RU2092556C1

RU2092556C1 - Method of insertion of the foreign genes to genomes of gram-negative microorganisms, plasmid vector pkc 47m for insertion of foreign genes to genomes of gram-negative microorganisms, method of plasmid vector pkc 47m constructing

Info

Publication number: RU2092556C1
Application number: RU95115284A
Authority: RU
Inventors: С.Н. Янов; И.В. Дармов; И.В. Маракулин
Original assignee: Научно-исследовательский институт микробиологии Министерства обороны Российской Федерации
Priority date: 1995-08-29
Filing date: 1995-08-29
Publication date: 1997-10-10

Abstract

FIELD: applied genetics, microbiology. SUBSTANCE: method involves the use of plasmid vector pKC 47m (size is 22.9 t.n.p.) and capacity 5.5 mDa. Vector can be inserted to the gram-negative microorganisms by transformation and mobilization with conjugating plasmids. Method involves the construction of recombinant plasmid pKC 47m and involves the following events: cloning in vitro genes A and B of phage Mu on plasmid showing capability to replication in gram-negative microorganism followed by replacement of the own termoinducible promoter of the phage Mu with the constitutive promoter of β-lactamase. Then A^-B^--phage-mini-Mu d1 5086-1 is inserted to genome in vivo. EFFECT: improved method of gene insertion. 4 cl, 2 dwg, 1 tbl

Description

Изобретение относится к способам введения чужеродного генетического материала в бактерии с использованием векторов в частности к способам введения чужеродных генов в геномы грамотрицательных микроорганизмов. Изобретение может быть использовано в прикладных генетических исследованиях для получения различных производных грамотрицательных микроорганизмов. The invention relates to methods for introducing foreign genetic material into bacteria using vectors, in particular, to methods for introducing foreign genes into the genomes of gram-negative microorganisms. The invention can be used in applied genetic research to obtain various derivatives of gram-negative microorganisms.

Известен способ введения чужеродных генов в геномы грамотрицательных микроорганизмов, основанный на использовании плазмиды pMTF59. Указанная плазмида содержит в своем геноме транспозоны Tn5 и Tn9 и проявляет температурную нестабильность в клетках Enterobacteriaceae (Воложанцев Н.В. Данилович В.П. Смирнов С.П. Голуб Е.И. Встраивание транспозона устойчивости к ампициллину в хромосому Escherichia coli K-12 и плазмиды // Генетика. - 1979. тXY, N 2& с. 209-219). При культивировании бактерий, содержащих pMTF59, при температуре 37^oC в питательной среде с добавлением канамицина или хлорамфеникола, транспозоны Th5(Km) и Tn9(Cm) встраиваются в хромосому хозяина, вызывая различного рода мутации, а сама плазмида при этом элиминирует их клеток.A known method of introducing foreign genes into the genomes of gram-negative microorganisms, based on the use of plasmid pMTF59. The indicated plasmid contains Tn5 and Tn9 transposons in its genome and exhibits temperature instability in Enterobacteriaceae cells (Volozhantsev N.V. Danilovich V.P. Smirnov S.P. Golub E.I.Injection of the ampicillin resistance transposon into the Escherichia coli K-12 chromosome and plasmids // Genetics. - 1979.TXY, N 2 & p. 209-219). When culturing bacteria containing pMTF59 at a temperature of 37 ^° C in a nutrient medium with the addition of kanamycin or chloramphenicol, the Th5 (Km) and Tn9 (Cm) transposons are inserted into the host chromosome, causing various mutations, and the plasmid itself eliminates their cells.

К недостаткам этого способа следует отнести нестабильность геномов получаемых микроорганизмов. Указанный недостаток обусловлен способностью транспозонов, уже встроенных в бактериальную хромосому, к повторным актам транспозиции. Общим с заявленным способам является использование для введения чужеродной ДНК в геномы микроорганизмов плазмиды с мигрирующими генетическими элементами, а также селекция и отбор рекомбинатных штаммов. The disadvantages of this method include the instability of the genomes of the resulting microorganisms. This drawback is due to the ability of transposons already integrated into the bacterial chromosome to repeat transposition acts. In common with the claimed methods is the use of plasmids with migrating genetic elements for introducing foreign DNA into the genomes of microorganisms, as well as the selection and selection of recombinant strains.

Другой известный способ введения чужеродных генов в геномы грамотрицательных микроорганизмов основан на использовании плазмиды pGP618. Плазмида представляет собой гибрид, содержащий клонированные гены A и B фага Mu под контролем сильного термоиндуцибельного промотора PL фага и A^-B^- -фаг мини Mu (Groeneu M. A.M. Timmers E. Vaude Putte P. DNA seguences at the ends of the genome of bacteriophage Mu essential for transpositon // Proc Natl. Acad. Sci. USA. 1985. Vol. 82. P. 6087- 6091). Недостатком этого способа является нестабильность геномов получаемых вариантов микроорганизмов. Указанный недостаток обусловлен тем, что плазмида pGP618 создавалась для изучения процесса транспозиции фага Mu, поэтому при ее конструировании для транскрипции генов A и B был использован термоиндуцибельный промотор фага Mu, что обеспечивало возможность точного отсчета времени начала транспозиции фага мини-Mu. Однако использование промотора PL обусловило необходимость включения в геном бактериальной клетки и репрессора C 1857, клонированного на плазмиде или находящегося в профаге, значительно усложнившего использование плазмиды pGP618 для инсерционного мутагенеза.Another known method for introducing foreign genes into the genomes of gram-negative microorganisms is based on the use of plasmid pGP618. The plasmid is a hybrid containing the cloned A and B genes of the Mu phage under the control of the strong thermo ^- inducible PL phage promoter and the A ^- B ^- phage mini Mu (Groeneu MAM Timmers E. Vaude Putte P. DNA seguences at the ends of the genome of bacteriophage Mu essential for transpositon // Proc Natl. Acad. Sci. USA. 1985. Vol. 82. P. 6087-6091). The disadvantage of this method is the instability of the genomes of the resulting variants of microorganisms. This drawback is due to the fact that the plasmid pGP618 was created to study the transposition process of the Mu phage; therefore, a thermo-inducible promoter of the Mu phage was used to transcribe the A and B genes, which made it possible to accurately track the start time of transposition of the mini-Mu phage. However, the use of the PL promoter necessitated the inclusion in the genome of a bacterial cell and a repressor C 1857, cloned on a plasmid or located in a prophage, which significantly complicated the use of plasmid pGP618 for insertion mutagenesis.

Нестабильность свойств получаемых вариантов микроорганизмов также вызвана сложностью элиминирования плазмиды pGP618 из бактерий после наведения соответствующих мутаций. Длительное присутствие в бактериальной клетке данной плазмиды с функционирующими генами A и B может вызвать многократную транспозицию фага мини-Mu и, как следствие этого, накопление множественных нежелательных мутаций. The instability of the properties of the resulting variants of microorganisms is also caused by the complexity of the elimination of the plasmid pGP618 from bacteria after inducing the corresponding mutations. The prolonged presence of a given plasmid with functioning A and B genes in a bacterial cell can cause multiple transposition of mini-Mu phage and, as a result, the accumulation of multiple unwanted mutations.

