RU2846426C2 - Способ получения человеческого Т-клеточного рецептора, специфичного для эпитопа 369-377 рецептора HER2/neu (ERBB2) - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения человеческого Т-клеточного рецептора, специфичного к эпитопу 369-377, полученному из белка рецептора HER2/neu (ERBB2). Изобретение включает выделение мононуклеарных клеток (МНК) периферической крови HLA-A02+доноров, затем культивирование МНК; на 5-й день добавляют в качестве фактора праймирования эпитоп 369-377 ERBB2 в культуру дендритных клеток с последующей их инкубацией, на 6-й день добавляют фактор созревания, затем полученные дендритные клетки собирают, промывают питательной средой, подсчитывают количество дендритных клеток, оценивают их жизнеспособность и сокультивируют с аутологичными CD8+Т-лимфоцитами, а через 7 дней сокультивирования выделяют антиген-специфические CD8+Т-клетки, затем производят идентификацию последовательности генов TCR и амплификацию вариабельной области цепей TCRα и TCRβ. Изобретение обеспечивает получение в короткий срок точной информации о человеческом Т-клеточном рецепторе, специфичном для эпитопа 369-377 рецептора HER2/neu (ERBB2). 4 ил.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммунологии, и направлено на получение конструкции, кодирующей последовательность Т-клеточного рецептора (TCR), распознающего антигенный эпитоп пептида белка HER2/neu (ERBB2), и способной индуцировать антиген-специфическое уничтожение клетки-мишени с экспрессией HER2/neu (ERBB2).

В структуре смертности населения России злокачественные новообразования занимают второе место (15,4%) после болезней системы кровообращения. Ведущими локализациями злокачественных опухолей у обоих полов являются кожа (12,3%, с меланомой -14,0%), молочная железа (11,4%), трахея, бронхи, легкое (10,5%), желудок (7,0%). При этом ведущей онкологической патологией у женского населения является рак молочной железы (20,9%), уровень смертности от которого занимает первое место (17,0%) [Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой Злокачественные новообразования в России в 2013 году (заболеваемость и смертность) М.: ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздрава России. - 2015. илл. 250 с. ISBN 978-5-85502-205-6].

Общепринятыми методами лечения рака на сегодняшний день являются хирургия, лучевая терапия и химиотерапия. Использование данных методов позволяет эффективно снижать опухолевую нагрузку за короткий период времени, но не дает возможности элиминировать все опухолевые клетки, диссеминированные в организме пациента. Минимальная опухолевая нагрузка, сохраняющаяся после удаления основной части новообразования, является причиной возникновения рецидивов опухоли и развития метастазов, что в свою очередь приводит к повышению уровня смертности и инвалидизации пациентов с онкологическими заболеваниями.

Таким образом, традиционные подходы к лечению рака обнаруживают недостатки в вопросе устранения минимальной опухолевой нагрузки, и становится очевидной необходимость появления новых технологий, направленных на улучшение процессов распознавания и уничтожения единичных опухолевых клеток, оставшихся в организме пациента после проведения лучевой терапии, химиотерапии или хирургического удаления основной массы опухоли.

Фундаментальные и клинические исследования последних лет подтверждают, что использование потенциала иммунной системы может быть весьма перспективным для устранения опухолевых клеток [Palucka K., Ueno Н., Banchereau J. Recent developments in cancer vaccines. // Jlmmunol. - 2011. - Vol. 186. - №3. - P. 1325-31; Qian X., Wang X., Jin H. Cell transfer therapy for cancer: past, present, and future. // JlmmunolRes. - 2014. doi: 10.1155/2014/525913]. Иммунотерапевтические подходы позволяют активировать клеточное звено иммунитета, нацеливая специфический иммунный ответ против опухолевых клеток, несущих на своей поверхности опухолевые антигены. В виду вышесказанного целесообразна разработка подходов, позволяющих эффективно генерировать специфический противоопухолевый иммунный ответ в организме пациента.

На сегодняшний день разработано несколько различных иммунотерапевтических подходов, направленных против опухолей молочной железы и яичников, экспрессирующих ERBB2. Иммунотерапия на основе антител против ERBB2, такая как моноклональные антитела трастузумаб, может использоваться для лечения пациентов с раком молочной железы со сверхэкспрессией ERBB2, но этот подход не оказался столь же эффективным у пациентов с раком яичников (Bookman М.А., Darcy К.М., Clarke-Pearson D., Boothby R.A., Horowitz I.R. Evaluation of monoclonal humanized anti-HER2 antibody, trastuzumab, in patients with recurrent or refractory ovarian or primary peritoneal carcinoma with overexpression of HER2: a phase II trial of the Gynecologic Oncology Group.J Clin. Oncol. 2003 Jan 15;21(2):283-90. doi: 10.1200/JCO.2003.10.104).

