RU2855103C1

RU2855103C1 - Молекулы антитела к LILRB3 и их применение

Info

Publication number: RU2855103C1
Application number: RU2022121028A
Authority: RU
Inventors: Бъёрн ФРЕНДЕУС; Али РОГХАНИАН; Марк КРЭГГ
Original assignee: Биоинвент Интернэшнл Аб; Юниверсити Ов Саутхэмптон
Priority date: 2020-02-12
Filing date: 2021-02-12
Publication date: 2026-01-29

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены молекула агонистического антитела, которая специфически связывается с LILRB3, кодирующая указанную молекулу нуклеиновая кислота, экспрессирующая плазмида, клетка для экспрессии указанного антитела. Также предложено применение антитела по изобретению в лечении отторжения трансплантата, аутоиммунных нарушений или воспалительных нарушений посредством перепрограммирования миелоидных клеток человека. Агонистическая активность антител по изобретению обеспечивает возможность их применения в качестве иммуноингибирующих агентов. 10 н. и 8 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым молекулам антител, которые специфически связываются с LILRB3 (ILT5). Настоящее изобретение также относится к применению таких новых молекул антител или других молекул антител, которые специфически связываются с LILRB3 (ILT5) для лечения отторжения трансплантата, аутоиммунного нарушения и/или воспалительного нарушения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Семейство рецепторов, подобных лейкоцитарному иммуноглобулину (Ig) человека (LILR), также называемых иммуноглобулин-подобными транскриптами человека (ITL), включает шесть активирующих (LILRA1-6) и пять ингибирующих (LILRB1-5) LILR, которые регулируют иммунные ответы (1, 2). Оба подтипа рецепторов имеют два или четыре внеклеточным домена, подобных гомологичному С-2 типу иммуноглобулина (Ig), но различаются по их трансмембранным и цитоплазматическим областям. (3, 4). LILRA имеют короткие усеченные цитоплазматические домены с заряженными остатками аргинина в их трансмембранных доменах, что позволяет им связываться с γ-цепью FcεR, несущего ITAM, для распространения активирующих сигнальных каскадов (5). И наоборот, LILRB имеют длинные цитоплазматические домены, которые содержат множество доменов ITIM, которые задействуют фосфатазы, такие как SHP-1 и SHIP-1, которые вызывают ингибирующую передачу сигналов. (3, 4). Эти полигенные рецепторы, расположенные на хромосоме 19q13.4 человека, демонстрируют значительные аллельные вариации, при этом LILRB3 (ILT5/CD85a) и LILRB4 (ILT3/CD85k) демонстрируют по меньшей мере 15 различных вариантов (3. 6).

Предполагается, что ингибирующие LILRB действуют как иммунные контрольные точки, служащие для контроля и ограничения явных иммунных ответов (1, 2). В соответствии с этим, экспрессия LILRB увеличивается в супрессивных (также называемых альтернативно активированными или М2) макрофагах и толерогенных дендритных клетках (DC) (7-10). На моноцитах, совместное лигирование LILRB1 (ILT2/CD85j) и LILRB2 (ILT4/CD85d) с FcγRI (CD64) приводит к активации SHP-1, уменьшению нижепроисходящих явлений фосфорилирования и мобилизации внутриклеточного кальция. (11). При лигировании с лигандами HLA класса I (HLA-I), LILRB1 и LILRB2 предотвращают миграцию DC и способствуют высвобождению ими противовоспалительных цитокинов (1, 12). Точно также взаимодействие LILRB1 на макрофагах с общей субъединицей HLA-I β2-микроглобулином на злокачественных клетках ограничивает их фагоцитарный потенциал. (13). Также было продемонстрировано, что LILRB делают DC толерогенными как in vitro, так и in vivo, впоследствии подавляя ответы Т-клеток (7, 8, 12, 14, 15). Таким образом, взаимодействие HLA-G с LILRB1 и LILRB2 является важным иммуносупрессивным путем на границе между плодом и матерью во время беременности (16-18). LILRB1 также экспрессируется на NK-клетках и, как сообщается, ингибирует цитотоксичность NK-клеток (19).

Хотя мыши не экспрессируют LILRB, ортологичный парный Ig-подобный рецептор (PIR)-В регулирует различные ветви иммунной системы. PIR-B регулирует примирование цитотоксиче-ских Т-лимфоцитов посредством DC через взаимодействие с МНС класса I, экспрессируемым на клетках CD8 (20); и отрицательно влияет на передачу сигналов интегрина в нейтрофилах и макрофагах (21). Кроме того, PIR-B регулирует дифференцировку клеток-супрессоров миелоидного происхождения (MDSC), которые способствуют прогрессированию опухоли (22). Подобно PIR-B, взаимодействие между HLA-G и LILRB1 поддерживает приживление алло трансплантата за счет размножения мощных MDSC (23, 24).

Среди ингибирующих LILRB, LILRB3 (ILT5/LIR3/CD85a), содержащий 4 внутриклеточных мотива ITLM, представляет собой привлекательную иммуномодулирующую мишень из-за его относительной ограниченности и высокой экспрессии на миелоидных клетках (2). Несмотря на его открытие в конце 1990-х годов, его точные функции и иммуномодулирующий потенциал не были полностью определены из-за отсутствия специфических реагентов и модельных систем.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для исследования потенциальной иммуномодулирующей способности LILRB3 была создана панель LILRB3-специфических моноклональных антител (mAb) с использованием запатентованной технологии Biolnvent International АВ n-CoDeR^® и платформы F.I.R.S.T™. Антитела связывались с двумя основными, но дискретными эпитопами в Ig-подобных доменах 2 и 4. Лиги-рование LILRB3 на первичных моноцитах и макрофагах человека приводило к фенотипическим и функциональным изменениям и сильному ингибированию иммунных ответов in vitro, включая значительное снижение фагоцитоза опсонизированных раковых клеток и пролиферации Т-клеток. Важно отметить, что нацеливание на LILRB3 у гуманизированных мышей индуцировало толеро-генный статус и обуславливало усиленное приживление клеток аллогенной лимфомы человека. Результаты, полученные авторами, описывают иммунорегуляторные функции LILRB3 человека и определяют его потенциал как важной миелоидной иммунной контрольной точки с потенциальной ролью в трансплантации, инфекционном процессе и аутоиммунитете.

Работа, приведшая к настоящему изобретению, включала следующее:

• создание и характеризация панели агонистической активности человеческих моноклональных антител анти-LILRB3,

• демонстрация того факта, что лигирование LILRB3 на миелоидных клетках человека индуцирует противовоспалительный фенотип, что приводит к последующему ингибированию пролиферации Т-клеток

• демонстрация того факта, что лигирование LILRB3 на макрофагах человека ингибирует фагоцитоз опсонизированных клеток-мишеней

• демонстрация того факта, что агонистические антитела анти-LILRB3 индуцируют толерантность у гуманизированных мышей, обеспечивая успешное приживление аллогенных клеток.

Таким образом, настоящее изобретение относится к молекулам антител, которые специфически связываются с LILRB3 (ILT5), для применения при лечении отторжения трансплантата, аутоиммунных нарушений и/или воспалительных нарушений.

Настоящее изобретение также относится к специфическим молекулам антител, которые специфически связываются с LILRB3 (ILT5), выбранным из группы, состоящей из молекул антител, содержащих 1-6 CDR VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3,

при этом VH-CDR1, если присутствует, выбран из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1, 9, 17 и 25;

при этом VH-CDR2, если присутствует, выбран из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 2, 10, 18 и 26;

при этом VH-CDR3, если присутствует, выбран из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 3, 11, 19 и 27;

при этом VL-CDR1, если присутствует, выбран из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 4, 12, 20 и 28;

при этом VL-CDR2, если присутствует, выбран из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 5, 13, 21 и 29; а также

при этом VL-CDR3, если присутствует, выбран из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 6, 14, 22 и 30.

Данное изобретение также относится к выделенным нуклеотидным последовательностям, кодирующим по меньшей мере одну из указанных выше молекул антител.

Данное изобретение также относится к плазмидам, содержащим по меньшей мере одну из указанных выше нуклеотидных последовательностей.

Данное изобретение также относится к клеткам, содержащим по меньшей мере одну из указанных выше нуклеотидных последовательностей, или по меньшей мере одну из указанных выше плазмид.

Данное изобретение также относится к указанным выше молекулам антител, нуклеотидным последовательностям, плазмидам и/или клеткам для применения в медицине.

Данное изобретение также относится к указанным выше молекулам антител, нуклеотидным последовательностям, плазмидам и/или клеткам для применения при лечении отторжения трансплантата.

Данное изобретение также относится к указанным выше молекулам антител, нуклеотидным последовательностям, плазмидам и/или клеткам для применения при лечении аутоиммунного нарушения (также называемого аутоиммунным состоянием).

Данное изобретение также относится к указанным выше молекулам антител, нуклеотидным последовательностям, плазмидам и/или клеткам для применения при лечении воспалительного нарушения.

Данное изобретение также относится к применению указанных выше молекул антител, нуклеотидных последовательностей, плазмид и/или клеток для применения при лечении отторжения трансплантата.

Данное изобретение также относится к применению указанных выше молекул антител, нуклеотидных последовательностей, плазмид и/или клеток для применения при лечении аутоиммунного нарушения.

Данное изобретение также относится к применению указанных выше молекул антител, нуклеотидных последовательностей, плазмид и/или клеток для применения при лечении воспалительного нарушения.

Данное изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим или состоящим из по меньшей мере одной из указанных выше молекул антител, нуклеотидных последовательностей, плазмид и/или клеток и, необязательно, фармацевтически приемлемого разбавителя, носителя, несущей среды и/или вспомогательного вещества. Такая фармацевтическая композиция может применяться при лечении отторжения трансплантата. Такую фармацевтическую композицию можно также или альтернативно применять для лечения аутоиммунного нарушения. Такую фармацевтическую композицию можно также или альтернативно использовать для лечения воспалительного нарушения.

Данное изобретение также относится к способам лечения отторжения трансплантата у пациента, включающим введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одной из указанных выше молекул антител, нуклеотидных последовательностей, плазмид и/или клеток.

Данное изобретение также относится к способам лечения аутоиммунного нарушения у пациента, включающим введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одной из указанных выше молекул антител, нуклеотидных последовательностей, плазмид и/или клеток.

Данное изобретение также относится к способам лечения воспалительного нарушения у пациента, включающим введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одной из указанных выше молекул антител, нуклеотидных последовательностей, плазмид и/или клеток.

Данное изобретение также относится к молекулам антител, молекулам антител для применения, выделенным нуклеотидным последовательностям, выделенным нуклеотидным последовательностям для применения, плазмидам, плазмидам для применения, клеткам, клеткам для применения, применениям, фармацевтическим композициям и способам лечения, как описано в данном документе, со ссылкой на прилагаемое описание, примеры и/или фигуры.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таким образом, настоящее изобретение относится к молекулам антител, которые специфически связываются с LILRB3 (ILT5). В этом контексте термин «молекула антитела, которая специфически связывается с LILRB3» может применяться взаимозаменяемо с термином «молекула антитела анти-LILRB3 (или «молекула антитела, которая специфически связывает ILT5» и «молекула антитела анти-ILT5» соответственно), и относится к молекуле антитела, которая специфически связывается по меньшей мере с одним эпитопом во внеклеточном домене LILRB3 (ILT5). «Антиген клеточной поверхности» и «эпитоп» это термины, которые может легко понять специалист в области иммунологии или клеточной биологии.

Способы оценки связывания белков известны специалистам в области биохимии и иммунологии. Было бы желательно, чтобы специалисты могли применять эти способы для оценки связывания антитела с мишенью, а также для оценки относительной силы или специфичности, или ингибирования, или предотвращения, или уменьшения этих взаимодействий. Примерами способов, которые можно применять для оценки связывания с белками, являются, например, иммуно-анализы, BIAcore, вестерн-блоттинг, радиоиммуноанализ (PIA), иммуноферментный анализ (ELISA) и проточная цитометрия (FACS). См. второе издание Fundamental Immunology, Raven Press, New York, стр. 332-336 (1989), где обсуждается специфичность антител.

Клетки-мишени, экспрессирующие LILRB3, с которыми связывается молекула антитела в соответствии с настоящим изобретением, могут быть любыми клетками, экспрессирующими LILRB3, такими как миелоидные клетки человека, включая моноциты и макрофаги.

Без привязки к какому-либо конкретному механизму, одна из гипотез состоит в том, что эффект связывания молекул антител по настоящему изобретению с LILRB3 может заключаться в том, что оно приводит к фосфорилированию доменов ITIM. LILRB3 содержит четыре внутриклеточных ITIM. Это, в свою очередь, ингибирует клеточную активацию и индуцирует продукцию иммуносупрессивных генов миелоидными клетками. Это видно из приведенного ниже примера, демонстрирующего анализ PHКseq моноцитов человека.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения агонистическая активность может быть улучшена молекулой антитела, связанной с рецептором Fcγ в дополнение к связыванию с LILRB3. В некоторых таких вариантах осуществления данного изобретения молекулы агонистического неблокирующего LILRB3 антитела связываются с более высокой аффинностью с ингибирующими рецепторами Fcγ, чем с активирующими рецепторами Fcγ. Обладая более высокой аффинностью к ингибирующим рецепторам Fcγ, чем к активирующим рецепторам Fcγ, авторы включают значения вариантов, которые связываются с более высокой аффинностью с ингибирующими рецепторами Fcγ по сравнению с индивидуальными активирующими рецепторами Fcγ, например, по сравнению с любым из FcγRIIA, FcγRIIIA и FcγRI.