Общим заявленным способом является использование для введения чужеродной ДНК в геномы микроорганизмов плазмиды с мигрирующими генетическими элементами, а также селекция и отбор рекомбинантных штаммов. The general claimed method is the use of plasmids with migrating genetic elements for introducing foreign DNA into the genomes of microorganisms, as well as selection and selection of recombinant strains.

Наиболее близким к заявленному является способ введения чужеродных генов в геномы грамотрицательных микроорганизмов, основанный на использовании рекомбинантной плазмиды pP01734 (Castilho B.A. Olfson P. Casadaban M.V. Plasmid insertion mutagenesis and iac gene fusion with mini Mu bacteriophage transposons // J. Bacteriol. 1984. Vol. 185. P. 488-495). Плазмида pP01734 сконструирована встраиванием в плазмиду pSC101 генома фага мини-Mu d11 1734, из которого предварительно были удалены отвечающие за его транспозицию гены A и B. Фаг мини-Mu d11 1734 содержит генетическую детерминанту резистентности к канамицину из транспозона Tn5, что позволяет контролировать процесс транспозиции. Для комплектации функции отсутствующих в фаге Mu d11 1734 генов A и B необходим фаг-помощник. Использование для инсерционного мутагенеза плазмидной ДНК фага Mu d11 1734 требует длительных подготовительных операций. Прежде всего, необходимо в хромосому клеток кишечной палочки, содержащих ДНК фага-помощника Mu Cts, встроить мини-Mu d11 1734. Затем в полученный штамм методом трансформации вводится плазмидная ДНК, подвергаемая мутагенезу. После индукции (путем инкубирования при температуре 42^oC) получают фаголизат, который наряду с фагом-помощником содержит гибридные фаги, образовавшиеся с помощью Mu d11 1734. Небольшая часть гибридных фагов (до 10%) содержит ДНК плазмиды, подвергаемой мутагенезу. Среди них есть рекомбинантные фаги, которые содержат плазмидную ДНК, фланкированную двумя копиями фага Mu d11 1734 в одинаковой ориентации. После введения такой молекулы трансдукцией в рецепиентный rec A^- штамм E. cjli за счет гомологичной рекомбинации образуется гибридная плазмидная ДНК, состоящая из исходной плазмиды и фага Mu d11 1734.Closest to the claimed is a method of introducing foreign genes into the genomes of gram-negative microorganisms, based on the use of the recombinant plasmid pP01734 (Castilho BA Olfson P. Casadaban MV Plasmid insertion mutagenesis and iac gene fusion with mini Mu bacteriophage transposons // J. Bacteriol. 1984. Vol. 185. P. 488-495). Plasmid pP01734 was constructed by inserting into the plasmid pSC101 the genome of the phage mini-d11 Mu 1734, from which genes A and B responsible for its transposition were previously removed. The phage mini-Mu d11 1734 contains the genetic determinant of resistance to kanamycin from the Tn5 transposon, which allows one to control the transposition process . To complete the function of 1734 genes A and B that are absent in the Mu d11 phage, an assistant phage is needed. The use of phage Mu d11 1734 for insertional mutagenesis of plasmid DNA requires lengthy preparatory operations. First of all, it is necessary to insert mini Mu d11 1734 into the chromosome of Escherichia coli cells containing DNA of the phage helper Mu Cts. Then, mutagenesis plasmid DNA is introduced into the obtained strain by transformation method. After induction (by incubation at a temperature of 42 ^° C.), a phagolysate is obtained which, along with the helper phage, contains hybrid phages generated by Mu d11 1734. A small portion of the hybrid phages (up to 10%) contain plasmid DNA that is mutagenized. Among them, there are recombinant phages that contain plasmid DNA flanked by two copies of the phage Mu d11 1734 in the same orientation. After introduction of such molecules into a recipient transduction rec A ^- strain E. cjli due to homologous recombination of the plasmid DNA hybrid is formed, consisting of the original plasmids and phage Mu d11 1734.

К недостаткам данного способа следует отнести, во-первых, ограниченность сферы его применения, т.к. он предназначен для мутагенеза только плазмидной, но не хромосомной ДНК; во-вторых, в фаголизатах присутствует фаг-помощник, который наряду с Mu d11 1734 может встраиваться в геном рецепиента и вызывать множественные мутации, влияющие на жизнеспособность бактерий, их ростовые и другие свойства тем самым снижая стабильность свойств получаемых штаммов микроорганизмов; в-третьих, круг возможных рецепиентов включает лишь те виды и штаммы бактерий, которые обладают рецепторами для фага Mu. Еще одно ограничение связано с тем, что транспозиция фага Mu d11 1734 индуцируется повышением температуры до 42^oC, однако не все виды бактерий могут расти при этой температуре. И, наконец, последний недостаток связан с трудоемкостью использования данной системы для инсерционного мутагенеза.The disadvantages of this method include, firstly, the limited scope of its application, because it is intended for mutagenesis only of plasmid, but not chromosomal DNA; secondly, an assistant phage is present in the phagolysates, which, along with Mu d11 1734, can integrate into the genome of the recipient and cause multiple mutations that affect the viability of bacteria, their growth and other properties, thereby reducing the stability of the properties of the resulting microorganism strains; thirdly, the range of possible recipients includes only those species and strains of bacteria that have receptors for phage Mu. Another limitation is due to the fact that the transposition of the phage Mu d11 1734 is induced by increasing the temperature to 42 ^o C, but not all types of bacteria can grow at this temperature. And finally, the last drawback is associated with the complexity of using this system for insertional mutagenesis.

Общим с заявленным способом является использование для введения чужеродной ДНК в геномы микроорганизмов плазмиды с мигрирующими генетическими элементами, а также селекция и отбор рекомбинантных штаммов. In common with the claimed method is the use of plasmids with migrating genetic elements for introducing foreign DNA into the genomes of microorganisms, as well as the selection and selection of recombinant strains.

Способ конструирования плазмиды, содержащей клонированные генетические детерминанты, ответственные за транспозицию фага Mu, а также A^-B^--фаг мини-Mu d1 5086-1, в доступной литературе не описан.A method for constructing a plasmid containing the cloned genetic determinants responsible for the transposition of the Mu phage, as well as the A ^- B ^- phage mini-Mu d1 5086-1, is not described in the available literature.

Задачами объектов настоящего изобретения являются интеграция введенных чужеродных генов в ДНК хромосомы реципиента, повышение стабильности свойств получаемых штаммов микроорганизмов, расширение круга возможных реципиентов и снижение трудоемкости способа. The objectives of the objects of the present invention are the integration of introduced foreign genes into the DNA of the recipient chromosome, increasing the stability of the properties of the resulting microorganism strains, expanding the range of possible recipients and reducing the complexity of the method.

Для решения поставленных задач способ введения чужеродных генов в геномы грамотрицательных микроорганизмов, включающий интродукцию в бактериальную клетку плазмиды, содержащей чужеродную ДНК в транспозируемом генетическом элементе, селекцию и отбор рекомбинантных штаммов, отличается тем, что для введения чужеродных генов используют плазмидный вектор pKC47м. To solve these problems, the method of introducing foreign genes into the genomes of gram-negative microorganisms, including the introduction into the bacterial cell of a plasmid containing foreign DNA in the transposed genetic element, selection and selection of recombinant strains, is characterized in that plasmid vector pKC47m is used to introduce foreign genes.

