RU2817792C1 - Экспрессионный вектор на основе аденоассоциированного вируса, несущий гены рекомбинантных антител, и его применение для профилактики заболеваний, вызываемых вирусом гриппа А и вирусом SARS-CoV-2 - Google Patents
Экспрессионный вектор на основе аденоассоциированного вируса, несущий гены рекомбинантных антител, и его применение для профилактики заболеваний, вызываемых вирусом гриппа А и вирусом SARS-CoV-2 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2817792C1 RU2817792C1 RU2023130939A RU2023130939A RU2817792C1 RU 2817792 C1 RU2817792 C1 RU 2817792C1 RU 2023130939 A RU2023130939 A RU 2023130939A RU 2023130939 A RU2023130939 A RU 2023130939A RU 2817792 C1 RU2817792 C1 RU 2817792C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- virus
- seq
- insdseq
- insdqualifier
- tetra1
- Prior art date
Links
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 title claims abstract description 51
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 title claims abstract description 45
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 title claims abstract description 43
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 33
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 25
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims description 11
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title description 5
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 claims abstract description 12
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 10
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 77
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 claims description 12
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims description 12
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims description 12
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims description 12
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims description 12
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 claims description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 12
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 claims description 10
- 230000007774 longterm Effects 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 45
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 45
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 39
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 38
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 34
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 31
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 26
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 16
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 235000017274 Diospyros sandwicensis Nutrition 0.000 description 12
- 241000282838 Lama Species 0.000 description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 12
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 10
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 8
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 8
- 101100292361 Colletotrichum gloeosporioides CAP5 gene Proteins 0.000 description 7
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 7
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 7
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 7
- 102100021879 Adenylyl cyclase-associated protein 2 Human genes 0.000 description 6
- 101000897856 Homo sapiens Adenylyl cyclase-associated protein 2 Proteins 0.000 description 6
- 101000836079 Homo sapiens Serpin B8 Proteins 0.000 description 6
- 101000798702 Homo sapiens Transmembrane protease serine 4 Proteins 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 4
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 102000053723 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000975 Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 description 2
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 2
- 239000007989 BIS-Tris Propane buffer Substances 0.000 description 2
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- 241000494545 Cordyline virus 2 Species 0.000 description 2
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 description 2
- 241001115401 Marburgvirus Species 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010057266 Type A Botulinum Toxins Proteins 0.000 description 2
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 2
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N bis-tris propane Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCNC(CO)(CO)CO HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 2
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 description 1
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 description 1
- 241000649044 Adeno-associated virus 9 Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101100326791 Caenorhabditis elegans cap-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010007556 Cardiac failure acute Diseases 0.000 description 1
- 208000031229 Cardiomyopathies Diseases 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 101900159346 Influenza A virus Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 241001500351 Influenzavirus A Species 0.000 description 1
- 239000012741 Laemmli sample buffer Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 description 1
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000037847 SARS-CoV-2-infection Diseases 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 208000012998 acute renal failure Diseases 0.000 description 1
- 206010001053 acute respiratory failure Diseases 0.000 description 1
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229940094657 botulinum toxin type a Drugs 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000013583 drug formulation Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 230000005182 global health Effects 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 239000013646 rAAV2 vector Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 101150066583 rep gene Proteins 0.000 description 1
- 201000004193 respiratory failure Diseases 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая экспрессионный вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса, применение экспрессионного вектора для профилактики заболеваний, вызываемых вирусом гриппа А и вирусом SARS-CoV-2, и иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызываемых вирусом гриппа А и вирусом SARS-CoV-2, содержащее экспрессионный вектор. В одном варианте реализации экспрессионный вектор несет ген рекомбинантного антитела, представляющего собой тетрамеризованные глицин-сериновыми линкерами однодоменные антитела, слитые с Fc-фрагментом IgG1 человека. Изобретение расширяет арсенал средств для профилактики заболеваний, вызываемых вирусом гриппа А и вирусом SARS-CoV-2. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 9 ил., 4 табл., 9 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Созданы экспрессионные векторы на основе аденоассоциированного вируса, экспрессирующие рекомбинантные нейтрализующие антитела специфичные к гемагглютинину вируса гриппа А и рецептор-связывающему домену (RBD) S-белка вируса SARS-CoV-2, предложено применение таких векторов для профилактики заболеваний, вызываемых вирусом гриппа А и вирусом SARS-CoV-2.
Предшествующий уровень техники
Вирус гриппа А и вирус SARS-CoV-2 остаются серьезной проблемой для мирового здравоохранения, несмотря на наличия широкого спектра терапевтических и профилактических препаратов. Вирус гриппа А и вирус SARS-CoV-2 являются РНК-содержащими вирусами и имеют высокую степень генетической изменчивости, в следствие чего являются причиной возникновения тяжелых эпидемий и пандемий. Оба вируса способны передаваться воздушно-капельным, воздушно-пылевым, контактным способами и имеют тенденцию к быстрому распространению.
Грипп и COVID-19 могут протекать как в легкой, так и тяжелой форме. При этом тяжелые формы заболеваний чаще развиваются у пациентов старше 60 лет и имеющих хронические заболевания. Наиболее грозными осложнениями гриппа и COVID-19 являются - пневмония, острый респираторный дистресс-синдром, острая дыхательная недостаточность, острая сердечная недостаточность, острая почечная недостаточность, септический шок, кардиомиопатии, и др. При сочетанной инфекции вирусы гриппа и вирусы SARS-CoV-2 способны вызывать коморбидные состояния (Ozaras R, Cirpin R, Duran A, Duman H, Arslan O, Bakcan Y, Kaya M, Mutlu H, Isayeva L, Kebanlı F, Deger BA, Bekeshev E, Kaya F, Bilir S. Influenza and COVID-19 coinfection: Report of six cases and review of the literature. J Med Virol. 2020 Nov;92(11):2657-2665. doi: 10.1002/jmv.26125. Epub 2020 Jun 29. PMID: 32497283).
На сегодняшний день, основным способом контроля распространения гриппозной инфекции и инфекции COVID-19 является вакцинопрофилактика, которую дополняют противовирусные препараты. Сегодня зарегистрировано и находится на различных этапах клинических исследований большое количество вакцин как против гриппозной инфекции, так и против инфекции COVID-19. Однако такие вакцины действуют в отношении конкретно вируса гриппа или вируса SARS-CoV-2 и не способны эффективно защита против обоих вирусов одновременно. Кроме того, вакцины обеспечиваю формирование стойкого протективного иммунного ответа лишь через, как минимум, 14 дней после введения препарата. Таким образом, в первые две недели после вакцинации человек по-прежнему остается не защищенным. Таким образом, создание средства способного защищать от вируса гриппа и вируса SARS-CoV-2 в профилактическом режиме одновременно является актуальной задачей.
Известно решение (патент RU 2751485), где создан прототип вакцины против вируса гриппа А, вируса гриппа В и вируса COVID-19. Изобретение представляет собой комбинированную пентавалентную векторную вакцину против вируса гриппа А H1N1, H3N2, вируса гриппа В линий Виктория и Ямагата и вируса SARS-CoV-2 варианта альфа, на основе аденовируса человека 5 серотипа. Показана иммуногенность и протективность полученных рекомбинантных аденовирусов. Недостатком решения является относительная сложность в получении прототипа, так как необходимо наращивать, очищать и контролировать качество 5-ти рекомбинантных аденовирусов. Кроме того, последовательность S-белка вируса SARS-CoV-2 варианта альфа не является на сегодняшний день актуальной для создания вакцины, так как циркулирующие на данный момент штаммы вируса (XBB, BA.5, BA.X) генетически значительно далеки от варианта альфа.
