RU2814990C2 - Применение паразитов и внеклеточных везикул, полученных из паразитов, для лечения злокачественной опухоли - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены применение паразитов Leishmania или внеклеточных везикул, полученных из паразитов Leishmania, для лечения неопластических заболеваний, которые относятся к злокачественным опухолям или физиологическим состояниям, описываемым неконтролируемым клеточным ростом, и фармацевтическая композиция, содержащая паразиты Leishmania или внеклеточные везикулы, полученные из паразитов Leishmania, и системы наноносителей. Изобретения обеспечивают расширение арсенала способов лечения злокачественной опухоли посредством переноса специфического лекарственного средства к клетке-мишени и повышения биодоступности лекарственного средства, не вызывая побочных эффектов на здоровые клетки. 2 н. и 22 з.п. ф-лы, 20 ил.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к применению паразитов и внеклеточных везикул, полученных из паразитов, для лечения злокачественной опухоли.

Уровень техники изобретения

Злокачественная опухоль является одним из наиболее опасных и распространенных заболеваний в настоящее время. Согласно оценке, в 2012 году в мире возникло 14,1 миллиона новых случаев злокачественной опухоли [1]. Хотя предпринимались попытки лечения злокачественной опухоли многими различными химическими и биологическими агентами, разработанные способы лечения являются недостаточными вследствие их низкой эффективности и высоких побочных эффектов. Например, химиотерапия является наиболее часто используемым способом лечения при многих типах злокачественной опухоли, таких как рак молочной железы, однако она вызывает серьезное повреждение многих здоровых тканей в организме, таких как костный мозг, волосы и пищеварительная система [2]. Недостаточность способов лечения вынудила ученых предпринимать попытки применения новых способов в области злокачественных опухолей. Среди этих испытаний экзосомы предвещают эффективные результаты.

Термин "неопластические заболевания", используемый в рамках настоящей заявки, относится к злокачественным опухолям или физиологическим условиям, характеризующимся неконтролируемым клеточным ростом, таким как рак. В этом контексте, термины "неопластическое заболевание" и "злокачественная опухоль" могут использоваться взаимозаменяемо. Примеры злокачественной опухоли включают, но не ограничиваются ими, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз.

- Карцинома, как используют в рамках изобретения, относится к типу злокачественной опухоли, которая состоит из эпителиальных клеток.

- Лимфома, как используют в рамках изобретения, относится к типу злокачественной опухоли, которая развивается из лимфоцитов.

- Бластома, как используют в рамках изобретения, относится к типу злокачественной опухоли, которая развивается из клеток-предшественников, также известных как бластные клетки.

- Саркома, как используют в рамках изобретения, относится к типу злокачественной опухоли, которая возникает из трансформированных клеток мезенхимального происхождения.

- Лейкоз, как используют в рамках изобретения, относится к типу злокачественной опухоли, которая начинается в костном мозге и приводит к высоким количествам аномальных лейкоцитов.

Более конкретные примеры типов злокачественных опухолей включают рак молочной железы, рак предстательной железы, рак ободочной и прямой кишки, рак кожи, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, мезотелиому, желудочно-кишечный рак, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак вульвы, рак шейки матки, карциному эндометрия, рак яичника, рак печени, гепатому, рак мочевого пузыря, рак почки, карциному слюнной железы, рак щитовидной железы и различные типы рака головы и шеи.

Часто для лечения злокачественной опухоли используют хирургические операции и/или химиотерапию. В то время как в некоторых случаях хирургическая операция обеспечивает полный и эффективный результат; обычно после операции вводят химиотерапевтическое средство для предотвращения возможности присутствия злокачественных клеток, которые выжили и запустят образование злокачественной опухоли в долгосрочной перспективе. По большей части, химиотерапия вызывает ряд побочных эффектов посредством повреждения здоровых клеток так же, как и злокачественных клеток. Клетки с высокой скоростью пролиферации в организме в наибольшей степени поражаются при химиотерапии, которые представляют собой образующие волосы клетки, клетки крови, продуцируемые в костном мозге, и клетки пищеварительной системы.

Побочные эффекты, часто наблюдаемые после химиотерапии, являются следующими:

- Усталость: хотя она в основном вызывается анемией в результате поражения клеток крови, причина также может быть психологической.

- Тошнота и рвота: в то время как она может быть следствием чувствительности к лекарственным средствам, она также может иметь психологические причины.

- Потеря волос: потеря волос, которая особенно выражена при химиотерапии вследствие их быстрого роста, является одной из наиболее значительных причин возникновения депрессии у пациентов.

- Снижение показателей крови: поражение костного мозга химиотерапией приводит к значительному снижению уровней клеток крови. Поскольку достаточное количество кислорода не может быть предоставлено тканям в результате этого снижения, можно наблюдать множество неблагоприятных эффектов, таких как ослабление иммунной системы и затруднение свертывания крови.

- Язвы в полости рта: химиотерапевтические средства иногда могут вызывать воспалительные язвы в полости рта. В ходе лечения пациенты должны избегать горячих и холодных напитков и уделять особое внимание гигиене их полости рта.

- Диарея или запор: диарея или запор могут наблюдаться в результаты ответа клеток пищеварительной системы на химиотерапевтические средства. Эта ситуация, эффекты которой в основном могут быть сокращены посредством диеты, в некоторых случаях может приводить к тяжелой диарее, требующей внутривенного введения жидкости.

- Изменения кожи и ногтей: химиотерапевтические средства имеют побочные эффекты, такие как потемнение кожи, шелушение кожи, покраснение или сухость кожи. Также может наблюдаться ломкость ногтей или потемнение их цвета. Особое внимание должно уделяться шелушению кожи, поскольку это вызывает раны у пациентов со сниженным иммунитетом.

- Проблемы со сном: хотя они обычно возникают по психологическим причинам, недостаток отдыха у организма в ходе химиотерапевтического лечения приводит как к снижению эффекта химиотерапии, так и дальнейшему ухудшению психического здоровья пациента.

Для повышения успеха лечения, необходимость применения химиотерапии в комбинации как с хирургическими, так и с другими способами, распространенность и непредсказуемость их побочных эффектов, варьирующихся от пациента к пациенту, привела к поиску учеными новых способов лечения.

Nauts. et al. (1953) показали, что микроорганизмы могут индуцировать противоопухолевый ответ. Они работали над идеей, что непатогенные организмы, ослабленные или генно-модифицированные, могут использоваться в качестве противоопухолевых средств [3]. Они обнаружили, что Toxoplasma gondii и Acanthamoeba castellanii демонстрировали противоопухолевую активность. Ввиду этой разработки в онкологии появилась новая область лечения с использованием микроорганизмов, и были проведены научные исследования и исследования с целью разработки под названием "биотерапия", которое впервые было использовано в 1931 году.

Baird et al. (2013) использовали аттенуированный паразит Toxoplasma gondii для лечения меланомы мышей B16F10 и продемонстрировали, что у мышей, которым вводили Toxoplasma gondii, возникал выраженный индуцированный CD8+ T-клетками противоопухолевый ответ [9].

Bose et al. (2016) сделали заключение в их исследовании, что аттенуированные нагреванием Leishmania donovani индуцируют апоптоз клеток рака печени HepG2 через опосредуемый активными формами кислорода (ROS) зависимый от p53 митохондриальный каскад [10].

