты мониторингом ее амплификации.

2. Способ по п. 1, в котором указанную стадию обнаружения проводят мониторингом указанного продукта амплификации целевой нуклеиновой кислоты на геле после электрофореза.

3. Способ по п. 1, в котором первый флюорофор ковалентно связывают с указанным первым праймером и второй флюорофор ковалентно связывают с указанным олигонуклеотидом, соответственно, причем один из указанных первого и второго флюорофоров является донорным флюорофором, а другой является акцепторным флюорофором, так что, когда указанный первый праймер и указанный олигонуклеотид гибридизуют, указанный донорный флюорофор и указанный акцепторный флюорофор находятся в тесной близости для того, чтобы происходила передача энергии резонанса между ними; и, кроме того, указанную стадию обнаружения осуществляют мониторингом изменения флюоресцентной эмиссии указанного акцепторного флюорофора при облучении указанного донорного флюорофора возбуждающим светом, указанное изменение является функцией той степени, насколько указанный первый праймер диссоциирован от указанного олигонуклеотида и включен в указанный продукт амплификации целевой нуклеиновой кислоты.

4. Способ по п. 1, в котором указанный первый праймер содержит сегмент, несмежный с указанной первой праймирующей последовательностью.

5. Способ по п. 4, в котором указанный олигонуклеотид имеет по меньшей мере 5 последовательных нуклеотидов, полностью комплементарных по меньшей мере к 5 последовательным нуклеотидам в указанном несмежном сегменте указанного первого праймера.

6. Способ по п.1, в котором указанный первый праймер не содержит сегмента, несмежного с указанной первой праймирующей последовательностью.

7. Способ по п.1, в котором указанную стадию амплифицирования проводят в присутствии дополнительного олигонуклеотида, который является неспособным действовать как праймер для указанной полимеразы, в котором указанный дополнительный олигонуклеотид имеет по меньшей мере 5 последовательных нуклеотидов, полностью комплементарных по меньшей мере к 5 последовательным нуклеотидам второго праймера.

8. Набор для обнаружения целевой нуклеиновой кислоты, содержащий: первый праймер с или без сегмента, несмежного с первой праймирующей последовательностью, и второй праймер с или без сегмента, несмежного со второй праймирующей последовательностью, причем указанные первый и второй праймеры предназначены для использования с полимеразой для амплификации целевой нуклеиновой кислоты; и олигонуклеотид, который является неспособным действовать как праймер для указанной полимеразы и имеет по меньшей мере 5 последовательных нуклеотидов, полностью комплементарных по меньшей мере к 5 последовательным нуклеотидам указанного первого праймера; где каждый из указанного первого праймера, указанного второго праймера и указанного олигонуклеотида содержит 10-50 нуклеотидов.

9. Набор по п.8, в котором указанный первый праймер и указанный олигонуклеотид представлены как дуплекс.

10. Набор по п.8, в котором указанный олигонуклеотид имеет по меньшей мере 8 последовательных нуклеотидов, полностью комплементарных по меньшей мере к 8 последовательным нуклеотидам указанного первого праймера.

11. Набор по п.10, в котором первый флюорофор ковалентно связан с указанным первым праймером и второй флюорофор ковалентно связан с указанным олигонуклеотидом, причем один из указанных двух флюорофоров является донорным флюорофором, а другой является акцепторным флюорофором, так что, когда указанный первый праймер и указанный олигонуклеотид гибридизованы, указанный донорный флюорофор и указанный акцепторный флюорофор находятся в тесной близости для того, чтобы происходила передача энергии резонанса между ними.

12. Набор для обнаружения целевой нуклеиновой кислоты, содержащий: первый олигонуклеотид, содержащий 10-50 нуклеотидов с первым флюорофором, ковалентно связанным с ним, причем указанный первый олигонуклеотид является неспособным действовать как праймер для применения с полимеразой в амплификации целевой нуклеиновой кислоты; и второй олигонуклеотид, содержащий 5-30 нуклеотидов, со вторым флюорофором, ковалентно связанным с ним, причем указанный второй олигонуклеотид имеет свободную 3' ОН и способен гибридизоваться посредством по меньшей мере 5 последовательных полностью комплементарных нуклеотидных спариваний с указанным первым олигонуклеотидом; где указанный первый олигонуклеотид перекрывает 3' конец указанного второго олигонуклеотида 1-12 нуклеотидами, а также указанные первый и второй флюорофоры, один из которых является донорным флюорофором, а другой - акцепторным флюорофором, находятся в тесной близости, когда указанный первый олигонуклеотид гибридизуется с указанным вторым олигонуклеотидом для обеспечения передачи энергии резонанса между ними.

13. Набор по п.12, в котором указанный первый олигонуклеотид содержит 15-40 нуклеотидов и перекрывает 3' конец указанного второго олигонуклеотида 4-8 нуклеотидами и способен гибридизоваться посредством по меньшей мере 8 последовательных полностью комплектарных нуклеотидных спариваний с указанным первым олигонуклеотидом.

14. Набор по п.13, в котором указанные первый и второй олигонуклеотиды представлены как дуплекс.

15. ДНК дуплекс, содержащий: первый олигонуклеотид, который является способным действовать как праймер, с или без сегмента, несмежного с его праймирующей последовательностью, для применения с полимеразой в амплификации целевой нуклеиновой кислоты; второй олигонуклеотид, который гибридизован посредством по меньшей мере 5 последовательных полностью комплементарных нуклеотидных спариваний с указанным первым олигонуклеотидом, причем второй олигонуклеотид не способен действовать как праймер для указанной полимеразы; и первый флюорофор, ковалентно связанный с указанным первым олигонуклеотидом и второй флюорофор, ковалентно связанный с указанным вторым олигонуклеотидом, причем один из указанных двух флюорофоров является донорным флюорофором, а другой является акцепторным флюорофором, так что, когда указанные два флюорофора находятся в тесной близости, возможна передача энергии резонанса между ними; где каждый из указанного первого олигонуклеотида и указанного второго олигонуклеотида содержит 10-50 нуклеотидов.

16. Композиция, содержащая: первый одноцепочечный олигонуклеотид, содержащий 10-50 нуклеотидов, указанный олигонуклеотид, содержащий 10-50 нуклеотидов, указанный олигонуклеотид, способный действовать как праймер для применения с полимеразой в амплификации целевой нуклеиновой кислоты; первый флюорофор, ковалентно связанный с указанным олигонуклеотидом; второй одноцепочечный олигонуклеотид, содержащий 5-30 нуклеотидов, и имеющий свободную 3' ОН, причем указанный второй олигонуклеотид гибридизован посредством по меньшей мере 5 последовательных полностью комплементарных нуклеотидных спариваний с указанным первым олигонуклеотидом, а указанный первый олигонуклеотид перекрывает 3' конец указанного второго олигонуклеотида 1-12 нуклеотидами; второй флюорофор, ковалентно связанный с указанным вторым олигонуклеотидом, указанные первый и второй флюорофоры, один из которых является донорным флюорофором, а другой - акцепторным флюорофором, находящимися в тесной близости для обеспечения передачи энергии резонанса между ними.