Перспективным направление в создании противовирусных средств является получение моноклональных антител, специфичных к высоко консервативным участкам вирусных белков. Частным случаем моноклональных антител являются однодоменные антитела семейства верблюдовых, которые из-за наличия длинных петель CDR3 способны связывать труднодоступные эпитопы вирусных антигенов. Однако, недостатком моноклональных и особенно однодоменных антител является ограниченное время циркуляции в организме, вследствие чего они не подходят для продолжительной профилактики инфекционных заболеваний. В свою очередь вакцины индуцируют формирование иммунного ответа через определенный срок после введения, как правило несколько недель. Существует альтернативный способ пассивной иммунизации с применением аденоассоциированного вирусного вектора, обеспечивающего доставку и продолжительную экспрессию в организме антител заданной специфичности. Существуют данные об успешном применении такого подхода для индукции длительной защиты против ВИЧ [Casazza, J.P., Cale, E.M., Narpala, S. et al. Safety and tolerability of AAV8 delivery of a broadly neutralizing antibody in adults living with HIV: a phase 1, dose-escalation trial. Nat Med 28, 1022–1030 (2022). https://doi.org/10.1038/s41591-022-01762-x], вируса Эболы [Laura P. van Lieshout, Amira D. Rghei, Wenguang Cao, Shihua He, Geoff Soule, Wenjun Zhu, Sylvia P. Thomas, Debra Sorensen, Kathy Frost, Kevin Tierney, Brad Thompson, Stephanie Booth, David Safronetz, Raveendra R. Kulkarni, Byram W. Bridle, Xiangguo Qiu, Logan Banadyga, Sarah K. Wootton, AAV-monoclonal antibody expression protects mice from Ebola virus without impeding the endogenous antibody response to heterologous challenge, Molecular Therapy - Methods & Clinical Development, Volume 26, 2022, pages 505-518], Марбург вируса [Rghei, A.D., van Lieshout, L.P., Cao, W. et al. Adeno-associated virus mediated expression of monoclonal antibody MR191 protects mice against Marburg virus and provides long-term expression in sheep. Gene Ther (2022). https://doi.org/10.1038/s41434-022-00361-2] вируса гриппа [Adam VS, Crosariol M, Kumar S, Ge MQ, Czack SE, Roy S, Haczku A, Tretiakova A, Wilson JM, Limberis MP. Adeno-associated virus 9-mediated airway expression of antibody protects old and immunodeficient mice against influenza virus. Clin Vaccine Immunol. 2014 Nov;21(11):1528-33. doi: 10.1128/CVI.00572-14], а также интоксикации ботулотоксином типа А [Derkaev, A. A.; Ryabova, E. I.; Esmagambetov, I. B.; Shcheblyakov, D. V.; Godakova, S. A.; Vinogradova, I. D.; Noskov, A.N.; Logunov, D. Y.; Naroditsky, B. S.; Gintsburg, A. L. rAAV expressing recombinant neutralizing antibody for the botulinum neurotoxin type A prophylaxis. Front Microbiol 2022, 13:960937. doi: 10.3389/fmicb.2022.960937]. Выбор аденоассоциированного обусловлен его способностью трансдуцировать широкий спектр клеток мишеней, низкой иммуногенностью, безопасностью, а также длительной персистенцией в организме в виде эписомы.
В работе Del Rosario et al. (Del Rosario J.M.M.; Smith M, Zaki K.; Risley P.; Temperton N.; Engelhardt O.G.; Collins M.; Takeuchi Y.; Hufton S.E. Protection From Influenza by Intramuscular Gene Vector Delivery of a Broadly Neutralizing Nanobody Does Not Depend on Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity. Front Immunol. 2020, 11:627. doi: 10.3389/fimmu.2020.00627) получена рекомбинантные векторы на основе аденоассоциированного вируса человека, экспрессирующие рекомбинантные антитела, специфичные к гемагглютинину вируса гриппа А, а также, предложено их применение для долгосрочной профилактики гриппа А. Однако, в данном решении, существенным недостатком является использование Fc-фрагмента иммуноглобулина мыши в составе рекомбинантного антитела, который может быть иммуногенным при циркуляции в организме человека и вызывать тем самым побочные эффекты.
В патенте RU 2777404 получены аденоассоциированные вирусные векторы, экспрессирующие однодомененные антитела, слитые с Fc-фрагментом IgG1 человека. Показано, что введение таких векторов в эффективном количестве способно индуцировать защиту от летальной инфекции вирусом SARS-CoV-2 непосредственно после введения. Кроме того, показано, что такие аденоассоциированные вирусные векторы способные обеспечивать защиту против различных штаммов вируса SARS-CoV-2, том числе варианта Омикрон, в течении как минимум 9 месяцев после введения (Esmagambetov IB, Ryabova EI, Derkaev AA, Shcheblyakov DV, Dolzhikova IV, Favorskaya IA, Grousova DM, Dovgiy MA, Prokofiev VV, Gosudarev AI, Byrikhina DV, Zorkov ID, Iliukhina AA, Kovyrshina AV, Shelkov AY, Naroditsky BS, Logunov DY, Gintsburg AL. rAAV expressing recombinant antibody for emergency prevention and long-term prophylaxis of COVID-19. Front Immunol. 2023 Mar 30;14:1129245. doi: 10.3389/fimmu.2023.1129245. PMID: 37063833; PMCID: PMC10098153). Изобретение RU 2777404 было выбрано авторами в качестве прототипа. Однако прототип не способен обеспечивать защиту против вируса гриппа А.
Таким образом, в уровне техники существует потребность в создании нового рекомбинантного антитела и экспрессионного вектора, способных обеспечить защиту от инфекций, вызываемых вирусом гриппа типа А и вирусом SARS-CoV-2 в профилактическом режиме одновременно.
Раскрытие изобретения
Технической задачей заявленной группы изобретений является расширение арсенала рекомбинантных вирусных векторов для профилактики заболеваний, вызываемых вирусом гриппа типа А и вирусом SARS-CoV-2.
Технический результат заключается в создании аденоассоциированных вирусных векторов, экспрессирующих рекомбинантные антитела, представляющие собой тетрамеризованные через глицин-сериновый линкер однодоменные антитела, слитые с Fc-фрагментом IgG1 человека, специфичные к гемагглютинину вируса гриппа А и рецептор-связывающему домену RBD S-белка вируса SARS-CoV-2 одновременно. Данные аденоассоциированные вирусные вектора могут быть использованы для индукции пролонгированной экспрессии в организме указанных рекомбинантных антител. Кроме того, технический результат достигается тем, что созданные аденоассоциированные вирусные вектора могут быть использованы для профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа А и различными штаммами вируса SARS-CoV-2.
Указанный технический результат достигается тем, что создан рекомбинантный аденоаcсоцированный вирусный вектор, несущий генетическую конструкцию SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14, экспрессирующую ген рекомбинантного антитела, представляющего собой тетрамеризованные глицин-сериновыми линкерами однодоменные антитела, слитые с Fc-фрагментом IgG1 человека, где одно однодоменное антитело имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, другое однодоменное антитело имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, другое однодоменное антитело имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9, и другое однодоменное антитело имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:10, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12, соответственно.
Также технический результат достигается тем, что экспрессируемое в составе вектора рекомбинантное антитело специфически связывает гемагглютинин вируса гриппа А и рецептор-связывающий домен RBD S-белка вируса SARS-CoV-2 одновременно и таким образом обладает защитной активностью против вируса гриппа А и вируса SARS-CoV-2, одновременно.
Также технический результат достигается тем, что введение созданного препарата рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора в эффективном количестве обеспечивает продолжительную экспрессию в организме рекомбинантного антитела.
Разработан способ профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа А и вирусом SARS-CoV-2, заключающийся во введении в эффективном количестве рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора, экспрессирующего рекомбинантное антитело, специфически связывающее гемагглютинин вируса гриппа А и рецептор-связывающий домен RBD S-белка вируса SARS-CoV-2 одновременно.
Также технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызываемых вирусом гриппа А и вирусом SARS-CoV-2, содержащее экспрессионный вектор rAAV2-Tetra1, представляющий собой рекомбинантный аденоассоциированный вирус 2-ого серотипа и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:13 или экспрессионный вектор rAAV2-Tetra2, представляющий собой рекомбинантный аденоассоциированный вирус 2-ого серотипа и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:14 или экспрессионный вектор rAAV5-Tetra1, представляющий собой рекомбинантный аденоассоциированный вирус 5-ого серотипа и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:13 или экспрессионный вектор rAAV5-Tetra2, представляющий собой рекомбинантный аденоассоциированный вирус 5-ого серотипа и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:14.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлено схематическое изображение рекомбинантного антитела Tetra1.
P2C5 – однодоменное антитело P2C5;
P1C6 – однодоменное антитело P1C6;
92 – однодоменное антитело 92;
23 – однодоменное антитело 23;
GS – глицин-сериновый линкер;
H – Шарнирный регион (Hinge) IgG1 человека;
Fc – Fc фрагмент IgG1 человека.
На фиг. 2 представлено схематическое изображение рекомбинантного антитела Tetra2.
92 – однодоменное антитело 92;
23 – однодоменное антитело 23;
P2C5 – однодоменное антитело P2C5;
P1C6 – однодоменное антитело P1C6;
GS – глицин-сериновый линкер;
H – Шарнирный регион (Hinge) IgG1 человека;
Fc – Fc фрагмент IgG1 человека.
На фиг. 3 представлены схематические изображения плазмид pHELP, pREP/CAP2, pREP/CAP5, pAAV-Tetra1, pAAV-Tetra2.