Другой иммунотерапевтический подход заключается в создании изолированных рецепторов Т-клеток (TCR), обладающих высокой аффинностью и специфически связывающий эпитоп ERBB2 (369-377) на клетке-мишени. Другие варианты реализации включают Т-клетку или популяцию Т-клеток, модифицированную для экспрессии ЕРВВ2-специфического TCR. Дополнительные варианты реализации включают способы использования переноса гена TCR, специфичного для ERBB2, для лечения раковых клеток, экспрессирующих ERBB2. Также включены способы и фармацевтические композиции, содержащие модифицированные Т-клетки, для адоптивной терапии (US 10414812, C07K 4/725, 2018; US 11345735, C07K 14/47, 2020).

Основную роль в развитии специфического противоопухолевого иммунного ответа играют цитотоксические Т-лимфоциты. Наличие противоопухолевых цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), как в отношении их количества, так и нормального функционирования, является необходимым условием для уничтожения опухолевых клеток иммунной системой [Aerts J., Hegmans J. Tumor-specific cytotoxic T cells are crucial for efficacy of immunomodulatory antibodies in patients with lung cancer. // Cancer Res. - 2013. - Vol. 73. - P. 2381-2388]. Иммунотерапевтические подходы, направленные на борьбу с конкретными опухоль-ассоциированными антигенами, также используют активированные антигенспецифические цитотоксические Т-лимфоциты в качестве главного противоопухолевого агента.

Известен способ получения in vitro популяций активированных антигенспецифических противоопухолевых цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных к эпитопам опухоль-ассоциированного антигена, включающий получение прилипающей и неприлипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК), выделенных из периферической крови человека, получение дендритных клеток (ДК) путем стимуляции их дифференцировки из прилипающей фракции МНК и антигенную активацию полученных зрелых ДК опухоль-ассоциированным антигеном, совместное культивирование клеток из неприлипающей фракции с аутологичными зрелыми антиген-активированными ДК из прилипающей фракции, последующее выделение фракции антигенспецифических Т-лимфоцитов с помощью окрашивания антигенспецифическими реагентами, стимуляцию роста выделенных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) с использованием рекомбинантного человеческого интерлейкина-2 (рчИЛ-2), интерлейкина-7 (рчИЛ-7) и интерлейкина-15 (рчИЛ-15), отличающийся тем, что антигенную активацию полученных зрелых ДК осуществляют с использованием ДНК-конструкции, кодирующей эпитопы KIFGSLAFL и RLLQETELV опухоль-ассоциированного белка HER2, совместному культивированию с аутологичными зрелыми антиген-активированными ДК из прилипающей фракции подвергают все клетки неприлипающей фракции МНК, далее из совместной культуры ДК и МНК выделяют цитотоксические Т-лимфоциты, специфичные к эпитопам KIFGSLAFL и RLLQETELV белка HER2 методом магнитной сепарации с использованием антигенспецифических реагентов, обеспечивающих обратимое окрашивание выделяемых клеток, а после выделения HER2-специфических ЦТЛ производят стимуляцию их пролиферации посредством культивирования в присутствии внесенных одновременно цитокинов рчИЛ-2, рчИЛ-7, рчИЛ-15 в течение 14-20 суток, причем конечная концентрация каждого из цитокинов рчИЛ-2, рчИЛ-7 и рчИЛ-15 составляет 50 нг/мл. В качестве окрашивающего антигенспецифического реагента используют стрептамеры (RU 261918, C12N 5/0783, 2017).

Недостатком способа является необходимость получения дополнительно культуры дендритных клеток, их трансфекция и их сокультивирования, а также необходимость использования антигенспецифических реагентов (стрептомеров) для выделения HER2/neu-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов, что значительно удлиняет время получения антиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов и могут негативно влиять на эффективность генерации популяций антигенспецифических цитотоксических Т-клеток с активностью против опухолевых клеток.