Плазмидный вектор pKC47m для введения чужеродных генов в гены грамотрицательных микроорганизмов имеет размер 22,9 т.п.н. и состоит из следующих элементов:
Hind III рестрикт (5, 3 т.п.н.) из плазмиды pEG 5068 с генами A и B фага Mu и участком, ответственным за репликацию вектора (rep pMB1);
Hind III рестрикт (4, 5 т.п.н.) с геном резистентности к гентамицину из плазмиды pKC8/2 и встроенным дефектным (A^-B^-) фагом Mu (Mu d15086-1), способным при цис-комплементации к встраиванию в геном реципиентной клетки и содержащим в качестве генетического маркера ген устойчивости к мономицину, уникальный Bam HI, предназначенный для клонирования чужеродных генов, а также сайт Hind III;
Hind III рестрикт (3, 5 т.п.н.) из плазмиды pKC 8/2 с геном резистентности к хлорафениколу с расположенным в нем сайтом для Eco R1 и промотором β -лактамазы Pβ предназначенная для конститутивной экспрессии генов A и B фага Mu;
Емкость вектора 5,5 МД в грамотрицательные микроорганизмы может передаваться трансформацией и мобилизацией коньюгативными плазмидами, генетические маркеры Km^r, Gm^r и Cm^r.The plasmid vector pKC47m for introducing foreign genes into the genes of gram-negative microorganisms has a size of 22.9 TPN and consists of the following elements:
Hind III restriction (5, 3 kb) from plasmid pEG 5068 with genes A and B of the phage Mu and the region responsible for vector replication (rep pMB1);
Hind III restriction (4.5 kb) with the gentamicin resistance gene from plasmid pKC8 / 2 and the built-in defective (A ^- B ^- ) phage Mu (Mu d15086-1) capable of integrating into cis complementation into the recipient cell genome and containing, as a genetic marker, a monomycin resistance gene, unique Bam HI, designed to clone foreign genes, as well as the Hind III site;
Hind III restriction (3, 5 kb) from plasmid pKC 8/2 with the chloraphenicol resistance gene with the site for Eco R1 and the β-lactamase Pβ promoter for constitutive expression of the A and B genes of phage Mu;
The capacity of the 5.5 MD vector into gram-negative microorganisms can be transmitted by transformation and mobilization of conjugative plasmids, genetic markers Km ^r , Gm ^r and Cm ^r .

Способ конструирования рекомбинантной плазмиды pKC47м, заключается в том, что на плазмиде, способной к репликации в грамотрицательном микроорганизме, клонируют in vivo гены A и B фага Mu, отвечающие за его транспозицию и заменяют собственный термоиндуцибельный промот фага Mu на конструктивный просмотр b -лактамазы, затем в геном полученного гибрида in vivo встраивают A^-B^- -фаг мини Mu d1 5086-1.The method of constructing the recombinant plasmid pKC47m consists in cloning in vivo genes A and B of the phage Mu responsible for its transposition on a plasmid capable of replication in a gram-negative microorganism and replacing the native thermally inducible promoter of the Mu phage with a constructive viewing of β-lactamase, then A ^- B ^- phage mini Mu d1 5086-1 is inserted into the genome of the obtained hybrid in vivo.

Между совокупностью существенных признаков заявляемых объектов и достигаемым техническим результатом существует причинно-следственная связь (см. таблицу). Between the totality of the essential features of the claimed objects and the achieved technical result, there is a causal relationship (see table).

Плазмида pKC47м имеет в своем составе три маркера резистентности к антибиотикам. Генетическая дереминанта резистентности к канамицину (мономицину) локализована в геноме фага mu d1 5086-1, а гены, отвечающие за устойчивость к гентамицину и хлорамфениколу, находятся вне фага и сцеплены с детерминантами, обусловливающими его транспозицию (генами A и B). Плазмида pKC47м, имея относительно большой размер (22,9 т.п.н.), характеризуется сегретационной нестабильностью и утрачивается после одного-двух пересевов в жидкой питательной среде без добавления гентамицина или хлорафеникола. В данном случае это является достоинством гибридной конструкции, так как позволяет при высеве культуры на среду мономицином легко получать большое количество клонов, утративших исходную pKC47м и содержащих только встроенный в геном бактерии A^-B^- -фаг мини Mu d1 5086-1. После встраивания фага мини -Mu в хромосому и элиминиции pKC47м из бактериальной клетки повторная транспозиция фага невозможна из= за отсутствия генов A и B, отвечающих за транспозицию. Плазмида pKC47м может передаваться в реципиентные клетки не только трансформацией, но и мобилизацией конъюгативными плазмидами, например R388 или RP4.Plasmid pKC47m incorporates three antibiotic resistance markers. The genetic determinant of resistance to kanamycin (monomycin) is located in the genome of phage mu d1 5086-1, and the genes responsible for resistance to gentamicin and chloramphenicol are outside the phage and linked to determinants that determine its transposition (genes A and B). Plasmid pKC47m, having a relatively large size (22.9 kb), is characterized by segregation instability and is lost after one or two passages in a liquid nutrient medium without the addition of gentamicin or chlorofenicol. In this case, this is an advantage of the hybrid design, since it is easy to obtain a large number of clones that have lost the original pKC47m and contain only the A ^- B ^- phage mini Mu d1 5086-1 built into the genome when seeding culture with monomycin. After insertion of the mini-Mu phage into the chromosome and elimination of pKC47m from the bacterial cell, repeated transposition of the phage is impossible due to the lack of A and B genes responsible for transposition. Plasmid pKC47m can be transmitted to recipient cells not only by transformation, but also by mobilization by conjugative plasmids, for example, R388 or RP4.

Применение pKC47м не требует фага-помощника, т.к. в отличие от прототипа, в состав генома предлагаемой рекомбинантной плазмиды включены клонированные гены A и B, ответственные за транспозицию фага Mu. В отличие от прототипа значительно уменьшены ограничения по спектру бактериальных хозяев, поскольку имеется возможность использования для переноса рекомбинантной плазмиды не только трансдукции, но и трансформации, как и мобилизации конъюгативными плазмидами R388 или RP4. Кроме того, транспозиция фага мини-Mu d1 5086-1 не зависит от температуры, так как транскрипция генов A и B осуществляется конструктивно с промотора b -лактамазы. Упрощение способа и повышение эффективности инсерционного мутагенеза по сравнению с прототипом обусловливается высокой частотой встраивания фага Mu d1 5086-1 в геном бактерии, быстрой элиминацией плазмиды pKC47м- носителя мини-Mu фага и простотой осуществления переноса этой плазмиды в реципиентные клетки путем мобилизации конъгативными плазмидами. При этом следует подчеркнуть, что в отличие от методик сайт-направленного мутагенеза, в данном случае не требуется знание нуклеотидной последовательности "выключаемого" гена, достаточно лишь иметь в наличии эффективный способ отбора нужных мутантов. The use of pKC47m does not require an assistant phage, as unlike the prototype, the cloned genes A and B responsible for the transposition of the Mu phage are included in the genome of the proposed recombinant plasmid. In contrast to the prototype, restrictions on the spectrum of bacterial hosts are significantly reduced, since it is possible to use not only transduction, but also transformation, as well as mobilization of conjugative plasmids R388 or RP4 for transferring a recombinant plasmid. In addition, the transposition of the phage mini-Mu d1 5086-1 does not depend on temperature, since the transcription of genes A and B is carried out constructively from the β-lactamase promoter. The simplification of the method and the increase in the efficiency of insertion mutagenesis in comparison with the prototype is due to the high frequency of incorporation of the phage Mu d1 5086-1 into the bacterial genome, the rapid elimination of the plasmid pKC47m carrier of mini-Mu phage, and the simplicity of transferring this plasmid to recipient cells by mobilization of conjugative plasmids. It should be emphasized that, in contrast to the methods of site-directed mutagenesis, in this case, knowledge of the nucleotide sequence of the “turn-off” gene is not required, it is enough to have an effective way of selecting the desired mutants.

