RU34865U1 - Структура материала для имплантации на гортани - Google Patents

Description

СТРУКТУРА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ИМПЛАНТАЦИИ

НА ГОРТАНИ

Нолезная модель относится к области медицины, а именно к конструктивному строению материала для имплантации гортани.

Известны конструкции материалов, используемых для имплантатов гортани. Так известен способ хирургической реабилитации больных после удаления гортани, при котором искусственнз о гортань формируют из кожно-мышечного лоскута на сосудистой ножке, выкроенного с выступом из большой грудной мышцы пациента.(Ки 2115376).

Известно формирование трансплантата из вестибулярной складки непораженной стороны в комплексе с прилежаш:ей передне-наружной стенкой гортаноглотки, после чего моделируют медиальную стенку резецированного грушевидного синуса, фиксируют трансплантат к краям операционного дефекта до полной герметизации раны. .(RU 2016549).

Также известен трансплантат, формируемый из лучевого лоскута предплечья (RU 2074658).

Недостатком всех указанных выше аналогов является невозможность формирования кожных лоскутов трансплантата при наличии сопутствуюш;их заболеваний, препятствуюших использованию донорской ткани, а также снижение осложнений в виде частичного или даже полного отторжения трансплантатов.

Целью разработки полезной модели является создание биологической конструкции (структуры материала), дающего возможность замещения дефектов мягкой ткани гортани путем закрытия полости различной конфигурации и размера в мягких тканях гортани искусственно созданным трансплантатом, способным продуцировать органогенез собственных тканей, стимулировать пролиферацию и миграцию

эпителиальных клеток, и исключающий иммунный ответ организма реципиента.

Поставленная цель достигается тем, что материал имеет следующую структуру: коллагеновый гель, включающий аллогенную клеточную культуру фибробластов и эпителиальные клетки, по крайней мере, одну сетчатую матрицу из биосовместимого полимера, расположенную внутри геля.

Коллагеновый гель представляет собой подложку для культивирования эпителиальных клеток и одновременно выполняет функцию носителя активных компонентов. В готовом виде материал имеет объемную структуру толщиной соответствующей стенки гортани, как правило, 3-5 мм.

Материал обладает характеристиками соответствующими естественному микроокружению фибробластов in vivo, и, одновременно, представляет собой подложку для культивирования эпителиальных клеток, например, таких как кератиноцитов. Благодаря оптимальным параметрам, присущим структуре сформированного таким образом коллагенового геля, возникает возможность транспортировать живые клетки в клинику, и переносить, не травмируя их, непосредственно на раневую полость гортани в качестве имплантата.

Коллагеновый гель функционально является носителем биологически активных компонентов и включает в свою структуру следующие компоненты:

-среда для культивирования клеток человека, по крайней мере, не менее 10%;

-глутамин, по крайней мере, не менее 0,2 мг/мл;

-фосфатный буфер, по крайней мере, не менее 0,02%;

-бикарбонат натрия, по крайней мере, не менее 0,25%.

Коллагеновый гель представляет собой ОД-0,15% раствор коллагена в 0,1% уксусной кислоте. В качестве среды для культивирования клеток может быть использована, например, среда «199x10.

Содержащийся в составе коллагенового геля бикарбонат натрия (Na2CO3) является источником углекислого газа, необходимого для осуществления жизнедеятельности живых клеток.

Глутамин является питательной добавкой поддержания процесса жизнедеятельности клеток.

В исходный Коллагеновый гель могут быть дополнительно внесены другие матриксные белки, например, фибронектин и ламинин, которые являются естественным компонентом околоклеточного матрикса для фибробластов in vivo. Указанные белки внеклеточного матрикса способствуют структурированию коллагенового геля и ускорению процесса полноценного замещения утраченных мышечных тканей гортани.