Относительно высокая гомология между системами FcγR мыши и человека объясняет многие общие аспекты консервативных опосредованных FcγR механизмов между видами. Однако подклассы IgG мыши и человека различаются по своей аффинности с родственными FcγR, это важно при переводе FcγR-опосредованных наблюдений в мышиной системе в терапевтические средства на основе IgG человека для выбора антитела, подкласса антител и/или сконструированного варианта подкласса, которые демонстрируют соответствующее связывание с человеческими активирующими по сравнению с ингибирующими FcγR. Аффинность и/или авидность молекул антител человека к индивидуальным FcγR человека можно определить с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR - surface plasmon resonance).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения связывание с Fc рецептором происходит посредством нормального взаимодействия между Fc областью молекулы агонистического антитела и Fc рецептором. В некоторых таких вариантах осуществления данного изобретения молекула антитела представляет собой IgG, который имеет Fc область, связывающуюся с Fcγ рецептором. В некоторых таких вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-LILRB3 представляет собой изотип IgG2 человека, который имеет аналогичную промежуточную аффинность к ингибирующему FcγRIIB человека и активирующему FcγRIIA человека и FcγRIIIA, но не взаимодействует продуктивно с активирующим FcγRI человека. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-LILRB3 относится к изотипу IgG1 человека, который связывает FcγRIIB с более высокой аффинностью по сравнению с IgG2, но также связывает активирующие активирующие FcγRIIA, FcγRIIIA человека с более высокой аффинностью и дополнительно связывает активирующий FcγRI с высокой аффинностью. В других вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-LILRB3 представляет собой IgG человека, сконструированный для усиленного связывания с FcγRIIB, например, с мутацией «SELF» (Chu et al. "Inhibition of В cell receptor-mediated activation of primary human В cells by coengagement of CD19 and Fcgam-maRIIb with Fc-engineered antibodies." Mol Immunol. 2008 Sep; 45 (15): 3926-33) и/или сконструированный для относительного повышенного связывания с FcγRIIB по сравнению с активирующим FcγR, например, с мутациями V9 или V11 (Mimoto et al. "Engineered antibody Fc variant with selectively enhanced FcγRIIb binding over both FcγRIIa^R131 and FcγRIIa^H131".Protein Eng Des Sel. 2013 Oct; 26(10): 589-598.). Было продемоснтрировано, что такие варианты IgG, сконструированные для усиленного связывания с ингибирующим FcγRIIB или специфически повышенной аффинности связывания с ингибирующим FcγRIIB, но не активирующим FcγRIIA, увеличивают активность агониста in vivo, и терапевтическую активность агонистического антитела CD40 СР-870893 у гуманизированных животных для активации и ингибирования FcγR (Dahan et al. 2016. 'Therapeutic Activity of Agonistic, Human Anti-CD40 Monoclonal Antibodies Requires Selective FcgammaR Engagement', Cancer Cell, 29: 820-31).

Fc рецептор, с которым молекула агонистического антитела может связываться в дополнение к LILRB3, представляет собой рецептор, обнаруженный на поверхности клеток миелоидного происхождения, таких как макрофаги, моноциты, MDCS, нейтрофилы, тучные клетки, базофилы или дендритные клетки, или на поверхности лимфоцитов, таких как НК-клетки, В-клетки или определенные Т-клетки.

В других вариантах осуществления данного изобретения молекулы антитела могут содержать модифицированную Fc область, характеризующуюся пониженным связыванием с Fcγ рецепторами, например, дегликозилированный или агликозилированный вариант молекулы антитела IgG1. Такое агликозилирование может быть достигнуто, например, путем замены аминокислоты, аспарагина, в положении 297 (N297X) в цепи этого антитела. Замена может быть глютамином (N297Q) или аланином (N297A), или глицином (N297G), или аспарагином (N297D), или серином (N297S). Другие замены, например, описаны Jacobsen FW et al., JBC 2017, 292, 1865-1875 (см., например, Таблицу 1); такие дополнительные замены включают L242C, V259C, А287С, R292C, V302C, L306C, V323C, I332C и/или K334C.

Антитела хорошо известны специалистам в данной области техники иммунологии и молекулярной биологии. Как правило, антитело состоит из двух тяжелых (Н) цепей и двух легких (L) цепей. В данном документе, иногда эта полная молекула антитела называется полноразмерным антителом или антителом полной длины. Тяжелая цепь антитела содержит один вариабельный домен (VH) и три константных домена (CH1, СН2 и СН3), а легкая цепь молекулы антитела содержит один вариабельный домен (VL) и один константный домен (CL). Вариабельные домены (иногда вместе упоминаемые как F_v область) связываются с мишенью антитела или антигеном. Каждый вариабельный домен состоит из трех петель, называемых областями, определяющими компле-ментарность (CDR - complementary determining region), которые отвечают за связывание с мишенью. Константные домены не участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном, но демонстрируют различные эффекторные функции. Антитела или иммуноглобулины могут быть отнесены к разным классам в зависимости от аминокислотной последовательности константной области их тяжелых цепей. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и у человека некоторые из этих иммуноглобулинов дополнительно делятся на подклассы (изотипы), например IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4; IgA1 и IgA2.

Другой частью антитела является Fc область (также известный как кристаллизующийся фрагмент домена), которая состоит из двух константных доменов каждой из тяжелых цепей антитела. Как уже упоминалось выше, Fc область отвечает за взаимодействие между антителом и Fc рецептором.

В контексте данного документа термин «молекула антитела относится к полноразмерным антителам или антителам полной длины, а также к функциональным фрагментам полноразмерных антител и производным молекул таких антител.

Функциональные фрагменты полноразмерного антитела имеют те же характеристики связывания антигена, что и соответствующее полноразмерное антитело, и включают либо те же вариабельные домены (т.е. последовательности VH и VL), и/или те же последовательности CDR, что и соответствующее полноразмерное антитело. Функциональный фрагмент не всегда содержит все шесть CDR соответствующего полноразмерного антитела. Следует отметить, что молекулы, содержащие три или меньшее количество областей CDR (в некоторых случаях даже только одну область CDR или ее часть), способны сохранять антигенсвязывающую активность антитела, производными которого являются CDR. Например, в работе Gao et al., 1994, J. Biol. Chem., 269: 32389-93 указано, что вся цепь VL (включая все три области CDR) имеет высокую аффинность к своему субстрату.

Молекулы, содержащие две области CDR, описаны, например, в работе Vaughan & Sollazzo 2001, Combinatorial Chemistry & High Proposal Screening, 4: 417-430. На странице 418 (правая колонка 3 «Наша стратегия проектирования») описано миниантитело, включающее только гипервариабельные области H1 и Н2 CDR, перемежающиеся внутри каркасных областей. Это миниантитело описывают, как способное связываться с мишенью. На работы Pessi et al., 1993, Nature, 362: 367-9, и Bianchi et al., 1994, J. Mol. Biol., 236: 649-59, ссылаются Vaughan и Sollazzo и более подробно описывают миниантитела H1 и Н2 и их свойства. В работе Qiu et al., 2007, Nature Biotechnology, 25:921-9 продемонстрировано, что молекула, состоящая из двух связанных областей CDR, способна связывать антиген. В работе Quiocho 1993, Nature, 362: 293-4 приведено краткое описание технологии «миниантитела». В работе Ladner 2007, Nature Biotechnology, 25:875-7, описано, что молекулы, содержащие две области CDR, способны сохранять антигенсвязывающую активность.

Молекулы антител, содержащие одну область CDR, описаны, например, в работе Laune et al., 1997, JBC, 272: 30937-44, в которой показано, что ряд гексапептидов, полученных из области CDR, демонстрируют антигенсвязывающую активность, и отмечается, что синтетические пептиды полной единичной области CDR демонстрируют сильную связывающую активность. В работе Monnet et al., 1999, JBC, 274: 3789-96, показано, что ряд 12-мерных пептидов и связанных с ними каркасных участков обладают антигенсвязывающей активностью, и прокомментировано, что один только CDR3-подобный пептид способен связывать антиген. В работе Heap et al., 2005, J. Gen. Virol., 86: 1791-1800, сообщается, что "микроантитело" (молекула, содержащая одну область CDR) способно связывать антиген, и показано, что циклический пептид из анти-ВИЧ антитела обладает антигенсвязывающей активностью и функцией. В работе Nicaise et al., 2004, Protein Science, 13:1882-91, показано, что одна область CDR может придавать антигенсвязывающую активность и аффинность своему лизоцимному антигену.

Таким образом, молекулы антител, имеющие пять, четыре, три или меньшее количество областей CDR способны сохранять антигенсвязывающие свойства полноразмерных антител, производными которых они являются.

Такая молекула антитела может также быть производной полноразмерного антитела или фрагментом такого антитела. При применении производного оно должно обладать теми же антигенсвязывающими характеристиками, что и соответствующее полноразмерное антитело, в том смысле, что оно связывается с тем же эпитопом на мишени, что и полноразмерное антитело.

Таким образом, под термином «молекула антитела», который употребляется в данном документе, понимаются все типы молекул антител и их функциональные фрагменты, а также их производные, включая: моноклональные антитела, поликлональные антитела, синтетические антитела, рекомбинантно полученные антитела, мультиспецифичные антитела, биспецифичные антитела, человеческие антитела, антитела человеческого происхождения, гуманизированные антитела, химерные антитела, одно цепочечные Fvs (scFv), фрагменты Fab, фрагменты F(ab')₂, фрагменты F(ab'), Fvs (sdFv) с дисульфидной связью, тяжелые цепи антител, легкие цепи антител, го-модимеры тяжелых цепей антител, гомодимеры легких цепей антител, гетеродимеры тяжелых цепей антител, гетеродимеры легких цепей антител, антигенсвязывающие функциональные фрагменты таких гомо- и гетер одимеров.

Кроме того, термин «молекула антитела», употребляемый в данном документе, включает все классы молекул антител и функциональных фрагментов, включая: IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgD и IgE, если не указано иное.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения, молекула антитела представляет собой молекулу антитела человека, молекулу гуманизированного антитела или молекулу антитела человеческого происхождения. В данном контексте молекула гуманизированного антитела означает изначально нечеловеческое антитело, которое было модифицировано для увеличения его сходства с человеческим антителом. Молекулы гуманизированных антител могут, например, исходно представлять собой мышиные антитела или антитела ламы. В данном контексте молекула антитела человеческого происхождения означает исходную молекулу человеческого антитела, которая была модифицирована.

В некоторых таких вариантах осуществления данного изобретения молекула антитела представляет собой антитело IgG.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения молекула антитела представляет собой антитело IgG дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения молекула антитела представляет собой Fc сконструированное антитело IgG, такое как антитела, упомянутые выше, включая агликозилиро ванные или дегликозилиро ванные молекулы антитела IgG, такие как молекулы, включающие замену аспарагина в положении 297, такую как, например, замена N297Q или N297A.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения молекула антитела представляет собой антитело IgG1 человека. Антитела IgG1 человека соответствуют мышиным антителам IgG2a, поэтому, если необходимо применять мышиный заменитель IgG1 человека, например, для исследований in vivo, применяют формат мышиного IgG2a.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения молекула антитела представляет собой антитело IgG2 человека. Антитела IgG2 человека соответствуют мышиным антителам IgG3, поэтому, если необходимо применять мышиный заменитель IgG2 человека, например, для исследований in vivo, применяют формат мышиного IgG3.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения молекула антитела представляет собой антитело IgG4 человека. Антитела IgG4 человека соответствуют мышиным антителам IgG1, поэтому, если необходимо применять мышиный заменитель IgG4 человека, например, для исследований in vivo, применяют формат мышиного IgG1.

Fc модификации могут различаться между молекулами человеческих и мышиных антител; например, молекулу мышиного антитела N297A IgG2a можно применять в качестве заменителя молекулы антитела N297Q IgGl человека.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения, антитело анти-LILRB3 представляет собой моноклональное антитело.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения, антитело анти-LILRB3 представляет собой поликлональное антитело.

Как указывается выше, данное изобретение включает в себя различные типы и формы молекул антител, которые должны быть известны специалисту в области иммунологии. Хорошо известно, что антитела, применяющиеся в терапевтических целях, часто модифицируются дополнительными компонентами, которые изменяют свойства молекулы антитела.

Соответственно, авторы подразумевают, что молекула антитела, описанная в данном документе, или молекула антитела, применяемая, как описано в данном документе (например, молекула моноклонального антитела, и/или молекула поликлонального антитела, и/или молекула биспецифического антитела), содержат обнаруживаемый фрагмент и/или цитотоксический фрагмент.

Под «обнаруживаемым фрагментом молекулы» авторы подразумевают одну или большее количество групп, состоящих из: фермента; радиоактивного атома; флуоресцентного фрагмента молекулы; хемилюминесцентного фрагмента молекулы; биолюминесцентного фрагмента молекулы. Обнаруживаемый фрагмент молекулы позволяет визуализировать молекулу антитела in vitro и/или in vivo, и/или ex vivo.

Под «цитотоксическим фрагментом молекулы» авторы подразумевают радиоактивную часть и/или фермент, например, при этом фермент представляет собой каспазу; и/или токсин, например, при этом токсин представляет собой бактериальный токсин или яд; при этом цитотоксический фрагмент способен индуцировать лизис клеток.

Также авторы изобретения подразумевают, что молекула антитела может быть в изолированной форме и/или очищенной форме, и/или может быть ПЕГилирована. Пегилирование представляет собой метод, с помощью которого полимеры полиэтиленгликоля добавляются к молекуле, такой как молекула антитела или производное, с целью изменения ее характеристик, например, продлить период полураспада путем увеличения ее гидродинамического размера, препятствуя выведению почками.

Как уже обсуждалось выше, CDR антитела связываются с антителом-мишенью. Назначение аминокислот каждой области CDR, описанной в данной заявке, соответствует определениям, приведенным в работе Kabat ЕА et al. 1991, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (Последовательности белков, представляющих иммунологический интерес), пятое издание, публикация NIH №91-3242, рр xv-xvii.