Плазмида pKC47м позволяет осуществлять мутагенез одновременно и плазмидной, и хромосомной ДНК, получать генетически стабильные мутанты (частный случай выполнения заявляемого изобретения), которые могут быть использованы при конструировании новых вакцинных штаммов и продуцентов антигенов. При условии предварительного включения в геном pKC47м по сайту Bam H1 гетерологичной ДНК в геном бактерий можно встраивать дополнительные генетические детерминанты. Последнее может быть использовано при конструировании полидетерминантных вакцинных штаммов-продуцентов биологически активных веществ. The plasmid pKC47m allows mutagenesis of both plasmid and chromosomal DNA, to obtain genetically stable mutants (a special case of the invention), which can be used in the construction of new vaccine strains and producers of antigens. Subject to the preliminary inclusion of heterologous DNA into the pKC47m genome at the Bam H1 site, additional genetic determinants can be inserted into the bacterial genome. The latter can be used in the construction of polydeterminant vaccine strains producing biologically active substances.

Способ коструирования рекомбинантной плазмиды pKC47м заключается в использовании комбинации методов генетической инженерии in vitro. Первоначально были сконструированы две рекомбинантные плазмиды pEG 5086-1 и pKC4/7(см. фиг. 2). Первая из них (pEG 5086-1)содержала A^-B^- -фаг мини-Mu, не способный к транспозиции. Вторая плазмида имела в своем составе клонированные гены A и B фага Mu, транскрипция которых осуществлялась с промотора b -лактазамы. На втором этапе конструирования было необходимо встроить A^-B^- фаг мини в пазмиду pKC4/7. Для этого в штамм E.coli, содержащий pEG 5068-1, была передана трансформацией плазмида pKC4/7. В результате этого дефектный A^-B^- фаг мини-Mu приобрел способность к транспозиции в бактериальную хромосому и, с небольшой частотой (менее 10^-3), в плазмиду pKC4/7. Плазмида pEG 5086-1 носитель фага Mu при этом элиминировала из клеток E. coli, о чем свидетельствовала утрата ими резистентности к ампициллину при сохранении устойчивости к мономицину (селективный маркер фага Mu d1 5086-1). Отбор клеток E. coli содержащих плазмиду pKC4/7 со встроенным в нее фагом мини Mu d 5086-1, обычными методами селекции был трудно осуществим. По этой причине была выделена из клеточной популяции E. coli общая плазмидная ДНК, которую использовали для трансформации бесплазмидного штамма E. coli 803. Селекцию трансформаторов вели на плотной питательной среде с 10 мкг/мл мономицина. Несколько отобранных Mm^r -трансформантов содержали рекомбинантную плазмидную ДНК, состоящую из pKC4/7 и встроенного в нее фага мини Mu d1 5068-1, что свидетельствовало об эффективности предлагаемого способа конструирования рекомбинантной ДНК.A method for constructing the recombinant plasmid pKC47m using an in vitro combination of genetic engineering methods. Initially, two recombinant plasmids pEG 5086-1 and pKC4 / 7 were constructed (see FIG. 2). The first of them (pEG 5086-1) contained the A ^- B ^- phage mini-Mu, not capable of transposition. The second plasmid contained cloned genes A and B of the phage Mu, which were transcribed from the β-lactazama promoter. At the second design stage, it was necessary to embed the A ^- B ^- phage mini in the pKC4 / 7 pasmid. For this, the plasmid pKC4 / 7 was transferred to E. coli strain containing pEG 5068-1. As a result, the defective A ^- B ^- phage mini-Mu acquired the ability to transpose into the bacterial chromosome and, with a small frequency (less than 10 ^-3 ), into the plasmid pKC4 / 7. Plasmid pEG 5086-1 carrier of phage Mu was eliminated from E. coli cells, as evidenced by their loss of resistance to ampicillin while maintaining resistance to monomycin (selective marker of phage Mu d1 5086-1). The selection of E. coli cells containing plasmid pKC4 / 7 with the built-in phage mini Mu d 5086-1 was difficult to carry out by conventional selection methods. For this reason, total plasmid DNA was isolated from the E. coli cell population, which was used to transform the plasmid-free E. coli 803 strain. The transformers were selected on solid nutrient medium with 10 μg / ml monomycin. Several selected Mm ^r transformants contained recombinant plasmid DNA consisting of pKC4 / 7 and an integrated phage Mu d1 5068-1 phage, which indicated the effectiveness of the proposed method for constructing recombinant DNA.

На фиг. 1 представлена рестрикционная карта плазмиды pKC47м; на фиг. 2 - схема конструирования плазмиды pKC47м. In FIG. 1 shows the restriction map of plasmid pKC47m; in FIG. 2 is a schematic of the construction of plasmid pKC47m.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pKC47м для инсерционного мутагенеза грамотрицательных бактерий. Example 1. Construction of a recombinant plasmid pKC47m for insertional mutagenesis of gram-negative bacteria.

А. Выделение ДНК плазмид рЕG 5086 и рКС8/2. A. Isolation of DNA plasmids pEG 5086 and pKS8 / 2.

Плазмиды pEG 5068 и pKC8/2 служили в качестве исходного генетического материала при конструировании рекомбинантной плазмиды pKC47м. Plasmids pEG 5068 and pKC8 / 2 served as the starting genetic material for the construction of the recombinant plasmid pKC47m.

Первая из них (pEG 5068), хорошо известная по литературным данным (Groisman E. A. Casadaban M.J. Mini-Mu bacteriophage with plasmid replicons for in vivo cloning and lac gene fusing // J.Bacteriol. -1986. -Vol. 168. -P. 357-364), содержит A⁺B⁺ -фаг мини -Mu d1 5086. Вторая плазмида (pKC8/2) была ранее сконструирована встраиванием в вектор pBR328 Pstl рестрикта плазмиды R55 с геном, ответственным за резистентность к гентамицину. Полученный в результате этого гибрид используется здесь как донор двух Hind III рестриктов, 4,5 т. п. н. и 3,5 т.р.н. с генами резистентности к гентамицину и хлорамфениколу соответственно.The first of them (pEG 5068), well known from the literature (Groisman EA Casadaban MJ Mini-Mu bacteriophage with plasmid replicons for in vivo cloning and lac gene fusing // J. Bacteriol. -1986. -Vol. 168. -P. 357-364), contains the A ⁺ B ⁺ phage mini-Mu d1 5086. The second plasmid (pKC8 / 2) was previously constructed by inserting the restriction of plasmid R55 into the pBR328 Pstl vector with the gene responsible for gentamicin resistance. The resulting hybrid is used here as a donor of two Hind III restriction proteins, 4.5 kb. and 3.5 tr. with gentamicin and chloramphenicol resistance genes, respectively.