Наиболее близким является способ получения человеческого Т-клеточного рецептора, специфичного к эпитопу 369-377, полученному из белка рецептора HER2/neu (ERBB2), включающий выделение мононуклеарных клеток периферической крови HLA-А02+пациенток, больных раком молочной железы, из которых культивируют зрелые дендритные клетки, содержащие пептиды, полученные из ERBB2; введение полученной аутологичной дендритноклеточной вакцины HLA-А02+пациенткам с ERBB2+опухолями молочной железы; затем у этих пациенток посредством лейкофереза и элютриации выделяют моноциты и культивируют в присутствии 500 МЕ/мл рекомбинантного человеческого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и 250 МЕ/мл интерлейкина-4 (IL-4) в течение четырех дней; а на 5-й день в культуру добавляют 1000 единиц/мл IFN-γ с последующей инкубацией в течение 16-18 часов при температуре 37°С; на 6-й день добавляют липополисахарид (LPS) в концентрации Юнг/мл в течение 6 часов для завершения созревания дендритных клеток; после чего в течение 2 часов вводили HLA-связывающий пептид, специфичный для ERBB2(369-377), затем полученные дендритные клетки собирают, промывают питательной средой, подсчитывают количество дендритных клеток, оценивают их жизнеспособность и сокультивируют с аутологичными очищенными на колонке CD8+Т-клетками, полученные после вакцинации в соотношении 10:1, а на 2-й день в совместную культуру добавляют IL-2 (50 МЕ/мл) и через 7 дней сокультивирования CD8+Т-клетки выделяют с помощью тетрамер HLA-A02/ERBB2(369-377), затем оценивают эффекторные функции ERBB2-специфичных Т-клеток при сокультивировании с клетками HLA-A2+T2, предварительно загруженных пептидом ERBB2(369-377). Если CD8+Т-клетки демонстрировали высокую продукцию пептид-специфического IFN-γ при совместном культивировании с антигенпрезентирующими клетками, нагруженными соответствующим пептидом ERBB2, тогда Т-клетки анализируют для исследования последовательности генов TCR. Для идентификации последовательностей генов TCR проводят с помощью 5'-RACE-PCR (ПЦР) амплификацию вариабельной области цепей TCRα и TCRβ, включая CDR3, с РНК, выделенной из клонов Т-клеток. Затем продукты RACE-PCR секвенируют. Цепи TCRα и TCRβ соединяют пептидным линкером 2А (TCRb-P2A-TCRa), а полные конструкции клонируют в скелет вектора ретровирусной векторной плазмиды pMSGV1, производного вектора pMSGV [сплайсинг на основе вируса стволовых клеток мыши (MSCV) -gag вектор], который использует длинный концевой повтор MSCV (LTR) (Cohenet al., J.Immunol 175, 5799-5808, 2005). Для определения репертуара α-цепи вариабельной области TCR (TCRV) и репертуар β-цепи TCRV захваченных ERBB2-специфичных Т-клеток, из отсортированных клеток выделяют тотальную РНК и подвергали 5'-RACE-PCR (ПЦР). Двадцать три отдельных клона кДНК α-цепи и четырнадцать отдельных клонов кДНК β-цепи были полностью секвенированы в результате двух независимых реакций ПЦР. Данные о последовательностях продемонстрировали две относительно доминантные последовательности в репертуаре TCRVβ, которые принадлежали семейству β-цепей BV3-1(9S1). Большая гетерогенность наблюдалась в репертуаре TCRV а: по два повтора для α-цепей AV3 и AV12 (US 2022332787 A1, C07K 14/725, 2022).

Недостатком прототипа является необходимость предварительной дендритноклеточной вакцинации больных раком молочной железы, которая может длиться до 6 месяцев и полученные результаты варьируются у разных пациентов в зависимости от тяжести болезни и стадии противоопухолевой терапии; недостатком также является то, что для анализа антиген-специфические Т-клетки выделяли тетрамерами, что затрудняет получение чистой культуры эффекторных клеток; информация о антиген-специфических TCR Т-клеточных рецепторах представлена лишь в виде его составных элементов (альфа- и бета-цепи по отдельности), что не отражает строение конкретного TCR-T клеточного рецептора, так как альфа- и бета-цепи, из которых в прототипе создают Т-клеточный рецептор, могут изначально принадлежать двум разным Т-клеточным рецепторам, из-за чего возможны серьезные побочные эффекты. Кроме того, противоопухолевая активность TCR-T клеток оценивается по продукции IFN-γ, которая является косвенным показателем и отражает в целом активацию Т-клеточного звена иммунитета и она может быть не связана с антиген-специфическим противоопухолевым иммунным ответом. Данные недостатки не позволяют получить истинную информацию о строении и аффинитете человеческого Т-клеточного рецептора к эпитопу HER-2/neu.

Задачей изобретения является получения в короткий срок точной информации о человеческом Т-клеточном рецепторе, специфичном для эпитопа 369-377 рецептора HER2/neu (ERBB2).

