RU96107212A - Комбинация днк-последовательностей, способствующая образованию модифицированного крахмала в растительных клетках и растениях, способы продуцирования этих растений и модифицированный крахмал, получаемый из этих растений - Google Patents

Claims (24)

1. Комбинация ДНК-последовательностей, состоящая из: a) кодирующей области ветвящего фермента или ее части, обладающей способностью кодировать ветвящий фермент, и b) кодирующей области диспропорционирующего фермента или ее части, обладающей способностью кодировать диспропорционирующий фермент, каждая из которых соединена с промотором в антисмысловой ориентации и локализована на одной плазмиде, которая при введении в геном трансгенных растений приводит к синтезу транскриптов, ингибирующих синтез ветвящего фермента и диспропорционирующего фермента в клетках, в результате чего в этих клетках образуется модифицированный крахмал, который по своей степени ветвления и по своему содержанию фосфата отличается от крахмала, синтезируемого в клетках в природных условиях.

2. Комбинация ДНК-последовательностей, состоящая из: a) кодирующей области ветвящего фермента или ее части, обладающей способностью кодировать ветвящий фермент, и b) кодирующей области диспропорционирующего фермента или ее части, обладающей способностью кодировать диспропорционирующий фермент, каждая из которых соединена с промотором в антисмысловой ориентации и локализована на отдельных плазмидах, причем эти плазмиды при их одновременном или последовательном введении в геном трансгенных растений приводят к синтезу транскриптов, которые ингибируют продуцирование ветвящего фермента и диспропорционирующего фермента в клетках, в результате чего в этих клетках образуется модифицированный крахмал, который по своей степени ветвления и по своему содержанию фосфата отличается от крахмала, синтезируемого в клетках в природных условиях.

3. Комбинация ДНК-последовательностей по пп. 1 и 2, отличающаяся тем, что кодирующие области ветвящего и диспропорционирующего ферментов происходят от Solanum tuberosum.

4. Комбинация ДНК-последовательностей по пп. 1 и 3, отличающаяся тем, что кодирующая область ветвящего фермента и кодирующая область диспропорционирующего фермента локализованы на плазмиде p35S-anti-D-anti-BE (DSМ 9367).

5. Комбинация ДНК-последовательностей по пп. 2 и 3, отличающаяся тем, что кодирующая область ветвящего фермента локализована на плазмиде р35S-anti-ВЕ (DSМ 6144), а кодирующая область диспропорционирующего фермента локализована на плазмиде р35SН-anti-D (DSМ 8479).

6. Комбинация ДНК-последовательностей по пп. 2 и 3, отличающаяся тем, что кодирующая область ветвящего фермента локализована на плазмиде p35SH-anti-BE (DSМ 9366), а кодирующая область диспропорционирующего фермента локализована на плазмиде р35S-anti-D (DSМ 9365).

7. Способ получения трансгенных растений, способных синтезировать модифицированный крахмал путем стабильной интеграции комбинации ДНК-последовательностей по пп. 1-6 в геном растительной клетки с последующей регенерацией целых растений из этих трансформированных растительных клеток, отличающийся тем, что этот способ представляет собой: A) одностадийный способ, включающий следующие этапы: а) получение комбинации ДНК-последовательностей, состоящей из следующих отдельных последовательностей: i) в каждом случае одного промотора, который является активным в растениях и обеспечивает образование РНК в целевых тканях или целевых клетках; ii) в каждом случае одной кодирующей области ветвящего фермента или ее части, способной кодировать ветвящий фермент, и кодирующей области диспропорционирующего фермента или ее части, способной кодировать диспропорционирующий фермент, где указанные области соединены с промотором, упомянутым в (i), так, что в результате этого образуется транскрипт некодирующей нити (антисмысловое слияние), и iii) в каждом случае одной 3'-нетранслируемой последовательности, которая в растительных клетках приводит к терминации транскрипции и добавлению poly-А-остатков к 3'-концу РНК и которая соединена с последовательностью, упомянутой в (ii), так, что 3'-нетранслируемая последовательность присоединяется к 3'-концу некодирующей нити, упомянутой в (ii); b) перенос и встраивание комбинаций ДНК-последовательностей в геном растения в целях продуцирования трансгенных растительных клеток и c) регенерация целых интактных растений из трансформированных растительных клеток, или В) одностадийный способ, включающий следующие этапы: а) получение комбинации ДНК-последовательностей, состоящей из следующих отдельных последовательностей: i) промотора, который является активным в растениях и обеспечивает образование РНК в нужных целевых тканях и целевых клетках; ii) гибридной последовательности, состоящей из кодирующей области ветвящего фермента или ее части, способной кодировать ветвящий фермент, и кодирующей области диспропорционирующего фермента или ее части, способной кодировать диспропорционирующий фермент, соединенных вместе так, что обе эти кодирующие области считываются в одном и том же направлении (смысловом или антисмысловом), а также соединенных с промотором, упомянутым в (i), так, что в результате этого образуется транскрипт некодирующей нити гибридной последовательности (антисмысловое слияние), и iii) 3'-нетранслирумой последовательности, которая в растительных клетках приводит к терминации транскрипции и добавлению poly-А-остатков в 3'-концу РНК и которая соединена с последовательностью, упомянутой в (ii), так, что 3-нетранслируемая последовательность присоединяется к 3'-концу некодирующей нити, упомянутой в (ii); b) перенос и встраивание комбинаций ДНК-последовательностей в геном растения в целях продуцирования трансгенных растительных клеток и c) регенерация целых интактных растений из трансформированных растительных клеток или C) двустадийный способ, в котором сначала ДНК-последовательность, состоящую из следующих отдельных последовательностей: iv) промотора, который является активным в растениях и обеспечивает образование РНК в целевых тканях или целевых клетках, v) кодирующей области ветвящего фермента или ее части, способной кодировать ветвящий фермент, соединенной с промотором, упомянутым в (iv), так, что в результате этого образуется транскрипт некодирующей нити (антисмысловое слияние), и vi) 3'-нетранслируемой последовательности, которая в растительных клетках приводит к терминации транскрипции и добавлению poly-А-остатков к 3'-концу РНК и которая соединена с последовательностью, упомянутой в (v), так, что эта 3'-нетранслируемая последовательность присоединяется к 3'-концу некодирующей нити, упомянутой в (v), переносят и встраивают в геном растительной клетки, после чего из этой генетически модифицированной растительной клетки регенерируют целое растение, а затем путем повторной трансформации клеток этого генетически модифицированного растения другую ДНК-последовательность, состоящую из следующих отдельных последовательностей: vii) промотора, который является активным в растениях и обеспечивает образование РНК в целевых тканях или целевых клетках, viii) кодирующей области диспропорционирующего фермента или ее части, способной кодировать диспропорционирующий фермент, соединенной с промотором, упомянутым в (vii), так, что в результате этого образуется транскрипт некодирующей нити (антисмысловое слияние), и ix) 3'-нетранслируемой последовательности, которая в растительных клетках приводит к терминации транскрипции и к добавлению poly-А-остатков к 3'-концу РНК и которая соединена с последовательностью, упомянутой в (viii), так, что эта 3'-нетранслируемая последовательность присоединяется к 3'-концу некодирующей нити, упомянутой в (viii), также переносят и встраивают в геном растительной клетки, после чего из трансформированных таким образом растительных клеток, содержащих обе указанные кодирующие области или их части, способные кодировать ветвящий фермент и диспропорционирующий фермент, снова регенерируют целое растение, или D) двустадийный способ, описанный в пункте (C), где кодирующая область, упомянутая в (v), кодирует не ветвящий фермент, а диспропорционирующий фермент, а кодирующая область, упомянутая в (viii), кодирует не диспропорционирующий фермент, а ветвящий фермент.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что промотор, упомянутый в (i), (iv) или (vii), представляет собой промотор 35S вируса мозаики цветной капусты.