Клетки E. coli 803, содержащие плазмиды pEG 5068 и pKC8/2, выращивали в бульоне LB (pH 7,2) с аэрацией в течение 18 ч при 37^oC. Для амплификации плазмидной ДНК клетки E. coli обрабатывали хлорамфениколом (25 мкг/мл) с последующим подращиванием в течение 12 ч при температуре 37^oC. Затем клетки осаждали центрифугированием (5000 об./мин, в течение 10 мин при 4^oC). Последующие операции по выделению плазмидной ДНК проводили в соответствии с известной методикой (Маниатис Т. Фриг Э. Стрембрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование /Пер. с анг. под ред. А.А. Баева, К.Г. Скрябина. М. 1984.). Конечную очистку плазмидной ДНК проводили ультрацентрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия. Полученные препараты плазмидной ДНК pEG 5086 и pKC8/2 использовали для конструирования рекомбинатных плазмид pEG 5086-1 и pKC4/7.E. coli 803 cells containing plasmids pEG 5068 and pKC8 / 2 were grown in LB broth (pH 7.2) with aeration for 18 h at 37 ^° C. To amplify plasmid DNA, E. coli cells were treated with chloramphenicol (25 μg / ml), followed by growing for 12 h at a temperature of 37 ^o C. Then the cells were besieged by centrifugation (5000 rpm./min, for 10 min at 4 ^o C). Subsequent operations to isolate plasmid DNA were carried out in accordance with the known method (Maniatis T. Frig E. Strembrook J. Methods of genetic engineering. Molecular cloning / Transl. From the English under the editorship of A. A. Baev, K. G. Skryabin. M . 1984.). The final purification of plasmid DNA was carried out by ultracentrifugation in a density gradient of cesium chloride. The resulting preparations of plasmid DNA pEG 5086 and pKC8 / 2 were used to construct recombinant plasmids pEG 5086-1 and pKC4 / 7.

Б. Конструирование рекомбинатных плазмид pEG 5086 и pKC4/7. B. Construction of recombinant plasmids pEG 5086 and pKC4 / 7.

Схема конструирования рекомбинатных плазмид pEG 5086-1 и pKC4/7 представлена на фиг. 2. На первом этапе конструирования из генома плазмиды pEG 5086 был удален Hind III рестрикт (5,3 т.п.н.), содержащий гены A и B фага Mu и один из двух участков начала репликации этой плазмиды. Образовавшаяся в результате этого плазмида pEG 5086-1 содержала A^-B^- фаг мини -Mu d1 5086-1, не способный к транспозиции. Одновременно для комплектации функции транспозиции A^-B^- -фага мини -Mu d1 5986-1 была сконструирована гибридная плазмида pKC4/7, которая содержала Hind III -рестрикт (5,3 т.п.н.) pEG 5086 с генами A и B, а также два Hind III -рестрикта, 4,5 т.п.н. и 3,5 т.п.н. плазмиды pKC8/2 с генетическими детерминантами резистентности к гентамицину и хлорафениколу соответственно. Гены A и B при конструировании pKC4/7 утратили свой собственный терморегулируемый промотор и транскрибируются конститутивно с промотора b -лактамазы, генетическая детерминанта которой была инактивирована при коструировании pKC8/2.The design scheme for recombinant plasmids pEG 5086-1 and pKC4 / 7 is shown in FIG. 2. At the first stage of constructing, the Hind III restriction (5.3 kb) containing the A and B genes of the phage Mu and one of the two sites of the beginning of replication of this plasmid was removed from the genome of the plasmid pEG 5086. The resulting plasmid pEG 5086-1 contained A ^- B ^- phage mini-Mu d1 5086-1, not capable of transposition. At the same time, to hybridize the transposition function of the A ^- B ^- phage mini-Mu d1 5986-1, a hybrid plasmid pKC4 / 7 was constructed that contained the Hind III restriction (5.3 kb) pEG 5086 with genes A and B as well as two Hind III restriction, 4.5 kb and 3.5 kb plasmids pKC8 / 2 with genetic determinants of resistance to gentamicin and chloraphenicol, respectively. When constructing pKC4 / 7, genes A and B lost their own thermoregulable promoter and are transcribed constitutively from the β-lactamase promoter, the genetic determinant of which was inactivated during pKC8 / 2 cross-linking.

Системы из двух плазмид, pEG 5086-1 и pKC4/7, можно использовать как таковую для инсерционного мутагенеза, но введение в одну клетку двух близкородственных плазмид связано с определенными трудностями не всегда достижимо. Поэтому представлялось целесообразным встроить методами транспозиции in vivo A^-B^- -фаг мини -Mu d1 5086-1 входящий в pEG 5086-1, в плазмиду pKC4/7, геном которой содержит клонированные гены A и B фага Mu.Systems of two plasmids, pEG 5086-1 and pKC4 / 7, can be used as such for insertion mutagenesis, but the introduction of two closely related plasmids into one cell is not always achievable. Therefore, it seemed advisable to incorporate in vivo A ^- B ^- phage mini-Mu d1 5086-1 phage, which is included in pEG 5086-1, into the pKC4 / 7 plasmid, the genome of which contains the cloned A and B genes of the Mu phage.

В. Конструирование рекомбинантной плазмиды pKC47м. B. Construction of the recombinant plasmid pKC47m.

Для конструирования pKC47м в штамм E. coli 803, несущий плазмиду pEG 5086-1, была передана трансформацией плазмида pKC4/7. Полученный в результате штамм кишечной палочки пересевался дважды в жидкой питательной среде с добавлением 25 мкг/мл хлорамфеникола, резистентность к которому является одним из селективных маркеров плазмиды pKC4/7, и 25 мкг/мл мономицина (Mm^r - селективный маркер A^-B^- -фага -Mu d1 5086-1). После второго пересева культуры среди 100 проверенных клонов с фенотипом Mm^r, Gm^r, Cm^r не оказалось ни одного устойчивого к Ap, что свидетельствовало об элиминации плазмиды pEG 5086-1.To construct pKC47m into E. coli 803 strain carrying plasmid pEG 5086-1, plasmid pKC4 / 7 was transferred by transformation. The resulting Escherichia coli strain was reseeded twice in a liquid nutrient medium with the addition of 25 μg / ml chloramphenicol, resistance to which is one of the selective markers of plasmid pKC4 / 7, and 25 μg / ml monomycin (Mm ^r - selective marker A ^- B ^- - phage -Mu d1 5086-1). After the second reseeding of the culture, among the 100 tested clones with the phenotype Mm ^r , Gm ^r , Cm ^r there was not one resistant to Ap, which indicated the elimination of plasmid pEG 5086-1.