Поставленная задача решается тем, что в способе получения человеческого Т-клеточного рецептора, специфичного к эпитопу 369-377, полученному из белка рецептора HER2/neu (ERBB2), включающий выделение мононуклеарных клеток (МНК) периферической крови HLA-A02+доноров, затем МНК культивируют в присутствии рекомбинантного человеческого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и интерлейкина-4 (IL-4) в течение четырех дней; на 5-й день в культуру добавляют в качестве фактора праймирования эпитоп 369-377 ERBB2 дендритных клеток с последующей их инкубацией при температуре 37°С; на 6-й день добавляют фактор созревания для завершения созревания дендритных клеток; затем полученные дендритные клетки собирают, промывают питательной средой, подсчитывают количество дендритных клеток, оценивают их жизнеспособность и сокультивируют с аутологичными CD8+Т-лимфоцитами в определенном соотношении, а через 7 дней сокультивирования выделяют антиген-специфические CD8+Т-клетки, затем производят идентификацию последовательности генов TCR и амплификацию вариабельной области цепей TCRα и TCRβ, включая CDR3, выделенной из клонов Т-клеток, при этом цепи TCRα и TCRβ соединяют пептидным линкером 2А (TCRb-P2A-TCRa), а полную конструкцию TCR клонируют в скелет вирусной плазмиды для получения комплексов TCR, содержащие клоны кДНК α-цепи и β-цепи, при этом донорами являются условно-здоровые индивидуумы, из крови которых моноциты выделяли на градиенте фиколла, на 5-ый день добавляют в качестве фактора праймирования эпитоп 369-377 ERBB2 в дозе 30 мкг/мл и последующей инкубацией в течение 24-х часов, на 6-й день в качестве фактора созревания добавляют TNF-a в концентрации 25 нг/мл в течение 24 часов, а сокультивирование дендритных клеток осуществляют с CD8+Т-лимфоцитами в соотношении 1:10 в присутствии 0,5 мкг/мл анти-CD3, 1 мкг/мл анти-CD28 и IL-2, IL-7, IL-15 по 10 нг/мл каждого, через 7 дней сокультивирования выделяют антиген-специфические CD8+Т-клетки с помощью реагентов Flex-T, затем производят идентификацию последовательности генов TCR с помощью секвенирования РНК единичных клеток (Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq)) и выбор клона TCR, специфичного к эпитопу 369-377, полученному из белка рецептора HER2/neu (ERBB2), с помощью нейросетей ERGO-II и NetMHCpan-4.1 и программы ClonoSort, причем помимо соединения цепи TCRa и TCRP пептидным линкером 2А (TCRb-P2A-TCRa) используют 5' и 3' нетранслируемые области бета-глобулина на концах вставки, в качестве вирусной плазмиды используют лентивирус на основе ВИЧ-1 (pLentihPGK), получают один доминирующий TCR с одной альфа- и одной бета-цепью, происходящими из одной и той же клетки.

Изобретение, на наш взгляд, является новым. Существенным в данном способе является получение в короткий срок более точной информации о строении и аффинитете человеческого Т-клеточного рецептора, специфичного для эпитопа 369-377 рецептора HER2/neu (ERBB2), обладающего высоким аффинитетом к целевому пептиду и минимальным аффинитетом к нецелевым пептидам.

Это достигается, в частности, использованием более точного метода анализа РНК клеток (секвенирование РНК единичных клеток), позволяющего получить полную информацию о строении конкретного Т-клеточного рецептора (αа-цепи и β-цепи) на каждой отдельной клетке и использующего для этого значительно меньшее количество целевых клеток, что позволяет получать необходимую информацию используя биологический материал доноров. Данный метод позволяет не проводить дополнительные процедуры (вакцинация доноров клетками, нагруженные целевым антигеном, и длительное культивирование исследуемых клеток для получения необходимого количества) и сократить время получение Т-клеточного рецептора. Использование нейросетей ERGO-II, NetMHCpan-4.1 и программы ClonoSort (https://github.com/Perik-Zavodskaia/ClonoSort) позволяет выбрать клон TCR для антигена HER-2/neu, обладающего высоким аффинитетом к целевому пептиду и минимальным аффинитетом к нецелевым пептидам.

Способ осуществляется следующим образом.

1. Получение антиген-специфических Т-клеток. Мононуклеарные клетки (МНК) получают из периферической крови условно-здоровых доноров с генотипом HLA-A02. МНК разделяют на прилипающую и неприлипающую фракции посредством адгезии на пластике в течение 30 минут при +37°С в условиях СО₂-инкубатора. Получение зрелых дендритных клеток (ДК) из прилипающей фракции проводили с использованием GM-CSF (100 нг/мл) и IL-4 (50 нг/мл). Для нагрузки антигеном использовали пептид р369-377 (KIFGSLAFL), полученный из белка рецептора HER2/neu, в дозе 30 мкг/мл пептида на 5 сутки культивирования, с последующим созреванием ДК с помощью TNF-alpha (25 нг/мл) на 6 сутки культивирования. Клетки неприлипшей фракции МНК были культивированы в течение 6 суток. На 7 день проводилось объединение культур ДК и неприлипшей фракции МНК (соотношение 1:10) с добавлением 0,5 мкг/мл анти-CD3, 1 мкг/мл анти-CD28 и IL-2, IL-7, IL-15 (по 10 нг/мл каждый) для поддержания жизнеспособности и пролиферации CD8+цитотоксических Т-лимфоцитов.

Через 7-8 дней совместного культивирования проводили выделение антигенспецифических Т-клеток из совместной культуры ДК и неприлипших МНК с помощью реагентов Flex-T и соответствующих пептидов с одновременным окрашиванием позитивных специфических клеток двумя флюорохромами для идентификации методом проточной сортировки.