Yang et al. (2017) протестировали экзосомы, выделенные из мышей, инфицированных Plasmodium, в модели рака легкого Льюиса, и выявили, что они ингибируют ангиогенез опухоли [11].

Вследствие возможности их использования для нацеливания посредством груза, специфичного к клетке, из которой они получены, экзосомы стали значимыми в исследованиях, начатых с целью улучшения современных способов лечения и снижения побочных эффектов.

Внеклеточные везикулы представляют собой мелкие мешочки, которые вовлечены в межклеточный транспорт веществ и отделены по меньшей мере одним липидным бислоем от цитоплазматической жидкости. Экзосомы, которые являются одними из внеклеточных везикул, представляют собой везикулы, которые высвобождаются многими организмами, такими как высшие эукариоты и растения, и которые содержат липидные бислойные мембраны разных размеров. Важность этих везикул обусловлена способностью передавать информацию другим клеткам для влияния на функцию клеток. Передачу сигнала через экзосомы проводят посредством биомолекул во многих различных категориях, состоящих из белков, липидов, нуклеиновых кислот и сахаров [12]. Поскольку они содержат поверхностные белки клетки, из которой они продуцируются, экзосомы нацеливаются на тип клеток, в которых их доставляют в системах in vivo. Эти свойства делают экзосомы пригодными для переноса нуклеиновых кислот для медикаментозной терапии, терапии биоактивными веществами и генной терапии. Другой отличительной особенностью экзосом является то, что они являются специфичными к клетке, где продуцируются сигналы и грузы, которые они переносят, и к текущим физиологическим условиям клетки. Экзосомы других организмов, экзосомы других типов клеток того же организма и экзосомы той же клетки в других условиях демонстрируют различные свойства.

Каждая клетка продуцируют экзосомы для ее собственных целей. Было открыто, что злокачественные клетки с экзосомами, которые они продуцируют, создают благоприятное окружение для них в организме [13], ускользают от иммунной системы [14, 15] и используют экзосомы для метастазирования [16]. Экзосомы стволовых клеток [17] и особенно экзосомы дендритных клеток, которые представляют собой клетки иммунной системы [18, 19] имеют множеством видов активности при ответе организма на злокачественную опухоль. Другим источником экзосом, который обеспечивает успешные результаты, являются растения. Экзосомы, полученные из лимона, успешно использовались в модели хронического миелоидного лейкоза для целей лечения [20].

Все эукариотические клетки продуцируют их собственные экзосомы, включая эукариотических паразитов. Лейшманиоз является общим названием, данным группе трансмиссивных заболеваний, которые передаются человеку посредством укуса самки москита, инфицированной паразитами Leishmania protozoan. В соответствии с Всемирной организацией здравоохранения, лейшманиоз широко распространен более чем в 60 странах по всему миру, особенно в южноевропейских, средневосточных и североамериканских странах, включая Турцию и окружающие географические регионы.

В патентном документе Европы № EP1687025, известной в данной области заявке, описана вакцинная композиция, содержащая интерлейкин-18 и адъювант на основе сапонина. Было определено, что комбинированная терапия, описанная в рамках указанного изобретения, была пригодной для лечения или профилактики инфекционных заболеваний, злокачественных опухолей, аутоиммунных заболеваний и родственных состояний.

В патентном документе Китая № CN102988417, известной в данной области заявке, описано применение биологических средств на основе гельминтных паразитов для предупреждения и контроля заболеваний. Эти препараты на основе паразитов влияют на функцию регуляторных T-клеток. Заболевание лечат путем изменения активности регуляторных T-клеток посредством введения паразитарного препарата. Приведенные примеры заболеваний, которые лечат этим способом, представляют собой ассоциированные с Th1 или Th2 злокачественные опухоли.

Сущность изобретения

Задачей настоящего изобретения является применение паразитов и внеклеточных везикул, полученных из паразитов, для лечения злокачественной опухоли. Экзосомы паразитов прямо индуцируют ответ в злокачественных клетках, не вызывая побочных эффектов на здоровые клетки. Кроме того, активные вещества могут быть загружены на эндосомы с использованием способности экзосом к нагрузке лекарственным средством, и, таким образом, путем переноса специфического лекарственного средства к клетке-мишени и, тем самым, повышения биодоступности лекарственного средства, достигается желаемый эффект в специфической области опухоли, являющейся мишенью. В объеме изобретения, в частности, паразит Leishmania infantum используется в качестве источника внеклеточных везикул (экзосом).

Подробное описание изобретения

"Применение паразитов и внеклеточных везикул, полученных из паразитов, для лечения злокачественной опухоли", разработанное для решения задач по настоящему изобретению, проиллюстрировано на сопровождающих фигурах, на которых:

Фиг.1 представляет собой графическое представление апоптотического эффекта инкубации паразитов Leishmania infantum с клетками U87 в двух различных дозах на клетки.

Фиг.2 представляет собой фотографию, полученную под световым микроскопом, демонстрирующую паразитарную инфекцию через 8 часов после инкубации клеток U87 в культуральной среде с паразитами.

Фиг.3 представляет собой графическое представление эффекта введения экзосом, полученных из паразитов Leishmania infantum, на жизнеспособность клеток U87, через 24, 48 и 72 часов в 8 различных дозах.

Фиг.4 представляет собой графическое представление эффекта введения экзосом, полученных из паразитов Leishmania infantum, на жизнеспособность клеток A172 через 24, 48 и 72 часов в 8 различных дозах.

Фиг.5. представляет собой графическое представление эффекта введения экзосом, полученных из паразитов Leishmania infantum, на жизнеспособность клеток SHSY5Y через 24, 48 и 72 часов в 8 различных дозах.

Фиг.6 представляет собой графическое представление эффекта введения экзосом, полученных из паразитов Leishmania infantum, на жизнеспособность клеток SH4 через 24, 48 и 72 часов в 8 различных дозах.

Фиг.7 представляет собой графическое представление эффекта введения экзосом, полученных из паразитов Leishmania infantum, на жизнеспособность клеток 22RV через 24, 48 и 72 часов в 8 различных дозах.

Фиг.8 представляет собой графическое представление эффекта введения экзосом, полученных из паразитов Leishmania infantum, на жизнеспособность клеток HDF через 24, 48 и 72 часов в 8 различных дозах.

Фиг.9. представляет собой графическое представление эффекта введения экзосом, полученных из паразитов Leishmania infantum, на жизнеспособность клеток HaCaT через 24, 48 и 72 часов в 8 различных дозах.

Фиг.10 представляет собой графическое представление эффекта введения экзосом, полученных из паразитов Leishmania infantum, на жизнеспособность астроцитов через 24, 48 и 72 часов в 8 различных дозах.

Фиг.11 представляет собой графическое представление эффекта введения экзосом, полученных из паразитов Leishmania infantum, на экспрессию гена Bax в клетках нейробластомы SHSY5Y через 48 часов в одной дозе.

Фиг.12 представляет собой графическое представление эффекта введения экзосом, полученных из паразитов Leishmania infantum, на экспрессию гена Bcl-2 в клетках нейробластомы SHSY5Y через 48 часов в одной дозе.