E2A, E4, VA – гены аденовируса человека 5-ого серотипа, необходимые для репликации аденоассоциированного вируса;
REP – ген белков репликативного комплекса аденоассоциированного вируса 2-ого серотипа;
CAP2 – ген структурных белков аденоассоциированного вируса 2-ого серотипа;
CAP5 – ген структурных белков аденоассоциированного вируса 5-ого серотипа;
ITR – инвертированные концевые повторы генома аденоассоциированного вируса человека 2-го серотипа;
CMV – промотор цитомегаловируса человека;
Tetra1 и Tetra2 – гены соответствующих рекомбинантных антител;
Poly A – сигнал полиаденилирования.
На фиг. 4 представлены результаты иммуноблотинга, подтверждающего экспрессию рекомбинантных антител Tetra1 и Tetra2 в составе плазмид pAAV-Tetra1, pAAV-Tetra2 соответственно.
М – маркер молекулярного веса;
1 – образец культуральной жидкости не трансфецированных клеток (отрицательный контроль);
2 – образец культуральной жидкости клеток, трансфецированных плазмидой pAAV-Tetra1;
3 – образец культуральной жидкости клеток, трансфецированных плазмидой pAAV-Tetra2.
На фиг. 5 представлена электрофореграмма оценки чистоты и подлинности препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2.
М – маркер молекулярного веса;
1 – препарат rAAV5-Tetra1 после анионообменной хроматографии;
2 – препарат rAAV5-Tetra2 после анионообменной хроматографии;
3 – препарат rAAV2-Tetra1 после анионообменной хроматографии;
4 – препарат rAAV2-Tetra2 после анионообменной хроматографии;
5 – препарат rAAV5-Tetra1 после аффинной хроматографии;
6 – препарат rAAV5-Tetra2 после аффинной хроматографии;
7 – препарат rAAV2-Tetra1 после аффинной хроматографии;
8 – препарат rAAV2-Tetra2 после аффинной хроматографии;
9 – препарат rAAV5-Tetra1 после финального концентрирования;
10 – препарат rAAV5-Tetra2 после финального концентрирования;
11 – препарат rAAV2-Tetra1 после финального концентрирования;
12 – препарат rAAV2-Tetra2 после финального концентрирования;
VP1, VP2, VP3 – структурные белки аденоассоциированного вируса.
На фиг. 6 представлены результаты трансмиссионной электронной микроскопии фракции, содержащей преимущественно полные капсиды, препарата rAAV2-Tetra1.
Масштаб в 1 см – 50 нм.
На фиг. 7 представлены результаты трансмиссионной электронной микроскопии фракции, содержащей преимущественно пустые капсиды, препарата rAAV2-C.
Масштаб в 1 см – 50 нм.
На фиг. 8 изучение специфической активности рекомбинантных антител Tetra1 и Tetra2, экспрессируемых в составе препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2, в отношении гемагглютинина вируса гриппа А.
Ось ординат – уровень специфического сигнала ОД450нм;
ось абсцисс – название образцов культуральной жидкости.
rAAV5-Tetra1 – образец культуральной жидкости клеток НЕК293, трансдуцированных препаратом rAAV5-Tetra1;
rAAV5-Tetra2 – образец культуральной жидкости клеток НЕК293, трансдуцированных препаратом rAAV5-Tetra2;
rAAV2-Tetra1 – образец культуральной жидкости клеток НЕК293, трансдуцированных препаратом rAAV2-Tetra1;
rAAV2-EGFP – образец культуральной жидкости клеток НЕК293, трансдуцированных препаратом rAAV2-EGFP (отрицательный контроль);
rAAV5-EGFP – образец культуральной жидкости клеток НЕК293, трансдуцированных препаратом rAAV5-EGFP (отрицательный контроль).
На фиг. 9 изучение специфической активности рекомбинантных антител Tetra1 и Tetra2, экспрессируемых в составе препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2, в отношении RBD S белка вируса SARS-CoV-2.
Ось ординат – уровень специфического сигнала ОД450нм;
Ось абсцисс – название образцов культуральной жидкости.
rAAV5-Tetra1 – образец культуральной жидкости клеток НЕК293, трансдуцированных препаратом rAAV5-Tetra1;
rAAV5-Tetra2 – образец культуральной жидкости клеток НЕК293, трансдуцированных препаратом rAAV5-Tetra2;
rAAV2-Tetra1 – образец культуральной жидкости клеток НЕК293, трансдуцированных препаратом rAAV2-Tetra1;
rAAV2-EGFP – образец культуральной жидкости клеток НЕК293, трансдуцированных препаратом rAAV2-EGFP (отрицательный контроль);
rAAV5-EGFP – образец культуральной жидкости клеток НЕК293, трансдуцированных препаратом rAAV5-EGFP (отрицательный контроль).
Осуществление изобретения
Для осуществления настоящего изобретения на первом этапе получали плазмидные системы необходимые для сборки рекомбинантных аденоассоциированных вирусных векторов. Для этого, были использованы следующие плазмидные конструкции:
pHELP, несущая гены аденовируса человека 5-ого серотипа, необходимые для репликации рекомбинантного аденоассоциированного вируса;
pREP/CAP2, несущая гены REP и CAP, аденоассоциированного вируса человека 2-го серотипа;
pREP/CAP5, несущая гены REP и CAP, аденоассоциированного вируса человека 5-го серотипа;
pAAV-Tetra1, несущая инвертированные концевые повторы (ITR) аденоассоциированного вируса человека 2-го серотипа и генетическую конструкцию, экспрессирующую рекомбинантное антитело Tetra1;
pAAV-Tetra2, несущая инвертированные концевые повторы (ITR) аденоассоциированного вируса человека 2-го серотипа и генетическую конструкцию, экспрессирующую рекомбинантное антитело Tetra2;
Специалистам в данной области известно, что для получения рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора можно использовать любые другие плазмидные системы. Таким образом, любые плазмидные системы могут быть использованы для получения рекомбинантного аденоаcсоциированного вирусного вектора, несущего генетическую конструкцию, экспрессирующую ген рекомбинантного антитела Tetra1 и рекомбинантного антитела Tetra2.
Рекомбинантное антитело Tetra1 представляет собой тетрамеризованные глицин-сериновыми линкерами однодоменные антитела, слитые с Fc-фрагментом IgG1 человека, где первое однодоменное антитело P2C5 имеет CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, второе однодоменное антитело P1C6 имеет CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, третье однодоменное антитело 92 имеет CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9, и четвертое однодоменное антитело 23 имеет CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:10, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12, соответственно. Схематичное изображение рекомбинантного антитела Tetra1 представлено на фиг. 1.
Рекомбинантное антитело Tetra2 представляет собой тетрамеризованные глицин-сериновыми линкерами однодоменные антитела, слитые с Fc-фрагментом IgG1 человека, где первое однодоменное антитело 92 имеет CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9, второе однодоменное антитело 12 имеет CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:10, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12, третье однодоменное антитело P2C5 имеет CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, и четвертое однодоменное антитело P1C6 имеет CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, соответственно. Схематичное изображение рекомбинантного антитела Tetra2 представлено на фиг. 2.
Также, специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения последовательность рекомбинантного антитела , имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, либо имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, либо имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9, либо имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:10, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12, может содержать в себе аминокислотные замены, которые не сказываются на вторичной и третичной структуре рекомбинантного антитела и не влияют на его способность связывать и нейтрализовать вирус гриппа А и вирус SARS-CoV-2. Более того, поскольку в связывании с антигеном участвуют только антигенсвязывающие петли (CDR домены) однодоменных антител, то, как известно специалистам в данной области, любой иммуноглобулин или его аналог, содержащий такие же аминокислотные последовательности CDR доменов, попадает под объем настоящего изобретения. Более того, последовательности CDR доменов могут содержать замены/делеции/вставки аминокислот, которые при парном выравнивании аминокислотных последовательностей обеспечивают гомологичность не менее 70% и не оказывают качественного влияния на способность связываться с антигеном. Таким образом, любые плазмидные системы могут быть использованы для получения рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательности CDR доменов, гомология которых составляет не менее 70% с предлагаемыми последовательностями.
Кроме того, специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая рекомбинантное антитело, может отличаться, основываясь на принципе вырожденности генетического кода. Таким образом, любые плазмидные системы могут быть использованы для получения рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора, содержащие последовательности нуклеотидов, кодирующие аминокислотную последовательность рекомбинантного антитела, имеющего CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, либо имеющего CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, либо имеющего CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9, либо имеющего CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:10, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12.