После полного цикла протокола получения АГ-специфических Т-клеток было получено 2 образца специфичных для эпитопа KIFGSLAFL антигена HER2/neu. Жизнеспособность полученных клеток оценивали с помощью красителей 7AAD и кальцеина. Содержание 7AAD-негативных/кальцеин-позитивных клеток в пробе составляло не менее 80%. Полученные клетки были помечены антителами для мультиплексирования биологических образцов SampleTag для использования на платформе для исследования мультиома единичных клеток BD Rhapsody.

Помеченные антителами для мультиплексирования Т-клетки в количестве 40000 были загружены в станцию BD Rhapsody Express, в которой было произведено добавление улавливающих поли-А-несущие молекулы (мРНК, включая альфа- и бета-цепи Т-клеточного рецептора (TCR), и SampleTag) металлических бус с молекулярными штрихкодами, лизис клеток и гибридизация поли-А-несущие молекул лизированных клеток с металлическими бусами. Поли-А-несущие молекулы затем были обратно транскрибированы с получением кДНК. К кДНК добавили Template Switch Oligo (TSO) и провели еще один раунд обратной транскрипции, что позволяет производить прочтения с 5'-конца кДНК. кДНК была амплифицирована в двух раундах полугнездовой ПЦР. Затем, для TCR библиотеки был произведен случайный отжиг праймеров и элонгация. С целью получения финальных библиотек иммунного транскриптома (379 генов связанные с иммунным ответом), TCR и SampleTag, продукты второй полугнездовой ПЦР библиотек SampleTag и иммунного транскриптома и продукты случайного отжига и элонгации библиотеки TCR были амплифицированны в гнездовой ПЦР с праймерами, содержащими адаптеры для секвенаторов Illumina. Полученные библиотеки были пулированы из расчета 40000 загруженных клеток и 10000 прочтений на клетку для библиотеки иммунного транскриптома, 15000 прочтений на клетку для библиотеки TCR, 1200 прочтений на клетку для библиотеки SampleTag и секвенированы на приборе NovaSeq 6000 на ячейке S2 с 150 парными прочтениями.

Полученные FASTQ файлы были обработаны при помощи пайплайна BD версии 1.11.1L, который проводит контроль качества прочтений, их выравнивание на референсный транскриптом, в том числе и Т-клеточных рецепторов, строит библиотеки клеточных индексов, устраняет ПЦР эффекты при помощи UMI RSEC (unique molecular identifier recursive substitution error correction) и UMI DBEC (unique molecular identifier distribution-based error correction), строит библиотеки клеток, устраняет технический шум при помощи анализа второй производной и выдает финальные матрицы экспрессии генов и Adaptive Immune Receptor Repertoire (AIRR) - матрицы последовательностей альфа- и бета-цепей Т-клеточного рецептора. Нами было получено 7700 единичных клеток. Биоинформатический анализ данных секвенирования производился с помощью программного инструмента ClonoSort ((https://github.com/Perik-Zavodskaia/ClonoSort). ClonoSort - это инструмент для определения доминантных (по количеству единичных клеток) по CDR3-петле или по полным аминокислотным последовательностям клонотипов Т-клеточных рецепторов. На первом этапе производится СРМ (Counts Per Million) нормализация матрицы экспрессии генов, далее матрица трансформируется по log2. На втором этапе отбираются только CD8+Т-клетки при помощи квадрантного гейтирования по генам CD4 и CD8a, для них выбираются контиги их TCR, сшиваются через спейсер альфа и бета цепи (CDR3/full length TCR) и считается количество клеток с одинаковыми парами сшитых последовательностей. Для эпитопа HER2/neu обнаружено более 1500 клонотипов, среди них 110 доминантных (более 2 клеток на клонотип).

Известно, что многие CAR-T и TCR-T клетки имеют нетаргетный эффект, так как могут взаимодействовать с родственными белками. Чтобы снизить данный эффект in silico был произведен компьютерный анализ взаимодействия полученных TCR с пептидами родственных белков. Так с помощью нейросети ERGO-II in silico была предиктирована вероятность связывания TCR комплексом пептид/МНС (пептиды семейства HER). Используя ERGO-II, мы можем предсказать аффинитет полученных TCR к пептиду, что облегчает выбор между кандидатами из пула TCR в зависимости от желаемого применения.

Нетаргетные пептиды выбирали в результате анализа литературы и проверяли при помощи нейросети NetMHCpan-4.1 со следующими параметрами: длина пептида - 8-11 аминокислот, аллель - Н1_А-А*02:01, взвешенный критерий достоверности предиктированного связывания (rank) - меньше 2%.