Фиг.13 представляет собой графическое представление эффекта введения экзосом, полученных из паразитов Leishmania infantum, на экспрессию гена каспазы-3 в клетках нейробластомы SHSY5Y через 48 часов в одной дозе.

Фиг.14 представляет собой графическое представление эффекта введения экзосом, полученных из паразитов Leishmania infantum, на экспрессию гена p53 в клетках нейробластомы SHSY5Y через 48 часов в одной дозе.

Фиг.15 представляет собой графическое представление эффекта введения экзосом, полученных из паразитов Leishmania infantum, на экспрессию гена p21 в клетках нейробластомы SHSY5Y через 3 часа в одной дозе.

Фиг.16 представляет собой графическое представление эффекта введения экзосом, полученных из паразитов Leishmania infantum, на экспрессию гена p21 в астроцитах через 3 часа в одной дозе.

Фиг.17 представляет собой графическое представление эффекта введения экзосом, полученных из паразитов Leishmania infantum, на экспрессию гена p53 в клетках нейробластомы SHSY5Y через 3 часа в одной дозе.

Фиг.18 представляет собой графическое представление эффекта введения экзосом, полученных из паразитов Leishmania infantum, на экспрессию гена p53 в астроцитах через 3 часа в одной дозе.

Фиг.19 представляет собой графическое представление эффекта введения экзосом, полученных из паразитов Leishmania infantum, на экспрессию гена каспазы-3 в клетках нейробластомы SHSY5Y через 3 часа в одной дозе.

Фиг.20 представляет собой графическое представление эффекта введения экзосом, полученных из паразитов Leishmania infantum, на экспрессию гена каспазы-3 в клетках астроцитах через 3 часа в одной дозе.

Настоящее изобретение относится к применению паразитов и внеклеточных везикул, полученных из паразитов, для лечения неопластических заболеваний. Термин "неопластические заболевания" относится к злокачественным опухолям или физиологическому состоянию, характеризующемуся неконтролируемым клеточным ростом, и обозначает рак. В объеме изобретения термины "неопластическое заболевание" и "злокачественная опухоль" могут использоваться взаимозаменяемо. Неопластическое заболевание может представлять собой по меньшей мере один тип злокачественной опухоли, выбранный из группы, включающей рак молочной железы, рак предстательной железы, рак ободочной и прямой кишки, рак кожи, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, мезотелиому, желудочно-кишечный рак, рак поджелудочной железы, саркому, бластому, лимфому, глиобластому, нейробластому, рак вульвы, рак шейки матки, карциному эндометрия, рак яичника, рак печени, гепатому, лейкоз, рак мочевого пузыря, рак почки, карцинома слюнной железы, рак щитовидной железы и различные типы рака головы и шеи. В рамках изобретения лечение злокачественной опухоли проводят в форме уничтожения злокачественных клеток U87 и злокачественных клеток A172, которые представляют собой клеточные линии глиобластомы, злокачественных клеток SHSY-5Y, которые представляют собой клеточные линии нейробластомы, злокачественных клеток SH4, которые представляют собой клеточные линии меланомы, и злокачественных клеток 22R, которые представляют собой клеточные линии предстательной железы.

Изобретение относится к применению паразитов Leishmania и внеклеточных везикул, полученных из паразитов, для лечения злокачественной опухоли, поскольку они селективно уничтожают злокачественные клетки. При разработке изобретения было обнаружено, что паразиты и внеклеточные везикулы, полученные из паразитов, имеют в высокой степени фатальное действие на злокачественную опухоль, но практически не имеют побочных эффектов на здоровые клетки.

В рамках изобретения может быть возможной нагрузка активными веществами экзосом с использованием способности экзосом к нагрузке лекарственным средством и транспорту специфичного к клетке-мишени лекарственного средства и таким, образом, к повышению биодоступности лекарственного средства и достижению желаемого эффекта в области-мишени.

Отличительным признаком изобретения является применение экзосом, выделенных из паразита Leishmania, для лечения злокачественной опухоли. В исследованиях, упомянутых в разделе "Уровень техники изобретения", прямое применение паразитов имеет серьезное препятствие для применения при лечении, поскольку они вызывают заболевания. В случае настоящего изобретения с использованием экзосом из паразитов предупреждается возможный риск заболеваний, связанных с прямым применением паразитов.

В рамках настоящего изобретения различные паразиты, включая паразита Leishmania infantum, и экзосомы, полученные из паразитов, используют для лечения злокачественной опухоли. В рамках изобретения используемые паразиты включают следующие виды: Acanthamoeba sp. (Acanthamoeba castellanii), Echinocococcus spp., E. histolytica spp., Ancylostoma brazilense, A. caninum, A. ceylanicum, и Uncinaria stenocephala, Angiostrongylus cantonensis, Ascaris, Giardia, Leishmania spp. (L. Arabica, L. archibaldi, L. aristedesi, L. braziliensis, L. chagasi, L. colombiensis, L. Deanei, L. donovani, L. enrietii, L. equatorensis, L. forattinii, L. garnhami, L. gerbil, L.guyanensis, L. herreri, L. hertigi, L. infantum, L. killicki, L. lainsoni, L. major, L. Mexicana, L. naiffi, L. panamensis, L. peruviana, L. pifanoi, L. shawi, L. tarentolae, L. tropica, L. turanica, L. venezuelensis), Plasmadium spp. (P. falciparum, P. vivax, P. ovale), Schistosoma spp., Toxoplasma spp. (Toxoplasma gondii), Trypanosoma brucei ssp. Объем изобретения вовлекает внеклеточные везикулы, полученные из одного или нескольких из этих видов, по отдельности или в комбинации, где в последнем случае экзосомы, полученные из различных паразитов, демонстрируют совокупный эффект при лечении злокачественной опухоли.

В рамках изобретения Leishmania infantum выбирают в качестве паразита для охарактеризации внеклеточных везикул, полученных из паразитов. Они могут применяться при лечении злокачественной опухоли с использованием культуральной среды паразитов.

В рамках изобретения паразиты предусматриваются паразиты и внеклеточные везикулы, полученные из паразитов, у которых паразитарные антигены (инактивированные нагреванием или непосредственно сам антиген), генетический материал (мРНК, малая РНК, митохондриальная ДНК, фрагменты ДНК), паразиты с переносом и трансфекцией генов (плазмидный перенос, лентивирусный, электропорация с антигеном SV40) используются для лечения злокачественной опухоли на основе CRISPR (способы, включающие редактирование нуклеотидов). Их используют для лечения злокачественной опухоли в форме, инкапсулированной в системы наноносителей.

В рамках настоящего изобретения выделение паразитов и внеклеточных везикул, полученных из паразитов, проводят с использованием по меньшей мере одного из следующих способов выделения: выделение с использованием водных двухфазных систем (ATPS), градиентное центрифугирование, ультрацентрифугирование, ультрацентрифугирование в градиенте сахарозы, преципитация с полимером, ультрафильтрация, выделение с использованием хроматографических способов (аффинная хроматография (аффинность к антителу и пептиду), хроматография разделения по размеру (эксклюзионная хроматография)), выделение с микрошариками и преципитация в зависимости от ионного заряда (преципитация на основе электрического заряда) и высаливание. Способ выделения в двухфазной жидкости в рамках изобретения включает стадии

- сбора культуральной среды паразитов, из которой намереваются выделять внеклеточные везикулы,

- центрифугирования со скоростью от 2000g до 10000g в течение 5-20 минут для удаления нежелательных веществ, таких клеточные остатки и паразиты, из культуральной среды,

- удаления частиц размером 220 нм и выше посредством фильтрации после центрифугирования,

- переноса смеси везикулы-белок, полученной посредством центрифугирования, в двухфазную жидкую систему, содержащей фазу PEG и фазу DEX, для ее разделения,

- удаления невезикулярных белков, клеточных жиров и других примесей из везикул с использованием химической тенденции фазы PEG к белкам и фазы DEX к мембранам, имеющим фосфолипидную структуру,

- получения выделенных везикул.