Входящие в состав коллагенового геля аллогенные фибробласты распределены в объеме коллагенового геля и способны продуцировать факторы роста, стимулируют пролиферацию и миграцию эпителиальных клеток. Однако, в случае закрытия полостей гортани значительной площади или в случае наличия сопутств)ющего заболевания, препятствующего процессу вживления материала имплантата, количество фибробластов оказывается недостаточным и в состав коллагенового геля дополнительно могут быть внесены ростовые факторы, влияющие на активность клеток, в том числе: эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), трансформирующий фактор роста аир (TGF), фактор роста, выделяемый тромбоцитами (PDGF), фактор роста гепатоцитов (скаттер - фактор) или их сочетания. Факторы роста добавляют в концентрациях порядка 1-100 нг/мл.

Коллагеновый гель дополнительно может содержать аутологичную клеточную культуру фибробластов и эпителиальных клеток. Сочетание

аллогенных и аутологичных клеточных культур клеток способствует наиболее быстрой адаптации и приживлению трансплантата.

Готовый к использованию в клинической практике слой коллагенового геля может иметь различную толщину, плотность от 0,8 до 1,5 мг/ мл, рН 7,4.

Количественный и качественный состав коллагенового геля, как носителя биологически активных компонентов, позволяет практически полностью исключить иммунный ответ организма реципиента. Это является следствием того, что коллаген, представляющий собой иммунонейтральную основу, содержит незначительное количество донорских клеток по сравнению, например, с имплантируемым фрагментом донорской кожи. Кроме того, живые клетки, прошедшие стадию культивирования, обладают пониженной специфичностью. Введение в состав коллагенового геля антисептиков и/или антибиотиков широкого спектра действия, таких как, например, гентамицин, ампициллин, пенициллин в концентрациях не токсичных для клеток, позволяет значительно уменьшить вероятность возникновения воспалительного процесса в пораженной ткани.

В качестве аналога эпителиального слоя в заявляемой композиции используют культуру эпителиальных клеток (например, кератиноциты). Эпителиальные клетки могут быть распределены на поверхности слоя коллагенового геля или в его объеме. Через трое суток культивирования на коллагеновом геле с фибробластами эпителиальные клетки формируют колонии клеток. При этом они активно синтезируют на поверхности геля базальную мембрану, по которой в дальнейшем при перенесении тканевого эквивалента на раневую поверхность идет миграция собственных эпителиальных клеток пациента.

Для удобства фиксации имплантата из живого эквивалента ткани гортани и придания имплантату необходимой формы заявляемая композиция включает, по крайней мере, один полимерный слой.

()

размещенный внутри коллагенового геля. Полимерный слой может быть выполнен в виде сетчатого эндопротеза или нерфорированной нленки. В любом случае нолимерный слой должен быть выполнен из биосовместимого материала. Другие слои сетчатого эндопротеза дополнительно могут быть размещены с внешних сторон структуры коллагенового слоя. В частности указанный сетчатый эндопротез может быть выполнен из викриловой сетки или ее равноценного заменителя обладающего следующими свойствами: биосовместимость, эластичность, размеры ячеек 1-3 мм.

Сетчатый эндопротез, размещенный в толще коллагенового геля, выполняет каркасную функцию: препятствует естественному для подобных конструкций процессу сжатия геля при культивировании в нем клеток in vitro и значительно упрощает процедуру перенесения тканевого эквивалента на полость гортани пациента. Кроме того, преимущества сетчатого эндопротеза состоят в том, что он способен принимать различные геометрические формы соответствующие дефектам гортани и позволяет фиксировать такой имплант по краям раны.

Коллагеновый гель получают простым смешением всех его компонентов с последующей заливкой в форму заданной конфигурации с размещенной там сеткой. При необходимости к основным компонентам коллагенового геля вносят матриксные белки, факторы роста, антибиотики и/или антисептики. Процесс полимеризации происходит при температуре 37°С в течение 30-40 минут. В дальнейшем застывший гель оставляют при температуре 37°С в течение 2-3 суток, при этом фибробласты активно структурируют фибриллы коллагена. В дальнейшем на поверхность геля наносят эпителиальные клетки. Затем через 48-72 часа культивирования на коллагеновом геле, содержащем фибробласты, кератиноциты, формируют колонии клеток. Полученный таким образом тканевой эквивалент мягких тканей гортани может быть подвержен криоконсервации в жидком азоте, и

оставлен для сохранения при отрицательных температурах на срок до 1 года.