Как может быть известно специалисту в данной области техники, существуют и другие способы назначения аминокислот каждой области CDR. Например, Международная информационная система иммуногенетики (IMGT(R)) (http://www.imgt.org/ и Lefranc и Lefranc "The Immunoglobulin FactsBook" опубликованные издательством Academic Press, 2001).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения молекула антитела, которая специфически связывает LILRB3, содержит одну из последовательностей VH-CDR1, перечисленных в Таблице 1 ниже.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения молекула антитела, которая специфически связывает LILRB3, содержит одну из последовательностей VH-CDR2, перечисленных в Таблице 1 ниже.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения молекула антитела, которая специфически связывает LILRB3, содержит одну из последовательностей VH-CDR3, перечисленных в Таблице 1 ниже.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения молекула антитела, которая специфически связывает LILRB3, содержит одну из последовательностей VL-CDR1, перечисленных в Таблице 1 ниже.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения молекула антитела, которая специфически связывает LILRB3, содержит одну из последовательностей VL-CDR2, перечисленных в Таблице 1 ниже.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения молекула антитела, которая специфически связывает LILRB3, содержит одну из последовательностей VL-CDR3, перечисленных в Таблице 1 ниже.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения молекула антитела анти-LILRB3 представляет собой молекулу антитела, выбранную из группы, состоящей из молекул антител, при этом три CDR в вариабельной области тяжелой цепи (VH) выбраны из группы, состоящей из:

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3;

SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11;

SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19; и

SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения молекула антитела анти-LILRB3 представляет собой молекулу антитела, выбранную из группы, состоящей из молекул антител, при этом три CDR в вариабельной области легкой цепи (VL) выбраны из группы, состоящей из:

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6;

SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14;

SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 22 и SEQ

SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения, молекула анти-LILRB3 антитела представляет собой молекулу антитела, выбранную из группы, состоящей из молекул антитела, содержащих VH, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 7, 15, 23 и 31.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения, молекула анти-LILRB3 антитела представляет собой молекулу антитела, выбранную из группы, состоящей из молекул антитела, содержащих VL, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 8, 16, 24 и 32.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения молекула анти-LILRB3 антитела содержит СН, имеющий SEQ ID NO: 41.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения молекула анти-LILRB3 антитела содержит CL, имеющий SEQ ID NO: 42.

Все последовательности в Таблице 1 выше имеют человеческое происхождение и происходят из библиотеки n-CoDeR®, как подробно объяснено в Примере 1.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения молекулы антител, которые специфически связывают LILRB3, описанные в данном документе, также могут содержать одну или обе константных областей (СН и/или CL), перечисленные в Таблице 2 ниже.

CH (SEQ ID NO: 33) и (SEQ ID NO: 34) последователоьности в приведенной выше Таблице 2 имеют человеческое происхождение.

Как указано выше, в некоторых вариантах осуществления данного изобретения молекулы антитела связывают человеческий LILRB3). В некоторых таких вариантах осуществления данного изобретения предпочтительно, чтобы молекулы антитела прочно связывались с человеческим LILRB3, то есть чтобы они имели низкое значение ЕС50.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предпочтительно, чтобы молекула антитела связывалась как с LILRB3 человека, так и с LILRB3 яванского макака (cmLILRB3 или LILRB3 яванского макака). Перекрестная реактивность с LILRB3, экспрессируемым на клетках яванского макака, также называемого крабоядным макаком или Масаса fascicularis, может быть выгодным, так как это позволяет тестировать молекулу антитела на животных без необходимости применять суррогатное антитело, уделяя особое внимание переносимости.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения необходимо применять суррогатное антитело для тестирования функциональной активности молекулы антитела на соответствующих in vivo моделях на мышах. Чтобы гарантировать сопоставимость между эффектом молекулы антитела у людей и результатами in vivo для суррогатного антитела у мышей, важно выбрать функционально эквивалентное суррогатное антитело, имеющее такие же характеристики in vitro, что и молекула антитела человека.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения молекула антитела по данному изобретению или применяемая в соответствии с данным изобретением представляет собой молекулу антитела, которая способна конкурировать со специфическими антителами, представленными в данном документе, например, способная конкурировать с молекулами антитела, содержащими VH, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 15, 23 и 31; и/или VL, выбранным из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 8, 16, 24 и 32, для связывания с LILRB3.

Под «способное конкурировать за» подразумевается то, что конкурирующее антитело способно ингибировать или иным образом вмешиваться, по меньшей мере частично, в связывание молекулы антитела, как определено в данной заявке, с конкретной мишенью LILRB3.

Например, такая молекула конкурирующего антитела может быть способна ингибировать связывание описанной в данном документе молекулы антитела с LILRB3 по меньшей мере около на 10%; например, по меньшей мере на около 20% или по меньшей мере на около 30%, по меньшей мере на около 40%, по меньшей мере на около 50%, по меньшей мере на около 60%, по меньшей мере на около 70%, по меньшей мере на около 80%, по меньшей мере на около 90%, по меньшей мере на около 95% или на около 100%.

Конкурентное связывание может быть определено способами, хорошо известными специалистам в данной области техники, такими как иммуноферментный анализ (ELISA).

Анализы ELISA можно применять для оценки эпитоп-модифицирующих или блокирующих антител. Дополнительные способы, пригодные для выявления конкурирующего антитела, описаны в лабораторном руководстве Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow & Lane («Антитела: Лабораторное руководство», авторы - Харлоу и Лейн), которое включено в данную заявку посредством ссылки (например, см. стр. 567 - 569, 574 - 576, 583 и 590 - 612, 1988, CSHL, NY, ISBN 0-87969-314-2).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения, представляет интерес применение не самой молекулы антитела анти-LILRB3, а нуклеотидной последовательности, кодирующей такую молекулу антитела. Таким образом, настоящее изобретение охватывает нуклеотидные последовательности, кодирующие указанные выше молекулы антител анти-LILRB3.

Вышеописанные молекулы антител и нуклеотидные последовательности, или другие молекулы антител анти-LILRB3, или нуклеотидные последовательности, кодирующие такие молекулы антител, могут применяться в медицине, и тогда такая молекула антитела и/или нуклеотидная последовательность могут быть включены в фармацевтическую композицию, как обсуждается далее ниже.

Молекулы антител анти-LILRB3, нуклеотидные последовательности и/или фармацевтические композиции можно применять для лечения отторжения трансплантата, как дополнительно обсуждается ниже.

Молекулы антител анти-LILRB3, нуклеотидные последовательности и/или фармацевтические композиции можно применять для лечения аутоиммунного нарушения, как дополнительно обсуждается ниже.

Молекулы антител анти-LILRB3, нуклеотидные последовательности и/или фармацевтические композиции можно применять для лечения воспалительного нарушения, как дополнительно обсуждается ниже.

Молекулы антител анти-LILRB3 и/или нуклеотидные последовательности можно применять при изготовлении фармацевтической композиции для лечения отторжения трансплантата.

Молекулы антител анти-LILRBS и/или нуклеотидные последовательности можно применять при изготовлении фармацевтической композиции для лечения аутоиммунного нарушения.

Молекулы антител анти-LILRBS и/или нуклеотидные последовательности можно применять при изготовлении фармацевтической композиции для лечения воспалительного нарушения.

Молекулы антител анти-LILRBS, нуклеотидные последовательности и/или фармацевтические композиции можно применять для лечения отторжения трансплантата, аутоиммунного нарушения и/или воспалительного нарушения у пациента, при этом пациенту вводят терапевтически эффективное количество молекулы антитела анти-LILRBS, нуклеотидной последовательности и/или фармацевтической композиции.

Примеры отторжения трансплантата, которое можно лечить, как описано в данном документе, включают отторжение в связи с трансплантацией органов или трансплантацией тканей, такой как трансплантация почки, печени, сердца, легкого, поджелудочной железы и кишечника, от донора к реципиенту в случаях, когда реципиент страдает заболеванием или патологией, поражающей орган, замещаемый при трансплантации. Другой пример отторжения трансплантата, который можно лечить, как описано в данном документе, включает отторжение алло генного трансплантата, при котором стволовые клетки, такие как гемопоэтические стволовые клетки (HSC), получают от соответствующего донора и трансплантируют пациенту для подавления болезни и восстановления иммунной системы пациента.

По меньшей мере, в некоторых вариантах осуществления данного изобретения реципиент трансплантата должен пройти предварительную подготовку путем введения агонистического LILRB3 mAb перед трансплантацией. В некоторых вариантах осуществления реципиент трансплантата также должен пройти лечение агонистическим LILRB3 mAb после трансплантации.

Молекулы антител, фармацевтические композиции и методы лечения, описанные в настоящем документе, можно применять для предотвращения, лечения или сведения к минимуму отторжения реципиентом нового органа или другого трансплантата.

Примеры аутоиммунного нарушения или аутоиммунного состояния, которые можно лечить, как описано в настоящем документе, включают следующие патологии: глютеновая болезнь, сахарный диабет 1 типа, саркоидоз, системная красная волчанка (SLE), Синдром Шегрена, эозинофильный гранулематоз с полиангиитом, тиреоидит Хашимото, болезнь Грейвса, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, болезнь Эддисона, ревматоидный артрит (RA), анкилозирующий спондилоартрит, полимиозит (РМ), дерматомиозит (DM) и рассеянный склероз (MS).

Примеры воспалительных заболеваний, которые можно лечить, как описано в данном документе, включают как хронические воспалительные заболевания, такие как ревматоидный артрит (RA), системная красная волчанка (SLE) и рассеянный склероз (MS), а также острые воспалительные заболевания, такие как сепсис.

Специалисту в области медицины может быть известно, что лекарствернные средства могут быть модифицированы с помощью различных добавок, например, чтобы изменить скорость всасывания лекарственного средства в организме; и могут быть модифицированы в различных формах, например, чтобы обеспечить определенный путь введения в организм.

Соответственно, данная заявка включает молекулы антител, нуклеотидные последовательности, плазмиды и/или клетки, описанные в данном документе, могут быть объединены с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом, носителем, разбавителем, носущей средой и/или адъювантом в фармацевтическую композицию. В этом контексте термин фармацевтическая композиция может применяться взаимозаменяемо с терминами фармацевтический препарат, фармацевтический состав, терапевтическая композиция, терапевтический препарат, терапевтический состав и терапевтическое средство.

Описанные в данном документе фармацевтические композиции могут содержать или в некоторых вариантах осуществления данного изобретения состоять из молекул антител, нуклеотидных последовательностей, плазмид или клеток.

Описанные в данном документе фармацевтические композиции могут в некоторых вариантах осуществления данного изобретения состоять или содержать плазмиды, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие описанные выше молекулы антител или содержащие описанные выше нуклеотидные последовательности.

Настоящее изобретение также включает другие терапевтические варианты или «формы» лекарственных средств, такие как конъюгаты «антитело-лекарственное средство», слитые белки и т.д., и фармацевтическую композицию, содержащую такие терапевтические варианты.

Молекулы антител, нуклеотидные последовательности, плазмиды, клетки и/или фармацевтические композиции, описанные в данном документе, могут быть пригодны для парентерального введения, включая водные и/или неводные стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, и/или буферы, и/или бактериостатики, и/или растворенные вещества, которые делают композицию изотоничной по отношению к крови предполагаемого реципиента; и/или водные и/или неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты и/или загустители. Молекулы антител, нуклеотидные последовательности, плазмиды, клетки и/или фармацевтические композиции, описанные в данном документе, могут быть представлены в контейнерах для однократной или многократной дозы, например, в запечатанных ампулах и флаконах, и могут храниться в высушенном сублимацией (т.е. лиофилизированном) состоянии, требующем добавления только стерильного жидкого носителя, например, воды для инъекций, непосредственно перед применением.

Экстемпоральные инъекционные растворы и суспензии можно приготовить из стерильных порошков и/или гранул, и/или таблеток ранее описанного вида.

При парентеральном введении пациентам-людям уровень суточной дозы молекулы анти-LILRB3 антитела обычно составляет от 1 мг/кг веса тела пациента до 20 мг/кг, а в некоторых случаях даже до 100 мг/кг, и вводится в разовой или разделенных дозах. Более низкие дозы можно применять в особых обстоятельствах, например, в сочетании с продолжительным введением. В любом случае врач определит фактическую дозу, которая будет наиболее подходящей для каждого отдельного пациента, и которая будет варьировать в зависимости от возраста, веса и ответа конкретного пациента. Приведенные выше дозы являются типовыми для среднего случая. Конечно, могут быть отдельные случаи, когда будут оправданы более высокие или более низкие диапазоны доз, и такие случаи входят в объем настоящего изобретения.

Как правило, описанная в данном документе фармацевтическая композиция (или лекарственное средство), содержащая молекулу антитела, будет содержать молекулу анти- LILRB3 антитела в концентрации от около 2 мг/мл до 150 мг/мл или от около 2 мг/мл до 200 мг/мл.

Обычно для людей пероральное или парентеральное введение молекул антител, нуклеотидных последовательностей, плазмид, клеток и/или фармацевтических композиций, описанных в данном документе, является предпочтительным и наиболее удобным путем. Для ветеринарного применения, молекулы антител, нуклеотидные последовательности, плазмиды, клетки и/или фармацевтические композиции, описанные в данном документе, вводят в виде подходящего приемлемого состава в соответствии с обычной ветеринарной практикой, и ветеринарный хирург определит схему и способ введения, которые будут наиболее подходящими для конкретного животного. Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащую количество молекулы антитела, нуклеотидной последовательности, плазмиды и/или клетки по данному изобретению, эффективное для лечения различных патологических состояний (как описано выше и далее ниже). Желательно, чтобы молекулы антител, нуклеотидные последовательности, плазмиды, клетки и/или фармацевтические композиции, описанные в данном документе, были адаптированы для доставки с помощью пути, выбранном из группы, включающей внутривенный (IV или в/в); внутримышечный (IM или в/м) или подкожный (SC или п/к) пути.

Данное изобретение также включает молекулы антител, нуклеотидные последовательности, плазмиды клетки и/или фармацевтические композиции, описанные в данном документе, включающие фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли или основно-аддитивные соли целевых связывающих молекул или их частей по данному изобретения. Кислоты, которые применяются для получения фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей вышеупомянутых основных соединений, пригодных для данного изобретения, являются кислотами, которые образуют нетоксичные кислотно-аддитивные соли, т.е. соли, содержащие фармакологически приемлемые анионы, в частности, такие как, среди прочего: гидрохлорид, гидробромид, гидройодид, нитрат, сульфат, бисульфат, фосфат, кислый фосфат, ацетат, лактат, цитрат, кислый цитрат, тартрат, битартрат, сукцинат, малеат, фумарат, глюконат, сахарат, бензоат, метансульфонат, этан-сульфонат, бензолсульфонат, р-толуолсульфонат и памоат [т.е. 1,1' - метилен-бис-(2-гидрокси-3 нафтоат)]. Фармацевтически приемлемые основно-аддитивные соли также можно применять для получения фармацевтически приемлемых солевых форм агентов согласно данному изобретению. Химические основания, которые можно применять в качестве реактивов для получения фармацевтически приемлемых основных солей настоящих агентов, которые являются кислотными по своей природе, представляют собой химические основания, которые образуют с такими соединениями нетоксичные основные соли. Такие нетоксичные основные соли включают, помимо прочего, нетоксичные основные соли, являющиеся производными таких фармакологически приемлемых катионов, как катионы щелочных металлов (например, калия и натрия) и катионы щелочноземельных металлов (например, кальция и магния), аммоний или водорастворимые амино-аддитивные соли, такие как N-метилглюкамин-(меглюмин), а также, среди прочего, низший алканоламмоний и другие основные соли фармацевтически приемлемых органических аминов. Молекулы антител, нуклеотидные последовательности, плазмиды и/или клетки, описанные в данном документе, могут быть лиофилизированы для хранения и восстановлены в подходящем носителе перед применением. Можно применять любой подходящий метод лиофилизации (например, распылительная сушка, сушка осадка) и/или методики восстановления. Специалистам в данной области будет понятно, что лиофилизация и восстановление могут привести к разной степени потери активности антител (например, при применении обычных иммуноглобулинов, антитела IgM имеют тенденцию к большей потере активности, чем антитела IgG) и что уровни использования, возможно, придется скорректировать в сторону повышения с компенсаторной целью. В одном варианте осуществления данного изобретения лиофилизированный (сублимированный) полипептид связывающий фрагмент теряет не более чем около 20%, или не более чем около 25%, или не более чем около 30%, или не более чем около 35%, или не более чем около 40%, или не более чем около 45%, или не более чем около 50% своей активности (до лиофилизации) при регидратации.