Входящий в состав этой плазмиды фаг мини -Mu d1 5086-1, о присутствии которых в клетках E. coli свидетельствовало наличие устойчивости к мономицину, встраивался в бактериальную хромосому и в небольшом проценте случаев в плазмиду pKC4/7. Для отбора коинтегратов pKC4/7 Mu d1 5086-1 из клеточной популяции E. coli получен препарат плазмидной ДНК, который использовали для трансформации бесплазмидного штамма E. coli 803. Для селекции трансформантов использовали плотную питательную среду с добавлением 10 мкг/мл мономицина. Полученные трансформанты, кроме резистентности к мономицину, обладали также устойчивостью к гентамицину и хлорамфениколу, что подтверждало наличие в реципиентных клетках искомых коинтегратов pKC4/7 Mu d1 5086-1. Более детально были изучены свойства одной из таких рекомбинантных плазмид, получившей наименование pKC47м. Рестрикционная карта плазмиды pKC47м представлена на фиг. 1. The phage mini-Mu d1 5086-1, which is a part of this plasmid, whose presence in E. coli cells was indicated by the presence of monomycin resistance, was integrated into the bacterial chromosome and, in a small percentage of cases, into plasmid pKC4 / 7. For the selection of co-integrates pKC4 / 7 Mu d1 5086-1 from the cell population of E. coli, a plasmid DNA preparation was obtained, which was used to transform the plasmid-free E. coli 803 strain. Dense nutrient medium supplemented with 10 μg / ml monomycin was used to select transformants. The obtained transformants, in addition to resistance to monomycin, were also resistant to gentamicin and chloramphenicol, which confirmed the presence of the desired co-integrates pKC4 / 7 Mu d1 5086-1 in recipient cells. The properties of one of such recombinant plasmids, which received the name pKC47m, were studied in more detail. The restriction map of plasmid pKC47m is shown in FIG. one.

Как видно из фиг. 1, рекомбинантная плазмида pKC47м, предназначенная для инсерционного мутагенеза, состоит из следующих структурных элементов:
Hind III рестрикта (5,3 т.п.н.) из плазмиды pEG 5086 c генами A и B фага Mu и участком, соответственным за репликацию вектора (rep pMB1);
Hind III рестрикта (4,5 т.р.н.) с геном резистентности к гентамицину из плазмиды pKC8/2 и встроенным дефектным (A^-B^-) фагом Mu (Mu d1 5086-1), способным при цис-комплектации к встраиванию в геном реципиентной клетки и содержащим в качестве генетического маркера ген устойчивости к мономицину, уникальный сайт Bam HI, предназначенный для клонирования чужеродных генов, а также сайт Hind III;
Hind III рестрикта (3,5 т.п.н.) из плазмиды зЛС 8/2 с геном резистентности к хлорамфениколу с расположенным в нем сайтом для Eco R1 и промотором бета-лактамазы ( Pβ ), предназначенным для конститутивной экспрессии генов A и B фага Mu;
Пример 2. Получение ауксотрофных мутантов Yersinia pseudotuberculosis посредством трансформации плазмидой pKC47м.As can be seen from FIG. 1, the recombinant plasmid pKC47m, intended for insertion mutagenesis, consists of the following structural elements:
Hind III restriction (5.3 kb) from plasmid pEG 5086 with genes A and B of the phage Mu and the region corresponding to vector replication (rep pMB1);
Hind III restriction (4.5 trn) with the gentamicin resistance gene from plasmid pKC8 / 2 and the built-in defective (A ^- B ^- ) phage Mu (Mu d1 5086-1), capable of integrating with cis-assembly in the recipient cell genome and containing the monomycin resistance gene as a genetic marker, the unique Bam HI site for cloning foreign genes, as well as the Hind III site;
Hind III restriction (3.5 kb) from plasmid zLS 8/2 with the chloramphenicol resistance gene with a site for Eco R1 and a beta-lactamase (Pβ) promoter designed for constitutive expression of A and B genes phage Mu;
Example 2. Obtaining auxotrophic mutants of Yersinia pseudotuberculosis by transformation with plasmid pKC47m.

ДНК плазмиды pKC47м выделяли из штамма E. coli 803 (pKC47m) и очищали равновесным центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия с бромистым этидием. Очищенный ДНК трансформировали клетки штамма 147 Y.pseudotuberculosis. Селекцию трансформантов осуществляли на плотной питательной среде с добавлением 20 мкг/мл мономицина. В ходе последующего его изучения с помощью метода реплик клонов, выросших на этой среде, оказалось, что более 99% их устойчивы к мономицину, но чувствительны к хлорамфениколу и гентамицину. Это свидетельствовало о встраивании фага мини Mu d1 5086-1 в геном бактерии и о быстрой элиминации плазмиды pKC47м. Так как встраивание фага Mu в геном бактерий происходит случайным образом, то для выделения из популяции нужных мутантов были использованы обычные методы селекции, включая ампициллиновое обогащение (Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике /Пер. с англ. Ю.Н. Зографа, Т.С. Ильиной, В.Г. Никифорова; под ред. С.И. Алиханян. -М. 1976). В данном эксперименте стояла задача получения ауксотрофных по триптофану мутантов псевдотуберкулезного микроба, поэтому в качестве селективной использовали минимальную питательную среду A (Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике /Пер. с англ. Ю.Н. Зографа, Т.С. Ильиной, В. Г. Никифорова; под ред. С.И. Алиханян. М. 1976). с добавлением и без добавления триптофана. После двух циклов ампициллинового обогащения из 100 проверенных методом реплик было выделено 9 клонов, не способных расти на минимальной среде без триптофана. При проверке стабильности сохранения мутантного фенотипа после 10 пересевов культур в богатой жидкой питательной среде без антибиотиков не было выявлено реверантов, способных расти на минимальной среде без трептофана. Высевали "голодный" агар примерно по 10¹⁰ клеток культур мутантов, при этом не вырастало ни одной колонии, поэтому частоту спонтанных реверсий к дикому типу (если они возможны) можно оценить как <10¹⁰.PKC47m plasmid DNA was isolated from E. coli 803 strain (pKC47m) and purified by equilibrium centrifugation in density gradient of cesium chloride with ethidium bromide. Purified DNA was transformed with Y. pseudotuberculosis strain 147 cells. The selection of transformants was carried out on a solid nutrient medium with the addition of 20 μg / ml monomycin. During its subsequent study using the replica method of clones grown on this medium, it turned out that more than 99% of them are resistant to monomycin, but sensitive to chloramphenicol and gentamicin. This indicated the insertion of phage mini Mu d1 5086-1 into the bacterial genome and the rapid elimination of plasmid pKC47m. Since the insertion of Mu phage into the bacterial genome occurs randomly, the usual selection methods, including ampicillin enrichment, were used to isolate the desired mutants from the population (Miller J. Experiments in molecular genetics / Transl. From English Yu.N. Zograf, T. S. Ilyina, V.G. Nikiforova; under the editorship of S.I. Alikhanyan. - M. 1976). In this experiment, the task was to obtain tryptophan auxotrophic mutants of a pseudotuberculosis microbe, therefore, the minimal nutrient medium A was used as selective (Miller J. Experiments in molecular genetics / Transl. From English Yu.N. Zograf, TS Ilyina, V. G. Nikiforova; under the editorship of S.I. Alikhanyan. M. 1976). with and without tryptophan. After two cycles of ampicillin enrichment, out of 100 checked replicas, 9 clones were selected that were unable to grow on minimal medium without tryptophan. When checking the stability of the conservation of the mutant phenotype after 10 cultures in a rich liquid nutrient medium without antibiotics, no reverers were found that could grow on minimal medium without traptophan. About 10 ¹⁰ cells of mutant cultures were sown with "hungry" agar, and no colonies grew, so the frequency of spontaneous reversals to the wild type (if possible) can be estimated as <10 ¹⁰ .