Состав, разработанный в рамках настоящего изобретения и содержащий паразиты и внеклеточные везикулы, полученные из паразитов, содержит системы наноносителей, выбранные из группы, включающей везикулы, эмульсионные системы, биологические и химические наночастицы (полимерные наночастицы, твердые липидные наночастицы), неорганические наночастицы (металлические наночастицы), липидные везикулярные системы (липосомы, ниосомы и этосомы), дендримеры, конъюгаты полимер-лекарственное средство, мицеллы и углеродные нанотрубки. Этот состав содержит по меньшей мере одно активное соединение, выбранное из группы, содержащей активные соединения, демонстрирующие антипаразитарную, антибактериальную, противовирусную, антинеопластическую, и/или цитотоксическую, и/или антиметастатическую активность, и их двойные и тройные комбинации в качестве активного вещества. Этот состав содержит по меньшей мере одно средство, выбранное из группы, включающей амикацин, гентамицин, канамицин, неомицин, нетилмицин, тобрамицин, паромомицин, стрептомицин, спектиномицин, гелданамицин, гербимицин, рифаксимин, лоракабеф, эртапенем, дорипенем, имипенем, меропенем, цефадроксил, цефазолин, цефалотин, цефалексин, цефаклор, цефамандол, цефокситин, цефпрозил, цефуроксим, цефиксим, цефдинир, цефдиторен, цефоперазон, цефотаксим, цефподоксим, цефтазидим, цефтибутен, цефтизоксим, цефепим, цефтаролин фосамил, цефтобипрол, тейкопланин, ванкомицин, телеванцин, далбаванцин, оритаванцин, клиндамицин, линкомицин, даптомицин, азитромицин, кларитромицин, диритромицин, эритромицин, рокситромицин, тролеандомицин, телитромицин, спирамицин, азтреонам, фуразолидон, нитрофурантоин, линезолид, посизолид, радезолид, торезолид, амоксициллин, ампициллин, азлоциллин, карбенициллин, клоксициллин, диклоксициллин, флуклоксициллин, мезлоциллин, метициллин, нафциллин, оксациллин, пенициллин G, пенициллин V, пиперациллин, темоциллин, тикарциллин, клавуланат, сульбактам, тазобактам, бацитрацин, колистин, полимиксин B, ципрофлоксацин, эноксацин, гатифоксацин, гемифлоксацин, левофлоксацин, ломефлоксацин, моксифлоксацин, налидиксовую кислоту, норфлоксацин, офлоксацин, тровафлоксацин, гепафлоксацин, спарфлоксацин, темафлоксацин, мафенид, сульфацетамид, сульфадиазин, сульфадиметоксин, сульфаметизол, сульфаметоксазол, сульфаниламид, сульфасалазин, сульфизоксазол, триметоприм, демеклоциклин, доксицилин, миноциклин, окситетрациклин, тетрациклин, клофазимин, дапзон, капреомицин, циклосерин, этамбутол, изониазид, пиразинамид, рифампицин, рифабутин, рифапентин, стрептомицин, арсфенамин, хлорамфеникол, фосфомицин, фусидовую кислоту, метронидазол, мупироцин, платенсимицин, квинупристин, дальфопристин, тиамфеникол, тигециклин, тинидазол, триметоприм и их двойные или тройные комбинации и/или инкапсулированные формы в качестве активного соединения, демонстрирующего антибактериальную активность. Этот состав содержит по меньшей мере одно средство, выбранное из группы, включающей абакавир, ацикловир, адефовир, амантадин, ампренавир, амплиген, арбидол, атазанавир, атриплу, балавир, сидофовир, комбивир, долутегравир, дарунавир, делавирдин, диданозин, доказанол, эдуксудин, эфавиренц, эмтрицитабин, энфувиртид, энтекавир, эколивер, фамицикловир, фомивирсен, фосампренавир, фоскарнет, фосфонет, ганцикловир, ибаситабин, имуновир, идоксуридин, имиквимод, индинавир, инозин, интерферон типа I, интерферон типа II, интерферон типа III, интерферон, ламивудин, лопинавир, ловирид, маравирок, мороксидин, метисазон, нельфинавир, невирапин, нексавир, нитазоксанид, новир, озельтамивир, пегинтерферон альфа-2a, пенсикловир, перамивир, плеконарил, подофилотоксин, ингибитор протеаз, нуклеозидные аналоги, ралгетавир, рибавирин, римантидин, ритонавир, пирамидин, саквинавир, софосбувир, ставудин, телапревир, тенофовир, типранавир, трифлуридин, трисивир, тромантадин, троваду, валацикловир, валганцикловир, видарабин, вирамидин, зальцитабин, занамивир, зидовудин и их двойные или тройные комбинации и/или инкапсулированные формы в качестве активного соединения, демонстрирующего противовирусную активность. Этот состав содержит по меньшей мере одно средство, выбранное из группы, включающей нитазоксанид, меларсопрол, эфлорнитин, метронидазол, тинидазол, милтефозин, мебендазол, пирантела памоат, тиабендазол, диэтилкарбамазин, ивермектин, никлосамид, празиквантел, албендазол, рифампин, амфотерицин B, фумагиллин, фуразолидон, нифурсемизон, нитазоксанид, орнидазол, паромомицина сульфат, пентамидин, пириметамин, тинидазол, албендазол, мебендазол, тиабендазол, фенбендазол, триклабендазол, флубендазол, абамектин, диэтилкарбамазин, ивермектин, сурамин, пирантела памоат, левамизол, никлосамид, нитазоксанид, оксиклозанид, монепантел, дерквантел, амфотерицин B, мочевины стибамин, натрия стибоглюконат, меглумин антимониат, паромомицин, милтефозин, флуконазол, пентамидин, и их двойные или тройные комбинации и/или инкапсулированные формы в качестве активного соединения, демонстрирующего антипаразитарную активность. Этот состав содержит по меньшей мере одно средство, выбранное из группы, включающей циклофосфамид, ифосфамид, темозоломид, капецитабин, 5-фторурацил, метотрексат, гемцитабин, пеметрексед, митомицин, блеомицин, эпирубицин, доксорубицин, этопозид, паклитаксел, иринотекан, доцетаксел, винкристин, карбоплатин, цисплатин, оксалиплатин, бевацизумаб, цетуксимаб, гефитиниб, иматиниб, трастузумаб, деносумаб, ритуксимаб, сунитиниб, золедронат, абиратерон, анастрозол, бикалутамид, экземестан, гозерелин, медроксипрогестерон, октреотид, тамоксифен, бендамустин, кармустин, хлорамбуцил, ломустин, мелфалан, прокарбазин, стрептозоцин, флударабин, ралтитрексед, актиномицин D, дактиномицин, доксорубицин, митоксантрон, эрибулин, топотекан, винбластин, винорелбин, афатиниб, афлиберцепт, кризотиниб, дабрафениб, интерферон, ипилимумаб, лапатиниб, ниволумаб, панитумумаб, пембролизумаб, пертузумаб, сорафениб, трастузумаб эмтансин, темсиролимус, вемурафениб, ибандроновую кислоту, памидронат, бексаротен, бузерелин, ципротерон, дегареликс, фолиновую кислоту, фулвестрант, ланреотид, леналидомид, лектрозол, леупрорелин, магестрол, месну, талидомид, винкристин и их двойные или тройные комбинации и/или инкапсулированные формы в качестве активного соединения, демонстрирующего антинеопластическую активность, в комбинации с внеклеточными везикулами и/или системами наноносителей. Более того, этот состав содержит по меньшей мере одно активное вещество. Активное вещество включает определенные выше и перечисленные вещества.