Молекулы анти-LILRB3 антитела, нуклеотидные последовательности и фармацевтические композиции, описанные в данном документе, могут быть применены для лечения отторжения трансплантата или аутоиммунных состояний у субъекта или пациента. В данном документе термины «субъект» и «пациент» применяются взаимозаменяемо.

Термин «пациент» (или субъект), применяемый в данном документе, относится к животному, в том числе человека, у которого было диагностированоотторжение трансплантата или аутоиммунное состояниеи/или у которого проявляются симптомыотторжения трансплантата или аутоиммунного состояния.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения пациент (или субъект) представляет собой животное, включая человека, у которого было диагностировано отторжение трансплантата или аутоиммунное состояние. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения пациент (или субъект) представляет собой животное, в том числе человека человека, которому будет проведена трансплантация и, следовательно, существует риск отторжения трансплантата; затем указанному пациенту будет проведено лечение, обсуждаемое в данном документе, в качестве профилактического лечения или в профилактических целях..

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения пациент (или субъект) представляет собой млекопитающие или не млекопитающие животное, в том числе человека, у которого диагностировано отторжение трансплантата или аутоиммунное состояние и/или проявляются симптомы отторжения трансплантата или аутоиммунного состояния.

Указанные виды лечения можно проводить в виде курса лечения, то есть терапевтический агент вводят в течение определенного периода времени. Продолжительность курса лечения будет зависеть от ряда факторов, которые, среди прочего, могут включать тип вводимого лекарственного препарата; тип заболевания или патологического состояния, которое подвергается лечению; тяжесть заболевания или патологического состояния, которое подвергается лечению; возраст и состояние здоровья пациента.

Под фразой «во время лечения» авторы подразумевают то, что пациент в данное время проходит курс лечения и/или получает терапевтический агент, и/или получает курс терапевтического агента.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

В приведенных ниже примерах делается ссылка на следующие фигуры:

Фигура 1. Создание полностью человеческих mAb против человеческого LILRB3. Фиг. 1А: Скрининг созданных клонов LILRB3. Выполняли FMAT и клоны scFv подвергали скринингу в отношении клеток-мишеней LILRB3 и нецелевых трансфицированных LILRB1 клеток. Рассчитывали MFI, при этом специфические для мишени scFv отображались более светлым цветом, а нецелевые scFv - более темным. Фиг. 1В: Скрининг LILRB3 mAb с помощью проточной цитометрии. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) или LILR-трансфицированные клетки CHO-S инкубировали с His-мечеными супернатантами scFv с последующим окрашиванием анти-His-AF647. В случаях, когда применяли трансфицированные клетки CHO-S, клетки CHO-S, LILRB1- и LILRB2-трансфициро ванные клетки применяли в качестве нецелевых относительно LILRB3. Клоны антител сравнивали как с гейтированными моноцитами, так и с трансфицированными клетками-мишенями CHO-S с помощью программного обеспечения TIBCO Spotfire, при этом клоны, специфичные для LILRB3, выделены светло-серым цветом, неспецифические клоны темно-серым, а нерелевантный изотипический контроль серым. Фиг. 1С: Специфичность клонов LILRB3 в отношении человеческих LILR-трансфицированных клеток 2В4. LILRB3 mAb тестировали в отношении клеток, трансфицированных указанными представителями семейства LILR, с помощью проточной цитометрии; представлен репрезентативный клон (А16). Фиг. 1D и Е: Тестирование специфичности клонов LILRB в отношении первичных клеток с помощью проточной цитометрии. РВМС (Фиг. 1D) или цельная кровь (Фиг. 1Е), окрашенные либо АРС-меченым LILRB3 (клон А16), либо изотипом hIgG1, а также различными поверхностными маркерами лейкоцитов, как указано. Гистограммы представляют собой репрезентативные графики нескольких доноров: моноциты и В-клетки (n=12), Т-клетки и NK-клетки (n=12) и нейтрофилы (n=6).

Фигура 2. Характеризация антител LILRB3. Фиг. 2А: Аффинность LILRB3 mAb, оцененная с помощью SPR. Рекомбинантный белок LILRB3-hFc иммобилизовали, и через чип пропускали различные LILRB3 mAb. Значения KD рассчитывали с помощью оценочного программного обеспечения Biacore™ Т100. Показаны репрезентативные клоны LILRB3. Фиг. 2В: Способность сгенерированного mAb перекрестно блокировать связывание LILRB3 mAb (коммерческое LILRB3 mAb; (клон 222821, R&D Systems, UK)). РВМС окрашивали неконъюгированными клонами антитела LILRB3, а затем окрашивали непосредственно конъюгированным коммерческим LILRB3 mAb и анализировали с помощью проточной цитометрии; репрезентативные клоны отображаются, как указано. Изотипический контроль (изо контр.) заштрихован серым цветом, клон 222821 отдельно черным цветом и в комбинации с указанными клонами LILRB3 - серой линией. Фиг. 2С: Картирование эпитопа домена LILRB3. Клетки HEK293F, трансфицированные LILRB3 дикого типа (полноразмерная внеклеточная часть), LILRB3-D1-3, LILRB3-D1-2 или LILRB3-D1, окрашивали клонами LILRB3 с последующим окрашиванием вторичным антителом анти-hIgG-PE. Приведена схема сгенерированных доменных конструкций и рестрикционное расщепление каждой конструкции. Гистограммы, демонстрирующие окрашивание двух репрезентативных клонов, дифференциально связывающихся с клетками, экспрессирующими WT (D4), D3, D2 и D1, как указано (n=3 независимых эксперимента). Фиг. 2D: Репортерные клетки LILRB3 2В4 обрабатывали 10 мкг/мл антител LILRB3 в течение ночи для оценки агонизма или антагонизма. Затем экспрессию GFP измеряли с помощью проточной цитометрии; показаны репрезентативные клоны.

Фигура 3. Лигирование LILRB3 регулирует активацию и пролиферацию Т-клеток CFSE-меченые РВМС стимулировали антителами против CD3 и CD28 человека в присутствии или в отсутствие изотипического контроля (изо контр.) или LILRB3 mAb (10 мкг/мл) и измеряли пролиферацию посредством разбавления CFSE через 3-5 дней. Фиг. 3А: Оценка активации и пролиферации Т-клеток после обработки. Изображения световой микроскопии после стимуляции РВМС в культуре. Пролиферацию CD8+ Т-клеток оценивали с помощью разведения CFSE; показаны репрезентативные гистограммы. Фиг. 3В: LILRB3 mAb были дегликозилированы (Degly) посредством обработки PNG-азой, что подтверждено SDS-PAGE; показаны репрезентативные клоны. Фиг. 3С: Оценка эффектов дегликозилированного LILRB3 mAb на пролиферацию Т-клеток. CFSE разведение CD8+ Т-клеток, обработанных различными LILRB3 mAb, оценивали с помощью проточной цитометрии. Данные нормализованы к образцам, обработанным анти-CD3/CD28, и при эом среднее значение представлено сплошной линией; показаны репрезентативные клоны. Был выполнен двусторонний парный Т-тест; звездочки обозначают уровень значимой разницы по сравнению с изоти-пическим контролем (*** р<0,005); n=13-20 независимых доноров (каждая точка представляет отдельного донора).

Фигура 4. Лигирование LILRB3 модулирует фагоцитоз макрофагов. Фиг. 4A: MDM человека окрашивали анти-CD14 и анти-LILRB3 (А16), после чего анализировали с помощью проточной цитометрии. Фиг. 4В: MDM обрабатывали дегликозилированным изотипическим контролем (изо контр.) или LILRB3 mAb (10 мкг/мл) перед совместным культивированием с клетками-мишенями, опсонизированными CFSE⁺ ритуксимабом; после чего определяли фагоцитоз как количество гейтированых живых клеток, которые были дважды положительными (CD16⁺CFSE⁺ клетки), в процентах от общего количества MDM (CD16⁺ клетки), используя следующее уравнение:

(Двойные положительные MDM / Общее количество MDM) × 100 = % положительных MDM Фиг. 4С: Влияние дегликозилированного LILRB3 mAb на фагоцитоз. Каждый донор был обследован в трех повторностях, и среднее значение представлено сплошной линией (n=4-6 здоровых доноров); показаны репрезентативные клоны. Был выполнен двусторонний парный Т-тест; звездочки представляют уровень значимой разницы по сравнению с изотипическим контролем (* р<0,05, *** р<0,0005). Фиг. 4D: Влияние дегликозилированного LILRB3 mAb на фагоцитоз, оцененное с помощью конфокальной микроскопии. MDM, обработанные LILRB3 (серый), совместно культивировали с В-клетками, мечеными CFSE (светло-серый), фиксированными в 4% PFA и мембранными глико-протеинами, окрашенными биотинилированным WGA. Затем клетки инкубировали с AF635, конъ-югированным со вторичным стрептавидином, и анализировали с помощью конфокальной микроскопии.

Фигура 5. Лигирование LILRB3 индуцирует толерантность in vivo. Были сгенерированы полностью воссозданные гуманизированные мышиные модели (≥50% циркулирующих лейкоцитов hCD45+), и экспрессию человеческого LILRB3 подтверждали на миелоидных клетках CD14+. Фиг. 5А: Репрезентативная гистограмма проточной цитометрии, демострирующая экспрессию LILRB3 на hCD45⁺ миелоидных клетках hCD14⁺ костного мозга; изотипический контроль - сплошной темно-серый цвет, LILRB3 - сплошной светло-серый цвет. Фиг. 5В. Гуманизированным мышам инъецировали 200 мкг LILRB3 mAb (клон А1) или контрольное mAb соответствующего изотипа (hIgG1) на день 0 и 4, в/в и внутрибрюшинно (в/бр), соответственно. На день 7 мышам в/бр инъецировали 1×10⁷ неаутологичных люцифераза⁺ клеток лимфомы человека. Рост клеток лимфомы отслеживали с течением времени с помощью устройства визуализации IVIS; показаны репрезентативные изображения из 3 независимых экспериментов (n=3 мыши/группа).

Фигура 6. Лигирование человеческого LILRB3 перепрограммирует первичные миелоидные клетки человека. Свежевыделенные периферические CD14⁺ моноциты человека обрабатывали изотипическим контролем (изо контр.) или человеческим LILRB3 mAb (клон А1). Фиг. 6А: Морфология моноцитов после обработки. Изображения световой микроскопии после обработки свежевыделенных CD14⁺ моноцитов указанным mAb в культуре в течение ночи. Фиг. 6В: Транскриптомный анализ моноцитов, обработанных LILRB3. РНК экстрагировали из клеток после обработки mAb (~18 часов) и подвергали РНК секвенированию. Левая панель изображает перечень генов, которые были значительно активированы, а правая панель изображает гены, которые были значительно подавлены по сравнению с клетками, обработанными изотипическим контролем (n=4; каждая строка представляет отдельного донора). Фиг. 6С: лигирование LILRB3 на первичных CD14⁺ моноцитах человека индуцирует М2-поляризованные гены. Графики GSEA, демонстрирующие значительное обогащение М2-поляризующими генами в моноцитах, обработанных LILRB3, по сравнению с изотипическим контролем, соответственно. UP; активированный, NES; нормализованный показатель обогащения = -1,68; FWER; групповая вероятность ошибки первого рода р<0,001. Фиг. 6D: qPCR-анализ выбранных генов после лигирования LILRB3 на моноцитах. Данные нормализовали по уровням мРНК GAPDH и стандартизировали по уровням моноцитов, обработанных изотипическим контролем. Данные кратностей изменения были преобразованы в log10. Был проведен однофкторный анализ ANOVA с тестом множественных сравнений Бонферрони, n=3 независимых донора (** р<0,005, *** р<0,0005). Фиг. 6 Е: Анализ GSEA, демонстрирующий отрицательную корреляцию с сигнальными элементами «IFN-γ» (NES=-2,17; FWER p<0,001), «IFN-α» (NES=-2,3; FWERp<0,001) и «отторжением аллотрансплантата» (NES=-1,58; FWER p=0,14) и положительную корреляцию с «окислительным фосфорилированием» (NES=2; FWER р<0,001). Фиг. 6F: Схематическая диаграмма, демонстрирующая иммуносупрессивную функцию LILRB3 после лигирования на АРС.

ПРИМЕРЫ

Далее будут описаны конкретные неограничивающие примеры, которые воплощают определенные аспекты настоящего изобретения.

Материалы и способы

Заявление об этике

Все исследования с человеческими образцами и мышами проводились в соответствии с институциональными рекомендациями, Хельсинкской декларацией и Руководством Министерства здравоохранения и социальных служб США по уходу и использованию лабораторных животных. Комитет по уходу за животными Массачусетского технологического института (MIT) рассмотрел и одобрил описанные в данном документе исследования. Все образцы крови человека (периферическая кровь взрослых и печень плода) были собраны анонимно с информированного согласия третьей стороны и приобретены для исследования. Что касается периферической крови человека, этическое одобрение на использование клинических образцов было получено доверительным фондом NHS клиники Саутгемптонского университета; от Комитета по этике исследований Саутгемптона и Юго-Западного Гэмпшира после предоставления информированного согласия. Образцы первичного хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL) были получены из банка тканей Саутгемптонского университета, лицензированного Управлением тканей человека, в рамках LPD-исследования LREC номер 228/02/Т.