После загрузки репозитория нейросети ERGO-II выполнялся запуск инструмента из терминала с выбором входного файла и базы данных (McPAS), на основе которой была обучена модель. McPAS-TCR - вручную курируемая и основанная на опубликованной литературе база данных, содержащая информацию примерно о сорока тысячах последовательностях Т-клеточных рецепторов, антигенов, с которыми они связываются, типе Т-клеток (CD4⁺/CD8⁺) и типе МНС (MHC-I/MHC-II класса). В McPAS-TCR включается информация о Т-лимфоцитах, экспансирующихся при различных патологических состояниях человека или мыши (в т.ч. вирусные инфекции, онкологические заболевания и аутоиммунные реакции). Входной CSV-файл для запуска ERGO-II содержит информацию о последовательности TCR CDR3α и CDR3β, последовательности пептида, типе МНС (MHC-I/MHC-II класса), генах V и J, а также типе Т-клеток (CD4⁺/CD8⁺). Выходной файл содержит значение прогнозирования вероятности связывания Т-клеточного рецептора с комплексом пептид/МНС (нормализованная оценка аффинитета - score), которое варьируется от 0 до 1, где 0 - минимальный аффинитет, а 1 - максимальный аффинитет. Были отобраны клоны со значением нормализованной оценки аффинитета выше 0.5.

На основании анализа доминантности клонотипов при помощи ClonoSort, их аффинитета к целевому пептиду и минимальным аффинитету к нецелевым пептидам при помощи нейросетей ERGO-II и NetMHCpan-4.1 был выбран доминантный клон с наибольшим числом клеток. На фиг. 1 представлен аффинитет и количество клеток различных клонотипов против HER-2/neu.

Далее был сконструирован лентивирусный вектор на основе ВИЧ-1 (pLenti hPGK GFP с вставкой вместо гена EGFP, - схема плазмиды pLenti hPGK, которая показана на фиг. 2) и использованы для получения TCR-T-клеток, специфичных к эпитопу опухоль-ассоциированных антигенов HER-2/neu. В состав трансферной плазмиды лентивирусного вектора включены последовательности TCRa и TCRb в единой рамке считывания, разделенные при помощи сигнала для сброса полипептида с полисом Р2А. Схема конструирования вставки для плазмиды показана на фиг. 3, где обозначены 5' и 3' нетранслируемые области бета-глобулина (Hbb5'UTR и Hbb3'UTR) на 5' и 3' концах вставки.

Для синтеза и клонирования специфического гена, кодирующего TCR, специфичный к эпитопу опухолеассоциированного антигена HER-2/neu, был использован следующий протокол:

1. Синтез гена методом ПЦР (полимеразная цепная реакция).

Ген, кодирующий TCR, был синтезирован путем амплификации с помощью ПЦР. Сначала, были синтезированы праймеры, последовательность которых представлена на диске CD-RW. Сессия записи диска закрыта для последующей записи на него информации.

ПЦР выполнена с использованием набора ThermoFisherScientific (#F549), который включает ДНК-полимеразу Phusion Hot Start II, систему 5-кратных буферов HF и GC, 50 мМ раствор MgCl₂, ДМСО, была проведена ПЦР на амплификаторе Bio Rad Thermal cycler C-1000. Фланкирующие праймеры для For и Rev использовали с концентрацией 10 мкМ. Остальные праймеры использовали с концентрацией 2 мкМ. Реакционную смесь для первой ПЦР готовили следующим образом (конечный объем - 50 мл): 10 мкл 5Х буфера GC, 10 мкл эквимолярного раствора праймеров, 0,5 мкл смесь дНТФ (25 мМ каждый), 1 мкл полимеразы Phusion HS II, 28,5 мкл mQ. Режим: начальная денатурация (1 цикл): 98°С - 2 мин; амплификация (15 циклов): 98°С - 10 сек, 60°С - 15 сек, 72°С - 2.5 мин; досинтез (1 цикл): 72°С - 5 мин; хранение при +4°С.

После завершения первой ПЦР была проведена вторая ПЦР, направленная на получение ампликонов целевой длины (2071 п. н.). Реакционную смесь для второй ПЦР готовили следующим образом (конечный объем - 50 мл): 10 мкл 5Х буфера GC, 2 мкл рабочего раствора фланкирующих праймеров (10 мкМ каждый), 6 мкл реакционной смеси, полученной после ПЦР 1 этапа, 0,5 мкл смесь дНТФ (25 мМ каждый), 1 мкл полимеразы Phusion HS II, 30,5 мкл mQ. Режим: начальная денатурация (1 цикл): 98°С - 2 мин; амплификация (25 циклов): 98°С - 15 сек, 50°С - 15 сек, 72°С - 2,5 сек; досинтез (1 цикл): 72°С - 5 мин; хранение при +4°С.

После второй ПЦР проводили горизонтальный гель-электрофорез в 1% агарозном геле при напряженности 6 В/см в течение не менее 30 минут.В геле были видны фрагменты ПЦР длиной 2071 п. н.. Фрагменты вырезали из геля и очищали с помощью коммерческого набора LumiPure для выделения ДНК из агарозного геля.

2. Клонирование в промежуточный вектор pUC57.

Вектор pUC57, линеаризованный по сайту EcoRV, был использован в качестве вектора клонирования. Реакции лигирования проводили с использованием ДНК-лигазы Т4 (5 единиц/мкл) Thermo Scientific™ (#EL0011). Соотношение вектор: очищенный ПЦР-продукт 1:3. Инкубация 16-18 ч при температуре+4°С.