ПРИМЕРЫ КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ:

ПРИМЕР 1. Для приготовления коллагенового геля используют 1,25% раствор коллагена в уксусной кислоте, нейтрализуют полученный раствор раствором NaOH (0,34N). Процесс перемешивания осуществляют при температуре 6°С в течение 3 мин. В процессе перемешивания в раствор вносят необходимое количество среды для культивирования клеток «199x10, глутамина 0,2%, бикарбонат натрия 0,25% и фосфатный буфер 0,25%. По завершении процесса изготовления геля, в него вносят суспензию аллогенной клеточной культуры фибробластов. Фибробласты, предназначенные для приготовления тканевого эквивалента, предварительно ферментативно дезагригируют трипсином и суспензию в концентрации 20 - 200 тысяч клеток на мл вносят в коллагеновый гель при тщательном перемешивании до его полимеризации.

В емкости, предназначенной для изготовления эквивалента, размещают полимерную сетку, заданного размера и еще не застывший гель, содержащий фибробласты, разливают в подготовленную емкость для полимеризации. В дальнейшем для культивирования фибробластов в коллагеновом геле застывший гель оставляют при 37°С в течение 2-3 суток, при этом фибробласты активно структурируют фибриллы коллагена. На этом этапе возможно дополнительное внесение растворов ростовых факторов. Полученный на этом этапе эквивалент мягкой ткани гортани может быть подвержен криоконсервации в жидком азоте, и оставлен для сохранения при отрицательных температурах на срок до 1 года.

В дальнейшем ферментативно дезагригированную клеточную суспензию эпителиальных клеток наносят на поверхность коллагенового геля, содержащего фибробласты, из расчета 5-100 тысяч клеток на 1 см

поверхности. Через 48-72 часа культивирования на коллагеновом геле, содержащем фибробласты, кератиноциты формируют колонии клеток.

Таким образом, продолжительность всего технологического процесса изготовления тканевого эквивалента составляет от 4 до 6 суток. Увеличение продолжительности культивирования клеточных структур приводит к сжатию коллагенового геля, увеличению его плотности и уменьшению площади поверхности эквивалента ткани.

В случае если коллагеновый гель с фибробластами был изъят из криохранилища, необходимо проверить жизнеспособность клеток, прошедших криоконсервирование, например, путем окрашивания пробы клеток трипановым синим или другим красителем, позволяющем отличить жизнеспособные клетки от погибших. При этом количество жизнеспособных клеток должно быть не менее 70% от их общего количества. Перед проведением дальнейших манипуляций гель необходимо в течение 30-40 минут выдержать при 37°С.

ПРИМЕР 2. Методика изготовления материала для имплантата гортани ведут в соответствии с примером 1. Дополнительно на этапе перемешивания компонентов при приготовлении коллагенового геля могут быть внесены ростовые факторы и матриксные белки. Далее процесс ведут так же в соответствии с примером 1.

ПРИМЕР 3. Методика изготовления материала для имплантата гортани ведут в соответствии с примером 1. Дополнительно на этапе перемешивания компонентов при приготовлении коллагенового геля могут быть внесены клеточную культуру фибробластов и эпителиальные клетки аутологичного происхождения. Далее процесс ведут так же в соответствии с примером 1.

ПРИМЕР 4. Больной В., возраст 65 лет, находился на лечении с диагнозом рак гортани 2-ой стадии. Была проведена операция по удалению опухоли. Состояние после хирургического лечения - Ларингостома. Состояние после пластики - Трахеостома.