Все плазмидные конструкции получали в препаративных количествах путем трансформации клеток E. coli штамма Dh5α. После трансформации компетентных бактерий E.coli и их лизиса выделение суперскрученной ДНК проводили на наборе PlasmidSelect Xtra Starter Kit согласно инструкции производителя. После хроматографической очистки плазмидные ДНК переосаживали изопропиловым спиртом для избавления от ЭДТА и других составляющих буфера, способных к ингибированию процесса трансфекции.
Далее для получения рекомбинантных аденоассоциированных вирусов серотипа 2 rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2, экспрессирующих рекомбинантные антитела соответственно вирусов Tetra1 и Tetra2, специфично связывающие гемагглютинин вируса гриппа А и RBD S белка вируса SARS-CoV-2, полученными плазмидами трансфецировали клеточную линию НЕК293, в которой происходила продукция и сборка рекомбинантных аденоассоциированных вирусов, несущего гены рекомбинантных антител Tetra1 и Tetra2 соответственно. Таким образом, для получения препарата rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 использовали плазмиды pHELP, несущую гены аденовируса человека 5-ого серотипа, необходимые для репликации рекомбинантного аденоассоциированного вируса, pREP/CAP2, несущую гены REP и CAP, аденоассоциированного вируса человека 2-го серотипа, pAAV-Tetra1 и pAAV-Tetra2, несущие инвертированные концевые повторы (ITR) аденоассоциированного вируса человека 2-го серотипа и генетические конструкции, экспрессирующие рекомбинантные антитела Tetra1 и Tetra2, соответственно.
Для получения рекомбинантных аденоассоциированных вирусов серотипа 5 rAAV5-Tetra1 и rAAV5-Tetra2, экспрессирующих рекомбинантные антитела соответственно вирусов Tetra1 и Tetra2, специфично связывающие гемагглютинин вируса гриппа А и RBD S белка вируса SARS-CoV-2, полученными плазмидами трансфецировали клеточную линию НЕК293, в которой происходила продукция и сборка рекомбинантных аденоассоциированных вирусов, несущего гены рекомбинантных антител Tetra1 и Tetra2 соответственно. Таким образом, для получения препарата rAAV5-Tetra1 и rAAV5-Tetra2 использовали плазмиды pHELP, несущую гены аденовируса человека 5-ого серотипа, необходимые для репликации рекомбинантного аденоассоциированного вируса, pREP/CAP5, несущую ген REP аденоассоциированного вируса человека 2-го серотипа и ген CAP аденоассоциированного вируса человека 5-го серотипа, pAAV-Tetra1 и pAAV-Tetra2, несущие инвертированные концевые повторы (ITR) аденоассоциированного вируса человека 2-го серотипа и генетические конструкции, экспрессирующие рекомбинантные антитела Tetra1 и Tetra2, соответственно.
Клетки НЕК293 культивировали в суспензионных условиях в биореакторе BIOSTAT RM 20/50 (Sartorius stedim biotech, Германия) с использованием BIOSTAT CultiBag RM (Sartorius stedim biotech, Германия) с использованием питательной среды BalanCD HEK293 (FujiFilm Irvine scientific, Нидерланды). Трансфекцию клеток указанными плазмидами осуществляли при помощи реагента PEI 25kDa (Polyscience, США).
Первичную очистку препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 осуществляли при помощи тангенцальной фильтрации с использованием системы AKTA Flux S и картриджа Hollow fiber 300 kDa (Cytiva, США) и аффинной хроматографии с использованием системы AKTA PURE 25 (Cytiva, США) и колонки, упакованной сорбентом AVB sepharose (Cytiva, США). Обогащение препаратов полными капсидами осуществляли при помощи системы AKTA PURE 25 (Cytiva, США) и монолитной колонки CIMmultusQA.
Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения для продукции и сборки рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора можно использовать другие системы экспрессии. При необходимости способ получения дополнительно включает в себя выделение и очистку любым способом, известным в данной области.
Далее, были изучены количественные и качественные характеристики препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2, была изучена трансдуцирующая активность, чистота, подлинность, количество геномных копий и продукция рекомбинантных антител Tetra1 и Tetra2 в составе полученных препаратов.
При изучении полученных препаратов rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 in vivo, была оценена экспрессия рекомбинантных антител Tetra1 и Tetra2 в сыворотке крови мышей, получивших препараты rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 соответственно.
Была подобрана эффективная доза препаратов rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2, обеспечивающая 100 %-ную защиту от заболеваний, вызванных вирусом SARS-CoV-2 (варианты В.1.1.1 и Омикрон ВА.5) и 60 %.-ную защиту от заболевания, вызванного вирусом гриппа А подтипа H1N1.
Кроме того, разработан способ профилактики заболеваний, вызванных вирусом SARS-CoV-2 и вирусом гриппа А, заключающийся во введении млекопитающим в эффективной дозе препарата rAAV2-Tetra1.
Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Получение плазмидных конструкций
Плазмиды pHELP, pREP/CAP2, pREP/CAP5, pAAV-Tetra1, pAAV-Tetra2 наращивали в клетках E.coli. Для этого бактерии трансформировали целевыми плазмидами методом теплового шока. Компетентные клетки получали по стандартным протоколам. При проведении трансформации к компетентным клеткам штамма Dh5α добавляли 5-10 нг целевой плазмидной ДНК, инкубировали на льду 30 минут. После инкубации пробирку с клетками помещали в водяную баню при температуре 42 °C на 45 секунд. Затем инкубировали на льду в течение 10 минут, добавляли 1 мл среды SOB и инкубировали при 37 °C в течение 1 часа на шейкер-инкубаторе. Впоследствии с помощью селективных антибиотиков их помещали в чашки Петри на твердую среду и инкубировали при 37 °С в течении ночи. После 16 часов инкубации отобранные колонии высевали в колбы с 100 мл среды LB и инкубировали в шейкер-инкубаторе при 210 об/мин 16-18 часов при 37 °С.
Целевые плазмидные ДНК полученные из бактерий Е.coli штаммов DH5α выделяли с помощью 3-стадийной хроматографической очистки при помощи набора Plasmid select Xtra starter kit (Cytiva, США) и хроматографа AKTA pure 25 (Cytiva, США) или при помощи коммерческого набора PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, США). Выделение выполняли согласно протоколу производителей. Результат оценивали с помощью горизонтального электрофореза в агарозном геле (0,8%). Визуализировали результаты с помощью системы гель-документирования Gel Doc EZ (Bio-Rad). Схематичные изображения плазмид представлены на фиг. 3.
Таким образом, в данном примере была получена система плазмидных векторов (pHELP, pREP/CAP2, pREP/CAP5, pAAV-Tetra1, pAAV-Tetra2), необходимая для продукции рекомбинантных аденоассоциированных вирусов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2.
Пример 2. Подтверждение экспрессии рекомбинантных антител Tetra1 и Tetra2 в составе полученных плазмид pAAV-Tetra1 и pAAV-Tetra2
Для подтверждения экспрессии рекомбинантных антител Tetra1 и Tetra2 в составе полученных плазмид pAAV-Tetra1 и pAAV-Tetra2, проводили трансфекцию клеток СНО. Для этого клетки СНО рассевали в 12-луночный планшет в концентрации 1 млн клеток в лунку в 2 мл питательной среды BalanCD Tranfectory CHO (FujiFilm, Нидерланды). На следующий день проводили трансфекцию клеток плазмидами pAAV-Tetra1 и pAAV-Tetra2. Трансфекционную смесь готовили на среде OptiMEM (HyClone, США). В качестве трансфецирующего агента использовали PEI (Polyscience, США). ДНК использовали в количестве 1 мкг/мл культуральной жидкости. Через 7 дней после трансфекции, культуральную жидкость анализировали в иммуноблоте с использованием анти-человеческих антител, меченных HRP - 933NA (Cytiva, США). Культуральную жидкость подвергали электрофорезу в ПААГ в восстанавливающих условиях, затем осуществляли перенос на цитроцеллюлозную мембрану 0,45 мкм (Bio-Rad, США). Далее мембрану блокировали раствором 5% сухого молока на ФСБ-Т и далее добавляли антитела 933NA 1 на 5000 на 1 час при комнатной температуре. Далее проводили 5-ти кратную отмывку и люминесцирующего субстрата. После, результаты детектировали прибором Amersham Imager 600 (Cytiva, США). В результате (фиг.4) в образцах культуральной жидкости (треки 2 и 3) были детектированы бэнды, соответствующие по молекулярной массе рекомбинантным антителам Tetra1 и Tetra2 в восстанавливающих условиях (около 80 кДа). В отрицательном контроле (трек 1), специфических полос детектировано не было.