Выделение гемопоэтических стволовых клеток/клеток-предшественников (HSPC) и создание гуманизированных мышиных моделей

Печень плода человека получали от абортированных плодов на 15-23 неделе беременности в соответствии с институциональными этическими рекомендациями (Advanced Bioscience Resources, Inc., штат Калифорния, США). Все женщины дали письменное информированное согласие на донорство тканей плода для исследований. Плоды собирали в течение 2 часов после прерывания беременности. Ткань печени плода сначала разрезали на мелкие кусочки и расщепляли коллагеназой VI (2 мг/мл в среде Игла, модифицированной по Дульбекко [DMEM]) в течение 30 минут при 37°С с периодическим перемешиванием. Суспензии одиночных клеток готовили путем пропускания расщепленной ткани через 100-мкм клеточный фильтр (BD Biosciences, штат Нью-Джерси, США). CD34⁺ клетки очищали с применением набора для селекции CD34⁺ (Stem Cell Technologies, Ванкувер, Британская Колумбия, Канада); чистота CD34⁺ клеток составляла 90-99%. Жизнеспособные клетки подсчитывали по исключению мертвых клеток трипановым синим. Все клетки выделяли в стерильных условиях.

Мышей NSG приобретали в Jackson Laboratories (США). Бар-Харбор, штат Мэн, США) и содержали в особых условиях отсутствия патогенов в помещениях для животных в MIT. Для воссоздания мышиной модели, новорожденных детенышей (в возрасте менее 2 дней), облучали дозой 100 сГр с использованием источника гамма-излучения, и интракардиально вводили клетки CD34+CD133+ (приблизительно 2×10⁵ клеток/реципиента), как сообщалось ранее 25). Примерно в возрасте 12 недель восстановление лейкоцитов человека определяли с помощью проточной цитометрии мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС). Химеризм, или уровень восстановления лейкоцитов человека, рассчитывали следующим образом: % CD45+ клеток человека/(% CD45+ клеток человека + % CD45+ клеток мыши). В исследовании использовали мышей с ≥ 40% лейкоцитов человека CD45+.

Культура клеток

Линии клеток выращивали при 37°С либо в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS) (Sigma-Aldrich, Великобритания), 100 ед/мл пенициллина-стрептомицина, 2 мМ глутамина и 1 мМ пирувата (Thermo Fisher Scientific, Великобритания) во влажном инкубаторе с 5% CO₂, средой Freestyle 293F, 8% CO₂, встряхивая со скоростью 130 об/мин, либо в среде Freestyle СНО (Thermo Fisher Scientific, Великобритания) с 8 мМ глютамином, 8% CO₂, встряхивая со скоростью 140 об/мин.

Генерация и продукция антител

Генерация антител LILRB3.

Селекцию различных mAb, специфичных для LILRB3, проводили с применением библиотеки фагового дисплея n-CoDeR® (26). Выполнены три последовательных раунда пэнинга, а также этап предварительного пэнинга. При пэннинге, Fc слитые белки, содержащие внеклеточные домены LILRB1, LILRB2 или LILRB3 (LILRB-Fc), применяли в качестве нецелевых белков или белков-мишеней соответственно. Эти белки были получены во временно трансфицированных клетках HEK293 с последующей очисткой на белке А, как описано ранее (27). Клетки CHO-S, временно трансфицированные для экспрессии различных белков LILRB, также примененяли в качестве белков-мишеней/нецелевых белков при пэннинге.

При пэннинге 1, BioInvent n-CoDeR® scFv отбирали с применением биотинилированных рекомбинантных слитых белков LILRB-Fc человека (h) собственного производства (захваченных с помощью покрытых стрептавидином гранул Dynabeads®) с конкуренцией или без нее, или LILRB-hFc, нанесенных на протравленные полистироловые гранулы (Polysciences, США)/пластиковые иммунопробирки. Связывающие фаги элюировали путем расщепления трипсином и амплифицировали на чашках с помощью стандартных процедур (28). Амплифицированные фаги из пэннинга 1 применяли для пэннинга 2, процесс повторяли, а амплифицированные фаги из пэннинга 2 применяли для пэнинга 3. Однако в третьем цикле пэннинга амплифицированные фаги из всех трех стратегий объединяли и отбирали по отношению к временно трансфицированным LILRB клеткам CHO-S.

Затем LILRB3-положительные кассеты scFv из обогащенного репертуара фагов из пэннинга 3 повторно клонировали, чтобы обеспечить экспрессию растворимого scFv в Е. coli. Фрагменты растворимого scFv, экспрессированные отдельными клонами, тестировали на связывание с клетками CHO-S, трансфицированными LILRB, с помощью технологии флорометрического микрообъемного анализа (Flourometric Microvolume Assay Technology - FMAT), а с рекомбинантным белком LILRB - с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Это позволило идентифицировать клоны, специфически связывающиеся с LILRB3. Затем клоны дополнительно уменьшали в третичном скрининге по отношению к клеткам CHO-S, экспрессирующим LILRB1-3, и первичным клеткам (РВМС). Клоны, демонстрирующие специфические профили связывания с одним LILRB, секвенировали с получением LILRB1-3-специфических mAb.

Продукция полноразмерных IgG

Уникальные scFv, идентифицированные выше, клонировали в системе эукариотической экспрессии, обеспечивающей временную экспрессию полноразмерного IgG в клетках HEK293-EBNA. Затем антитела очищали из культуральных супернатантов с помощью аффинной хроматографии на основе белка А, как описано ранее (29).

Продуцирование дегликозилированного IgG.

Чтобы сделать возможным выделение Fc- и Fab-зависимых эффекторных функций, IgG дегликозилировали с применением РNGазы F (Promega) с 0,05 ед. PNGaзы/мкг IgG при 37°С в течение по меньшей мере 15 часов. Дегликозилирование было подтверждено уменьшением размера тяжелой цепи при SDS-PAGE.

Прудуцирование доменных мутантных конструкций

Применяя кДНК LILRB3 дикого типа, выделенную из РВМС здорового донора, с помощью PCR с перекрытием генерировали ряд конструкций ДНК с мутантными доменами для экспрессии 1, 2 или 3 Ig-подобных доменов LILRB3 (с доменами, идентифицированными на основе аннотаций в Uniprot). Затем генные конструкции клонировали в pcDNA3.

Клеточные трансфекции

10×10⁶ клеток HEK293F временно трансфицировали 10 мкг плазмидной ДНК путем липо-фекции с применением 233 фектина со средой Optimem 1 (Thermo Fisher Scientific, Великобритания).

Получение лейкоцитов человека и получение макрофагов, происходящих из моноцитов (MDM)

Цельную кровь получали после информированного согласия здоровых добровольцев. РВМС выделяли из колб для лейкоцитов крови (Служба переливания крови, Саутгемптонская больница общего профиля). Выделение проводили центрифугированием в градиенте плотности с применением lymphoprep (Axis Shield, Великобритания). MDM генерировали из здоровых моноцитов периферической крови человека, как и ранее (30). Вкратце, РВМС высевали в количестве 2×10⁷ кле-ток/лунку на 6-луночный планшет (Corning, Великобритания) с 1% сывороткой АВ человека (Sigma-Aldrich, Великобритания) и инкубировали при 37°С в течение 2 часов. Неприлипшие клетки отмывали, а прилипшие моноциты (>90% CD14⁺) инкубировали при 37°С в течение ночи с 5% CO₂. На следующий день в каждую лунку добавляли 100 нг/мл человеческого рекомбинантного M-CSF (собственного производства). Среду и цитокин дважды пополняли во время культивирования, а затем клетки собирали на день 7-8.

Анализ фагоцитоза макрофагов

Человеческие MDM, полученные, как описано выше, высевали в количестве 1×10⁵ клеток/лунку на 96-луночный планшет с плоским дном. MDM обрабатывали с применением 10 мкг/мл антитела LILRB3 в течение 2 часов и промывали. Клетки первичного хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), меченные 5 мкМ CFSE (Sigma-Aldrich, Великобритания), опсонизировали ри-туксимабом в течение 25 минут при 4°С (или герцептином в качестве изотипического контроля). Затем MDM и клетки-мишени CLL совместно культивировали в течение 1 часа при 37°С в соотношении 1:5 соответственно перед окрашиванием 10 мкг/мл CD16-APC (BioLegend, Великобритания) в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. Клетки промывали, собирали, анализировали с помощью проточной цитометрии и рассчитывали % фагоцитоза следующим образом: (% двойных положительных MDM)/(% общего количества MDM) × 100.

Проточная цитометрия

Для окрашивания клеточной поверхности РВМС или цельной крови, клетки блокировали 2% сывороткой АВ человека (Sigma-Aldrich, Великобритания) в течение 10 минут на льду, а затем окрашивали соответствующим АРС-меченым mAb или изотипом hIgG1 (BioInvent, Швеция) наряду со следующими маркерами клеточной поверхности: CD14-PE (eBioscience, Великобритания), CD20-А488 (ритуксимаб с флуоресцентной меткой, собственного производства), CD3-PE-Cy7, CD56-АРС-Су7 или CD15-Pacific Blue и CD66B-FITC mAb (все BioLegend, Великобритания). Клетки окрашивали в течение 30 минут при 4°С, а затем дважды промывали, сначала в 10% буфере для лизиса эритроцитов (RBC) (Serotec, Великобритания), а затем промывали FACS (PBS, 1% BSA, 10 мМ NaN3) перед сбором данных с помощью FACSCalibur или FACSCanto II (BD Biosciences, США) и анализом с помощью FCS Express V3 (De Novo Software).

Для проведения анализов, определяющих, связаны ли mAb с аналогичными перекрестно блокирующими эпитопами, 1×10⁶ РВМС блокировали 2% сывороткой АВ человека в течение 10 минут и окрашивали 10 мкг/мл неконъюгированного mAb LILRB3 в течение 30 минут при 4°С. Затем клетки окрашивали непосредственно конъюгированным коммерческим mAb LILRB3 (клон 222821; R&D Systems, Великобритания) в течение 20 минут при 4°С перед промывкой и сбором данных с помощью FACSCalibur.

Для исследования картирования эпитопов LILRB3 клетки HEK293F, трансфицированные мутантным доменом LILRB3, окрашивали соответствующими mAb LILRB3 в течение 25 минут при 4°С, дважды промывали, окрашивали вторичным античеловеческим РЕ (Jackson ImmunoResearch, США) в течение 20 минут при 4°С перед промывкой и сбором данных с помощью FACSCalibur.

Для окрашивания репортерных клеток 2В4, экспрессирующих LILR-A1, -А2, -А5, -В1, -В2, -В3, -В4 или -В5 (или нетрансфицированные контроли), клетки окрашивали 10 мкг/мл LILRB mAb и инкубировали при 37°С с 5% CO₂ в течение ночи. На следующий день клетки промывали и окрашивали вторичным антителом анти-hIgG (Jackson ImmunoResearch, США) при 4°С в течение 45 минут. Клетки промывали, получали данные с помощью FACScan (BD Biosciences, США) и анализировали с помощью Cell Quest (BD Biosciences, США).

Данные проточной цитометрии анализировали с помощью FCS Express V3 (De Novo Software) и Flow Jo.

Поверхностный плазмонный резонанс (SPR)

SPR выполняли с помощью Biacore Т100 (GE Healthcare, Великобритания) в соответствии с инструкциями производителя. Рекомбинантный белок LILRB3-hFc (внеклеточный домен LILRB3 с Fc-меткой человека) применяли в качестве лиганда и иммобилизовали путем связывания с амином на сенсорном чипе серии S (СМ5). В качестве «аналитов» применяли различные mAb LILRB3, которые пропускали через чип и измеряли SPR. Значения KD рассчитывали по «универсальной» модели связывания 1:1 по Kd [1/с]/Ka [1/мс] с помощью оценочного программного обеспечения Biacore™ Т100 (GE Healthcare, Великобритания).

Анализ пролиферации Т-клеток

РВМС (1-2×10⁷) метили 2 мкМ CSFE при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем клетки ресуспендировали в бессывороточной среде CTL (Immunospot, Германия) и высевали в количестве 1×10⁵ клеток/лунку на 96-луночный круглодонный планшет (Corning, Великобритания). Затем клетки стимулировали с применением 0,02 мкг/мл CD3 (клон ОКТ3, Саутгемптонский Университет), 5 мкг/мл CD28 (клон CD28.2; BioLegend, Великобритания) и 10 мкг/мл антитела LILRB3 или соответствующего изотипа. Затем планшеты инкубировали при 37°С в течение 4 дней, после чего клетки окрашивали с применением 5 мкг/мл CD8-APC (клон SK1; BioLegend, Великобритания), собирали и разведение CSFE измеряли с помощью проточной цитометрии в качестве показателя пролиферации Т-клеток.

Анализ аллотрансплантата in vivo

Полностью реконструированным гуманизированным мышам (≥40% циркулирующих hCD45+ лейкоцитов) вводили 200 мкг mAb LILRB3 (клон А1) или соответствующий по изотипу (hIgG1) контроль в день 0 и день 4, в/в и в/бр, соответственно. На день 7 когортам мышей в/бр вводили 1×10⁷ клеток люциферазоположительных В-клеточных лимфом человека с «двойным попаданием» (25, 31), полученных от неродственных несовместимых доноров. Рост клеток лимфомы контролировали с течением времени с помощью системы биолюминесцентной визуализации IVIS Spectrum, как и ранее (25).

