Claims (3)
1. Способ введения чужеродных генов в геномы грамотрицательных микроорганизмов, включающий интродукцию в бактериальную клетку плазмиды, содержащей чужеродную ДНК в транспозируемом генетическом элементе, селекцию и отбор рекомбинантных штаммов, отличающийся тем, что для введения чужеродных генов используют плазмидный вектор рКС47м.1. The method of introducing foreign genes into the genomes of gram-negative microorganisms, including the introduction into the bacterial cell of a plasmid containing foreign DNA in the transposed genetic element, selection and selection of recombinant strains, characterized in that for the introduction of foreign genes using the plasmid vector pKS47m.
2. Плазмидный вектор рКС47м для введения чужеродных генов в геномы грамотрицательных микроорганизмов имеет размер 22,9 т.п.н. и состоит из следующих элементов: Hind III - рестрикт (5,3 т.п.н.) из плазмиды pEG 5086 с генами А и В фага Мu и участком, ответственным за репликацию вектора (rep pMB1); Hind III - рестрикт (4,5 т.п.н.) с геном резистентности к гентамицину из плазмиды рКС8/2 и встроенным дефектным (А- В-) фагом Мu (Мu dI5086-1), способным при цис-комплементации к встраиванию в геном реципиентной клетки и содержащим в качестве генетического маркера ген устойчивости к мономицину, уникальный сайт Bam HI, предназначенный для клонирования чужеродных генов, а также сайт Hind III; Hind III - рестрикт (3,5 т.п.н.) из плазмиды рКС 8/2 с геном резистентности к хлорамфениколу с расположенным в нем сайтом для Eco RI и промотором β- лактамазы (Pβ), предназначенным для конститутивной экспрессии генов А и В фага Мu, емкость вектора 5,5 МД, в грамотрицательные микроорганизмы может передаваться трансформацией и мобилизацией коньюгативными плазмидами, генетические маркеры - Kmr, Gmr и Сmr.2. The plasmid vector pKS47m for introducing foreign genes into the genomes of gram-negative microorganisms has a size of 22.9 TPN and consists of the following elements: Hind III - restriction (5.3 kb) from plasmid pEG 5086 with genes A and B of the phage Mu and the region responsible for vector replication (rep pMB1); Hind III - restriction (4.5 kb) with the gentamicin resistance gene from plasmid pKS8 / 2 and the built-in defective (A - B - ) phage Mu (Mu dI5086-1), capable of cis complement complement in the genome of the recipient cell and containing the monomycin resistance gene as a genetic marker, the unique Bam HI site for cloning foreign genes, as well as the Hind III site; Hind III - a restriction (3.5 kb) from plasmid pKS 8/2 with the chloramphenicol resistance gene with the Eco RI site located in it and the β-lactamase (Pβ) promoter designed for constitutive expression of genes A and In phage Mu, the capacity of the vector is 5.5 MD, in gram-negative microorganisms can be transmitted by transformation and mobilization by conjugative plasmids, genetic markers are Km r , Gm r and Cm r .
3. Способ конструирования рекомбинантной плазмиды рКС47м, заключающийся в том, что на плазмиде, способной к репликации в грамотрицательном микроорганизме, клонируют in vitro гены А и В фага Мu, отвечающие за его транспозицию, и заменяют собственный термоиндуцибельный промотор фага Мu на конститутивный промотор β-лактамазы, затем в геном полученного гибрида in vivo встраивают А- В- -фаг мини- Мu dI 5086-1.3. A method of constructing a recombinant plasmid pKS47m, namely, that in a plasmid capable of replication in a gram-negative microorganism, the A and B genes of phage Mu responsible for its transposition are cloned in vitro and replace their own thermo-inducible phage Mu promoter with the constitutive β- promoter lactamases, then A - B - phage mini-Mu dI 5086-1 is inserted into the genome of the obtained hybrid in vivo.