9. Способ по п. 7, отличающийся тем, что промотор, упомянутый в (i), (iv) или (vii), представляет собой промотор В33 гена пататина Solanum tuberosum.

10. Способ по пп. 7 и 8, отличающийся тем, что в случае вариантов (С) и (D) для введения комбинации ДНК в клетки используют плазмиды р35S-anti-ВЕ (DSМ 6144) и р35SH-anti-D (DSМ 8479), или р35SH-anti-ВЕ (DSМ 9366) и р35S-anti-D (DSМ 9365), или их производные, обладающие способностью кодировать ветвящий и диспропорционирующий ферменты.

11. Способ по пп. 7 и 8, отличающийся тем, что в случае вариантов (В) для введения комбинации ДНК в клетки используют плазмиду р35S-anti-D-anti-ВЕ (DSМ 9367) или ее производное, обладающее способностью кодировать ветвящий и диспропорционирующий ферменты.

12. Растительные клетки, содержащие комбинацию ДНК-последовательностей по пп.1-6.

13. Применение растительных клеток по п. 12 для продуцирования растений, синтезирующих модифицированный крахмал, который по своим степени ветвления и содержанию фосфата отличается от крахмала, синтезируемого клетками в природных условиях.

14. Крахмалпродуцирующие трансгенные растения, полученные способом по пп. 7-11, отличающиеся тем, что они синтезируют крахмал, который по своим степени ветвления и содержанию фосфата отличается от крахмала, синтезируемого клетками крахмалообразующих растений в природных условиях.

15. Крахмалпродуцирующее растение по п. 14, отличающееся тем, что оно является продуктивным растением картофеля.

16. Применение комбинации ДНК-последовательностей по пп. 1-6 для получения растений, синтезирующих модифицированный крахмал, который по своей степени ветвления и содержанию фосфата отличается от крахмала, синтезируемого клетками в природных условиях.

17. Применение плазмид р35S-anti-ВЕ (DSМ 6144) и р35SН-аnti-D) (DSM 8479) или p35S-anti-D (DSМ 9365) и р35SН-anti-ВЕ (DSМ 9366) в комбинации для трансформации растительных клеток для того, чтобы в этих клетках продуцировался модифицированный крахмал, который по своим степени ветвления и содержанию фосфата отличался бы от крахмала, синтезируемого клетками в природных условиях.

18. Применение плазмиды p35S-anti-D-anti-BE (DSМ 9367) для трансформации растительных клеток в целях продуцирования в этих клетках модифицированного крахмала, который по своей степени ветвления и содержанию фосфата отличался бы от крахмала, синтезируемого клетками в природных условиях.

19. Модифицированный крахмал, который по своим степени ветвления и содержанию фосфата отличается от крахмала, синтезируемого клетками в природных условиях, и который может быть выделен из растений, заявленных в пп. 14 и 15.

20. Модифицированный крахмал, который по своим степени ветвления и содержанию фосфата отличается от крахмала, синтезируемого клетками в природных условиях, и который может быть выделен из растений, заявленных в п. 12.

21. Применение крахмала по пп. 19 и 20 для получения пищевых и промышленных продуктов.

22. Плазмида p35SH-anti-D (DSМ 8479) в комбинации с плазмидой р35S-anti-ВЕ (DSМ 6144).

23. Плазмида р35S-anti-D (DSМ 9365) в комбинации с плазмидой р35SН-anti-ВЕ (DSМ 9366).

24. Плазмида p35S-anti-D-anti-BE (DSМ 9367).