Способ введения этой описанной выше фармацевтической композиции для лечения включает по меньшей мере один способ введения, выбранный из группы, включающей парентеральное, внутривенное, внутрикожное, подкожное, внутрибрюшинное, местное, интратекальное, интраназальное, интрацеребровентрикулярное, глазное, вагинальное, уретральное, трансдермальное, сублингвальное, субарахноидальное, ректальное, периодонтальное, периневральное, перидуральное, околосуставное, пероральное, интратимпанальное, внутриопухолевое, внутрилегочное, интрасиновиальное, внутримышечное, интраовариальное, интраменингеальное, проводимое внутрь пещеристого тела, интракоронарное, интрацеребральное, эпидуральное, кожное, буккальное, дентальное.

Внеклеточные везикулы используются в качестве адъювантов для лечения злокачественной опухоли в рамках изобретения. Фармацевтическая композиция, описанная в рамках изобретения, может быть составлена путем включения внеклеточных везикул, полученных из паразитов, по меньшей мере в одно из гидроксида алюминия, фосфата алюминия, токоферола, эмульсионных систем, содержащих 3D-MPL, холестерина, CG олигонуклеотида; или комбинации двух или более из них.

Получение паразитов и паразитических внеклеточных везикул, которые могут использоваться для лечения злокачественной опухоли для целей изобретения, включает следующие стадии.

1. Культивирование паразитов

Промастиготы Leishmania infantum (MHOM/MA/67/ITMA-P263) инкубируют при 27°C в среде RPMI (с инактивированной нагреванием 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 2 мМ L-глутамином, 20 мМ HEPES, 100 Е/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина). Паразитов, достигших логарифмической фазы (10⁶/мл), используют для инфицирования.

2. Обработка культивируемыми паразитами глиобластомы и измерение уровня апоптоза посредством анализа с аннексином V

Полученные паразиты добавляют к клеткам глиобластомы U87 в культуральной среде. Паразиты, используемые в 2 различных дозах (50- и 100-кратное количество относительно количества клеток U87), инкубируют в течение 8 часов, а затем паразиты на клетках U87 удаляют. На следующие сутки после добавления раствора аннексина V определяют смертность с использованием устройства для проточной цитометрии.

3. Сбор среды паразитов

В рамках изобретения внеклеточные везикулы паразитов выделяют способом выделения, выбранным из группы, состоящей из выделения посредством двухфазной жидкой системы, градиентного центрифугирования, ультрафильтрации, хроматографических способов, выделения на основе полимеров и выделения с использованием микрошариков. Среди них выделения наиболее чистых внеклеточных везикул достигают путем выделения с использованием двухфазной жидкой системы и, таким образом, этот способ является предпочтительным в рамках настоящей заявки.

Способ выделения посредством двухфазной жидкой системы, использованной для выделения паразитических внеклеточных везикул, используемых в рамках настоящего изобретения, включает следующие стадии:

- сбора культуральной среды паразитов, из которой намереваются выделять внеклеточные везикулы,

- центрифугирования со скоростью от 2000g до 10000g в течение 5-20 минут для удаления нежелательных веществ, таких как клеточные остатки и паразиты, из культуральной среды,

- удаления частиц размером 220 нм и выше посредством фильтрации после центрифугирования,

- переноса смеси везикулы-белок, полученной посредством центрифугирования, в двухфазную жидкую систему, содержащей фазу PEG и фазу DEX для ее разделения,

- удаления невезикулярных белков, клеточных жиров и других примесей из везикул с использованием химической тенденции фазы PEG к белкам и фазы DEX к мембранам, имеющим фосфолипидную структуру,

- получения выделенных везикул.

4. MTS

После посева клеток в 96-луночные планшеты для культивирования (Corning Glasswork, Corning, NY) в количестве 5000 клеток/лунка в модифицированной способом Дульбекко среде Игла (DMEM), содержавшей 10% эмбриональную телячью сыворотку (Invitrogen) и 1% PSA (Biological Industries, Beit Haemek, Израиль) в культуральной среде определяли уровень жизнеспособности клеток на 1, 2 и 3 сутки. Жизнеспособность клеток определяли с использованием способа с 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразолия (MTS) (CellTiter96 Aqueous One Solution; Promega, Southampton, Великобритания). К клеткам добавляли 10 мкл раствора MTS в 100 мкл среды для роста, и их инкубировали в темноте в течение 2 часов. После процесса инкубации жизнеспособность клеток определяли путем проведения измерения поглощения с использованием устройства для считывания планшетов для ELISA (Biotek, Winooski, VT) при длине волны 490 нм.

5. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (RT-PCR)

На следующие сутки после посева клеток в 96-луночные планшеты для культивирования (Corning Glasswork, Corning, NY) в количестве 150000 клеток/лунка в модифицированной способом Дульбекко среде Игла (DMEM), содержавшей 10% эмбриональную телячью сыворотку (Invitrogen) и 1% PSA (Biological Industries, Beit Haemek, Израиль) в культуральной среде, клетки инкубировали с различными дозами (10-40 мкг/мл) экзосом паразитов, и через 3 и 48 часов после инкубации определяли экспрессию генов p21, p53, каспазы 3, Bcl-2 и Bax в клетках. В общем, выделение РНК проводили на клетках с использованием Trizol®, концентрации тотальной РНК определяли посредством спектрофотометрии NanoDrop, а затем проводили анализ кДНК с использованием набора cDNA kit (Roche). RT-PCR проводили при 95°C в течение 15 мин, затем с 39 циклами при 95°C в течение 15 с, 58°C в течение 1 мин и 72°C в течение 30 c, используя SYBR Green Kit (Thermofisher scientific). В качестве гена домашнего хозяйства использовали GAPDH.