Транскриптомный анализ

Для оценки LILRB3-опосредованных транскрипционных изменений на моноцитах, моноциты периферической крови человека выделяли из свежеприготовленных РВМС, взятых у здоровых доноров, с применением набора Human Monocyte Enrichment Kit (клетки негативной селекции; SEasySep™ temCell Technologies, США). Клетки инкубировали в среде CTL с добавлением 100 ед/мл пенициллина-стрептомицина, 2 мМ глутамина и буфера HEPES и обрабатывали 10 мкг/мл изотипического контроля или агонистического mAb LILRB3 (клон A1; hIgG1). Через 18 ч клетки лизировали в лизирующем буфере RLT, содержащем β-меркаптоэтанол, и выделяли общую РНК с помощью микронабора RNeasy (Qiagen, США). Общую РНК оценивали качественно и количественно определяли с помощью набора total RNA 6000 Nano LabChip на биоанализаторе 2100 (Agilent Inc., США) и библиотек кДНК, приготовленных и секвенированных в соответствии с Руководством Illumina TruSeq по подготовке образцов РНК для набора SMARTer Universal Low Input RNA Kit(Clontech, США) и системы HiSeq 2000 (Illumina, США). Выходные данные PHKseq приводили в соответствие с hg19 с помощью программного обеспечения Bowtie2 v2.2.3 (32). Число картированных считываний определяли количественно с помощью программного обеспечения RSEM v1.2.15 (33). Дифференциальный анализ экспрессии между парными образцами до и после обработки проводили с помощью edgeR (34) с р<0,05 и отсечениями >2 кратностей изменения. Дифференциально экспрессируемые гены аннотировали с помощью онлайн-инструмента для анализа функционального обогащения DAVID (http://david.ncifcrf.gov/) (35). Анализ обогащения набора генов (GSEA) выполняли с помощью программного обеспечения Broad Institute. (36), с перечнем генов, предварительно ранжированных в соответствии со значениями logFC из выходных данных edgeR. Для сравнения экспрессии набора генов, наборы генов макрофагов M1 и М2 (37)по-лучали из базы данных молекулярных сигнатур (http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/). Тепловые карты визуализировали с MeV (38).

Количественная PCR (qPCR)

qPCR на основе зонда применяли для амплификации кДНК в реакциях объемом 20 мкл, проводимых в трех повторностях для каждого состояния образца в 96-луночном планшете для PCR (Bio-Rad, Великобритания). Каждая реакция включала 48 нг к ДНК, 10 мкл платиновой смеси для qPCR (Life Technologies, Великобритания), 8 мкл воды DEPC и 1 мкл геноспецифичной смеси 20х PrimeTime зонд/праймер в соответствии с протоколом производителя. 96-луночный планшет, содержащий реагенты для PCR, запускали в PCR-машине в системе реального времени С1000 Thermal Cycler CFX96 (Bio-Rad, Кидлингтон, Великобритания). Программное обеспечение CFX manager (Bio-Rad, Кидлингтон, Великобритания) применяли для сбора данных и анализа экспрессии генов, первоначально зарегистрированной как пороговые значения цикла (Ct). Значения Ct нормализовали по гену «домашнего хозяйства» глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) и стандартизировали по уровням экспрессии генов в клетках, обработанных изотипическим контролем.

Статистика

Двусторонние парные Т-тесты выполняли как для данных фагоцитоза, так и для данных пролиферации Т-клеток; прямые столбцы указывают на средние значения. На гистограммах, изображающих случаи, когда было проведено по меньшей мере 3 эксперимента, планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение, однофкторный анализ ANOVA с тестом множественных сравнений Бонферрони выполняли для анализа данных qPCR. Статистический анализ проводили с помощью программного обеспечения GraphPadPrism (версия 5 или 6).

Результаты

Создание панели специфических mAb LILRB3

Для изучения экспрессии белка и функции человеческого LILRB3, антитела анти-LILRB3 идентифицировали с применением библиотеки фагового дисплея человека. Селекцию проводили с применением целевого белка LILRB3 (в растворе, нанесенном на поверхность пластика или экс-прессированного на клетках) и путем селекции по отношению к гомологичным нецелевым белкам LILRB1 и LILRB2. После трех циклов пэннинга и обогащения фагов, успешный отбор клонов, специфичных для LILRB3, подтверждали с помощью проточной цитометрии и ELISA (данные не показаны). Впоследствии scFv клоны, связанные с фагом, специфическим для мишени, конвертировали в растворимый scFv и подвергали скринингу с помощью FMAT и ELISA. На график наносили интенсивность флуоресценции для каждого клона и отображали специфичность белка-мишени по сравнению с нецелевым белком (Фиг. 1А). Успешные клоны отбирали на основе связывания LILRB3 и отсутствия перекрестной реактивности с LILRB1 и LILRB2. Затем выбранные клоны секвенировали и тестировали на связывание с первичными клетками и трансфектантами (Фиг. 1В). После того, как клоны, специфические для мишени, были выбраны и преобразованы в IgG, специфичность повторно подтверждали путем скрининга по отношению к панели репортерных клеточных линий 2В4, экспрессирующих LILR (Фиг. 1С). Всего для дальнейшего изучения было идентифицировано 16 LILRB3-специфических антител. Окрашивание РВМС или цельной крови этими mAb LILRB3 продемонстрировало преимущественное окрашивание моноцитов (Фиг. 1D) и нейтрофилов (Фиг. 1Е), что согласуется с предыдущими сообщениями (39). LILRB3-специфические клоны были дополнительно протестированы, и было подтверждено отсутствие перекрестной реактивности с мышиным ортологом PIR-В (данные не показаны).

mAb LILRB3 связываются с высокой аффинностью и картируются с различными эпитопами

Затем LILRB3-специфические mAb тестировали на их свойства связывания. Анализ SPR показал, что все клоны LILRB3 связывались с рекомбинантным белком LILRB3-hFc дозозависимым образом (Фиг. 2А) и демонстрировали ряд аффинностей, представленных А16 (8,16×10^-10). Интересно, что все mAb имели одинаковую скорость ассоциации (~105), но различались по скорости их диссоциации на три порядка (~10^-3 - 10^-6).

Затем проводили исследования по картированию эпитопов. Некоторые mAb были способны блокировать связывание коммерческих mAb LILRB3 (например, А35), предполагая наличие общего или близкородственного эпитопа; в то время как другие этого осуществлять не могли (например, А1), что указывает на связывание в другом месте (Фиг. 2В). Специфичность связывания была дополнительно подтверждена серией мутантов домена LILRB3 (Фиг. 2D), демонстрирующих либо все четыре внеклеточных домена (WT), либо три, либо два, либо один домен, временно трансфициро-ванный в клетки HEK293F. Связывание с этими клетками продемонстрировало две группы mAb: те, которые связывались с клетками, экспрессирующими WT, D3 и D2; и те, которые связывали только клетки, трансфицированные WT (Фиг. 2В), что указывает на связывание в пределах D4 (на примере А1) соответственно (Фиг. 2С). Эти данные демонстрируют, что против LILRB3 вырабатывались высокоспецифичные, полностью человеческие mAb IgG1. Картирование эпитопов продемонстрировало, что, хотя консервативные остатки, по-видимому, присутствуют во всех 4 доменах, mAb LILRB3 связываются с любым из двух различных внеклеточных доминирующих эпитопов, расположенных в пределах D2 и D4, соответственно.

Кроме того, репортерные клетки, трансфициро ванные внеклеточным доменом LILRB3, слитым с цитоплазматическим доменом CD3ζ человека, применяли для исследования способности полученных mAb связывать рецептор. Передача сигналов через эти гибридные клетки приводит к экспрессии GFP под промотором NFAT (40). Авторам удалось идентифицировать две отдельные группы mAb LILRB3: те, которые способны индуцировать передачу сигналов (например, А1), и те, которые являются инертными (например, А28) при связывании с рецептором (Фиг. 2D).

Лигирование LILRB3 модулирует активацию и пролиферацию Т-клеток

Затем авторы поставили цель исследовать влияние этих mAb на клеточные эффекторные функции. Ранее было продемонстрировано, что LILRB1 ингибирует ответы Т-клеток; либо вызывая дефосфорилирование в сигнальном каскаде CD3, либо конкурируя с CD8 за связывание HLA-I (41, 42). Также было продемонстрировано, что LILRB косвенно ингибируют ответы Т-клеток, делая антиген-презентирующие клетки (АРС), такие как моноциты и DC, толерогенными, посредством индукции CD8+ Т-супрессорных клеток (10, 12, 43). Чтобы исследовать иммуномодулирующий потенциал LILRB3 и его способность регулировать адаптивные иммунные ответы, авторы протестировали mAb LILRB3 в анализах РВМС, измеряя пролиферацию Т-клеток в ответ на стимуляцию анти-CD3/CD28. Активация и пролиферация Т-клеток успешно стимулировались антителами к CD3 и CD28, что продемонстрировано кластеризацией клеток и разбавлением CFSE (Фиг. 3А).

Известно, что рецепторы Fcγ (FcγR) опосредуют эффекты IgG человека (29, 44-46), поэтому для изучения прямых F(ab):рецептор-опосредованных эффектов mAb LILRB3 на пролиферацию Т-клеток их сначала дегликозилировали для устранения эффектов, опосредованных взаимодействиями FcγR-IgG (47). SDS-PAGE подтвердил снижение молекулярной массы дегликозилированных mAb (Degly) по сравнению с контролями дикого типа (WT), что свидетельствует об успешном дегликозилировании (Фиг. 3В). Затем mAb вводили в описанный выше анализ пролиферации Т-клеток. Успешную пролиферацию Т-клеток, управляемую антителами к CD3 и CD28, оценивали у 20 различных доноров, демонстрируя значительное увеличение пролиферации CD8+ Т-клеток по сравнению с контролем (р<0,0001) (Фиг. 3С). Большинство mAb LILRB3 значительно ингибировали пролиферацию CD8+ Т-клеток, представленных клоном А1, по сравнению с изотипическим контролем IgG1 человека (р=0,0001; Фиг. 3С). А28 также проявлял тенденцию к ингибированию пролиферации, но А16, по-видимому, не обладал ингибирующим эффектом. Эти данные демонстрируют, что нацеливание на LILRB3 может модулировать ответы Т-клеток в любом направлении четко специфичным для mAb образом, с некоторыми LILR3B-агонистическими свойствами (усиленное ингибирование), например, А1. Когда анализ повторяли таким же образом с выделенными Т-клетками, ингибирования не наблюдалось, что подтверждает то, что АРС внутри РВМС, скорее всего, моноциты, были ответственны за наблюдаемые эффекты (данные не показаны). Этот результат был ожидаемым, учитывая отсутствие экспрессии LILR3B на Т-клетках.

mAb LILRB3 модулируют эффекторную функцию макрофагов

Приведенные выше результаты показали, что mAb LILRB3 были способны агонизировать или антагонизировать LILRB3, чтобы регулировать пролиферацию Т-клеток, вероятно, посредством регуляции функции АРС. Следовательно, поскольку макрофаги также экспрессируют высокие уровни LILRB и, как известно, регулируются ими, (13) изучали влияние лигирования LILRB3 на фагоцитоз макрофагов. Окрашивание репрезентативным mAb LILRB3 подтвердило высокие уровни экспрессии LILRB3 на MDM человека (Фиг. 4А). Для оценки какой-либо модуляции их эффекторной функции CFSE-меченые первичные В-клетки CLL опсонизировали mAb анти-CD20 (ритуксимаб) и применяли в качестве мишеней для макрофагов в анализе фагоцитоза (Фиг. 4ВС). Дегликозилированные клоны анти-LILRB3 значительно снижали степень фагоцитоза (р<0,05 во всех случаях) (Фиг. 4С). Эти результаты были дополнительно подтверждены конфокальной микроскопией, демонстрирующей меньшее количество клеток-мишеней CFSE+ в макрофагах, обработанных LILRB3, по сравнению с изотипическим контролем (Фиг. 4D). Эти данные демонстрируют, что большинство mAb LILRB3 доставляло ингибирующие сигналы для снижения эффекторной функции макрофагов. Важно отметить, что mAb LILRB3 были дегликозилированными, способными опосредовать только Fab-зависимые эффекты без осложнений, возникающих в результате взаимодействий Fc:FcγR (48).

Лигирование LILRB3 вызывает иммунную толерантность у гуманизированных мышей

Учитывая эти данные, демонстрирующие, что как адаптивная (Т-клетки), так и врожденная (миелоидная) активность могут быть подавлены после лигирования LILRB3, авторы затем проверили возможные эффекты модуляции LILRB3 в модели аллогенного приживления с использованием гуманизированных мышиных моделей (восстановленных первичными человеческими HSC). Характеризация гуманизированных мышиных моделей продемонстрировала, что LILRB3 экспрес-сируется на миелоидных клетках аналогично периферической крови человека (Фиг. 5А). Клетки аллогенной лимфомы человека легко отторгаются у гуманизированных мышей из-за несоответствия HLA (данные не показаны; 49). Чтобы проверить потенциал лигирования LILRB3 для подавления аллогенного иммунного ответа, авторы предварительно обработали воссозданные гуманизированные модели взрослых мышей агонистическим mAb LILRB3 (Al) и оценили приживление аллогенных человеческих клеток В-клеточной лимфомы с «двойным попаданием», (31, 50) полученных от неродственных доноров. Обработка mAb LILRB3 была способна индуцировать состояние толерантности у мышей и приводила к успешному приживлению клеток лимфомы человека (Фиг. 5В). Мышей с опухолями, получавших LILRB3, необходимо было гуманно выбраковывать из-за высокой опухолевой нагрузки, тогда как мыши, получавшие изотипический контроль, легко отторгали клетки лимфомы без каких-либо осложнений. Эти наблюдения дополнительно подтверждают результаты функциональных анализов in vitro, полученные авторами, и идентифицируют LILRB3 как ключевой регулятор миелоидных клеток во время иммунного ответа.

Лигирование LILRB3 приводит к транскрипционным модификациям и М2-ассиметрии человеческих АРС

Чтобы исследовать пути и факторы, участвующие в LILRB3-опосредованной иммуносу-прессии, авторы проанализировали транскриптомные изменения в первичных АРС после вовлечения LILRB3. Кратковременная (~18 часов) обработка in vitro выделенных периферических CD14+ моноцитов человека агонистическим mAb LILRB3 (A1) вызывала резкое изменение их фенотипа (Фиг. 6А), при этом клетки демонстрировали вытянутую морфологию, напоминающую «М2», иммуносупрессивные макрофаги, обработанные IL4/IL-13 (51). Анализ PHКseq показал, что лигирование LILRB3 на моноцитах индуцирует сигнатуру, напоминающую «М2»-ассиметричные иммуно-супрессивные макрофаги (Фиг. 6В). Аналогичным образом экспрессия генов, ассоциированных с «М1»-асимметричными иммуностимулирующими макрофагами, была снижена в моноцитах, обработанных mAb LILRB3, по сравнению с моноцитами, обработанными изотипическим контролем (Фиг. 6ВС). Авторы подтвердили эти данные, выполнив qPCR еще у 3 доноров для выбранного количества дифференциально регулируемых генов (Фиг. 6D). Обработка моноцитов менее/неаго-нистическим mAb LILRB3 (А28) не влияла на фенотип моноцитов и экспрессию генов (данные не показаны и Фиг. 6С). Анализ обогащения набора генов (GSEA) продемонстрировал положительную корреляцию с сигнатурами генов, о которых сообщалось для супрессивных макрофагов, например, окислительного фосфорилирования(52). Напротив, сигнатуры LILRB3-лигированных генов моноцитов отрицательно коррелировали с сигнатурами генов, о которых сообщалось для воспалительных макрофагов, например, чувствительных к IFN-γ и IFN-α элементов, а также отторжения аллотрансплантата (Фиг. 6Е). В совокупности эти данные подтверждают, что активация LILRB3 приводит к значительным фенотипическим и транскрипционным изменениям в АРС, таких как моноциты, что приводит к сильному ингибированию нижерасположенных иммунных ответов (Фиг. 6F).