Лигазная смесь была трансформирована в клетки E.coli XL1-blue для химической трансформации Eurogene СС001 по методике производителя. Затем эти трансформированные клетки высевали на чашки Петри с LB-агаром, содержащим X-gal, IPTG и ампициллин в дозе 100 мкг/мл. Инкубация чашек в течение 16-18 ч при +37°С. Верификацию белых клонов проводили методом ПЦР-скрининга с использованием специфических праймеров для вставки. Для скрининга использовали реакционную смесь для ПЦР Basic, 2х Lumiprobe # 5024. Ожидаемый размер продукта ПЦР составил 2217 п. н. Клоны, давшие положительные результаты ПЦР, культивировали в жидкую LB-среду (5 мл, ампициллин 100 мкг/мл). Выделение плазмид проводили на следующий день (через 16 часов) с помощью набора LumiPure для выделения плазмидной ДНК (Spin Miniprep), Lumiprobe #1583. После чего подходящие клоны отбирали путем секвенирования.

3. Переклонирование искомого гена в конечный лентивирусный вектор pLenti_hPGK_gfp.

Вставку подготавливали для переклонирования путем вырезания плазмиды pUC57_H с последовательной реакцией рестрикции, сначала по сайту BstAUl (Сибэнзим) (1 ч при 37С в буфере Fast Digest от ThermoScientific, #В72), потом по BamHI (Сибэнзим) (также в буфере Fast Digest от ThermoScientific, #В72). Затем проводили горизонтальный гель-электрофорез в 1% агарозном геле реакционной смеси при напряжении 5-6 В/см не менее 45 мин, и вырезание из геля срезы с желаемым фрагментом размером (2065 п. н.). Фрагмент был очищен с помощью набора LumiPuree для выделения ДНК из агарозного геля, Lumiprobe, №5793.

pLenti_hPGK_gfp вектор подготавливали для переклонирование путем удаления гена, кодирующего gfp, из вектора с одновременной рестрикцией по сайтам BstAUl (Сибэнзим) и BamHI (сибэнзим) Fast Digest от ThermoScientific, #В72, 1 ч при 37С.Затем проводили горизонтальный гель-электрофорез в 1% агарозном геле реакционной смеси при напряжении 5-6 В/см не менее 45 мин, и вырезание из геля срезы с желаемым фрагментом размером 7594 п. н., соответствующему вектору без вставки. Фрагмент был очищен с помощью набора LumiPuree для выделения ДНК из агарозного геля, Lumiprobe, №5793.

4. Клонирование гена в вектор pLenti_hPGK_gfp сайтами BstAUl, BamHI.

Постановка реакции лигирования проводилась с помощью Т4 DNA Ligase (5 U/uL) Thermo Scientific™ (#EL0011). Соотношение вектор: фрагмент 1:5. Инкубация в течение 16-18 ч при +4°С.

Лигазная смесь была трансформирована в клетки E.coli XL1-blue для химической трансформации Eurogene СС001 по методике производителя. Затем эти трансформированные клетки высевали на чашки Петри с LB-агаром, содержащим ампициллин в дозе 100 мкг/мл. Инкубация чашек ночь при +37°С. Верификацию клонов проводили методом ПЦР-скрининга с использованием специфических праймеров hPGK-F (5- GTGTTCCGCATTCTGCAAG-3), WPRE-R (5- CATAGCGTAAAAGGAGCAACA-3), для скрининга использовалась реакционная смесь для ПЦР Basic, 2х Lumiprobe # 5024. Ожидаемый размер продукта ПЦР составил 2189 п. н. Клоны, давшие положительные результаты ПЦР, культивировали в жидкую LB-среду (5 мл, ампициллин 100 мкг/мл, ночная культура). Выделение плазмид проводили на следующий день (через 16 часов) с помощью набора LumiPure для выделения плазмидной ДНК (Spin Miniprep), Lumiprobe #1583. После чего подходящие клоны отбирали путем секвенирования.

Трансферная плазмида, плазмида, кодирующая VSV-G, и упаковочные плазмиды лентивируса третьего поколения были наработаны в Е. coli (штамм NEB Stable), полученные плазмиды были проверены с помощью рестрикционных ферментов и гель-электрофореза. Вышеперечисленные плазмиды были доставлены при помощи липофектамина 2000/3000 в упаковочные клетки НЕК-293Т. Наработанные лентивирусы были концентрированы при помощи коммерческого набора TransLve Lentivirus Precipitation Solution (5x) и титрованы при помощи количественной (с стандартами в разведении) PCR на провирусную ДНК (TransLvTM Lentivirus qPCR Titration Kit) в целевых Т-клетках. Для целевых клеток была подобрана необходимая множественность инфекции (Multiplicity Of Infection, MOI) для трансдукции наибольшего количества клеток с наибольшей витальностью и с наименьшим числом маркеров истощения. Затем Т-клетки-мишени трансдуцировали полученными лентивирусными частицами в соответствии с оптимальным MOI (Multiplicity Of Infection), после чего отсортировали CD8 клетки. Для оценки цитотоксической активности трансдуцированных TCR-T клеток их сокультивировали с клетками опухолевых линий (соотношение 1:5), отличающихся по экспрессии HER2/neu (SK-MEL-37 - HER-2/neu -позитивная, MCF-7 - HER2/neu - негативная). Контролем служили нетрансдуцированные Т-клетки.