Одним из отличий настоящего изобретения относительно уровня техники является применение паразитов и экзосом, выделенных из паразитов, и это составляет значительное отличие как с точки зрения вида, из которого их выделяют, так и применения экзосом паразитов. Эти экзосомы являются только частью химических веществ, которые высвобождаются клетками наружу. В рамках изобретения показана активность паразитов и их экзосом как на злокачественные, так и на здоровые клеточные линии. Паразиты применяли для клеток глиобластомы U-87 как в 50-кратном, так и в 100-кратном количестве, и оценивали уровни апоптоза, т.е. уровни гибели, злокачественных клеток, и в конце инкубации в течение 8 часов для обеих доз наблюдали гибель вплоть до 30% (фиг.1). В то же время, инфицирование клеток, претерпевших апоптоз, т.е. гибель, паразитами Leishmania infantum составляет приблизительно 68 процентов (фиг.2). При изучении жизнеспособности клеток в течение 3 суток после использования не только паразитов, но также экзосом, которые секретировались этими паразитами и были выделены из среды, в определенных концентрациях (0,78-50 мкг/мл) для определенных злокачественных и здоровых клеток, наблюдали снижение жизнеспособности клеток и апоптоз в клетках глиобластомы U87 (40% и выше), клетках нейробластомы SHSY5Y (90% и выше), клетках глиобластомы A172 (45% и выше), клетках меланомы SH4 (90% и выше), клетках предстательной железы 22RV (90% и выше), в то время как не наблюдали эффекта на жизнеспособность клеток HaCaT, HDF и асторцитов, которые представляют собой линии здоровых клеток (фиг.3-10).

Дозой экзосом 10 мкг/мл обрабатывали клетки нейробластомы SHSY-5Y и после инкубации в течение 48 часов проводили анализ экспрессии генов p53, каспазы 3, Bcl-2 и Bax посредством количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (RT-PCR); и в результате наблюдали значительное повышение экспрессии генов p53, каспазы 3 и Bax, и снижение экспрессии гена Bcl-2 в клетках нейробластомы SHSY-5Y (фиг.11-14). Дозой экзосом 40 мкг/мл обрабатывали клетки нейробластомы SHSY-5Y и астроциты (NHA) и после инкубации в течение 3 часов оценивали изменения экспрессии генов p21, p53 и каспазы 3; и значительное повышение экспрессии генов p21 и каспазы 3 наблюдали в клетках нейробластомы SHSY-5Y, в то время как в астроцитах (NHA) экспрессия генов p21, p53 и каспазы 3 снижалась (фиг.15-20). Результаты, полученные с помощью этих экспериментов, показывают, что настоящее изобретение является пригодным для разработки состава, который не имеет цитотоксического эффекта на здоровые клетки, одновременно вызывая гибель (апоптоз) высоких количеств злокачественных клеток.

Преимущества настоящего изобретения могут быть описаны следующим образом:

- Настоящее изобретение демонстрирует практически полную активность в течение 24 часов на различные типы злокачественных клеток и не демонстрирует побочных эффектов на здоровые клетки,

- Поскольку паразиты, особенно виды Leishmania, чрезвычайно подвержены генетическим модификациям, паразиты и внеклеточные везикулы паразитов могут быть модифицированы посредством генетического вмешательства в зависимости от потребности, и они доступны для улучшения их активности в отношении злокачественной опухоли и объема продуцирования из паразитов,

- Активные вещества могут быть загружены в экзосомы с использованием способности экзосом к нагрузке лекарственным средством и, таким образом, посредством переноса специфического лекарственного средства к клетке-мишени и тем самым повышения биодоступности лекарственного средства, достигают желаемого эффекта в специфической области-мишени опухоли.

- Внеклеточные везикулы, используемые в рамках изобретения, представляют собой продукты, которые могут быть продуцированы в высоких объемах при доступной цене.

ССЫЛКИ

[1] Ferlay, J. et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International journal of cancer, 2015. 136(5): p. E359-E386.

[2] Tao, J.J., K. Visvanathan, and A.C. Wolff, Long term side effects of adjuvant chemotherapy in patients with early breast cancer. The Breast, 2015. 24: p. S149-S153.

[3] Nauts H.C, Fowler G.A and Bogatko F.H: A review of the influence of bacterial infection and of bacterial products (coley's toxins) on malignant tumors in man; a critical analysis of 30 inoperable cases treated by coley's mixed toxins, in which diagnosis was confirmed by microscopic examination selected for special study. Acta Med Scand Suppl 1953;276:1-103.

[4] Atayde V.D, Jasiulionis M.G, Cortez M., Yoshida N.: A recombinant protein based on trypanosoma cruzi surface molecule gp82 induces apoptotic cell death in melanoma cells. Melanoma Res 2008;18:172-183.

[5] Kallinikova V.D., Matekin P.V., Ogloblina T.A., Leikina M.I., Kononenko A.F., Sokolova N.M., Pogodina L.S: [anticancer properties of flagellate protozoan trypanosoma cruzi chagas, 1909]. Izv Akad Nauk Ser Biol 2001:299-311.

[6] Kim J.O., Jung S.S., Kim S.Y., Kim T.Y., Shin D.W., Lee J.H., Lee Y.H.: Inhibition of lewis lung carcinoma growth by toxoplasma gondii through induction of th1 immune responses and inhibition of angiogenesis. J Korean Med Sci 2007;22:S38-46.

[7] Lopez N.C., Valck C., Ramirez G., Rodriguez M., Ribeiro C., Orellana J., Maldonado I., Albini A., Anacona D., Lemus D., Aguilar L., Schwaeble W., Ferreira A.: Antiangiogenic and antitumor effects of trypanosoma cruzi calreticulin. PLoS Negl Trop Dis 2010;4:e730.

[8] Roskin Gr., Exempliarskaia E: Protozoeninfektion und experimenteller Krebs. Z Krebsforsch 1931;34:628- 645.

[9] Baird R. et al. Immune-mediated regression of established B16F10 melanoma by intratumoral injection of attenuated Toxoplasma gondii protects against rechallenge. J Immunol. 2013 January 1; 190(1): 469-478. doi:10.4049/jimmunol.1201209.

[10] Bose D. et. al. Heat Killed Attenuated Leishmania Induces Apoptosis of HepG2 Cells Through ROS Mediated p53 Dependent Mitochondrial Pathway. Cell Physiol Biochem 2016;38:1303-1318.

[11] Yang Y. et al. Exosomes from Plasmodium-infected hosts inhibit tumor angiogenesis in a murine Lewis lung cancer model. Nature Oncogenesis (2017) 6, e351; doi:10.1038/oncsis.2017.52.

[12] Théry, C., L. Zitvogel, and S. Amigorena, Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology, 2002. 2(8): p. 569.

[13] Kahlert, C. and R. Kalluri, Exosomes in tumor microenvironment influence cancer progression and metastasis. Journal of molecular medicine, 2013. 91(4): p. 431-437.

[14] Clayton, A. and M.D. Mason, Exosomes in tumour immunity. Current oncology, 2009. 16(3): p. 46.

[15] Clayton, A., et al. Cancer exosomes express CD39 and CD73, which suppress T cells through adenosine production. The Journal of Immunology, 2011: p. 1003884.

[16] Costa-Silva, B. et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature cell biology, 2015. 17(6): p. 816.

[17] Lee, J.K., et al. Exosomes derived from mesenchymal stem cells suppress angiogenesis by down-regulating VEGF expression in breast cancer cells. PloS one, 2013. 8(12): p. e84256.

[18] Viaud, S. et al. Dendritic cell-derived exosomes for cancer immunotherapy: what's next? Cancer research, 2010: p. 0008-5472. CAN-09-3276.