Через 5 месяцев проведена пластика ларингостомы костнонадкостничпо-мышечным лоскутом с подсадкой живого эквивалента мягких тканей гортани данной полезной модели. Материал зафиксирован в положении надкостницы и суставной капсулы таким образом, что слой эпителиальных клеток обращен в просвет трахеи. Трансплантат перемещен в позицию ларингостомы в проэкции угла щитовидного хряща и фиксирован по периметру к мышцам гортани. Дополнительный лоскут укрыт передними мыщцами шеи. Произведен тщательный гомеостаз. Рана послойно ушита с оставлением аспирационного дренажа в донорской зоне. Наложена спиртовая асептическая повязка. В трахеостому введена трахеостомическая трубка Portex №8.

В послеоперационном периоде осложнений не было. На 30-е сутки пациент деканулирован, дыхание свободное. Через 2-е суток после декануляции пациенту была проведена ФИБРОЛАРИНГОТРАХЕОСКОПИЯ, при осмотре состояние после резекции гортани без признаков рецидива. Имеется белесоватый налет на площади 7x15 мм по передней стенке подскладочного отдела с переходом на средний отдел. Просвет в среднем и вестибулярном отделе широкий. В месте трансплантации была взята биопсия, гистологический анализ показал многослойный плоский эпителий с гиперкератозом. На 35-е сутки после трансплантации пациент выписан домой, восстановлено свободное дыхание и речь.

Изготовление имплантата гортани из живого эквивалента мягких тканей гортани должно проводиться в стерильных лабораторных условиях. Его доставка в операционную производится в стерильной, герметичной упаковке без специальных условий.

За период с 2000 по 2002 год было проведено И аллотрансплантаций. У всех больных была произведена резекция гортани с реконструкцией костно-мышечным лоскутом и тканевой культурой. У 2-х больных произведена реконструкция гортани по поводу послеоперационного рубцового стеноза. 1 пациенту произведена

реконструкция трахеи по поводу послеоперационного рубцового стеноза. 5 больным выполнена резекция гортани с одномоментной реконструкцией по поводу рака гортани. У 1-ого больного произведено пластическое закрытие ларингостомы. У всех больных в послеоперационном периоде на 21 сутки при контрольной фиброларингоскопии отмечена эпителизация слизистой лоскута в гортани, трахее и полное приживление лоскутов. Осложнения: в послеоперационном периоде у 3-х больных образовались свищевые ходы гортаноглотки. Осложнения были купированы консервативными мероприятиями без последствий для лоскутов и тканевых культур. Проведенные нами клинические исследования свидетельствуют, что целесообразно использование предлагаемого тканевого эквивалента мягких тканей в качестве клеточного трансплантата для закрытия тканевых дефектов на гортани.

Разработанная промышленная модель способна замещать полнослойные дефекты ткани гортани и позволяет достичь следующих технических и лечебных результатов:

-замещение в полном объеме удаленных по медицинским показаниям фрагментов ткани гортани любого размера и конфигурации;

-восстановление функций утраченных фрагментов ткани гортани;

-предотвращение иммунного ответа организма реципиента, в том числе реакции отторжения замещенных фрагментов ткани, воспалительных процессов и др.;

-незначительная продолжительность процесса изготовления

имплантата;

возможность криоконсервации имплантата из тканевого эквивалента на различных стадиях изготовления;

-возможность создания резервного банка имплантата из тканевых

эквивалентов;

-возможность осуществления хирургической имплантации тканевого эквивалента на гортани;

- возможность транспортировки живых клеток от изготовителя тканевого эквивалента на гортани в клинику и размещения его непосредственно на полости гортани в качестве имплантата.

Заявители:

ff,

ИБР им. Н.К.Кольцова РАН

Хрущов

МНИОИ им П.А.Герцена

Директор

а%/7 В.И.Чиссов

Claims (22)

1. Структура материала для имплантации на гортани, отличающаяся тем, что включает объемную конструкцию коллагенового геля, содержащего аллогенные клетки фибробластов и эпителиальные клетки, по крайней мере, одну сетчатую матрицу из биосовместимого полимера, расположенную внутри геля.