На фиг. 4 показан процент гибели опухолевых клеток HER2/neu-позитивной линии (SK-MEL-37) и HER-2/neu-негативной линии (MCF-7) при сокультивировании их с CD8+Т-клетками, трансдуцированные лентивирусной конструкцией, кодирующей TCR-Т клеточный рецептор к эпитопу HER2/neu, и с нетрансдуцированными CD8+T-клетками (контроль), n=6. Стрелками обозначены статистически значимые различия между экспериментальными и контрольной группами (р≤0,05).

Таким образом, предложенный способ получения человеческого Т-клеточного рецептора, специфичного для эпитопа 369-377 рецептора HER2/neu (ERBB2), позволяет создать в короткий срок, без дополнительных длительных процедур (получение дендритноклеточных вакцин, вакцинация доноров), и имеющее точное описание строения Т-клеточного рецептора, специфичного для эпитопа 369-377 рецептора HER2/neu (ERBB2). Проведенные исследования in vitro CD8+клеток, трансдуцированных лентивирусной конструкцией, кодирующей разработанный клеточный рецептор к эпитопу 369-377 HER-2/neu(ERBB2), с использованием прямого цитотоксического теста против опухолевых клеток, экспрессирующих антиген HER2/neu, показали высокий показатель цитотоксичности против опухолевых клеток, экспрессирующих антиген HER2/neu, в отличие от соответствующего (антиген-негативного) контроля.

Claims (1)

1. Способ получения человеческого Т-клеточного рецептора, специфичного к эпитопу 369-377, полученному из белка рецептора HER2/neu (ERBB2), включающий выделение мононуклеарных клеток (МНК) периферической крови HLA-A02+доноров, затем МНК культивируют в присутствии рекомбинантного человеческого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и интерлейкина-4 (IL-4) в течение четырех дней; на 5-й день добавляют в качестве фактора праймирования эпитоп 369-377 ERBB2 в культуру дендритных клеток с последующей их инкубацией при температуре 37°С; на 6-й день добавляют фактор созревания для завершения созревания дендритных клеток; затем полученные дендритные клетки собирают, промывают питательной средой, подсчитывают количество дендритных клеток, оценивают их жизнеспособность и сокультивируют с аутологичными CD8+Т-лимфоцитами в определенном соотношении, а через 7 дней сокультивирования выделяют антиген-специфические CD8+Т-клетки, затем производят идентификацию последовательности генов TCR и амплификацию вариабельной области цепей TCRα и TCRβ, включая CDR3, выделенной из клонов Т-клеток, при этом цепи TCRα и TCRβ соединяют пептидным линкером 2А (TCRb-P2A-TCRa), а полную конструкцию TCR клонируют в скелет вирусной плазмиды для получения комплексов TCR, содержащие клоны кДНК α-цепи и β-цепи, отличающийся тем, что, донорами являются условно-здоровые индивидуумы, из крови которых моноциты выделяли на градиенте фиколла, на 5-ый день добавляют в качестве фактора праймирования эпитоп 369-377 ERBB2 в дозе 30 мкг/мл и последующей инкубацией в течение 24-х часов, на 6-й день в качестве фактора созревания добавляют TNF-a в концентрации 25 нг/мл в течение 24 часов, а сокультивирование дендритных клеток осуществляют с CD8+Т-лимфоцитами в присутствии 0,5 мкг/мл анти-CD3, 1 мкг/мл анти-CD28 и IL-2, IL-7, IL-15 по 10 нг/мл каждый в соотношении 1:10, через 7 дней сокультивирования выделяют антиген-специфические CD8+Т-клетки с помощью реагентов Flex-T, затем производят идентификацию последовательности генов TCR с помощью секвенирования РНК единичных клеток (Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq)) и выбор клона TCR, специфичного к эпитопу 369-377, полученного из белка рецептора HER2/neu (ERBB2), с помощью нейросетей ERGO-II и NetMHCpan-4.1 и программы Clone-Sort, причем помимо соединения цепи TCRα и TCRβ пептидным линкером 2А (TCRb-P2A-TCRa) используют 5' и 3' нетранслируемые области бета-глобулина на концах вставки, в качестве вирусной плазмиды используют лентивирус на основе ВИЧ-1 (pLentihPGK), получают один доминирующий TCR с одной альфа- и одной бета-цепью, происходящими из одной и той же клетки.