Обсуждение

Ранее авторы продемонстрировали, что лигирование LILRB1 на моноцитах человека индуцирует толерогенный фенотип, впоследствии препятствуя ответам Т-клеток (12, 53). В этом исследовании авторы исследовали другого представителя семейства LILR, LILRB3, функция которого еще не определена из-за отсутствия подходящих реагентов и экспериментальных систем. Поэтому авторы создали и охарактеризовали обширную панель полностью человеческих mAb со специфичностью в отношении LILRB3. Окрашивание различных популяций лейкоцитов специфическими mAb подтвердило, что LILRB3 в основном ограничен миелоидными клетками человека (3). Это было подтверждено у нескольких независимых доноров, с предположением, что, хотя эти рецепторы являются полиморфными (LILRB3 имеет по меньшей мере десять вариантов (3, 54)), антитела распознают многие, если не все варианты, что важно для разработки этих реагентов для терапевтического применения. Последующий анализ показал, что mAb LILRB3 демонстрировали ряд аффинностей, все из которых находились в наномолярном (нМ) диапазоне с аналогичными скоростями ассоциации, но скорости диссоциации различались более чем на три порядка. Составы со значением KD, находящиеся в низком диапазоне нМ, обычно считаются приемлемыми кандидатами в лекарственные средства; ритуксимаб, например, имеет аффинность к своей мишени CD20, составляющую 8 нМ (55). Это предполагает, что сгенерированные в настоящем изобретении mAb LILRB3 имеют потенциал в качестве терапевтических агентов. Некоторые из отобранных клонов LILRB3 продемонстрировали неожиданную перекрестную реактивность с другими LILR-трансфектантами человека и были исключены из последующего анализа. Однако следует отметить, что, поскольку LILR3B имеет > 95% гомологии последовательности в своем внеклеточном домене с LILRA6, mAb LILRB3 могут хорошо взаимодействовать с LILRA6 при совместной экспрессии (56). Кроме того, эксперименты по картированию эпитопов продемонстрировали, что специфические mAb LILRB3 генерировались против двух различных эпитопов, поскольку они связывались либо с Ig-подобным внеклеточным доменом два, либо четыре. Ни одно из сгенерированных mAb LILRB3 не связывалось с доменами один или три, что позволяет предположить, что эти домены могут не содержать консервативных уникальных эпитопов.

Способность mAb LILRB3 влиять на ответы Т-клеток наблюдалась посредством либо ингибирования, либо усиления пролиферации, что указывает на агонистические или антагонистические свойства соответственно. Подобно LILRB1, (12, 13, 57) это, вероятно, связано с влиянием на АРС, поскольку они являются единственными клетками, экспрессирующими LILRB3 в культуре. В отличие от LILRB 1, (42, 53, 583, 59) LILRB3 не экспрессируется на Т-клетках и может только косвенно влиять на ответы Т-клеток. Основываясь на профиле экспрессии LILRB3 и частоте клеток в культуре РВМС, моноциты представляют наиболее вероятный тип клеток, подверженный влиянию. В подтверждение этого агонистическое mAb LILRB3 не подавляло пролиферацию Т-клеток в отсутствие моноцитов. Связывающие эпитопы влияют на способность mAb модулировать функцию рецептора во многих системах, (29, 60) поэтому неудивительно, что mAb LILRB3 способны выполнять противоположные функции. Большинство mAb LILRB3, которые связывались со вторым Ig-подобным доменом LILRB3, были способны ингибировать пролиферацию Т-клеток. И наоборот, некоторые клоны, которые связывались с четвертым доменом, усиливали пролиферацию. Тем не менее, D4-связывающее mAb (A1) было одним из самых сильных ингибиторов пролиферации, а другое D4-связывающее антитело (А28) вызывало меньший ингибирующий эффект. Следовательно, домен-специфические эпитопы, по-видимому, не коррелируют напрямую с функциями эффекторных клеток, опосредованными mAb LILRB3.

Хотя mAb LILRB3 демонстрировали вариации в их способности ингибировать или усиливать пролиферацию Т-клеток, большинство клонов ингибировали фагоцитоз макрофагами или не оказывали никакого эффекта. Это предполагает, что большинство mAb являются агонистами в этом контексте, стимулируя ингибирующую передачу сигналов и подавляя эффекторную функцию, подобно ингибированию ответов Т-клеток.

Наблюдения авторов, демонстрирующие иммуноингибирующую активность, проявляющуюся после LILR3B, были дополнительно подтверждены на воссозданной гуманизированной мышиной модели. В этой системе, где LILRB3 присутствует только на моноцитарных клетках, лигирование LILRB3 с агонистическим mAb LILRB3 перед приживлением клеток аллогенной лимфомы (31) индуцировало толерантность in vivo и способствовало последующему росту опухоли. Это демонстрирует способность LILRB3 оказывать сильное иммуносупрессивное действие, которое можно использовать в терапевтических условиях, таких как аутоиммунное состояние и трансплантация, когда будет полезна индукция иммунной толерантности. Хотя LILRB3 считается орфанным рецептором, было высказано предположение, что LILRB3 связывается с белками, ассоциированными с цитокератином (CK) (воздействующими на некротизированные раковые клетки), ангиопоэтинопо-добным белком 5 и бактериями, такими как Staphylococcus aureus (S. aureus)(40, 61, 62). Таким образом, функциональные данные, полученные авторами, свидетельствуют о том, что определенные патогены (61) могут быть в состоянии подорвать иммунные ответы путем активного лигирования LILRB3 во время активного ответа.

Чтобы исследовать пути и факторы, участвующие в LILRB3-опосредованной иммуносупрессии, авторы исследовали транскриптомные изменения в выделенных периферических миелоидных клетках после активации LILRB3. Более ста генов по-разному регулировались в первичных моноцитах человека после лигирования LILRB3, некоторые из которых, как известно, модулируются в макрофагах М2 и ТАМ. Амфирегулин был среди генов, экспрессия которых была значительно увеличена в LILRB3-лигированных моноцитах. Амфирегулин представляет собой эпидермальный фактор роста, подобный фактору роста, ответственный за индукцию толерантности и иммуносупрессию посредством различных механизмов, включая усиление активности Treg (63). Кроме того, амфирегулин сверхэкспрессирован в опухолеассоциированных DC (64) и супрессивных/М2 макрофагах (65), и было высказано предположение, что он играет решающую роль в имму-носупрессии и прогрессировании рака (66). Такие факторы, индуцируемые LILRB3, могут быть ответственны за супрессию, наблюдаемую в результатах анализов Т-клеток, полученных авторами. Текущие усилия авторов направлены на то, чтобы проверить это и полностью понять механизмы, ответственные за LILRB3-опосредованную супрессию миелоидных клеток. В недавнем исследовании, посвященном механизму действия глатирамера ацетата (копаксона), препарата на основе пептидов, применяемого для лечения пациентов с рецидивирующе-ремиттирующей формой рассеянного склероза, который ослабляет аутоиммунные проявления, LILRB2 и LILRB3 были идентифицированы в качестве потенциальных лигандов (67). Нацеливание человеческого LILRB2 с помощью антагонистических mAb на миелоидные клетки человека способно стимулировать их провоспали-тельную активность и усиливать противоопухолевый ответ in vivo (13). Кроме того, недавние данные, полученные Zhang и его коллегами, предполагают, что передача сигналов LILRB4 в лейкозных клетках опосредует Т-клеточное подавление поддержки диссиминации опухолевых клеток в дистальные органы (68). Эти данные дополнительно подтверждают выводы авторов, демонстрируя, что активация человеческого LILRB вызывает иммуносупрессию посредством перепрограммирования миелоидных клеток (т.е. снижение М1-подобного созревания и усиление MDSC-супрессивной функции).

Взятые вместе, данные, представленные в данном документе, демонстрируют, что активация LILRB3 на первичных миелоидных клетках человека оказывает сильное иммуноингибирующее действие и что LILRB3-специфические моноклональные антитела являются потенциально мощными иммуномодулирующими агентами с возможностью широкого применения, начиная от трансплантации и заканчивая аутоиммунными состояниями, воспалительными нарушениями и т.д.

Список литературы

1. K.J. Anderson, R.L. Allen, Regulation of T-cell immunity by leucocyte immunoglobulin-like receptors: innate immune receptors for self on antigen-presenting cells. Immunology 127, 8-17 (2009).

2. W. van der Touw, H.M. Chen, P.Y. Pan, S.H. Chen, LILRB receptor-mediated regulation of myeloid cell maturation and function. Cancer Immunol Immunother 66, 1079-1087 (2017).

3. M. Colonna et al., A common inhibitory receptor for major histocompatibility complex class I molecules on human lymphoid and myelomonocytic cells. JExpMed 186, 1809-1818 (1997).

4. L. Borges, M.L. Hsu, N. Fanger, M. Kubin, D. Cosman, A family of human lymphoid and myeloid Ig-like receptors, some of which bind to MHC class I molecules. J Immunol 159, 5192-5196(1997).

5. H. Nakajima, J. Samaridis, L. Angman, M. Colonna, Human myeloid cells express an activating ILT receptor (ILT1) that associates with Fc receptor gamma-chain. J Immunol 162, 5-8 (1999).

6. С.C. Chang et al., Polymorphism and linkage disequilibrium of immunoglobulin-like transcript 3 gene. Hum Immunol 69, 284-290 (2008).

7. F.W. Velten, K. Duperrier, J. Bohlender, P. Metharom, S. Goerdt, A gene signature of inhibitory MHC receptors identifies a BDCA3(+) subset of IL-10-induced dendritic cells with reduced allostimulatory capacity in vitro. Eur J Immunol 34, 2800-2811 (2004).

8. С.C. Chang et al., Tolerization of dendritic cells by T(S) cells: the crucial role of inhibitory receptors ILT3 and ILT4. Nat Immunol 3, 237-243 (2002).

9. M. Beyer et al., High-resolution transcriptome of human macrophages. PLoS One 7, e45466 (2012).

10. J.S. Manavalan et al, High expression of ILT3 and ILT4 is a general feature of tolerogenic dendritic cells. TransplImmunol 11, 245-258 (2003).

11. N.A. Fanger et al, The MHC class I binding proteins LIR-1 and LIR-2 inhibit Fc receptor-mediated signaling in monocytes. Eur J Immunol 2S, 3423-3434 (1998).

12. N.T. Young et al., The inhibitory receptor LILRB 1 modulates the differentiation and regulatory potential of human dendritic cells. Blood 111, 3090-3096 (2008).

13. A.A. Barkal et al., Engagement of MHC class I by the inhibitory receptor LILRB 1 suppresses macrophages and is a target of cancer immunotherapy. Nat Immunol 19, 76-84 (2018).

14. M.K. Rochat et al., Maternal vitamin D intake during pregnancy increases gene expression of ILT3 and ILT4 in cord blood. Clin Exp Allergy 40, 786-794 (2010).

15. M. Brenk et al, Tryptophan deprivation induces inhibitory receptors ILT3 and ILT4 on dendritic cells favoring the induction of human CD4+CD25+Foxp3+ T regulatory cells. J Immunol 183, 145-154 (2009).

16. M.G. Petroff, P. Sedlmayr, D. Azzola, J.S. Hunt, Decidual macrophages are potentially susceptible to inhibition by class la and class Ib HLA molecules. JReprodImmunol 56, 3-17 (2002).

17. R. Apps, L. Gardner, A.M. Sharkey, N. Holmes, A. Moffett, Ahomodimeric complex of HLA-G on normal trophoblast cells modulates antigen-presenting cells via LILRB1. Eur J Immunol 37, 1924-1937(2007).

18. L. Lombardelli et al, HLA-G5 induces IL-4 secretion critical for successful pregnancy through differential expression of ILT2 receptor on decidual CD4(+) T cells and macrophages. J Immunol 191, 3651-3662 (2013).

19. B. Favier, J. Lemaoult, E. Lesport, E.D. Carosella, ILT2/HLA-G interaction impairs NK-cell functions through the inhibition of the late but not the early events of the NK-cell activating synapse. FASEB J 24, 689-699 (2010).

20. S. Endo, Y. Sakamoto, E. Kobayashi, A. Nakamura, T. Takai, Regulation of cytotoxic T lymphocyte triggering by PIR-B on dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, 14515-14520 (2008).

21. S. Pereira, H. Zhang, T. Takai, C. A. Lowell, The inhibitory receptor PIR-B negatively regulates neutrophil and macrophage integrin signaling. J Immunol 173, 5757-5765 (2004).

22. N.S. Wilson et al., An Fcgamma receptor-dependent mechanism drives antibody-mediated target-receptor signaling in cancer cells. Cancer Cell 19, 101-113 (2011).

23. W. Zhang, S. Liang, J. Wu, A. Horuzsko, Human Inhibitory Receptor ILT2 Amplifies CD11b(+)Gr1(+) Myeloid-Derived Suppressor Cells that Promote Long-Term Survival of Allografts. Transplantation 86, 1125-1134(2008).

24. J. Wu et al., Isoforms of human leukocyte antigen-G and their inhibitory receptors in human kidney allograft acceptance!. Human Immunology 70, 988-994 (2009).

25. A. Roghanian et al, Cyclophosphamide Enhances Cancer Antibody Immunotherapy in the Resistant Bone Marrow Niche by Modulating Macrophage FcgammaR Expression. Cancer Immunol Res 7, 1876-1890 (2019).