Таким образом, в примере 2 была подтверждена экспрессия рекомбинантных антител Tetra1 и Tetra2 в составе плазмид pAAV-Tetra1 и pAAV-Tetra2 соответственно.
Пример 3. Продукция и очистка препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2
Для получения препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2, полученные в примере 1 плазмиды трансфецировали в культуру клеток линии HEK293. Для этого суспензионную культуру клеток HEK293 культивировали в среде BalanCD HEK293 (Fujifilm Irvine Scientifics, Нидерланды) приготовленной согласно инструкции производителя. Для культивации использовали колбы Эрленмейера с вентилируемой крышкой объемами 125, 500 и 1000 мл (Corning) с помощью шейкер-инкубатора Multitron (Infors HT) со скоростью перемешивания 110 об/мин при амплитуде 50 мм. В условиях культивирования использовали 37 °С, 80% влажности и 5% CO2. Пассажи проводили при достижении концентрации клеток 2-3*106 кл/мл. Далее клеточную суспензию засевали в одноразовый культуральный мешок BIOSTAT CultiBag RM и культивировали до достижения объема культуральной жидкости 9 л и концентрации 0,7-1,0*106 клеток на мл. Далее проводили трансфекцию с использованием трансфецирующего агента PEI linear 25 kDa (Polyscience). Конечная концентрация ДНК, используемая для трансфекции, составляла 1 мкг/мл культуральной среды. В качестве среды для трансфекции использовали Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium (Gibco™, Thermo Fisher Scientific) в объеме 10% от конечного клеточной суспензии. Трансфецирующий агент использовали в концентрации 1 мг/мл. Объем PEI к ДНК брали в соотношении 4:1. Процентное содержание плазмидных ДНК составляло pHELP – 50%, pREP/CAP2 или pREP/CAP5 – 25%, pAAV-Tetra1 или pAAV-Tetra2 – 25% соответственно. Полученную смесь инкубировали при комнатной температуре 5-10 минут для образования транфецирующего комплекса. После, смесь вносили в одноразовый биореактор. После трансфекции клетки культивировали в течение 3 суток со скоростью качания 12-20 в минуту, сатурации 40-70%, рН=7-7,4. Скорость потока воздуха от 0,2 до 0,5 л/мин и содержание СО2 в воздушной смеси 5%.
Таким образом, в результате проделанной работы была получена клеточная суспензия содержащая рекомбинантные аденоассоциированные вирусные частицы rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 соответственно, содержащие гены рекомбинантных антител, Tetra1 и Tetra2.
Пример 4. Очистка препарата rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2
По истечении 3 дней культивирования проводили лизис клеточной суспензии добавлением в биореактор 1% твин-20, трис-HCl до 20 мМ, хлорида натрия до 50 мМ, хлорида магния до 2 мМ, бензонуклеаза (Merck) 20U на мл культуральной жидкости. Лизис проводили при комнатной температуре в течении 4 часов при скорости качания 12 в минуту. После лизиса проводили осветление культуральной жидкости при помощи фильтрации через глубинные фильтры Sartoclear depth filter cassette 0,08 кв. м. 0,8/0,2 мкм (Sartorius Stedim Biotech, Германия).
Далее осветленный лизат подвергали концентрированию и диафильтрации буфером 20 мМ трис, 150 мМ натрия хлорид, 2 мМ магния хлорид, 0,001 % полоксомер 188, рН=8. Концентрирование и диафильтрацию проводили на установке AKTA flux S с использованием кассеты Hollow fiber 300 кДа, 4800 см. кв. в соотношении 50/5.
Дальнейшую чистку rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 проводили с использованием сорбента AVB Sepharose (Cytiva Life Sciences, Швеция) согласно инструкции производителя. Пример электрофореграммы очищенных препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 представлен на фиг. 2. Полученный препарат концентрировали с использованием центрифужных концентраторов 50 кДа Amicon Ultra-15 (Merck, Германия) до объема 1-2 мл. Обогащение препаратов полными капсидами проводили при помощи анионообменной хроматографии с использованием монолитной колонки CIMmultusQA 1 мл. Образец после аффинной хроматографии разбавляли в 20 раз буфером 20 мМ Бис-трис пропан, 10 мМ магния хлорид, 0,001 % полоксомер 188, рН=9. Отделение пустых и полных капсидов осуществляли при помощи линейного градиента (50 колоночных объемов) буфера 20 мМ Бис-трис пропан, 10 мМ магния хлорид, 250 мМ хлорид натрия, 0,001 % полоксомер 188, рН=9. Количество полных и пустых капсидов в полученных препаратах оценивали при помощи трансмиссионной электронной микроскопии. Результаты трансмиссионной электронной микроскопии образцов анионообменной хроматографии представлены на фиг. 3 и 4. Далее фракции с высоким содержанием полных капсидов стерилизовали мембранным фильтром 0,22 мкм (MF-Millipore) и использовали в дальнейшей работе. Концентрацию вирусных частиц (препарата) оценивали с помощью спектрофотометра NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, USA) при длине волны 260 нм. Препарат замораживали и хранили при -70°С. Для определения титра геномных копий в полученных препаратах использовали набор AAVpro® Titration Kit (for Real Time PCR) Ver.2 согласно инструкции производителя.
Таким образом, в данном примере были получены очищенные препараты rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 в количестве достаточном для проведения экспериментов in vivo и iv vitro.
Пример 4. Изучение чистоты и подлинности препараты rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2
Для оценки чистоты и подлинности, полученных препаратов препараты rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2, применяли метод электрофореза в ПААГ. Для этого очищенный препарат вносили в 4-20% полиакриламидном геле (4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 μl #4561096, Bio-Rad) с использованием красителя для образцов 4x Laemmli Sample Buffer (#161-0747, BioRad) с добавлением 2-Mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) для анализа в восстанавливающих условиях. Визуализацию геля проводили при помощи прибора Gel Doc EZ imager (Bio-Rad, США). В результате в препаратах препараты rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 были детектированы белки VP1, VP2 и VP3, значимого количества примесей детектировано не было. Электрофореграмма результатов анализа представлена на фиг. 5.
Из полученных результатов следует, что полученный препарат действительно является аденоассоциированным вирусом, так в нем присутствуют все структурные белки, а именно VP1, VP2, VP3. Молекулярные массы белков полностью совпадают с теоретическими.
Кроме того, при анализе препаратов методом трансмиссионной электронной микроскопии (фиг. 6 и 7) показано, что в образцах присутствуют частицы размером около 22 нм формы икосаэдра, что соответствует теоретическим размерам и форме аденоассоциированного вируса. На фиг. 6 представлена фотография электронной микроскопия фракции, содержащей преимущественно полные капсиды, а на фиг. 7 представлена фотография электронной микроскопия фракции, содержащей преимущественно пустые капсиды, отличающиеся от полных наличием затемнения в центре.
Таким образом, в данном примере была подтверждена чистота и подлинность препаратов препараты rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2.
Пример 5. Оценка трансдуцирующей способности rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 и экспрессии рекомбинантных антител Tetra1 и Tetra2 в составе препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2
Для оценки трансдуцирующей способности и экспрессии трансгена (рекомбинантных антител Tetra1 и Tetra2) антител в составе препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2, очищенным препаратом трансдуцировали культуру клеток HEK293. Для этого на 96-луночный планшет высевали клетки в среде DMEM (4 мМ глутамина, 10% FBS, бикарбонат натрия 3,8 г/л) в объеме 100 мкл с концентрацией 0,5*106 клеток/мл. Спустя 4 часа вносили от 5 до 10 мкл препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 (по 107 гк/лунка). Спустя 72 часа отбирали культуральную жидкость для дальнейшего анализа. Присутствие рекомбинантных антител Tetra1 и Tetra2 соответственно, оценивали при помощи метода ИФА. Для этого в лунки 96-луночного планшета сорбировали рекомбинантный RBD вируса SARS-CoV-2 (100 нг/лунку) или рекомбинантным стеблевым доменом гемагглютинина вируса гриппа А (100 нг/лунку). Затем, планшет отмывали 3-х кратно раствором PBS-T и далее инкубировали 30 мин при комнатной температуре с раствором обезжиренного молока на PBS-T. Далее вносили культуральную жидкость от клеток, трансдуцированных полученными препаратами, в нескольких повторах. Планшет с образцами инкубировали в течении 30 мин при 37 °С и далее проводили 3-кратную отмывку. После добавляли раствор вторичных антител 933 NA (GE life science, США). Планшет с образцами снова инкубировали в течении 30 мин при 37 °С и далее проводили 5-кратную отмывку. Далее добавляли субстрат ТМВ на 15 мин, после чего реакцию останавливали добавлением раствора 1М соляной кислоты. Оптическую плотность измеряли при 450 нм. Результаты представлены на фиг.8 и 9.