[19] Escudier, B. et al. Vaccination of metastatic melanoma patients with autologous dendritic cell (DC) derived-exosomes: results of thefirst phase I clinical trial. Journal of translational medicine, 2005. 3(1): p. 10.

[20] Raimondo, S. et al. Citrus limon-derived nanovesicles inhibit cancer cell proliferation and suppress CML xenograft growth by inducing TRAIL-mediated cell death. Oncotarget, 2015. 6(23): p. 19514.

Claims (30)

1. Применение паразитов или внеклеточных везикул, полученных из паразитов, для лечения неопластических заболеваний, которые относятся к злокачественным опухолям или физиологическим состояниям, описываемым неконтролируемым клеточным ростом, где паразиты представляют собой паразитов Leishmania.

2. Применение по п.1, где по меньшей мере одного паразита выбирают из группы, включающей следующие виды Leishmania spp.: L. Arabica, L. archibaldi, L. aristedesi, L. braziliensis, L. chagasi, L. colombiensis, L. Deanei, L. donovani, L. enrietii, L. equatorensis, L. forattinii, L. garnhami, L. gerbil, L.guyanensis, L. herreri, L. hertigi, L. infantum, L. killicki, L. lainsoni, L. major, L. Mexicana, L. naiffi, L. panamensis, L. peruviana, L. pifanoi, L. shawi, L. tarentolae, L. tropica, L. turanica или L. venezuelensis.

3. Применение по п.1, где паразитарные антигены (инактивированные нагреванием или непосредственно сам антиген), генетический материал (мРНК, малая РНК, митохондриальная ДНК, фрагменты ДНК), паразиты с переносом и трансфекцией генов (плазмидный перенос, лентивирусный, электропорация с антигеном SV40) используются для лечения злокачественной опухоли на основе CRISPR (способы, включающие редактирование нуклеотидов).

4. Применение по п.1, где паразитарные антигены (инактивированные нагреванием или непосредственно сам антиген), генетический материал (мРНК, малая РНК, митохондриальная ДНК, фрагменты ДНК), паразиты с переносом и трансфекцией генов (плазмидный перенос, лентивирусный, электропорация с антигеном SV40) используются для лечения злокачественной опухоли на основе CRISPR (способы, включающие редактирование нуклеотидов) посредством инкапсулирования в системы наноносителей.

5. Применение по п.1, где паразиты или внеклеточные везикулы представляют собой культуральную среду.

6. Применение по п.2, где в качестве паразита выбраны Leishmania infantum.

7. Применение по п.1, где неопластическое заболевание выбрано из группы, включающей рак молочной железы, рак предстательной железы, рак ободочной и прямой кишки, рак кожи, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, мезотелиому, желудочно-кишечный рак, рак поджелудочной железы, саркому, бластому, лимфому, глиобластому, нейробластому, рак вульвы, рак шейки матки, карциному эндометрия, рак яичника, рак печени, гепатому, лейкоз, рак мочевого пузыря, рак почки, карциному слюнной железы, рак щитовидной железы и различные типы рака головы и шеи.

8. Применение по п.7, где паразиты или внеклеточные везикулы используются при лечении злокачественной опухоли для уничтожения злокачественных клеток клеточной линии глиобластомы U87.

9. Применение по п.7, где паразиты или внеклеточные везикулы используются при лечении злокачественной опухоли для уничтожения злокачественных клеток клеточной линии глиобластомы A172.

10. Применение по п.7, где паразиты или внеклеточные везикулы используются при лечении злокачественной опухоли для уничтожения злокачественных клеток клеточной линии нейробластомы SHSY-5Y.

11. Применение по п.7, где паразиты или внеклеточные везикулы используются при лечении злокачественной опухоли для уничтожения злокачественных клеток клеточной линии меланомы SH4.

12. Применение по п.7, где паразиты или внеклеточные везикулы используются при лечении злокачественной опухоли для уничтожения злокачественных клеток клеточной линии предстательной железы 22RV.

13. Применение по любому из предшествующих пунктов, где паразиты или внеклеточные везикулы выделены с использованием по меньшей мере одного из следующих способов выделения: выделение с использованием водных двухфазных систем (ATPS), градиентное центрифугирование, ультрацентрифугирование, ультрацентрифугирование в градиенте сахарозы, преципитация с полимером, ультрафильтрация, выделение с использованием хроматографических способов (аффинная хроматография (аффинность к антителу и пептиду), хроматография разделения по размеру (эксклюзионная хроматография)), выделение с микрошариками и преципитация в зависимости от ионного заряда (преципитация на основе электрического заряда) и высаливание.

14. Применение по п.13, где паразиты или внеклеточные везикулы выделены способом выделения посредством двухфазной жидкой системы, включающим стадии:

- сбора культуральной среды паразитов, из которой намереваются выделять внеклеточные везикулы,

- центрифугирования со скоростью от 2000g до 10000g в течение 5-20 мин для удаления нежелательных веществ, таких как клеточные остатки и паразиты, из культуральной среды,

- удаления частиц размером 220 нм и выше посредством фильтрации после центрифугирования,

- переноса смеси везикулы-белок, полученной посредством центрифугирования, в двухфазную жидкую систему, содержащей фазу PEG и фазу DEX для ее разделения,

- удаления невезикулярных белков, клеточных жиров и других примесей из везикул с использованием химической тенденции фазы PEG к белкам и фазы DEX к мембранам, имеющим фосфолипидную структуру,

- получения выделенных везикул.

15. Фармацевтическая композиция для лечения неопластических заболеваний, которые относятся к злокачественным опухолям или физиологическим состояниям, описываемым неконтролируемым клеточным ростом, содержащая паразиты или внеклеточные везикулы, полученные из паразитов, и системы наноносителей, выбранные группы, включающей внеклеточные везикулы, эмульсионные системы, биологические и химические наночастицы (полимерные наночастицы, твердые липидные наночастицы), неорганические наночастицы (металлические наночастицы), липидные везикулярные системы (липосомы, ниосомы и этосомы), дендримеры, конъюгаты полимер-лекарственное средство, мицеллы и углеродные нанотрубки, где паразиты представляют собой паразитов Leishmania.

16. Фармацевтическая композиция по п.15, содержащая по меньшей мере одно активное соединение, выбранное из группы, включающей активные соединения, демонстрирующие антипаразитарную, антибактериальную, противовирусную, антинеопластическую, и/или цитотоксическую, и/или антиметастатическую активность, и их двойные и тройные комбинации в качестве дополнительного активного вещества.