2. Структура материала по п.1, отличающаяся тем, что сетчатая полимерная матрица имеет размер ячеек от 1 до 5 мм, а предпочтительно от 1 до 3 мм.

3. Структура материала по пп.1 и 2, отличающаяся тем, что в качестве сетчатой матрицы содержит викриловую сетку или ее эквивалент с размерами ячеек от 1 до 5 мм, а предпочтительно от 1 до 3 мм.

4. Структура материала по пп.1-3, отличающаяся тем, что коллагеновый гель дополнительно содержит антисептики и/или антибиотики.

5. Структура материала по пп.1-4, отличающаяся тем, что дополнительно содержит фибробласты и эпителиальные клетки аутологичного происхождения.

6. Структура материала по пп.1-4, отличающаяся тем, что коллагеновый гель содержит глутамин в количестве от 0,1 до 1 мг/мл геля, а предпочтительно от 0,1 до 0,4 мг/мл.

7. Структура материала по пп.1-6, отличающаяся тем, что коллагеновый гель содержит бикарбонат натрия в количестве от 0,1 до 1 мг/мл геля, а предпочтительно от 0,25 до 0,4 мг/мл.

8. Структура материала по пп.1-4, отличающаяся тем, что коллагеновый гель содержит фосфатный буфер в количестве от 0,01 до 0,1 мг/мл от объема, а предпочтительно от 0,01 до 0,05 мг/мл.

9. Структура материала по пп.1-4, отличающаяся тем, что коллагеновый гель дополнительно содержит матриксные белки.

10. Структура материала по пп.1-4, отличающаяся тем, что в качестве матриксных белков могут быть использованы фибронектин и/или ламинин и/или белок в концентрации от 0,1 до 100 мкг/мл, а предпочтительно от 1 до 5 мкг/мл.

11. Структура материала по пп.1-4, отличающаяся тем, что коллагеновый гель дополнительно содержит факторы роста.

12. Структура материала по пп.1-4, отличающаяся тем, что в качестве факторов роста могут быть использованы эпидермальный фактор роста, и/или фактор роста фибробластов, и/или трансформирующий фактор роста α и β, и/или фактор роста, выделяемый тромбоцитами, и/или фактор роста гепатоцитов в концентрациях от 1-300 нг/мл, а предпочтительно от 1 до 100 нг/мл.

13. Структура материала по пп.1-4, отличающаяся тем, что коллагеновый гель дополнительно содержит антисептики.

14. Структура материала по пп.1-4, отличающаяся тем, что в качестве антисептика могут быть использованы ионы серебра и золота.

15. Структура материала по пп.1-4, отличающаяся тем, что коллагеновый гель дополнительно содержит антибиотики.

16. Структура материала по пп.1-4, отличающаяся тем, что в качестве антибиотика может быть использован гентамицин в концентрации от 0,08 до 0,4 мг/мл геля, а предпочтительно от 0,1 до 0,2 мг/мл и/или любые другие антибиотики широкого спектра действия.

17. Структура материала по пп.1-4, отличающаяся тем, что коллагеновый гель дополнительно содержит постнатальные или эмбриональные фибробласты человека.

18. Структура материала по пп.1-4, отличающаяся тем, что в качестве клеток эпителия человека в состав эквивалента входят постнатальные кератиноциты кожи человека, нанесенные на поверхность коллагенового геля в виде суспензии и/или предварительно культивированные in vitro на коллагеновых микроносителях.

19. Структура материала по пп.1-4, отличающаяся тем, что содержит дополнительный полимерный слой.

20. Структура материала по пп.1-4, отличающаяся тем, что в качестве полимерного слоя в состав эквивалента входит сетчатый эндопротез или перфорированная пленка.

21. Структура материала по пп.1-4, отличающаяся тем, что в качестве сетчатого эндопротеза используют викриловую сетку или ее равноценный заменитель с размерами ячеек от 1 до 5 мм, а предпочтительно от 1 до 3 мм.

22. Структура материала по пп.1-4, отличающаяся тем, что коллагеновый гель дополнительно содержит пластификатор.