Пример 3. Получение ауксотрофных мутантов Y.pseudotuberculosis посредством мобилизации плазмиды pKC47м конъюгативными плазмидами. Example 3. Obtaining auxotrophic mutants of Y. pseudotuberculosis by mobilization of the plasmid pKC47m conjugative plasmids.

Передачу плазмиды pKC47м в клетки Y.pseudotuberculosis осуществляли путем мобилизации конъюгативными плазмидами RP4 и R388. Предварительно плазмиды RP4 и R388 были введены конъюгацией в клетки E. coli 803, содержащие pKC47м. Два полученных штамма E. colli 803 (pKC47м) (RP4) и E. coli 803 (pKC47m) (R388) использовали в качестве доноров, реципиентом служил устойчивый к рифампицину спонтанный мутант штамма 147 Y.pseudotuberculosis. Скрещивание проводили по общепринятой методике ( Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике /Пер. с англ. Ю.Н. Зографа, Т.С. Ильиной, В.Г. Никифорова; под ред. С.И. Алиханян. -М. 1976) в жидкой питательной среде. Для селекции трансконъюгантов использовали богатую питательную среду с добавлением 100 миг/мл рифампицина и 20 мкг/мл мономицина. Для отбора среди трансконъюгантов ауксотрофных мутантов применяли ту же методику, что и в примере 2. Было выбрано 3-5 мутантов, ауксотрофных соответственно по аргинину и триптофану. Transfer of plasmid pKC47m into Y. pseudotuberculosis cells was carried out by mobilization with conjugative plasmids RP4 and R388. Plasmids RP4 and R388 were previously introduced by conjugation into E. coli 803 cells containing pKC47m. Two obtained strains of E. colli 803 (pKC47m) (RP4) and E. coli 803 (pKC47m) (R388) were used as donors, the rifampicin-resistant spontaneous mutant of strain 147 Y. pseudotuberculosis was the recipient. The crossing was carried out according to the generally accepted technique (Miller J. Experiments in molecular genetics / Transl. From English by Yu.N. Zograf, TS Ilyina, V.G. Nikiforov; edited by S.I. Alikhanyan. -M. 1976 ) in a liquid nutrient medium. A rich nutrient medium with the addition of 100 mig / ml rifampicin and 20 μg / ml monomycin was used for the selection of transconjugants. For the selection of auxotrophic mutants among the transconjugants, the same procedure was used as in Example 2. 3-5 mutants auxotrophic according to arginine and tryptophan, respectively, were selected.

Приведенные выше примеры свидетельствуют об эффективности применения плазмиды pKC47м для селекции ауксотрофных мутантов Y.pseudotuberculosis. Плазмида pKC47м может быть использована также для вставочного мутагенеза Y. enterocolitica, E. coli и ряда других видов грамотрицательных бактерий, в клетки которых она способна передаваться методом трансформации или путем мобилизации плазмидами широкого спектра хозяев R388 и RP4. Положительными характеристиками методики инсерционного мутагенеза с использованием предлагаемой плазмиды являются: высокая стабильность вставки (а значит, и отсутствие реверсий к исходному фенотипу), исключение возможности повторных актов транспозиции и накопления множественных мутаций. The above examples indicate the effectiveness of the use of plasmid pKC47m for the selection of auxotrophic mutants of Y. pseudotuberculosis. Plasmid pKC47m can also be used for insertion mutagenesis of Y. enterocolitica, E. coli, and a number of other types of gram-negative bacteria, into the cells of which it can be transmitted by transformation or by mobilization of a wide range of R388 and RP4 hosts with plasmids. The positive characteristics of the insertion mutagenesis technique using the proposed plasmid are: high insert stability (and hence the absence of reversions to the original phenotype), elimination of the possibility of repeated transposition acts and the accumulation of multiple mutations.

Пример 4. Встраивание гена fra чумного микроба в хромосому кишечной палочки. Example 4. The insertion of the fra gene of the plague microbe into the chromosome of Escherichia coli.

Для этих целей использовали векторную систему pKC 1/1M Fra, которая была сконструирована in vitro путем встраивания в Bam H1-сайт плазмиды pKC47м BglII-фрагмента рекомбинантной ДНК R388 Fra (Дармов И.В. Маракулин И.В. Янов С. Н. Бывалов А.А. Абдуллин Т.Г. Cмирнов Е.В. Конструирование штаммов-продуцентов антигенов F1 и T чумного микроба // Биотехнология. -1992. -N 6. С. 59-62.) c детерминантной биосинтеза F1 антигена. For these purposes, the pKC 1 / 1M Fra vector system was used, which was constructed in vitro by embedding in the Bam H1 site of the plasmid pKC47m of the BglII fragment of the recombinant R388 Fra DNA (Darmov I.V. Marakulin I.V. Yanov S.N. Byvalov A.A. Abdullin, T.G. Smirnov, E.V. Construction of strains producing the plague microbe F1 and T antigens // Biotechnology. -1992. -N 6. P. 59-62.) C determinant biosynthesis of F1 antigen.

Передачу рекомбинантной плазмиды pKC1/1M Fra в бактерии E. coli HB 101 осуществляли методом трансформации. Селекцию трансформантов осуществляли на питательном агаре, содержащем одновременно мономицин (25 мкг/мл) и гентамицин (10 мкг/мл). Для индукции транспозиции мини-Mu-фага с детерминантой устойчивости к мономицину и генам биосинтеза F1-антигена в хромосому хозяина объединенную культуру выделенных трансформантов пересевали в жидкой питательной среде с добавлением мономицина в концентрации 25 мкг/мл. После пяти пересевов культуру рассевали до единичных колоний и осуществляли отбор клонов, утративших устойчивость к гентамицину (фрагмент рекомбинантной ДНК с AB генами), но сохранивших резистентность к мономицину. Из 100 изученных клоновых культур 98 имели искомый фенотип. Уровень биосинтеза F1-антигена бактериями исследуемых клоновых культур, выращенных при температуре 36.38^oC, как установлено с помощью реакции иммунопреципитации в агаре, составлял 128-256 антигенных единиц (АЕ), что соответствовало уровню продукции этого антигена бактериями вакцинного штамма EV Y. pestis. Анализ плазмидного профиля полученных продуцентов не выявил присутствия в их бактериях внехромосомной ДНК, что наряду с высокой стабильностью признака Fra свидетельствовало о встраивании мини-Mu-фага в хромосому хозяина.The recombinant plasmid pKC1 / 1M Fra was transferred to E. coli HB 101 bacteria by transformation. The selection of transformants was carried out on nutrient agar containing both monomycin (25 μg / ml) and gentamicin (10 μg / ml). To induce transposition of the mini-Mu-phage with the determinant of resistance to monomycin and F1 antigen biosynthesis genes into the host chromosome, the combined culture of isolated transformants was subcultured in a liquid nutrient medium with the addition of monomycin at a concentration of 25 μg / ml. After five passages, the culture was scattered to single colonies and clones were selected that lost resistance to gentamicin (a fragment of recombinant DNA with AB genes) but retained resistance to monomycin. Of the 100 clonal cultures studied, 98 had the desired phenotype. The level of F1 antigen biosynthesis by bacteria of the studied clonal cultures grown at a temperature of 36.38 ^o C, as determined by the immunoprecipitation reaction in agar, was 128-256 antigenic units (AE), which corresponded to the level of production of this antigen by the bacteria of the vaccine strain EV Y. pestis. Analysis of the plasmid profile of the obtained producers did not reveal the presence of extrachromosomal DNA in their bacteria, which, along with the high stability of the Fra trait, indicated the insertion of a mini-Mu-phage into the host chromosome.