Из полученных результатов следует, что клетки, трансдуцированные препаратами rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2, экспрессируют рекомбинантные антитела Tetra1 и Tetra2, соответственно, специфичные к RBD S белка вируса SARS-CoV-2 (фиг. 9) и гемагглютинину вируса гриппа А (фиг. 8).
Таким образом, в данном примере была подтверждена экспрессия рекомбинантных антител, специфичных к RBD S белка вируса SARS-CoV-2 и гемагглютинину вируса гриппа А, в составе препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2.
Пример 6. Изучение протективной активности препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 против летальной дозы вируса SARS-CoV-2
Протективную активность препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 оценивали на модели инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2, у АСЕ2-трансгенных мышей. Данные животные были выбраны, так как они высоко чувствительны к инфекции SARS-CoV-2. Летальность животных после заражения вирусом SARS-CoV-2 составляет 100%.
В работе использовали вирус SARS-CoV-2 вариант В.1.1.1 (hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL-1/2020), изолированный в 2020 году в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, хранящийся в Государственной коллекции вирусов. Инфекционный титр вируса 107 TCID50/мл и 3,5х107 БОЕ/мл. Животным вводили внутримышечно в заднюю поверхность бедра 1011 гк препарата и далее заражали вирусом SARS-CoV-2 интраназально в дозе 105 TCID50 на животное, через 7 дней после введения препарата, согласно табл.1.
Табл. 1. Результаты изучения протективной активности препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 против летальной дозы вируса вирус SARS-CoV-2
| Препарат | Доза препарата | Путь введения | Время введения | Инфицирование интраназально в дозе 105TCID50 | Оценка эффективности (%, выживаемсоти) |
| rAAV5-Tetra1 | 1011 гк/мышь | в/м | За 7 дней до заражения | 5 шт. | 80 |
| rAAV5-Tetra2 | 1011 гк/мышь | в/м | За 7 дней до заражения | 5 шт. | 60 |
| rAAV2-Tetra1 | 1011 гк/мышь | в/м | За 7 дней до заражения | 5 шт. | 100 |
| rAAV2-Tetra2 | 1011 гк/мышь | в/м | За 7 дней до заражения | 5 шт. | 80 |
| Плацебо | - | в/м | За 7 дней до заражения | 5 шт. | 0 |
В течение 21 дня после заражения оценивали выживаемость животных.
Полная гибель зараженных животных, получивших плацебо, наблюдалась к 5 суткам после инфицирования. Выживаемость в группах животных, получивших rAAV5-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 составила 80%, в группе животных, получивших rAAV5-Tetra2 составила 60% и, наконец, в группе животных, получивших rAAV2-Tetra1, составила 100%.
Таким образом, в данном примере было продемонстрировано, что разработанные препараты препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 могут быть использованы для защиты от заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2. Наибольшей протективной активностью в отношении вируса SARS-CoV-2 В.1.1.1 (hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL-1/2020) обладает препарат rAAV2-Tetra1.
Пример 7. Изучение протективной активности препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 против летальной дозы вируса гриппа А
Протективную активность препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 оценивали на модели инфекции, вызванной вирусом гриппа А, у мышей линии BALB/c статуса СПФ (свободны от патогенной микрофлоры), полученные из питомника «Андреевка» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России.
В работе использовали вирус гриппа A/California/04/2009 (H1N1), адаптированный для мышей, полученный в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, хранящийся в Государственной коллекции вирусов. Животным вводили внутримышечно в заднюю поверхность бедра 1011 гк препарата и далее заражали вирусом гриппа А интраназально в дозе 5ЛД50 на животное, через 7 дней после введения препарата, согласно табл.2.
Табл. 2. Результаты изучения протективной активности препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 против летальной дозы вируса гриппа А
| Препарат | Доза препарата | Путь введения | Время введения | Инфицирование интраназально в дозе 5ЛД50 | Оценка эффективности (%, выживаемсоти) |
| rAAV5-Tetra1 | 1011 гк/мышь | в/м | За 7 дней до заражения | 10 шт. | 40 |
| rAAV5-Tetra2 | 1011 гк/мышь | в/м | За 7 дней до заражения | 10 шт. | 50 |
| rAAV2-Tetra1 | 1011 гк/мышь | в/м | За 7 дней до заражения | 10 шт. | 60 |
| rAAV2-Tetra2 | 1011 гк/мышь | в/м | За 7 дней до заражения | 10 шт. | 70 |
| Плацебо | - | в/м | За 7 дней до заражения | 10 шт. | 0 |
В течение 21 дня после заражения оценивали выживаемость животных.
Полная гибель зараженных животных, получивших плацебо, наблюдалась к 14 суткам после инфицирования. Выживаемость в группе животных, получивших rAAV5-Tetra1, составила 40%, в группе животных, получивших rAAV2-Tetra2, составила 50%, в группе животных, получивших rAAV5-Tetra1 составила 60% и, наконец, в группе животных, получивших rAAV2-Tetra2, составила 70%.
Таким образом, в данном примере было продемонстрировано, что разработанные препараты препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 могут быть использованы для защиты от заболевания, вызванного вирусом гриппа А. Наибольшей протективной активностью в отношении вируса гриппа A/California/04/2009 (H1N1) обладает препарат rAAV2-Tetra2.
Пример 8. Cпособ профилактики заболеваний, вызванных различными вариантами вируса SARS-CoV-2
Для дальнейшего изучения протективной активности был выбран препарат rAAV2-Tetra1 как наиболее перспективный. Эффективность препарата rAAV2-Tetra1 против COVID-19 в режиме профилактики оценивали также на модели инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2 варианта В.1.1.1 (hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL-1/2020), а также варианта ВА.5 (hCoV-19/Russia/SPE-RII-25357S/2022), у АСЕ2-трансгенных мышей. Животных заражали вирусом SARS-CoV-2 интраназально в дозе 105 TCID50 на животное, через 6 месяцев после введения препарата rAAV2-Tetra1 в дозе 1011 гк/мышь. Результаты эксперимента представлены в табл. 3.
Табл. 3. Результаты экспериментального изучения эффективности препарата rAAV2-Tetra1 в режиме профилактики
| Препарат | Доза препарата | Путь введения | Время введения | Инфицирование интраназально в дозе 105TCID50 | Оценка эффективности (% выживаемости ) | |
| rAAV2-Tetra1 | 1011 гк/мышь | в/м | За 6 месяцев до заражения | варианта В.1.1.1 | 5 шт. | 100 |
| rAAV2-Tetra1 | 1011 гк/мышь | в/м | За 6 месяцев до заражения | варианта ВА.5 | 5 шт. | 100 |
| Плацебо | - | в/м | За 6 месяцев до заражения | варианта В.1.1.1 | 5 шт. | 0 |
| Плацебо | - | в/м | За 6 месяцев до заражения | варианта ВА.5 | 5 шт. | 40 |
В течение 21 дня после заражения оценивали выживаемость животных.
По результатам исследования было показано, что однократное внутримышечное введение препарата rAAV2-Tetra1 в дозе от 1011 гк/животное позволяет защитить животных от инфекции, вызванной различными штаммами (вариантами) вируса SARS-CoV-2, в режиме профилактики как минимум в течение 6 месяцев.
Таким образом, можно сделать вывод, что разработанные препараты rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 могут быть использованы для экстренной профилактики заболеваний, вызванных вирусом SARS-CoV-2.
Пример 9. Cпособ профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа А
Эффективность препарата rAAV2-Tetra1 против вируса гриппа А в режиме профилактики оценивали на модели инфекции мышей линии BALB/c вирусом гриппа A/California/04/2009 (H1N1) адаптированным для мышей. Животных заражали вирусом гриппа А интраназально в дозе 5ЛД50 на животное, через 6 месяцев после введения препарата rAAV2-Tetra1 в дозе 1011 гк/мышь. Результаты эксперимента представлены в табл. 4.
Табл. 4. Результаты экспериментального изучения эффективности препарата rAAV2-Tetra1 в режиме профилактики
| Препарат | Доза препарата | Путь введения | Время введения | Инфицирование интраназально в дозе 5ЛД50 | Оценка эффективности (% выживаемости ) |
| rAAV2-Tetra1 | 1011 гк/мышь | в/м | За 6 месяцев до заражения | 10 шт. | 100 |
| Плацебо | - | в/м | За 6 месяцев до заражения | 10 шт. | 0 |
В течение 21 дня после заражения оценивали выживаемость животных.