17. Фармацевтическая композиция по п.16, которая содержит по меньшей мере одно средство, выбранное из группы, включающей амикацин, гентамицин, канамицин, неомицин, нетилмицин, тобрамицин, паромомицин, стрептомицин, спектиномицин, гелданамицин, гербимицин, рифаксимин, лоракабеф, эртапенем, дорипенем, имипенем, меропенем, цефадроксил, цефазолин, цефалотин, цефалексин, цефаклор, цефамандол, цефокситин, цефпрозил, цефуроксим, цефиксим, цефдинир, цефдиторен, цефоперазон, цефотаксим, цефподоксим, цефтазидим, цефтибутен, цефтизоксим, цефепим, цефтаролин фосамил, цефтобипрол, тейкопланин, ванкомицин, телеванцин, далбаванцин, оритаванцин, клиндамицин, линкомицин, даптомицин, азитромицин, кларитромицин, диритромицин, эритромицин, рокситромицин, тролеандомицин, телитромицин, спирамицин, азтреонам, фуразолидон, нитрофурантоин, линезолид, посизолид, радезолид, торезолид, амоксициллин, ампициллин, азлоциллин, карбенициллин, клоксициллин, диклоксициллин, флуклоксициллин, мезлоциллин, метициллин, нафциллин, оксациллин, пенициллин G, пенициллин V, пиперациллин, темоциллин, тикарциллин, клавуланат, сульбактам, тазобактам, бацитрацин, колистин, полимиксин B, ципрофлоксацин, эноксацин, гатифоксацин, гемифлоксацин, левофлоксацин, ломефлоксацин, моксифлоксацин, налидиксовую кислоту, норфлоксацин, офлоксацин, тровафлоксацин, гепафлоксацин, спарфлоксацин, темафлоксацин, мафенид, сульфацетамид, сульфадиазин, сульфадиметоксин, сульфаметизол, сульфаметоксазол, сульфаниламид, сульфасалазин, сульфизоксазол, триметоприм, демеклоциклин, доксицилин, миноциклин, окситетрациклин, тетрациклин, клофазимин, дапзон, капреомицин, циклосерин, этамбутол, изониазид, пиразинамид, рифампицин, рифабутин, рифапентин, стрептомицин, арсфенамин, хлорамфеникол, фосфомицин, фусидовую кислоту, метронидазол, мупироцин, платенсимицин, квинупристин, дальфопристин, тиамфеникол, тигециклин, тинидазол, триметоприм и их двойные или тройные комбинации и/или инкапсулированные формы в качестве активного соединения, демонстрирующего антибактериальную активность.

18. Фармацевтическая композиция по п.16, которая содержит по меньшей мере одно средство, выбранное из группы, включающей абакавир, ацикловир, адефовир, амантадин, ампренавир, амплиген, арбидол, атазанавир, атриплу, балавир, сидофовир, комбивир, долутегравир, дарунавир, делавирдин, диданозин, доказанол, эдуксудин, эфавиренц, эмтрицитабин, энфувиртид, энтекавир, эколивер, фамицикловир, фомивирсен, фосампренавир, фоскарнет, фосфонет, ганцикловир, ибаситабин, имуновир, идоксуридин, имиквимод, индинавир, инозин, интерферон типа I, интерферон типа II, интерферон типа III, интерферон, ламивудин, лопинавир, ловирид, маравирок, мороксидин, метисазон, нельфинавир, невирапин, нексавир, нитазоксанид, новир, озельтамивир, пегинтерферон альфа-2a, пенсикловир, перамивир, плеконарил, подофилотоксин, ингибитор протеаз, нуклеозидные аналоги, ралгетавир, рибавирин, римантидин, ритонавир, пирамидин, саквинавир, софосбувир, ставудин, телапревир, тенофовир, типранавир, трифлуридин, трисивир, тромантадин, троваду, валацикловир, валганцикловир, видарабин, вирамидин, зальцитабин, занамивир, зидовудин и их двойные или тройные комбинации и/или инкапсулированные формы в качестве активного соединения, демонстрирующего противовирусную активность.

19. Фармацевтическая композиция по п.16, которая содержит по меньшей мере одно средство, выбранное из группы, включающей нитазоксанид, меларсопрол, эфлорнитин, метронидазол, тинидазол, милтефозин, мебендазол, пирантела памоат, тиабендазол, диэтилкарбамазин, ивермектин, никлосамид, празиквантел, албендазол, рифампин, амфотерицин B, фумагиллин, фуразолидон, нифурсемизон, нитазоксанид, орнидазол, паромомицина сульфат, пентамидин, пириметамин, тинидазол, албендазол, мебендазол, тиабендазол, фенбендазол, триклабендазол, флубендазол, абамектин, диэтилкарбамазин, ивермектин, сурамин, пирантела памоат, левамизол, никлосамид, нитазоксанид, оксиклозанид, монепантел, дерквантел, амфотерицин B, мочевины стибамин, натрия стибоглюконат, меглумин антимониат, паромомицин, милтефозин, флуконазол, пентамидин, и их двойные или тройные комбинации и/или инкапсулированные формы в качестве активного соединения, демонстрирующего антипаразитарную активность.

20. Фармацевтическая композиция по п.16, которая содержит по меньшей мере одно средство, выбранное из группы, включающей циклофосфамид, ифосфамид, темозоломид, капецитабин, 5-фторурацил, метотрексат, гемцитабин, пеметрексед, митомицин, блеомицин, эпирубицин, доксорубицин, этопозид, паклитаксел, иринотекан, доцетаксел, винкристин, карбоплатин, цисплатин, оксалиплатин, бевацизумаб, цетуксимаб, гефитиниб, иматиниб, трастузумаб, деносумаб, ритуксимаб, сунитиниб, золедронат, абиратерон, анастрозол, бикалутамид, экземестан, гозерелин, медроксипрогестерон, октреотид, тамоксифен, бендамустин, кармустин, хлорамбуцил, ломустин, мелфалан, прокарбазин, стрептозоцин, флударабин, ралтитрексед, актиномицин D, дактиномицин, доксорубицин, митоксантрон, эрибулин, топотекан, винбластин, винорелбин, афатиниб, афлиберцепт, кризотиниб, дабрафениб, интерферон, ипилимумаб, лапатиниб, ниволумаб, панитумумаб, пембролизумаб, пертузумаб, сорафениб, трастузумаб эмтансин, темсиролимус, вемурафениб, ибандроновую кислоту, памидронат, бексаротен, бузерелин, ципротерон, дегареликс, фолиновую кислоту, фулвестрант, ланреотид, леналидомид, лектрозол, леупрорелин, магестрол, месну, талидомид, винкристин и их двойные или тройные комбинации и/или инкапсулированные формы в качестве активного соединения, демонстрирующего антинеопластическую активность, в комбинации с внеклеточными везикулами и/или системами наноносителей.

21. Фармацевтическая композиция по любому из пп.16-20, которая содержит по меньшей мере одно активное вещество.

22. Фармацевтическая композиция по любому из пп.15-21, где способ лечения включает по меньшей мере один способ введения, выбранный из группы, включающей парентеральное, внутривенное, внутрикожное, подкожное, внутрибрюшинное, местное, интратекальное, интраназальное, интрацеребровентрикулярное, глазное, вагинальное, уретральное, трансдермальное, сублингвальное, субарахноидальное, ректальное, периодонтальное, периневральное, перидуральное, околосуставное, пероральное, интратимпанальное, внутриопухолевое, внутрилегочное, интрасиновиальное, внутримышечное, интраовариальное, интраменингеальное, проводимое внутрь пещеристого тела, интракоронарное, интрацеребральное, эпидуральное, кожное, буккальное, дентальное.

23. Применение по п.1, где внеклеточные везикулы используют в качестве адъювантов для лечения злокачественной опухоли.

24. Фармацевтическая композиция по любому из пп.15-22, которая сформирована путем включения внеклеточных везикул, полученных из паразитов, по меньшей мере в одно из гидроксида алюминия, фосфата алюминия, токоферола, эмульсионных систем, содержащих 3D-MPL, холестерина, CG олигонуклеотида; или комбинаций двух или более из них.

Images