Пример 5. Встраивание гена fra чумного микроба в хромосому аттенуированного штамма Y.pseudotuberculosis. Example 5. The insertion of the fra gene of the plague microbe into the chromosome of the attenuated strain of Y. pseudotuberculosis.

Передачу рекомбинантной плазмиды pKC1/1M-Fra в клетки Y.pseudotuberculosis осуществляли методом трансформации. Реципиентом служил аттенуированный (потенциально вакцинный ) штамм 45 Y.pseudotuberculosis. Для встраивания мини -Mu-фага с генами биосинтеза F1- антигена чумного микроба в хромосому хозяина применяли методику, что и примере 5. В результате этих экспериментов были получены клоновые культуры Y.pseudotuberculosis, продуцирующие капсульный антиген чумного микроба. Уровень биосинтеза F1-антигена бактериями полученных вариантов псевдотуберкулезного микроба, выращенных при температуре 36.38^oC, составлял 64.128 AE по результатам реакции иммунопреципитации. Бактерии вакцинного штамма EV Y. pestis в этих же условиях культивирования продуцировали F1 антиген в количестве 128.256 AE.Transfer of the recombinant plasmid pKC1 / 1M-Fra into Y. pseudotuberculosis cells was carried out by transformation method. The recipient was an attenuated (potentially vaccine) strain 45 of Y. pseudotuberculosis. To insert the mini-Mu phage with the plague microbe F1 antigen biosynthesis genes into the host chromosome, the procedure was used as in Example 5. As a result of these experiments, clonal cultures of Y. pseudotuberculosis were produced that produced the plague microbe capsular antigen. The biosynthesis level of F1 antigen by bacteria of the obtained variants of the pseudotuberculosis microbe grown at a temperature of 36.38 ^o C was 64.128 AE according to the results of the immunoprecipitation reaction. Bacteria of the vaccine strain EV Y. pestis under the same cultivation conditions produced F1 antigen in an amount of 128.256 AE.

Пример 6. Встраивание детерминанты устойчивости к мономицину в геном природной конъюгативной плазмиды R388. Example 6. Insertion of the determinants of resistance to monomycin in the genome of the natural conjugative plasmid R388.

Передачу рекомбинантной плазмиды pKC47м в бактерии E. coli 803 (R388) осуществляли методом трансформации. Селекцию трансформантов осуществляли на питательном агаре с добавлением 20 мкг/мл мономицина. Transfer of the recombinant plasmid pKC47m to E. coli 803 bacteria (R388) was carried out by transformation method. The selection of transformants was carried out on nutrient agar with the addition of 20 μg / ml monomycin.

В ходе изучения полученных клоновых культур трансформантов было установлено, что 98% их устойчивы к триметоприму и сульфаниламидам (маркеры плазмиды R388) и мономицину (маркер плазмиды pKC47м), но чувствительны к хлорамфениколу и гентамицину. Это свидетельствовало о встраивании фага мини-Mu d1 5088-1 в геном бактерии и быстрой элиминации плазмиды pKC47m. In the study of the obtained clonal cultures of transformants, it was found that 98% of them are resistant to trimethoprim and sulfonamides (plasmid markers R388) and monomycin (plasmid marker pKC47m), but are sensitive to chloramphenicol and gentamicin. This indicated the insertion of the phage mini-Mu d1 5088-1 into the bacterial genome and the rapid elimination of plasmid pKC47m.

Так как встраивание фага Mu в геном бактерии происходит случайным образом для селекции рекомбинантных плазмид, интегрировавших с детерминантной устойчивости к мономицину, был осуществлен конъюгативный перенос их в клетки других хозяев. Реципиентом в данном случае служил устойчивый к рифампицину штамм EV Y. pestis. Селекцию трансконъюгантов вели на плотной питательной среде с добавлением 100 мкг/мл рифампицина и 20 мкг/мл мономицина. Since the insertion of Mu phage into the bacterial genome occurs randomly for the selection of recombinant plasmids that integrate with determinant resistance to monomycin, they were conjugatively transferred to cells of other hosts. The recipient in this case was rifampicin-resistant strain EV Y. pestis. The selection of transconjugants was performed on solid nutrient medium supplemented with 100 μg / ml rifampicin and 20 μg / ml monomycin.

Последующее изучение полученных трансконъюгантов выявило наличие в их бактериях конъюгативной плазмиды с генами устойчивости к триметоприму, сульфамиламидам и мономицину, что свидетельствовало о встраивании детерминанты резистентности к мономицину в геном R388. A subsequent study of the obtained transconjugants revealed the presence of a conjugative plasmid in their bacteria with resistance genes for trimethoprim, sulfamylamides and monomycin, which indicated the incorporation of the determinants of resistance to monomycin in the R388 gene.

Claims

1. The method of introducing foreign genes into the genomes of gram-negative microorganisms, including the introduction into the bacterial cell of a plasmid containing foreign DNA in the transposed genetic element, selection and selection of recombinant strains, characterized in that plasmid vector pKS47m is used from plasmids.

2. Plasmid vector pKS47m for the introduction of foreign genes into the genomes of gram-negative microorganisms, having a size of 22.9 TPN and consisting of:
Hind III restriction (5.3 kbp) from plasmid pEC 5086 with genes A and B of the phage Mu and the region responsible for vector replication (rep pMB1);
Hind III restriction (4.5 bp) with the gentamicin resistance gene from plasmid pKS8 / 2 and the built-in defective (A ^- B ^- ) phage Mu (Mu d15086-1), capable of integrating into cis complementation into the recipient cell genome and containing the monomycin resistance gene as a genetic marker, the unique Bam H1 site for cloning foreign genes, as well as the Hind III site;
Hind III restriction (3.5 kbp) from plasmid pKS 8/2 with the chloramphenicol resistance gene with the site for Eco R1 and the β-lactamase (Pβ) promoter for constitutive expression of A and B genes phage Mu;
with a capacity of 5.5 MD, transmitted to gram-negative microorganisms by transformation and mobilization of conjugative plasmids, genetic markers Km ^r , Gm ^r and Cm ^r .

3. The method of constructing the plasmid vector pKS47m, namely, that in a plasmid capable of replication in a gram-negative microorganism, the A and B genes of the phage Mu responsible for its transposition are cloned in vitro and the native thermo-inducible promoter of the phage Mu is replaced with the constitutive promoter β - lactamases, then A ^- B ^- phage mini Mu d1 5086-1 is inserted into the genome of the obtained hybrid in vivo.