По результатам исследования было показано, что однократное внутримышечное введение препарата rAAV2-Tetra1 в дозе от 1011 гк/животное позволяет защитить животных от инфекции, вызванной вирусом гриппа А подтипа H1N1, в режиме профилактики как минимум в течении 6 месяцев.
Таким образом, можно сделать вывод, что разработанные препараты rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 могут быть использованы для профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа А.
Промышленная применимость
Все приведенные примеры подтверждают эффективность и промышленную применимость созданных векторов на основе аденоассоциированного вируса человека 2-ого и 5-ого серотипов, экспрессирующих рекомбинантные антитела и обладающих защитными свойствами против инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2, а также инфекции, вызванной вирусом гриппа А.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="rAAV-Tetra.xml"
softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"
productionDate="2023-10-26">
<ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное Государственное
Бюджетное Учреждение «Национальный исследовательский центр
эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи»
Министерства здравоохранения Российской Федерации</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Federal State Budget Institution, National
Research Center for Epidemiology and Microbiology Named after
Honorary Academician N.F. Gamaleya of the Ministry of Health of the
Russian Federation</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Экспрессионный вектор на основе
аденоассоциированного вируса, несущий гены рекомбинантных антител, и
его применение для профилактики заболеваний, вызываемых вирусом
гриппа А и вирусом SARS-CoV-2</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>14</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Lama sp.</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>GYTYCSYD</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Lama sp.</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>IIRRDGST</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>15</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..15</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Lama sp.</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>KSWACSSGEYLYQGD</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Lama sp.</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>GFLFRATD</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Lama sp.</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>AIDREGSH</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>10</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..10</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q12">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Lama sp.</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>GVGTYTGGSR</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>11</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..11</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q14">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Lama sp.</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>GYISNYRNLKR</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q16">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Lama sp.</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>VINSGGTS</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q18">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Lama sp.</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>AAGWVQPGRELNDSAYTY</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="10">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q20">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Lama sp.</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>GRIFRTYD</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="11">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q22">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Lama sp.</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>RISWSGGS</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="12">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q24">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Lama sp.</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>NADPSSVVGAIGAGYVY</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="13">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>2379</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..2379</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q26">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gaggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggt
ctctgagactctcctgtgtagcgtctggatacacctactgcagttacgacatgagttggtaccgccaggc
tccagggaaggagcgcgagttcgtttcaattattcgccgtgatggttctacggcgtacacagacgccgtg
aagggccgattcgccatctcccgagacaacgccaagaacacactgtatctgcaaatgaacagcctggaac
ctgaggacacggccatgtattactgtaaatcttgggcttgcagcagcggtgaatacttgtatcagggcga
ctggggccaggggacccaggtcaccgtctcctcaggtggtggcggatcaggtggaggtggatctggcggc
ggcggctcaggcggaggaggttcccaggtgcagctggtgcagtctgggggaggctcggtgcaggctggag
ggtctctgacactctcctgtaaagattctccttaccgcatctataaccgctacatggcgtggttccgcca
acttccaggacaggcgcgcgagggggttgcggcaatcgatagtcagggtaggacaacctacgcagactcc
gtgaaaggccggttcaccatctccaaagacaacgccgccaacactctaaatctgcaaatccacagcctga
aagttgaggacactgccatgtactactgtgcggcagatgttgtcttctaccaggaaccctatcctctcgc
accaacttcgtataagcattggggccaggggacccaggtcaccgtctcctcaggtggtggcggatcaggt
ggaggtggatctggcggcggcggctcaggcggaggaggttccgaggtgcagctggtggagtctgggggag
gctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgcgcagcctctggatacatatctaactatcgtaa
tctcaagcgcatggggtggttccgccaggctccagggaaggagcgcgagggggtcgcagttattaacagc
ggtggtactagtactagttattccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacgacaaga
acacgatttatctgcaaatgctcagcctgaaagctgaggacagtgcgatatactactgtgcggccggctg
ggtgcagccgggccgggaacttaacgatagtgcgtatacgtactggggccaggggacccaggtcaccgtc
tcctcaggtggtggcggatcaggtggaggtggatctggcggcggcggctcaggcggaggaggttccgagg
tgcagctggtggagtcggggggaggattggtgcaggctgggggctctctgagactctcctgtgcagcctc
tggacgcattttccgaacgtatgacatgggctggtaccgccaggctccagggaaggagcgtgagtttgtc
gcacgaattagttggagtggtggtagcacaaactatgcagacttcgtgaagggccggttcaccatctcca
aagacagcgccaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccatgtattt
ctgtaatgcagatccctccagcgtcgttggggcaatcggcgcgggatatgtctactggggccaggggacc
caggtcaccgtctcctcagaacctaagtcctgtgacaagacccacacctgtccaccttgtcctgctccag
agctgcttggaggtccaagcgtgttcctgtttcctcccaaacctaaggacaccctgatgatctccaggac
accagaagtgacctgtgtcgttgtggacgtctctcacgaggatcctgaggtgaagttcaactggtatgtg
gatggtgtggaggtccacaatgccaagaccaaacccagagaggaacagtacaacagcacctacagagtcg
tgagtgtgttgaccgtgctgcatcaagactggctgaatggcaaggaatataagtgcaaagtgagcaacaa
agcacttcctgctcccatcgagaagaccatctccaaagccaaaggacaacctagagaacctcaagtctac
accctgccaccctccagagaagagatgaccaaaaaccaagtgtctctgacctgtcttgtcaaaggcttct
atccctctgacattgctgtggagtgggagagcaatggacaacctgagaacaactataagaccacaccacc
tgtcctggacagtgatggctccttctttctgtatagtaagctgacagtggacaagagcaggtggcagcaa
ggcaatgtcttctcctgcagtgtgatgcatgaagccttgcacaaccactacacccagaagagcctgtctt
tgtctcctggcaagtgataa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="14">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>2379</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..2379</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q28">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gaggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggt
ctctgagactctcctgcgcagcctctggatacatatctaactatcgtaatctcaagcgcatggggtggtt
ccgccaggctccagggaaggagcgcgagggggtcgcagttattaacagcggtggtactagtactagttat
tccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacgacaagaacacgatttatctgcaaatgc
tcagcctgaaagctgaggacagtgcgatatactactgtgcggccggctgggtgcagccgggccgggaact
taacgatagtgcgtatacgtactggggccaggggacccaggtcactgtctcctcaggtggtggcggatca
ggtggaggtggatctggcggcggcggctcaggcggaggaggttccgaggtgcagctggtggagtcggggg
gaggattggtgcaggctgggggctctctgagactctcctgtgcagcctctggacgcattttccgaacgta
tgacatgggctggtaccgccaggctccagggaaggagcgtgagtttgtcgcacgaattagttggagtggt
ggtagcacaaactatgcagacttcgtgaagggccggttcaccatctccaaagacagcgccaagaacacgg
tgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccatgtatttctgtaatgcagatccctccag
cgtcgttggggcaatcggcgcgggatatgtctactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctcaggt
ggtggcggatcaggtggaggtggatctggcggcggcggctcaggcggaggaggttccgaggtgcagctgg
tggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgtagcgtctggatacac
ctactgcagttacgacatgagttggtaccgccaggctccagggaaggagcgcgagttcgtttcaattatt
cgccgtgatggttctacggcgtacacagacgccgtgaagggccgattcgccatctcccgagacaacgcca
agaacacactgtatctgcaaatgaacagcctggaacctgaggacacggccatgtattactgtaaatcttg
ggcttgcagcagcggtgaatacttgtatcagggcgactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca
ggtggtggcggatcaggtggaggtggatctggcggcggcggctcaggcggaggaggttcccaggtgcagc
tggtgcagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgacactctcctgtaaagattctcctta
ccgcatctataaccgctacatggcgtggttccgccaacttccaggacaggcgcgcgagggggttgcggca
atcgatagtcagggtaggacaacctacgcagactccgtgaaaggccggttcaccatctccaaagacaacg
ccgccaacactctaaatctgcaaatccacagcctgaaagttgaggacactgccatgtactactgtgcggc
agatgttgtcttctaccaggaaccctatcctctcgcaccaacttcgtataagcattggggccaggggacc
caggtcaccgtctcctcagaacctaagtcctgtgacaagacccacacctgtccaccttgtcctgctccag
agctgcttggaggtccaagcgtgttcctgtttcctcccaaacctaaggacaccctgatgatctccaggac
accagaagtgacctgtgtcgttgtggacgtctctcacgaggatcctgaggtgaagttcaactggtatgtg
gatggtgtggaggtccacaatgccaagaccaaacccagagaggaacagtacaacagcacctacagagtcg
tgagtgtgttgaccgtgctgcatcaagactggctgaatggcaaggaatataagtgcaaagtgagcaacaa
agcacttcctgctcccatcgagaagaccatctccaaagccaaaggacaacctagagaacctcaagtctac
accctgccaccctccagagaagagatgaccaaaaaccaagtgtctctgacctgtcttgtcaaaggcttct
atccctctgacattgctgtggagtgggagagcaatggacaacctgagaacaactataagaccacaccacc
tgtcctggacagtgatggctccttctttctgtatagtaagctgacagtggacaagagcaggtggcagcaa
ggcaatgtcttctcctgcagtgtgatgcatgaagccttgcacaaccactacacccagaagagcctgtctt
tgtctcctggcaagtgataa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (14)
1. Экспрессионный вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса, несущий ген рекомбинантного антитела, представляющего собой тетрамеризованные глицин-сериновыми линкерами однодоменные антитела, слитые с Fc-фрагментом IgG1 человека, где одно однодоменное антитело, имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, другое однодоменное антитело, имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6, другое однодоменное антитело, имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9, и другое однодоменное антитело, имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12.