26. E. Soderlind et al., Recombining germline-derived CDR sequences for creating diverse single-framework antibody libraries. Nature biotechnology 18, 852-856 (2000).

27. A. Roghanian et al., Antagonistic human FcgammaRIIB (CD32B) antibodies have antitumor activity and overcome resistance to antibody therapy in vivo. Cancer Cell 27, 473-488 (2015).

28. N. Olsson et al, Proteomic Analysis and Discovery Using Affinity Proteomics and Mass Spectrometry. Mol Cell Proteomics 10, (2011).

29. L.N. Dahal, A. Roghanian, S.A. Beers, M.S. Cragg, FcgammaR requirements leading to successful immunotherapy. Immunological reviews 268, 104-122 (2015).

30. A. Roghanian et al, Filament-associated TSGA10 protein is expressed in professional antigen presenting cells and interacts with vimentin. Cell Immunol 265, 120-126 (2010).

31. I. Leskov et al, Rapid generation of human B-cell lymphomas via combined expression of Мус and Bcl2 and their use as a preclinical model for biological therapies. Oncogene 32, 1066-1072 (2013).

32. B. Langmead, C. Trapnell, M. Pop, S.L. Salzberg, Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol 10, R25 (2009).

33. B. Li, C.N. Dewey, RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics 12, 323 (2011).

34. M.D. Robinson, D.J. McCarthy, G.K. Smyth, edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics 26, 139-140 (2010).

35. D.W. Huang et al., DAVID Bioinformatics Resources: expanded annotation database and novel algorithms to better extract biology from large gene lists. Nucleic Acids Res 35, W169-175 (2007).

36. A. Subramanian et al, Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci USA 102, 15545-15550 (2005).

37. F.O. Martinez, S. Gordon, M. Locati, A. Mantovani, Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: new molecules and patterns of gene expression. J Immunol 177, 7303-7311 (2006).

38. A.I. Saeed et al., TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis. Biotechniques 34, 374-378 (2003).

39. N. Tedla et al, Activation of human eosinophils through leukocyte immunoglobulin-like receptor 7. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 1174-1179(2003).

40. D.C. Jones et al, Allele-specific recognition by LILRB3 and LILRA6 of a cytokeratin 8-associated ligand on necrotic glandular epithelial cells. Oncotarget7, 15618-15631 (2016).

41. D. Saverino et al, The CD85/LIR-1/ILT2 inhibitory receptor is expressed by all human T lymphocytes and down-regulates their functions. J Immunol 165, 3742-3755 (2000).

42. M. Shiroishi et al, Human inhibitory receptors Ig-like transcript 2 (ILT2) and ILT4 compete with CD8 for MHC class I binding and bind preferentially to HLA-G. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 8856-8861 (2003).

43. С.C. Chang et al, BCL6 Is Required for Differentiation of Ig-Like Transcript 3-Fc-Induced CD8(+) T Suppressor Cells. JImmunol 185, 5714-5722 (2010).

44. R.A. Clynes, T.L. Towers, L.G. Presta, J.V. Ravetch, Inhibitory Fc receptors modulate in vivo cytotoxicity against tumor targets. Nature medicine 6, 443-446 (2000).

45. C.S. Lee et al, Expression of the inhibitory Fc gamma receptor IIB (FCGR2B, CD32B) on follicular lymphoma cells lowers the response rate to rituximab monotherapy (SAKK 35/98). British journal of haematology 168, 145-148 (2015).

46. С.Е. Hargreaves et al., Fcgamma receptors: genetic variation, function, and disease. Immunological reviews 268, 6-24 (2015).

47. Y. Kaneko, F. Ninunerjahn, E.V. Ravetch, Anti-inflammatory activity of immunoglobulin G resulting from Fc sialylation. Science 313, 670-673 (2006).

48. P.M. Hogarth, G.A. Pietersz, Fc receptor-targeted therapies for the treatment of inflammation, cancer and beyond. Nat Rev Drug Discov 11, 311-331 (2012).

49. A. Roghanian et al., Cyclophosphamide Enhances Cancer Antibody Immunotherapy in the Resistant Bone Marrow Niche by Modulating Macrophage FcgammaR Expression. Cancer Immunol Res, (2019).

50. C.P. Pallasch et al., Sensitizing protective tumor microenvironments to antibody-mediated therapy. Cell 156, 590-602 (2014).

51. F.Y. McWhorter, T. Wang, P. Nguyen, T. Chung, W.F. Liu, Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110, 17253-17258 (2013).

52. S. Galvan-Pena, L.A. O'Neill, Metabolic reprograming in macrophage polarization. Front Immunol 5, 420 (2014).

53. R.C. Khanolkar et al., Leukocyte Ig-Like receptor В1 restrains dendritic cell function through increased expression of the NF-kappaB regulator ABIN1/TNIP1. J Leukoc Biol, (2016).

54. A.A. Bashirova et al., Diversity of the human LILRB3/A6 locus encoding a myeloid inhibitory and activating receptor pair. Immunogenetics 66, 1-8 (2014).

55. M.D. Pescovitz, Rituximab, an anti-cd20 monoclonal antibody: history and mechanism of action. Am J Transplant 6, 859-866 (2006).

56. M.R. Lopez-Alvarez, D.C. Jones, W. Jiang, J.A. Traherne, J. Trowsdale, Copy number and nucleotide variation of the LILR family of myelomonocytic cell activating and inhibitory receptors. Immunogenetics 66, 73-83 (2014).

57. C.S. Wagner et al., Human cytomegalovirus-derived protein UL18 alters the phenotype and function of monocyte-derived dendritic cells. J Leukoc Biol 83, 56-63 (2008).

58. J. Dietrich, M. Cella, M. Colonna, Ig-like transcript 2 (ILT2)/leukocyte Ig-like receptor 1 (LIR1) inhibits TCR signaling and actin cytoskeleton reorganization. J Immunol 166, 2514-2521 (2001).

59. F. Ketroussi et al., Lymphocyte Cell-Cycle Inhibition by HLA-G Is Mediated by Phosphatase SHP-2 and Acts on the mTOR Pathway. Plos One 6, (2011).

60. X. Yu et al., Complex Interplay between Epitope Specificity and Isotype Dictates the Biological Activity of Anti-human CD40 Antibodies. Cancer Cell 33, 664-675 e664 (2018).

61. M. Nakayama et al, Paired Ig-like receptors bind to bacteria and shape TLR-mediated cytokine production. JImmunol 178, 4250-4259 (2007).

62. J. Zheng et al., Inhibitory receptors bind ANGPTLs and support blood stem cells and leukaemia development. Nature 485, 656-660 (2012).

63. D. M. W. Zaiss, W.C. Gause, L.C. Osborne, D. Artis, Emerging functions of amphiregulin in orchestrating immunity, inflammation, and tissue repair. Immunity 42, 216-226 (2015).

64. Y.L. Hsu et al., Lung tumor-associated dendritic cell-derived amphiregulin increased cancer progression. J Immunol 187, 1733-1744 (2011).

65. P. Vlaicu et al., Monocytes/macrophages support mammary tumor invasivity by co-secreting lineage-specific EGFR ligands and a STAT3 activator. BMC Cancer 13, 197 (2013).

66. B. Busser, L. Sancey, E. Brambilla, J.L. Coll, A. Hurbin, The multiple roles of amphiregulin in human cancer. Biochim Biophys Acta 1816, 119-131 (2011).

67. W. van der Touw et al., Glatiramer Acetate Enhances Myeloid-Derived Suppressor Cell Function via Recognition of Paired Ig-like Receptor B. JImmunol 201, 1727-1734 (2018).

68. M. Deng et al., LILRB4 signalling in leukaemia cells mediates T cell suppression and tumour infiltration. Nature 562, 605-609 (2018).

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> BioInvent International AB

University of Southampton

<120> Молекулы антитела к LILRB3 и их применение

<130> BIOBX/P76238PC

<150> EP20156969.6

<151> 2020-02-12

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

1 5 10

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

1 5 10 15

Lys Gly Arg

<210> 3

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Ala Arg Arg Lys Lys Arg Glu Arg Gly Phe Ser Gly Asn Asp Pro Val

1 5 10 15

Gly Ala Ile Asp Val

20

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His

1 5 10 15

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Gly Asn Thr Asn Arg Pro Ser

1 5

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Cys Ser Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Val Val

1 5 10

<210> 7

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Lys Lys Arg Glu Arg Gly Phe Ser Gly Asn Asp Pro Val

100 105 110

Gly Ala Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 8

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ala Trp Asp Asp Ser

85 90 95

Leu Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

Phe Ser Ser Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

1 5 10

<210> 10

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

Ser Arg Ile Asn Thr His Gly Thr Asn Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

1 5 10 15

Lys Gly Arg

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Val Gly Val Ala Gly Thr Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His

1 5 10 15

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser

1 5

<210> 14

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

Cys Gln Ser Tyr Asp Thr Ser Leu Ser Gly Ser Val

1 5 10

<210> 15

<211> 118

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Asn Thr His Gly Thr Asn Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Gly Val Ala Gly Thr Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr Ser

85 90 95

Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 17

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

1 5 10

<210> 18

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

1 5 10 15

Lys Gly Arg

<210> 19

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

Ala Arg Gly Leu Ala Thr Tyr Gly Leu Asp Val

1 5 10

<210> 20

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Arg His His Val Tyr

1 5 10

<210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

Ser Asn Ser Leu Arg Pro Ser

1 5

<210> 22

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Trp Val

1 5 10

<210> 23

<211> 118

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Leu Ala Thr Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 24

<211> 111

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Arg His

20 25 30

His Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Asn Ser Leu Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 25

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

1 5 10

<210> 26

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Thr Glu Asn Tyr Tyr Val Asp Ser Val

1 5 10 15

Glu Gly Arg

<210> 27

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

Ala Arg Asp Gly Asp Trp Gly Trp Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 28

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His

1 5 10 15

<210> 29

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 29

Glu Asn Asn Lys Arg Pro Ser

1 5

<210> 30

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 30

Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Trp Val

1 5 10

<210> 31

<211> 119

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 31

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Thr Glu Asn Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Asp Trp Gly Trp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 32

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Glu Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Val Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser

85 90 95

Leu Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 33

<211> 330

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 33

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 34

<211> 105

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 34

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

20 25 30

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

35 40 45

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

50 55 60

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

65 70 75 80

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

85 90 95

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<---

Claims

1. Применение молекулы антитела, которая специфически связывается с LILRB3 (ILT5), для лечения отторжения трансплантата, аутоиммунного нарушения и/или воспалительного нарушения, где указанная молекула антитела представляет собой молекулу агонистического антитела,

при этом указанная молекула антитела содержит CDR: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3,

при этом аминокислотная последовательность VH-CDR1 представлена SEQ ID NO: 1, аминокислотная последовательность VH-CDR2 представлена SEQ ID NO: 2, аминокислотная последовательность VH-CDR3 представлена SEQ ID NO: 3, аминокислотная последовательность VL-CDR1 представлена SEQ ID NO: 4, аминокислотная последовательность VL-CDR2 представлена SEQ ID NO: 5, и аминокислотная последовательность VL-CDR3 представлена SEQ ID NO: 6.

2. Молекула антитела, которая специфически связывается с LILRB3 (ILT5), при этом указанная молекула антитела содержит CDR: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3,

3. Молекула антитела по п. 2, отличающаяся тем, что указанная молекула антитела содержит:

аминокислотную последовательность вариабельной тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO: 7 и аминокислотную последовательность вариабельной легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 8.

4. Молекула антитела по любому из пп. 2 или 3, отличающаяся тем, что указанная молекула антитела представляет собой молекулу агонистического антитела.

5. Применение молекулы антитела по п. 1 или молекула антитела по любому из пп. 2-4, отличающееся(аяся) тем, что указанная молекула антитела выбрана из группы, состоящей из молекулы антитела человеческого IgG дикого типа или Fc-сконструированной молекулы человеческого IgG, молекулы гуманизированного антитела IgG и молекулы антитела IgG человеческого происхождения.

6. Применение молекулы антитела по п. 5 или молекула антитела по п. 5, отличающееся(аяся) тем, что указанная молекула антитела представляет собой антитело IgG1, IgG2 или IgG4 человека.

7. Применение молекулы антитела по п. 1 или молекула антитела по любому из пп. 2-6, отличающаяся тем, что указанная молекула антитела представляет собой моноклональное антитело.

8. Применение молекулы антитела по п. 1, отличающееся тем, что указанное антитело представляет собой антитело по любому из пп. 2-7.

9. Применение молекулы антитела по п. 1, отличающееся тем, что указанная молекула антитела представляет собой молекулу антитела, которая способна конкурировать за связывание с LILRB3 (ILT5) с молекулой антитела по любому из пп. 2-7.

10. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу антитела по любому из пп. 2-7.

11. Экспрессирующая плазмида, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 10.

12. Клетка для экспрессии молекулы антитела по любому из пп. 2-7, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 10 или плазмиду по п. 11.

13. Молекула антитела по любому из пп. 2-7, нуклеиновая кислота по п. 10, плазмида по п. 11 и/или клетка по п. 12 для применения в медицине.

14. Применение молекулы антитела по любому из пп. 2-7 для изготовления фармацевтической композиции для применения в лечении отторжения трансплантата, аутоиммунного нарушения и/или воспалительного нарушения.

15. Применение молекулы антитела, которая специфически связывается с LILRB3 (ILT5), для изготовления фармацевтической композиции для применения в лечении отторжения трансплантата, аутоиммунного нарушения и/или воспалительного нарушения, где указанная молекула антитела представляет собой молекулу агонистического антитела,

16. Фармацевтическая композиция для применения при лечении отторжения трансплантата, аутоиммунного нарушения и/или воспалительного нарушения, содержащая или состоящая из молекулы антитела по любому из пп. 2-7 и фармацевтически приемлемого разбавителя, носителя, несущей среды и/или вспомогательного вещества.

17. Способ лечения отторжения трансплантата, аутоиммунного нарушения и/или воспалительного нарушения у пациента, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества молекулы антитела, которое специфически связывается с LILRB3 (ILT5), где указанная молекула антитела представляет собой молекулу агонистического антитела,

18. Способ лечения отторжения трансплантата, аутоиммунного нарушения и/или воспалительного нарушения у пациента, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества молекулы антитела по любому из пп. 2-7.