2. Экспрессионный вектор по п. 1, отличающийся тем, что представляет собой:
(а) рекомбинантный аденоассоциированный вирус 2-го серотипа или (б) рекомбинантный аденоассоциированный вирус 5-го серотипа.
3. Экспрессионный вектор по п. 1, отличающийся тем, что содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 13 или нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14, кодирующие рекомбинантные антитела, представляющие собой тетрамеризованные глицин-сериновыми линкерами однодоменные антитела, слитые с Fc-фрагментом иммуноглобулина G1 человека.
4. Экспрессионный вектор по п. 1, отличающийся тем, что экспрессируемое в его составе рекомбинантное антитело специфично связывает гемагглютинин вируса гриппа А.
5. Экспрессионный вектор по п. 1, отличающийся тем, что экспрессируемое в его составе рекомбинантное антитело специфично связывает рецептор-связывающий домен RBD S белка вируса SARS-CoV-2.
6. Экспрессионный вектор по п. 1, отличающийся тем, что его введение млекопитающим в эффективном количестве обеспечивает продолжительную экспрессию в организме рекомбинантного антитела, специфичного гемагглютинину вируса гриппа А и рецептор-связывающему домену RBD S белка вируса SARS-CoV-2.
7. Экспрессионный вектор по пп. 4-6, отличающийся тем, что его введение млекопитающим в эффективном количестве обеспечивает длительную защиту от заболеваний, вызываемых вирусом гриппа А и вирусом SARS-CoV-2.
8. Применение экспрессионного вектора по пп. 1-7 для профилактики заболеваний, вызываемых вирусом гриппа А и вирусом SARS-CoV-2.
9. Иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызываемых вирусом гриппа А и вирусом SARS-CoV-2, содержащее экспрессионный вектор по пп. 1-7.
10. Иммунобиологическое средство по п. 9, отличающееся тем, что содержит экспрессионный вектор rAAV2-Tetra1, представляющий собой рекомбинантный аденоассоциированный вирус 2-го серотипа и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 13.
11. Иммунобиологическое средство по п. 9, отличающееся тем, что содержит экспрессионный вектор rAAV2-Tetra2, представляющий собой рекомбинантный аденоассоциированный вирус 2-го серотипа и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14.
12. Иммунобиологическое средство по п. 9, отличающееся тем, что содержит экспрессионный вектор rAAV5-Tetra1, представляющий собой рекомбинантный аденоассоциированный вирус 5-го серотипа и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 13.
13. Иммунобиологическое средство по п. 9, отличающееся тем, что содержит экспрессионный вектор rAAV5-Tetra2, представляющий собой рекомбинантный аденоассоциированный вирус 5-го серотипа и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2817792C1 true RU2817792C1 (ru) | 2024-04-22 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2731356C9 (ru) * | 2020-08-22 | 2021-10-05 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Экспрессионный вектор для создания иммунобиологического средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты) |
| RU2765729C1 (ru) * | 2021-12-29 | 2022-02-02 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа против SARS-CoV-2 и способ его применения (варианты) |
| US11312760B1 (en) * | 2021-01-19 | 2022-04-26 | Newsoara Biopharma Co., Ltd. | Expression vector for anti-SARS-CoV-2 neutralizing antibodies |
| EP4105228A1 (en) * | 2020-05-11 | 2022-12-21 | Hengda Biomedical Technology Co., Ltd. | Sars-cov-2 antigen polypeptide, recombinant adeno-associated virus thereof, and application in preparation of vaccine |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP4105228A1 (en) * | 2020-05-11 | 2022-12-21 | Hengda Biomedical Technology Co., Ltd. | Sars-cov-2 antigen polypeptide, recombinant adeno-associated virus thereof, and application in preparation of vaccine |
| RU2731356C9 (ru) * | 2020-08-22 | 2021-10-05 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Экспрессионный вектор для создания иммунобиологического средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты) |
| US11312760B1 (en) * | 2021-01-19 | 2022-04-26 | Newsoara Biopharma Co., Ltd. | Expression vector for anti-SARS-CoV-2 neutralizing antibodies |
| RU2765729C1 (ru) * | 2021-12-29 | 2022-02-02 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа против SARS-CoV-2 и способ его применения (варианты) |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11267847B2 (en) | Assembly activating protein (AAP) and its use for the manufacture of parvovirus particles essentially consisting of VP3 | |
| Nieto et al. | AAV vectors vaccines against infectious diseases | |
| EP2158488B1 (en) | Mutated parvovirus structural proteins as vaccines | |
| OA10741A (en) | Protection from viral infection via colonization of mucosal membranes with genetically modified bacteria | |
| WO2012145572A1 (en) | Regimens and compositions for aav-mediated passive immunization of airborne pathogens | |
| US20210346493A1 (en) | SARS-COV-2 Antigen Polypeptide, Recombinant Adeno-Associated Virus Expressing the Polypeptide, and Vaccine Containing the Virus | |
| JP2022533438A (ja) | 改変ウイルス粒子およびその使用 | |
| US20170119874A1 (en) | Human cytomegalovirus vaccine compositions and method of producing the same | |
| CN113913464B (zh) | 一种表达载体、重组腺相关病毒及其在制备2019新型冠状病毒疫苗中的应用 | |
| JP6608969B2 (ja) | パルボウイルスを大規模生産および精製するための方法 | |
| Robert et al. | Gene transfer of ZMapp antibodies mediated by recombinant adeno-associated virus protects against Ebola infections | |
| RU2817792C1 (ru) | Экспрессионный вектор на основе аденоассоциированного вируса, несущий гены рекомбинантных антител, и его применение для профилактики заболеваний, вызываемых вирусом гриппа А и вирусом SARS-CoV-2 | |
| Cheng et al. | Enhancing expression of the classical swine fever virus glycoprotein E2 in yeast and its application to a blocking ELISA | |
| Ljungberg et al. | DNA vaccination of ferrets with chimeric influenza A virus hemagglutinin (H3) genes | |
| US20220010335A1 (en) | Prokaryotic-eukaryotic hybrid viral vector for delivery of large cargos of genes and proteins into human cells | |
| US20230302120A1 (en) | Proteins, polynucleotides, and methods for treating coronavirus infection | |
| US20230365942A1 (en) | Engineered aav vectors | |
| CN114685627A (zh) | 一种预防呼吸道合胞病毒的rAAV载体疫苗 | |
| Esmagambetov et al. | rAAV expressing recombinant antibody for emergency prevention and long-term prophylaxis of COVID-19 | |
| RU2777404C1 (ru) | Экспрессионный вектор на основе аденоассоциированного вируса и способ его применения для экстренной профилактики и профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 (варианты) | |
| RU2467014C2 (ru) | Полиэпитопный белок, нуклеотидная последовательность, кодирующая полиэпитопный белок, плазмида с последовательностью, кодирующей полиэпитопный белок, и препарат полиэпитопного белка для индукции иммунного ответа против вируса ящура | |
| WO2013130393A1 (en) | Aav-directed persistent expression of an anti-nicotine antibody gene for smoking cessation | |
| RU2678175C1 (ru) | Рекомбинантный штамм вируса гриппа A/PR8/HK-NS80E85A, экспрессирующий фрагменты антигенов ESAT-6 и Ag85A M.tuberculosis, для получения векторной вакцины против туберкулеза | |
| Sanyal et al. | OPEN ACCESS EDITED BY | |
| ES2304813B1 (es) | Proteina de fusion con direccionamiento de antigenos vacunales a celulas presentadoras de antigeno y sus aplicaciones. |